DK145063B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antibioticum kaldet forbindelse 46192 - Google Patents

Fremgangsmaade til fremstilling af et antibioticum kaldet forbindelse 46192 Download PDF

Info

Publication number
DK145063B
DK145063B DK232078AA DK232078A DK145063B DK 145063 B DK145063 B DK 145063B DK 232078A A DK232078A A DK 232078AA DK 232078 A DK232078 A DK 232078A DK 145063 B DK145063 B DK 145063B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
agar
growth
compound
antibiotic
medium
Prior art date
Application number
DK232078AA
Other languages
English (en)
Other versions
DK145063C (da
DK232078A (da
Inventor
W D Celmer
W P Cullen
C E Moppett
J B Routien
P C Watts
R Shibakawa
J Tone
Original Assignee
Pfizer
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer filed Critical Pfizer
Publication of DK232078A publication Critical patent/DK232078A/da
Publication of DK145063B publication Critical patent/DK145063B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK145063C publication Critical patent/DK145063C/da

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/907—Streptosporangium

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Description

|j| (i2) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 145063 B
^w'
(19) DANMARK
DIREKTOHATET FOR PATENT- OO VAREMÆRKEVÆSENET
(21) Ansøgning nr. 2320/78 (51) lnt.CI.3 C 12 P 21/00 (22) Indleveringsdag 25. maj 1978 C 07 6 11/00 (24) Løbedag 25· maj 1978 (41) Aim. tilgængelig 2. dec. 1978 (44) Fremlagt 1 6. aug. 1982 (86) International ansøgning nr.
(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag (62) Stamansøgning nr.
(30) Prioritet 1. Jun. 1977* 802499, US
(71) Ansøger PFIZER INC., New York, US.
(72) Opfinder Walter Daniel Celmer, US: Walter Patrick Cullen, US: Charles
Edward Moppett, US: John Broderick Routlen, US: m. fl.
(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Boutard.
(54) Fremgangsmåde til fremstilling af et antibioticum kaldet For= hindels e 46192.
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt antibioticum, kaldet Forbindelse 46192, tilhørende gruppen af svovlholdige polypeptider. Denne familie af antibiotica inkluderer thiostrepton (Antibiotics Ann., 1955-1956, 554-559); siomy-jq cin (J. Antibiotics, 14:255, 1961); A-59 (J. Antibiotics, Al4:194, v) 1961); thiopeptin (j. Antibiotics, 23:113-119, 1970); og sporan- -O giomycin (J. Antibiotics, 21:525-531, 1968).
tal) S)
Det har ifølge opfindelsen vist sig, at dette hidtil ukendte antibioticum produceres af enhver af to stammer af en hidtil ukendt ^ underart af Streptosporangium under submerse aerobe betingelser 2 145063 i vandige næringsmedier, og i overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i .kravets kendetegnende del anførte.
Forbindelse 46192 er aktiv overfor en række forskellige mikroorganismer og har den virkning at forbedre fodereffektiviteten hos drøvtyggere.
De antibioticumproducerende mikroorganismer, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er isoleret fra jordprøver i Canada og Frankrig og fandtes ved undersøgelse at have de morphologis-ke træk, som er karakteristiske for en Strep tosporangium. Denne slægt skelnes fra andre tilhørende gruppen af actinomyceter ved dannelsen af snoede kæder af runde til elliptiske sporer indeholdt i sporangier og dannelsen af luftmycelium på kulturens overflade.
De to stammer af Streptosporangium, Pfizer F.D. 25824 og Pfizer F.D. 25898, er blevet deponeret i The American Type Culture Collection, Rockville, Md. under accessionsnumrene ATCC 31265 og ATCC 31266.
Begge kulturer blev præpareret til udplantning på medier ved den metode, som er beskrevet i Inter. Jr. Sys. Bacteriology 16(3):322, 1966. Inkubationstemperaturen var 28°C. Aflæsninger af resultater blev foretaget ved intervaller op til 21 dage. Kulturernes farver blev bestemt ved sammenligning med mærkater fra the Color Harmony Manual, fourth edition, såvel som personlige beskrivende vendinger.
De til karaterisering af kulturerne anvendte identifikationsmedier og referencer for deres sammensætning er som følger: 1. Trypton - gærekstrakt - væske (ISP No. 1 - Difco) 2. Gærekstrakt - maltekstrakt - agar (ISP No. 2 - Difco) 3. Havremel - agar (ISP No. 3 - Difco) 4. Uorganiske salte - stivelse - agar (ISP No. 4 - Difco) 5. Glycerol - asparagin - agar (ISP No. 5 - Difco) 6. Pepton - gærekstrakt - jern - agar (ISP No. 6 - Difco) 7. Tyrosin - agar (ISP No. 7 - Difco) 5 U50B3 8. Dextrose - nitrat-væske - S.A. Waksman, The Actinomyceres, vol. 2, medium 1, side 328, 1961, med 3 g dextrose i stedet for 30 g sucrose og agar udeladt.
9. Organisk nitrat - væske - R.E. Gordon and J.M. Mihm. Jr. Bac 73: 15-27, 1957.
10. Gelatine - Ibid.
11. Stivelse - Ibid.
12. Skummetmælk - Difco.
13. Ledningsvand - agar.
14. Glucose - asparagin - agar - S.A. Waksman, op. clt. medium 2, side 328.
15. Czapek - sucrose - agar - Ibid, medium 1, side 328.
16. Emerson’s agar - Ibid, medium 28, side 331.
17. Næringsagar - Ibid, medium 14, side 330 18. Calciummalat - agar - S.A. Waksman, Bact. Rev. 21:1-29, 1957.
19. Cellulose a) H.L. Jensen, Proc. Linnean Soc. N.S. Wales 55:231-248, 1930 b) M. Levine and H.W. Schoenlein, A Compilation of Culture Media, medium 2511, 1930.
20. Carbohhydrater - G.M. Luedemann and B.C. Brodsky, Antimicrobial Agent and Chemotherapy 1964: 47, 1965.
Kulturerne blev karakteriseret som følger: Gærekstrakt - maltekstrakt - agar - Vækst moderat til god, hævet, farveløs til lyst rødlig (6 1/2 gc og 6 1/2 le) med hvidt luftmycelium, som bliver lyserødt i løbet af 21 dage; underside hvid til lyserød; blegt lyserødt opløseligt pigment i løbet af 21 dage.
Havremel - agar - Vækst ringe til moderat, flødefarvet til blegt lyserød (6 ca) viser sig som små isolerede kolonier med fløjlsagtig overflade, luftmycelium kontinuert hele vejen eller ringlignende; underside flødefarvet til blegt lyserød; blegt lyserødt opløseligt pigment.
Uorganiske salte - stivelse - agar - Vækst ringe til moderat, blegt lyserød eller farveløs (5 ca til 6 ca), luftmycelium ringlignende; underside som overfladen; intet opløseligt pigment.
*· U5063
Glycerol - asparagin - agar - Vækst ringe, små isolerede prikker, hvid; underside farveløs til flødefarvet; intet opløseligt pigment,
Czapek - sucrose - agar - Vækst ringe, blegt lyserød (6 ca) til hvid, små isolerede prikker; underside hvid; intet opløseligt pigment.
Glucose - asparagin - agar - Vækst ringe til moderat, hvid, svagt hævet, glat med lidt luftmycelium; undersiden har samme farve som overfladen; intet opløseligt pigment.
Næringsagar - Vækst ringe til moderat, blegt gullig, hævet, svagt rynket, med lidt hvidt eller intet luftmycelium; undersiden har samme farve som overfladen; intet opløseligt pigment.
Emerson's agar - Vækst moderat, blegt gullig, stærkt hævet, rynket, intet luftmycelium eller små områder med hvidt luftmycelium; undersiden har samme farve som overfladen; intet opløseligt pigment.
Stivelse - agar - Vækst moderat til god, hvid til blegt grålig, hævet, rynket, intet luftmycelium; underside brunlig (4 le); blegt lyserødt opløseligt pigment.
Gelatine - Vækst moderat, hvid,svagt hævet, rynket; tinderside gullig brun (3 ic); meget blegt lyserødt til intet opløseligt pigment.
Calciummalat - agar -Vækst ringe, hvid til blegt lyserød (nær 6 ca) viser sig som små isolerede prikker; underside farveløs; intet opløseligt pigment.
TyroSin - agar - Vækst ringe til moderat, hvid til blegt lyserød, viser sig som små isolerede prikker; lyserødt opløseligt pigment.
Ledningsvand - agar - Hvide til blegt lyserøde små prikker; undersiden har samme farve som overfladen; intet opløseligt pigment.
5 145063
Snorangier og sporer (fra Czapek sucrose - agar) - Sporangier mfest runde, 6,5-10 (mest 7-8) ^mi i diameter, på lange 3-14 μτπ. spor-angiophorer; sporer runde til bredt elliptiske, mest 2,2 x 1,6 pm, men varierende fra 1,6-2,7 x 1,1-1,2 μτα, eller runde, 2,2 um i diameter; ikke-motile.
Biokemiske egenskaber - Der produceres intet melanin; intet HgS; gelatine smeltes; stivelse hydrolyseres meget svagt; nitrater reduceres; vækst på Jensens cellulose, men ingen nedbrydning og ingen vækst på Levine og Schoenleins cellulose; ingen virkning på mælk; calciummalat hydrolyseres ikke.
Carbonudnyttelse - Udnyttes: glucose, cellobiose, fructose, galactose, inositol, mannose, rhamnose, ribose, stivelse, trehalose, xylose; udnyttes ikke: adonitol, arabinose, dulcitol, glycerol, lactose, mannitol, melezitose, raffinose, sorbitol, sorbose, saccharose; variabelt for de to stammer: melibiose, salicin.
De to kulturer blev også dyrket på nogle få medier som skitseret af J.N. Couch, Jr. Elisha Mitchell Soc. 79:53-70 1963 og også prøvet for vækst ved forskellige temperaturer på ATCC medium No. 172.
Resultaterne var som følger:
Czapek - sucrose - agar - Kolonier 8-11 mm brede i løbet af 4-5 uger, flade, tynde, med frynsede radiale linier af lyserødt luftmycelium ved kanten eller med krans af undertrykt blegt lyserødt mycelium; luftmycelium Hydrangea Pink til Pale Congo Pink (Ridgway).
Pepton - czapek - agar - Kolonier 10-15 mm brede, flade til svagt hævede, lidt ru i den centrale del, men med flad ydre del, kant regelmæssig, mest nøgen, Olive Buff til Pale Olive Buff (Ridgway), noget hvidt luftmycelium nær kanten; opløseligt pigment meget blegt lyserødt til lyserødt-vinrødt.
Kartoffel - dextrose - agar - Kolonier 10-15 mm brede, hævede, noget ru, dækket med hvidligt til lyserødt luftmycelium (Pale Congo Pink - Ridgway), kanten hel; lysebrunt opløseligt pigment.
6 145063
Emerson1 s agar - Kolonier 12-17 mm brede; hævet mærkbart, uregelmæssigt ru over hele overfladen, kanten uregelmæssig, nøgen, farven nær Deep Olive Buff (Ridgway).
Temperaturforhold
42°C 37°C 28°C 21°C
ingen vækst god vækst god vækst god vækst
De to hidtil ukendte kulturer af Streptosporangium blev sammenlignet med de nært beslægtede Streptosporangium roseum ATCC 12428 og S. vulgare subsp. antibioticum ATCC 21906. De to hidtil ukendte kulturer fandtes at være forskellige fra S. vulgare subsp. antibioticum ATCC 21906, men at ligne S. roseum ATCC 12428 i mange henseender. På ISP medium 2, ISP medium 3, ISP medium 5» tyrosin-agar, Czapek-sucrose-agar, Czapek-pepton-agar, Emerson's agar, næringsagar, ledningsvand-agar, kartoffel-gulerod-agar og calciumma-lat-agar lignende kolonierne af de to hidtil ukendte kulturer meget nær kolonierne af S. roseum. De to hidtil ukendte kulturer og S. roseum viste positiv stivelseshydrolyse, positiv gelatinesmeltning, positiv nitratreduktion, negativ melaninproduktion, negativ cellulosenedbrydning og det samme område for væksttemperatur. Størrelsen og formen af sporangier og sporangio;sporer hos de tre kulturer var identisk. Udnyttelsesmønsteret for 7 carbonhydrater var ens hos de tre kulturer.
Kolonierne af de to hidtil ukendte kulturer var forskellige fra kolonierne af S. roseum på kartoffel-dextrose-agar og stivelse-agar og var lidt forskellige herfra på ISP medium 4, glucose-asparagin-agar og gelatine-agar.
Streptosporangium roseum udnyttede arabinose, medens de to hidtil ukendte kulturer ikke gjorde det.
Det blev konkluderet på basis af kulturmæssige, morphologiske og sammenligningsdata, at de to hidtil ukendte kulturer ikke kan skelnes fra hinanden og repræsenterer en ny underart af Streptosporangium roseum. På grund af deres lyserøde farve er det foreslåede navn for de to hidtil ukendte kulturer Streptosporangium roseum subsp. incamatum Routien subsp. nov.
7 145063
Dyrkning af Streptosporangium-kulturerne finder fortrinsvis sted i næringsmedier ved en temperatur på 28-36°C og under submerse aerobe betingelser med omrøring. Næringsmedier, som er nyttige til sådanne formål, inkluderer en kilde for assimilerbart carbon, såsom sukkerstoffer og stivelse, en kilde for organisk nitrogen, såsom casein, enzymatisk nedbrudt casein, soyabønnemel, bomuldsfrømel, jordnøddemel og hvedegluten. En kilde for vækststoffer, såsom distillers solubles, fiskemel og gærekstrakt, så vel som salte, såsom natriumchlorid og calciumcarbonat, og spormineraler, såsom jern, magnesium, zink, cobalt og mangan, kan også udnyttes med fordelagtige resultater. Hvis der opstår overdreven skumning under gæringen, kan der sættes antiskummemidler, såsom vegetabilske olier eller siliconer til gæringsmediet. Luftning af mediet i tanke til submers vækst opretholdes fortrinsvis med en hastighed på omkring 1/2 til 2 voluminer fri luft per volumen væske per minut. Omrøring kan opretholdes ved hjælp af omrørere, som alment er af den art, der anvendes inden for gæringsindustrien. Aseptiske betingelser må selvfølgelig opretholdes under overførslen af organismen og under dens vækst.
Podematerialet til fremstilling af Forbindelse 46192 kan opnås ved anvendelse af vækstmateriale fra et skråsubstrat af kulturen på et medium, såsom ATCC medium 172 (ATCC Catalogue, 10th edition, side 235, 1972). Vækstmaterialet kan anvendes til at pode enten rystekolber eller podetanke, eller alternativt kan podetankene podes fra rystekolbeme. Væksten i rystekolber vil almindeligvis have nået sit maksimum på omkring 4 dage, medens podematerialet i submerse podetanke sædvanligvis vil være i den mest favorable periode på 2-3 dage. Væsentlig antibiotisk aktivitet opnås i det endelige fermentor trin på fra omkring 72 til omkring 120 timer.
Antibioticumproduktionen følges hensigtsmæssigt under gæringen ved biologisk prøvning af væksten under anvendelse af en følsom stamme af Staphylococcus aureus. Der anvendes' standard-pladeprøvningsteknik, hvorved inhiberingszonen omkring en filterpapirskive mættet med væsken anvendes som et mål for antibiotisk styrke. Efter at gæringsvæsken har nået et ønsket niveau af antibiotisk styrke, isoleres antibioticunmet fra enten hele væsken eller den filtrerede væske. I det sidstnævnte tilfælde fjernes myceliet ved 8 145063 filtrering eller centrifugering. Forskellige typer udstyr, såsom filterpresser, centrifuger osv., kan anvendes.
Tyndtlags-chromatografi under anvendelse af silicagel er et nyttigt redskab til analyse af Forbindelse 46192 produceret sammen med et antal mindre betydende antibiotiske komponenter i gæringsmedier og sammensætningen af rå og rensede materialer extraheret fra gæringsvæsker. Adskillelsen af komponenterne i den antibiotiske blanding er i vigtig grad afhængig af systemets antibioticum-indhold. For lidt antibiotisk styrke fører til, at mindre betydende antibiotiske komponenter ikke afsløres; for megen antibiotisk styrke resulterer i en medslæbsvirkning, som fører til for dårlig adskillelse.
Udviklingssystemet for tyndtlags-chromatografi er chloroform/ace-tone' i volumenforholdet 3:1. De antibiotiske stoffer kan synliggøres ved udsættelse for 254 nm lys, sprøjtning med vand for at finde vandafvisende pletter eller overhældning med agar podet med en følsom stamme af Staphylococcus aureus.
Komponenterne i den antibiotiske blanding kan adskilles og udvindes fra gæringsvæsken ved opløsningsmiddelextraktion, modstrømsfordeling, adsorption, søjlechromatografi eller kombinationer deraf.
De antibiotiske stoffer kan extraheres fra hel væske ved et pH område på 4,0-10,0 under anvendelse af et organisk opløsningsmiddel, såsom butanol, pentanol, ethylacetat, methylisobutylketon og andre beslægtede med vand ublandbare opløsningsmidler. Opløsningsmidlet koncentreres derpå under vacuum, og de antibiotiske stoffer udfældes ved tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel, såsom n-heptan.
En metode til udskillelse og udvinding af Forbindelse 46192 er som følger: Hel gæringsvæske indstillet til pH ca. 5,0 med 50% svovlsyre extraheres med methylisobutylketon. Opløsningsmidlet fjernes i vacuum. Det mørke olieagtige koncentrat udrives med hep-tan, diethylether og endelig med ethylacetat. Det resulterende faste stof opløses derpå i methanol og udfældes ved afkøling til opnåelse af et næsten hvidt pulver. En portion af dette pulver opløst i chloroform chromatograferes på silicagel, fortrinsvis "si- 9 145063 lica gel 60" (forhandlet af E. Merck, Darmstadt, BRD) og elueres med chloroform indeholdende stigende mængder af methanol op til et maksimum på 3% methanol-97% chloroform. Disse fraktioner, som er rige på Forbindelse 46192, renses yderligere ved præparativ tyndtlags-chromatografi ("silica gel PF-254" forhandlet af E.
Merck, Darmstadt, BRD) udvikles og elueres med ethylacetat. Forbindelse 46192 krystalliserer fra methanol. Alle trin i rensningssekvensen kontrolleres ved tyndtlags-chromatograf i ( "Analtech silica gel Gf", chloroform/acetane, 3:1). Forbindelse 46192 synliggøres ved (a) udsættelse for 254 nm ultraviolet lys, (b) biooverlag under anvendelse af en agarsuspension indeholdende en følsom stamme af Staphylococcus aureus eller (c) sprøjtning med vand for at finde vandafvisende pletter.
Den krystallinske form af Forbindelse 46192 har et smeltepunkt på 210-216 °C, er opløselig i chloroform, ethylacetat og methylisobutylketon og uopløselig i heptan, har absorp- tionsmaxima i ethanol i spektrets ultraviolette område ved 1 % 238 og 300-305 , nm med E. værdier på henholdsvis 350 og s jc x cm 80, har den gennemsnitlige vægtmæssige sammensætning 48,49% carbon, 5,05% hydrogen, 13,03% nitrogen, 10,88% svovl og 22,55% oxygen (som forskel), har en optisk drejning på [a] = -129° ved en koncentration på 1% i chloroform og ud viser, pelleteret i KBr, karakteristisk absorption i det infrarøde område ved de følgende bølgelængder i pm: 2,97, 5,77, 6,02, 6,30, 6,6-6,75, 7,25, 8,25, 9,75 og 11,20.
Forbindelse 46192 er aktiv overfor en række forskellige Gram-positive bakterier som belyst i tabel I.
TABEL I
Organisme Minimal inhiberende koncentration - -(«κ/ml)__
Staphylococcus aureus sp. <0,10
Bacillus subtilis <0,10
Streptococcus pyogenes <0,10
Streptococcus faecalis <0,10
Clostridium sp. <0,12-3,12 10 145063
Signifikant beskyttelse ydes mus, som er eksperimentelt inficeret med Staphylococcus aureus 01A005, af Forbindelse 46192 i doser på 50-200 mg/kg og en oral dosis på 200 mg/kg.
Rå antibiotiske blandinger, såsom de der opnås direkte fra væsken eller i ethvert af de mellemliggende udvindingstrin, såvel som renset Forbindelse 46192 kan anvendes til behandling af antibio-ticum-følsomme infektioner hos mennesker og dyr i parenterale doser på 200 til 1000 mg, afhængigt af infektionens type og alvor og det behandlede individs vægt. Opløsninger af Forbindelse 46192 i sesamolie, jordnøddeolie og/eller propylenglycol i koncentrationer på 200-500 mg/ml kan anvendes til subcutan eller intramuskulær indgivning. Forbindelsen kan også indgives til dyr med dets foder bestående af sædvanlige foderingredienser, såsom majs og sojabønne-mel.
Virkningen af vækstfremmende midler i dyrefoder er almindeligvis blevet bestemt ved direkte dyrefodring. GB patentskrift nr. 1 197 826 beskriver i detaljer en in vitro teknik til bestemmelse af mulig vækstfremmende aktivitet hos drøvtyggere. Prøvningsmetoden indebærer anvendelsen af et apparat, hvori drøvtyggernes fordøjelsesprocesser gennemføres og studeres in vitro. Dyrefoderet, vommateriale og forskellige vækstfremmende midler indføres i og udtages fra en laboratorieenhed under omhyggeligt kontrollerede betingelser, og de ændringer der finder sted studeres kritisk og fortløbende, medens den mikrobielle flora i vomindholdet forbruger foderet. En forøgelse i propionsyreindholdet i vomvæsken viser, at det vækstfremmende middel i fodersammensætningen har medført en ønsket reaktion i vommens samlede funktion. Ændringen i propionsyreindholdet udtrykkes som procent af det propionsyreindhold,som findes i kontrolvomvæsken. Langvarige in vivo foderundersøgelser anvendes til at vise en pålidelig korellation mellem propionsyre-forøgelse i vomvæsken og forbedret virkning på dyr.
Vomvæske opsamles fra en fistuleret ko, som fodres på en kommerciel opfedningsration plus hø. Vomvæsken filtreres umiddelbart igennem et osteklæde, og 10 ml sættes til en 50 ml konisk kolbe indeholdende 400 mg standard substrat (68% majstivelse + 17% cellulose + 15% extraheret sojabønnemel), 10 ml af en pH 6,8 puffer og prøve- 145063 11 forbindelsen. Kolberne gennemskylles med oxygenfrit nitrogen i omkring 2 minutter og inkuberes i et rystevandbad ved 39°C i omkring 16 timer. Alle prøvninger gennemføres tredobbelt.
Efter inkubering blandes 5 ml af prøven med 1 ml 25% metaphosphor-syre. Efter 10 minutter tilsættes 0,25 ml myresyre, og blandingen centrifugeres ved 1500 omdr./min. i 10 minutter. Prøver analyseres derpå ved gas-væske-chroma tograf i ifølge den metode, som er beskrevet af D.W. Kellog i J. Dairy Science 52, 1690 (1969). Maksimumshøjder for eddikesyre, propionsyre og smørsyre bestemmes for prøver fra ubehandlede og behandlede inkubationskolber. Resultaterne er anført i tabel II.
TABEL II
Koncentration af for- Propionsyre (%) * bindelse 46192 (ppm) _ 20 165 10 159 5 163 * Ubehandlet kontrol = 100% På basis af disse data kan det udledes, at forbedret foderudnyttelse hos drøvtyggere, såsom kvæg og får, og enmavede dyr, såsom heste, svin og kaniner, vil opnås ved indførelse af Forbindelse 46192 i dyrefoder. Foruden ren Forbindelse 46192 og den rå isolerede forbindelse kan tørret gæringsvæske indeholdende Forbindelse 46192 inkorporeres i fodersammensætninger i den ønskede koncentration.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved de efterfølgende eksempler.
EKSEMPEL I
U5063 12
Der fremstilles et sterilt vandigt medium med den følgende sammensætning:
Ingrediens Gram/liter
Glucose 10
Stivelse 20
Enzymatisk nedbrudt casein 5
Dikaliumhydrogenpho sphat 0,5
Cobaltchlorid 0,002
Calciumcarbonat 4 Kødmel 5 Gærekstrakt 5 pH 7,1-7,2
Celler fra en skråkultur af S. roseum subsp. incamatum ATCC 31265 på ATCC medium 172 overføres til en række 300 ml kolber, som hver indeholder 50 ml af dette medium, og kolberne rystes på en rotationsryster i 3-4 dage ved 28-30°C. Aliquote'r af dette vækstmateriale overføres til 300 ml kolber, som hver indeholder 100 ml af det ovennævnte sterile medium. Efter rystning i 3-4 dage. ved 28-30°C overføres 5-10 volumenpro cent af dette podemateriale til en 4 liters fermentor indeholdende 2 liter af det følgende sterile medium:
Ingrediens Gram/liter
Glucose 20
Sojamel 30
Majsstøbevand 5 ml
Cobaltchlorid 0,002 pH 6,9-7,1 Gæringen gennemføres i 70-120 timer ved 30°C under omrøring ved 1700 omdr./min. og luftning med omkring et volumen luft per volumen væske per minut. Hele væsken extraheres to gange med det halve volumen methylisobutylketon efterfulgt af indstilling af pH-vær-dien til 5,0 med 50% svovlsyre. De kombinerede opløsningsmiddelekstrakter koncentreres i vacuum, og den antibiotiske aktivitet 13 U5063 udfældes ved tilsætning af flere volumener n-heptan. Det faste stof opsamles ved filtrering eller centrifugering.
EKSEMPEL II
Fremgangsmåden fra eksempel I kan gentages med tilsvarende resultater under anvendelse af Streptosporangium roseum subsp. incarna-tum ATCC 31266 i stedet for Streptosporangium roseum subsp. incar-natum ATCC 31265 og et gæringsmedium med den følgende sammensætning:
Ingrediens Gram/liter
Glucose 10
Stivelse 20 Gærekstrakt 5
Enzymatisk nedbrudt casein 5
Cobaltchlorid 0,002
Calciumcarbonat 1 pH 6,9-7,1
Hele gæringsvæsken inddampes til tørhed, fortrinsvis ved sprøjtetørring.
EKSEMPEL III
En gæring i stor målestok blev gennemført under anvendelse af podematerialet og produktionsmediet fra eksempel I. En 190 liters' fermentor indeholdende 95 liter af produktionsmediet fra eksempel I blev podet med 5 volumenprocent podemateriale af S. roseum subsp. incarnatum ATCC 31265 og derpå kørt i 5 dage ved 30°C med en luftningshastighed på 1 volumen luft per volumen væske per minut.
95 liter hel gæringsvæske blev extraheret med 30 liter methyliso-butylketon efter indstilling til pH 5 med 50% svovlsyre. Opløsningsmidlet blev fjernet i vacuum og efterlod en mørk olie. Denne blev udrevet i rækkefølge med 250 ml heptan, 50 ml diethylæter og derpå med 25 ml ethylacetat. Det resulterende faste stof blev derpå opløst i methanol og udfældet ved afkøling til opnåelse af 1,77 g af et næsten hvidt pulver. En portion af dette pulver (1,50 g) 145063 14 blev opløst i chloroform og chromatograferet på en søjle indeholdende tilnærmelsesvis 230 g "silica gel 60" under udvikling og e-luering med chloroform indeholdende stigende mængder af methanol op til et maksimum på 3% methanol/97$> chloroform. De fraktioner, som var rige på Forbindelse 46192, blev yderligere renset ved præparativ tyndtlags-chromatografi under anvendelse af "silica gel PF254"‘ materiale, som blev opnået ved eluering med ethylace-tat, blev krystalliseret fra methanol, smp. 210-216°C.
Forbindelse 46192 er opløselig i chloroform, ethylacetat og methyl-isobutylketon, delvis opløselig i methanol og uopløselig i heptan.
Fuldstændig sur hydrolyse af Forbindelse 46192 viser tilstedeværelsen af threonin og flere uidentificerede aminosyrer. ^C-NMR-spektret (CDCl-^) antyder tilstedeværelsen af omkring 73 carbonatomer.
Analyse giver de følgende procentforhold:
Carbon 48,49
Hydrogen 5,05
Nitrogen 13,03
Svovl 10,88
Oxygen (som forskellen) 22,55
Forbindelse 46192 er optisk aktiv med en drejning på [a]^ = -129^ (c = 1,0, chci3).
De ultraviolette absorptionsmaxima i ethanol er som følger: j^max 238 350 300-305gk nm E1 cm 80
Forbindelse 46192's infrarøde spektrum er vist på tegningen. En kali-umbromidpille viser karakteristisk absorption i det infrarøde område ved de følgende bølgelængder i jam: 2,97, 5,77, 6,02, 6,30, 6,6-6,75, 7,25, 8,25, 9,75 og 11,20.
DK232078A 1977-06-01 1978-05-25 Fremgangsmaade til fremstilling af et antibioticum kaldet forbindelse 46192 DK145063C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US05/802,499 US4083963A (en) 1977-06-01 1977-06-01 Polypeptide antibiotic produced by a new subspecies of streptosporangium
US80249977 1977-06-01

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK232078A DK232078A (da) 1978-12-02
DK145063B true DK145063B (da) 1982-08-16
DK145063C DK145063C (da) 1983-01-17

Family

ID=25183867

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK232078A DK145063C (da) 1977-06-01 1978-05-25 Fremgangsmaade til fremstilling af et antibioticum kaldet forbindelse 46192

Country Status (18)

Country Link
US (1) US4083963A (da)
JP (1) JPS543001A (da)
AR (1) AR215308A1 (da)
AU (1) AU3600378A (da)
BE (1) BE867443A (da)
CA (1) CA1096796A (da)
DE (1) DE2823207A1 (da)
DK (1) DK145063C (da)
FI (1) FI781570A7 (da)
FR (1) FR2393007A1 (da)
GB (1) GB1554838A (da)
GT (1) GT197852447A (da)
IE (1) IE46977B1 (da)
IT (1) IT1156774B (da)
LU (1) LU79715A1 (da)
NL (1) NL177326C (da)
PH (2) PH13972A (da)
ZA (1) ZA783025B (da)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2825618A1 (de) * 1977-06-23 1979-01-11 Sandoz Ag Neue antibiotika, ihre herstellung und verwendung
JPS58118622U (ja) * 1982-02-05 1983-08-12 東京特殊電線株式会社 スパイラルコ−ド
US4613503A (en) * 1984-10-11 1986-09-23 The Dow Chemical Company Antibiotic A26201-1 and antibiotic A26201-2 produced by a novel strain of actinoplanes
US4859599A (en) * 1984-10-11 1989-08-22 The Dow Chemical Company Antibiotic A26201-1 and antibiotic A26201-2 produced by a novel strain of actinoplanes
US4785078A (en) * 1985-04-18 1988-11-15 Pfizer Inc. Transformation product of thiosporamicin

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3857936A (en) * 1971-05-26 1974-12-31 Upjohn Co Melinacidin
GB1423628A (en) * 1973-05-25 1976-02-04 Lepetit Spa Antibiotics
US4031206A (en) * 1976-02-04 1977-06-21 Pfizer Inc. Antibiotics produced by species of pseudonocardia

Also Published As

Publication number Publication date
GT197852447A (es) 1979-11-17
IT7849558A0 (it) 1978-05-25
IE781043L (en) 1978-12-01
FI781570A7 (fi) 1978-12-02
PH13972A (en) 1980-11-20
DE2823207A1 (de) 1978-12-14
BE867443A (fr) 1978-11-27
IE46977B1 (en) 1983-11-16
PH15758A (en) 1983-03-18
DK145063C (da) 1983-01-17
US4083963A (en) 1978-04-11
CA1096796A (en) 1981-03-03
LU79715A1 (fr) 1979-02-02
NL177326C (nl) 1985-09-02
JPS543001A (en) 1979-01-11
AR215308A1 (es) 1979-09-28
NL7805305A (nl) 1978-12-05
GB1554838A (en) 1979-10-31
NL177326B (nl) 1985-04-01
DK232078A (da) 1978-12-02
IT1156774B (it) 1987-02-04
FR2393007A1 (fr) 1978-12-29
FR2393007B1 (da) 1981-06-26
AU3600378A (en) 1979-11-15
JPS5632318B2 (da) 1981-07-27
ZA783025B (en) 1979-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0000258B1 (en) Polycyclic ether antibiotics, process for producing them and animal feed compositions containing them
EP0169011B1 (en) New polycyclic ether antibiotics
CA1337803C (en) Antibiotic produced by fermentation with amycolatopsis orientalis
US4229535A (en) Method for preparing multhiomycin
CA1142107A (en) Streptomyces metabolite
FI71950C (fi) Foerfarande foer framstaellning av ett nytt polycykliskt eterantibiotikum genom odling av stammen streptomyces halstedii atcc 31812.
FI92411C (fi) Menetelmä polysyklisen eetteriantibiootin valmistamiseksi
US5147858A (en) Acidic polycyclic ether useful as an anticoccidial agent and as a growth promotant
US4083963A (en) Polypeptide antibiotic produced by a new subspecies of streptosporangium
CN1057562C (zh) 制备马杜拉放线菌属新菌株的方法
EP0001720B1 (en) A polycyclic ether antibiotic, process for producing it and its use for improving feed utilisation in animals
DK167816B1 (da) Glycopeptid antibiotikum, farmaceutisk acceptable kationssalte heraf, og fremgangsmaade til fremstilling deraf, fodermidler indeholdende dette antibiotikum og fremgangsmaade til at oege dyrs vaekst/foderudnyttelse under anvendelse af fodermidlet samt biologisk ren kultur af naevnte antibiotikumproducerende stamme
KR930007383B1 (ko) 산성 폴리사이클릭 에테르 항생물질을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 산성 폴리사이클릭 에테르 항생물질을 생산하는 방법
US5891727A (en) Acidic polycyclic ether useful as an anticoccidial agent and as a growth promotant
KR930007384B1 (ko) 산성 폴리사이클릭 에테르 항생물질
DK144765B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af en antibiotisk blanding indeholdende orbindelse 41043 og forbindelse 41494, eller de enkelte komponenter i blandingen

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed