DK145382B - Fremgangsmaade til fremstilling af beta-lactamantibiotika kaldet ps-6 og ps-7 eller salte eller estere deraf - Google Patents

Fremgangsmaade til fremstilling af beta-lactamantibiotika kaldet ps-6 og ps-7 eller salte eller estere deraf Download PDF

Info

Publication number
DK145382B
DK145382B DK454378AA DK454378A DK145382B DK 145382 B DK145382 B DK 145382B DK 454378A A DK454378A A DK 454378AA DK 454378 A DK454378 A DK 454378A DK 145382 B DK145382 B DK 145382B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
antibiotic
substrate
yellow
solution
culture
Prior art date
Application number
DK454378AA
Other languages
English (en)
Other versions
DK454378A (da
DK145382C (da
Inventor
K Okamura
S Hirata
Y Okumura
Y Fukagawa
Y Shimauchi
T Ishikura
K Kouno
J Lein
Original Assignee
Sanraku Ocean Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP12185777A external-priority patent/JPS5459295A/ja
Priority claimed from JP16042477A external-priority patent/JPS5492983A/ja
Application filed by Sanraku Ocean Co filed Critical Sanraku Ocean Co
Publication of DK454378A publication Critical patent/DK454378A/da
Publication of DK145382B publication Critical patent/DK145382B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK145382C publication Critical patent/DK145382C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D477/00—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring
    • C07D477/10—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
    • C07D477/12—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6
    • C07D477/16—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6 with hetero atoms or carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 3
    • C07D477/20—Sulfur atoms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

(19) DANMARK V^/
^ (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 145382B
DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET
(21) Ansøgning nr. 4543/78 (51) IntCI* C 12 P 17/18 (22) Indleveringsdag 12. okt. 1978 C 07 D 487/04 (24) Løbedag 12. okt. 1978 (41) Aim. tilgængelig 14. apr. 1979 (44) Fremlagt 8. nov. 1982 (86) International ansøgning nr.
(86) International indleveringsdag (85) Videreføreisesdag -(62) Stamansøgning nr. -
(30) Prioritet 13. okt. 1977, 121857/77, JP 29. dec: 1977, 160424/77, JP
(71) Ansøger SANRAKU-OCEAN CO. LTD., Tokyo, JP.
(72) Opfinder Kazuhiko Okamura, JP: Shoji Hirata, JP: Yasushi Oku= tnura, JP: Yasuo Fukagawa, JP: Yasutaka _Shlmauchi, JP: m. fl.
(74) Fuldmægtig ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.
(54) Fremgangsmåde til fremstilling af teta-lactamantibiotika kaldet PS-6 og PS-7 eller salte eller estere deraf.
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte antibiotiske stoffer kaldet PS-6 og PS-7 eller salte eller estere deraf med formlen Ώ R1 2 -yl V yv S-R -NH-CO-CH, X) CH -CH-.-A/ 2 J^-X 3 σ coorj hvor betyder CH-., og R^ betyder -CH--CH»-, eller R^ betyder H, y 2 - 3 * * g og R betyder -CH=CH-, og R betyder hydrogen, en saltdannende kation, alkyl med 1-6 carbonatomer eller triphenylmethyl.
2 145382
Det er kendt, at der findes antibiotika med β-lactamase-hæmmende virkning samt β-lactamasehæmmende midler. Fra beskrivelsen til US patent nr. 3.981.788 (Derwent CPI 19171X) kendes således stofferne MC696-SY2-A og -B, som er blevet isoleret fra dyrkningsvæsker fremkommet ved dyrkning af en MC696-SY2-producerende stamme af slægten Streptomyces. Fra DE offentliggørelsesskrift nr. 2.513.855 (Derwent CPI 67721W) og DE offentliggørelsesskrift nr. 2.513.854 (Derwent CPI 67720W) kendes tillige stofferne MM4550 eller MM13902 isoleret fra en dyrkningsvæske fremkommet ved dyrkning af en MM4550-eller MM13902-producerende stamme hørende til slægten Streptomyces.
Fra DE offentliggørelsesskrift nr. 2.517.316 (Derwent CPI 72840W) kendes endvidere clavulansyre isoleret fra dyrkningsvæsken fremkommet ved dyrkning af Streptomyces clavuligerus. Antibiotiket thienamycin med penicillinlignende kemisk struktur samt derivater deraf er endvidere kendt fra beskrivelsen til US patent nr. 3.950.357 (Derwent CPI 31696X), DE offentliggørelsesskrift nr. 2.652.677 (Derwent CPI 40282Y), beskrivelsen til BE patent, nr. 848.346 (Derwent CPI 34505Y), beskrivelsen til BE patent nr. 848.349 (Derwent CPI 34507), DE offent-liggørelskrift nr. 2.652.680 (Derwent CPI 40283Y), DE offentliggørelsesskrift nr. 2.652.675 (Derwent CPI 40280Y), DE offentliggørelsesskrift nr. 2.652.674 (Derwent CPI 40279Y) og DE offentliggørelsesskrift nr. 2.652.676 (Derwent CPI 40281Y).
I beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 1436/78 er endvidere beskrevet et β-lactamantibiotikum med betegnelsen "PS-5" og med følgende formel ch,-ch2 \ ^,S-CHo-CH,-NH-C0CH, nuf \:ooh
Dette antibiotikum fremstilles ifølge nævnte beskrivelse ved dyrkning af en stamme af arten Streptomyces sp. A271.
Den foreliggende opfindelse angår som nævnt en fremgangsmåde til fremstilling af de hidtil ukendte antibiotika med betegnelserne PS-6 og PS-7 eller ovennævnte derivater deraf, hvilke forbindelser har kraftig antibiotisk virkning, β-lactamasein-hiberende virkning og evne til at frembringe en synergistisk forøgelse af den antibiotiske virkning af penicilliner, cephalospo-riner og lignende forbindelser mod β-lactamasedannere, hvilken 145382 3 fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en stamme af arten Strepto-myces sp. A 271 dyrkes i et næringssubstrat, hvorpå de dannede antibiotika isoleres fra det dyrkede materiale, og, om ønsket, en således vundet forbindelse med formlen (I), hvori betyder hydrogen, omdannes til et salt deraf, eller en vundet forbindelse 3 med formlen (I), hvori R betyder hydrogen, eller en saltdannende kation, esterificeres til dannelse af en forbindelse med formlen 3 (I), hvor R betyder alkyl med 1-6 carbonatomer eller triphenyl-methyl.
Den forbindelse med formlen (I), hvori R1 betyder CH3 og betyder dvs.
CH, I ^ ch3"C\ ^^yS-CH?-CH?-NH-COCH^ C^~^COOH <Ia> betegnes i det følgende som '*antibiotikum PS-6".
1 2
Forbindelsen med formlen (I), hvori R betyder H og R betyder -CH=CH-, dvs.
CH3“CH2v ^S-CH=CH-NH-COCH, ΥίΓ\
QT ^COOH
betegnes i det følgende "antibiotikum PS-7".
Antibiotiket PS-6 og PS-7 samt deres nævnte derivater beskrives mere detaljeret i det følgende.
Antibiotiket PS-6
Antibiotiket PS-6 er karakteriseret ved hjælp af nedenstående fysisk-kemiske egenskaber og biologiske egenskaber:
Fysisk-kemiske egenskaber for antibiotiket PS-6 (1) Papirchromatograf i
Antibiotiket PS-6 (natriumsaltet) giver følgende R^-værdier ved papirchromatografering med nedhængende papir (Toyo Filter Paper NO.50) ved anvendelse af følgende opløsningsmidler: Acetonitril/tris/EDTA (Note 1): Rf=0,41 Ethanol/vand (7/3) : Rf=0,65 4 U5382
Note i: Blandet opløsningsmiddel sammensat af 120 ml acetonitril, 30 ml 1/10 M tris(hydroxymethyl) -aminomethan-saltsyrepuffer (pH-værdi 7,5) og 1 ml 1/10 M vandig natnumethylendiamintetra-acetatopløsning (pH-værdi 4,5).
I nærværende beskrivelse er opløsningsmiddelforholdene udtrykt i rumfang til rumfang, medmindre andet er anført.
(2) Tyndtlagschromatografi (TLC)
Ved tyndtlagschromatografi opnås følgende R£-værdier for antibiotiket PS-6 (natriumsaltet), idet der ved chromatografe-ringen anvendes Chromatogram Sheetl3254 Cellulose (No. 6065) fra firmaet Eastman Kodak Co., Ltd. og følgende fremkalderopløsningsmidler: n-Butanol/ethanol/vand (4/1/5) (øvre lag) : Rf=0,67 n-Propanol/vand (8/2) : Rf=0,69 n-butanol/i-propanol/vand (7/7/6): R^=0,7 0 Acetonitril/vand (8/2) : Rf=0,63 (3) Højspændingspapirelektroforese Når antibiotiket PS-6 (natriumsaltet) underkastes elektro-forese på Toyo Filter Papir No. 50 under anvendelse af et højspændingspapirelektrof oreseapparatur fra firmaet Savant Instrument Inc.
(High Voltage Power Supply HV 3000 A, Flat Place Electrophoresis Chamber FP 18A) konstateres følgende opførsel i en pufferopløsning af nedenstående sammensætning og pH-værdi.
Antibiotiket migrerer over en afstand på mindst 5 mm, sædvanligvis 10-40 mm mod anoden ved gennemiedning af en strøm i 30 minutter med en potentialgradient på 42 volt/cm i en puffer (pH-værdi 8,6) sammensat af 3000 ml vand, 3,3 g barbital og 25,5 g natriumbarbital.
(4) Opførsel over for β-lactamase
Virkningen inaktiveres af β-lactamase fra Bacillus cereus.
(5) Syre-baseegenskaber
Antibiotiket PS-6 er en Usyret syre med £n carboxylgruppe i molekylet.
(6) UV-absorptionsspektrum
Antibiotiket PS-6 (natriumsaltet) udviser et karakteristisk UV-absorptionsmaksimum ved v H2° A = ca. 300 rim
ItlclX
5 U5382 (7) IR-absorptionsspektrum
Antibiotiket PS-6 (natriumsaltet) udviser nedenstående karakteristiske IR-absorptionsmaksima målt i KBr-tablet: ca. 1760 cm-1 (-C0- i β-lactamring) ca. 1660 cm'1 (-CO- i amid) ca. 1600 cm'1 (-C00®) (8) Proton NMR-spektrum
Antibiotiket PS-6 (natriumsalt) giver følgende karakteristiske signaler i 100 MHz proton NMR spektret målt i tungt vand (D20): (i) et par dubletter centreret ved ca. 0,94 og 0,98 ppm med koblingskonstanter på ca. 7,0 Hz ( Cfr^CH") CH3^ (ii) en skarp singlet ved ca. 1,92 ppm (CH3-C0-) (iii) en multiplet ved ca. 2,40-3,50 ppm (-CH2-CH-)
(iv) en mulitplet ved ca. 3,90-4,20 ppm N
(-CH-) (9) Molekylvagt
Ud fra resultater fra højopløsningsmassespektrometri for methylesteren af antibiotiket PS-6 bestemmes molekylvægten til ca. 312.
(10) Farvereaktion
Reaktion med Ehrlich-reagens: positiv
Reaktion med iod-chlorplatinsyre: positiv
Reaktion med ninhydrin: negativ (11) Opløselighed
Antibiotiket PS-6 er opløseligt i vand ved pH 6-9, men er praktisk taget uopløseligt i benzen, acetone og ethylacetat.
Ovennævnte fysisk-kemiske egenskaber viser klart tilstede- CH, N \_/
I 3 II
værelsen af grupperne CH3~CH-, CH3CO-, -CH2-, -CH-, -CH-, Q^[ _ -NHCO- og -C00® i antibiotiket PS-6 (natriumsålt)<
Ud fra UV-absorptionsmaksimet og ændringen af UV-absorp-tionsmaksimet fra 300 nm til 316 nm som følge af esterificeringen 6 145382 af antibiotiket, som omtales nærmere i det følgende, antages det, at antibiotiket PS-6 har et thienamycinskeiet (jfr. beskrivelsen til US patent nr. 3.950.357) omfattende en svovlsidekæde svarende til det ovenfor omtalte antibiokum PS-5. Endvidere er molekylformen for antibiotiket PS-6 beregnet til C-^E^qNjO^S på baggrund af resultaterne af højopløsningsmassespektrometri for methylesteren.
På baggrund af ovenstående data antages det, at antibiotiket PS-6 har følgende struktur: ch3 CH?-CH^ .S-CH7-CH?-NH-COCH^ ti y
CT ^COOH
Biologiske egenskaber for antibiotiket PS-6 (1) Antibiotisk spektrum
Antibiotiket PS-6 har bredspektret antibiotisk virkning og udviser særdeles kraftig virkning mod forskellige bakterier, f.eks. grampositive bakterier hørende til slægterne Staphylococcus, Diplococcus, Streptococcus og Bacillus, samt gramnegative bakterier hørende til slægterne Alcaligenes og Comamonas.
Antibiotiket PS-6 udviser tillige god virkning mod f.eks. gramnegative bakterier hørende til slægterne Klebsiella og Proteus.
Det er karakteristisk, at antibiotiket PS-6 udviser kraftig virkning mod gramnegative bakterier, som er resistente over for antibiotika med β-lactamringstruktur, f.eks. bakterier, som hører til slægterne Citrobacter, Proteus og Klebsiella.
(2) Forøgelse af andre antibiotikas antibiotiske virkning mod β-lactama- seproducerende bakterier_
Antibiotiket PS-6 er i stand til at forøge andre antibiotikas antibiotiske virkning, især β-lactamantibiotika såsom penicilliner og cephalosporiner, mod β-lactamaseproducerende bakterier såsom Proteus vulgaris og Serratia marcescens.
(3) In vivo virkning
Antibiotiket har en udtalt terapeutisk virkning ved indgift til mus, som er inficeret med patogene grampositive bakterier.
(4) Toksicitet
Antibiotiket udviser ingen toksicitet ved intraperitoneal indgift til mus i en dosis på 500 mg/kg.
145382 7 (II) Antiblokum PS-7
Fysisk-kemiske egenskaber for antibiotlket PS-7 (1) Papirchromatografi
Antibiotiket PS-7 (natriumsalt) giver ved papirchromatografi med nedhængende papir på Toyo filterpapir nr. 50 nedenstående R^-vær-dier med følgende opløsningsmiddelsystem:
Acetonitril/tris/EDTA : R^=0/41
Ethanol/vand (7/3) : R^=0,68 (2) Tyndtlagschromatografi (TLC)
Antibiotlket PS-7 (natriumsalt) udviser følgende Rf-værdier ved tyndtlagschromatografi under anvendelse af chromatogramplader 13254 cellulose (nr. 6065) fra firmaet Eastman Kodak Co. med følgende opløsningsmiddelsystem: n-butanol/ethanol/vand (4/1/5)(øvre lag) : R^=0,60 n-propano1/vand (7/3) : R^=0,81 n-butanol/isopropa- nol/vand (7/7/6) : R^=0,71
Acetonitril/vand (8/2) : R^=0,65 (3) Højspændingspapirelektroforese
Der konstateres følgende migrering med antibiotlket PS-7 (natriumsalt) ved elektroforese på Toyo filterpapir nr. 50 med en pufferopløsning med den nedenfor anførte pH-værdi under anvendelse af et højspændingspapirelektroforeseapparatur fra firmaet Savant Instruments Co., højspændingskilde HV 300GA, elektroforese-beholder FP 18A: Antibiotiket PS-7 migrerer mod anoden i en længde på mindst 5 mm, sædvanligvis mellem 10 og 40 mm i en pufferopløsning bestående af 3,3 g bartital, 25,5 g natriumbarbital og 3000 ml vand (pH-værdi 8,6) ved gennemledning af en strøm ved 42 volt/cm i 30 minutter.
(4) Opførsel mod β-lactamase
Antibiotiket PS-7 inaktiveres af β-lactamase fra Bacillus cereus.
(5) Syre-baseegenskaber
Antibiotiket PS-7 er en énsyret syre, som indeholdet €n carboxylgruppe i molekylet.
U5382 8 (6) UV-absorptionspektrum
Antibiotiket PS-7 (natriumsait) udviser nedenstående karakteristiske UV-absorptionsmaksima: ^ H2^ = ca. 220 nm og max ^H2° = ca. 308 nm max (7) IR-absorptionsspektrum
Det infrarøde absorptionsspektrum for antibiotiket PS-7 (natriumsalt) målt i en KBr-tablet har karakteristiske absorptionsmaksima ved følgende bølgetal: ca. 1760 cm ^ (-CO- i β-lactamring) ca. 1670 cm ^ (-C0- i amid) ca. 1620 cm-1 (-C00® og -CH=CH-) (8) Proton NMR spektrum I 100 MHz proton NMR spektret i tungt vand (D2O) udviser antibiotiket PS-7 (natriumsalt) følgende tydelige karakteristiske signaler: (i) en triplet med centrum ved ca. 0,96 ppm (CH^-C^-) (ii) en multiplet med centrum ved ca. 1,72 ppm (-CH^-CH^) (iii) en skarp singlet ved ca. 2,05 ppm (CH^-CO-) (iv) en multiplet ved ca. 2,96-3,38 ppm (-C^-CH-)
N
(v) et signal med centrum ved ca. 3,96 ppm (-CH-) (vi) et par dubletter med centrum ved ca. 6,02 ppm og ca. 7,10 ppm (J = ca. 14 Hz) (-CH=CH-) (9) Molekylvægt
Molekylvægten er ca. 296 beregnet ud fra resultaterne af højopløsningsmassespektrometri for methylesteren af antibiotiket PS-7.
(10) Farvereaktion
Ehrlichreagensreaktion: positiv
Iod-chlorplatinsyrereaktion: positiv
Ninhydrinreaktion: negativ 145382 9 (11) Opløselighed
Stoffet er opløseligt i vand ved pH 6-9, men er praktisk taget uopløselig i benzen, acetone og ethylacetat.
Disse fysisk-kemiske egenskaber bekræfter antagelsen, at antibiotiket PS-7 (natriumsalt) indeholder grupperne
N VY
CH3-CH2-, CH3CO-, -CH=CH-, -GH- -NHCO- og -C00®. Ud fra disse data antages det, at antibiotiket PS-7 har følgende strukturformel ch3-ch S-CH=CH-NH-COCH^
JOCX
cr cooh
Biologiske egenskaber for antibiotiket PS-7 (1) Antibiotisk spektrum
Antibiotiket PS-7 har bredsprektret antimikrobiel virkning.
Det har særdeles kraftig antimikrobiel virkning mod forskellige mikroorganismer, f.eks. grampositive bakterier hørende til slægten Staphylococcus eller slægten Diplococcus, og det har tillige kraftig antimikrobiel virkning mod gramnegative bakterier hørende til f.eks. slægten Alcaligenes.
Antibiotiket PS-7 er især karakteriseret v.ed dets kraftige antimikrobielle virkning mod gramnegative bakterier hørende til f.eks. slægten Citrobacter eller slægten Enterobacter, hvilke slægter er resistente over for de kendte β-lactamantibiotika.
(2) Forøgelse af andre antibiotikas antibiotiske virkning mod β-lac- tamaseproducerende bakterier_ ‘
Antibiotiket PS-7 kan forøge andre antibiotikas antimikrobielle virkning, f.eks. β-lactamantibiotika såsom cephalosporiner på de β-lac-tamaseproducerende bakterier såsom Proteus vulgaris eller Serratia marcescens.
(3) In vivo virkning
Antibiotiket har en udtalt terapeutisk virkning ved indgift til mus, som er inficeret med patogene, grampositive bakterier.
10 145382 (4) Toksicitet
Antibiotiket udviser ingen akut toksicitet ved intraperitoneal indgift til mus i en dosis på 500 mg/kg.
Mikroorganismestammen, som kaldes stamme nr. A 271, er en stamme, som er blevet isoleret fra en jordprøve udtaget nær Eiheiji-templet i Yoshidadistriktet, Fukui, Japan. Denne stamme er i stand til at danne begge de to antibiotika PS-6 og PS-7. Den er i beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 1436/78, offentliggjort den 1. oktober 1978, beskrevet på følgende måde:
Taxonomiske karakteristika for stamme A271
De taxonomiske karakteristika for stamme Streptomyces A271 er som følger: 1) Morphologiske egenskaber
Forgrening hos sporedannende luftmycelium: Simpel forgrening. Form af sporedannende luftmycelium: den øverste del af luftmyceliet har kroge, løkker eller ufuldstændige spiraler.
Organismen henføres derfor til gruppen Retinaculum-Apertum. Disse former konstateres især når stammen dyrkes på et havre-agar-substrat og et glycerol-asparagin-agarsubstrat, medens en lige eller bugtet form lejlighedsvis konstateres på gærekstrakt-maltekstrakt-agarsubstrat. Form og antal af sporer i sporekæder: Ovale eller cylindriske sporer, som danner en kæde på mere end 10, sædvanligvis 10-50 sporer. Sporernes størrelse og overfladestruktur: 0,8-1,0 x 1,0-1,8 ja, glat overflade. Der er hverken konstateret svingtråde eller sporangier. Hyfer dannes på luftmyceliet.
2) Vækstegenskaber Vækstegenskaberne for stamme A271 er anført i nedenstående tabel I, som angiver resultaterne af observationer efter 2 ugers dyrkning ved 28°C, medmindre andet er anført. Farvebeskrivelsen er hovedsagelig baseret på fremgangsmåden ifølge H.D. Tresner og E.J. Backus, "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy", jvf. Appl. Microbiol. 11, 335, 1963, og farvebeskrivelsen i "Guide to Color Standard" fra Japan Color Institute Foundation.
u 145382
Tabel I
Substrat Vækst Luftmyce- Substrat- Opløseligt liets far- myceliets pigment ve farve
Saccharose- Kraftig lys oran- lysegul intet nitrat- gegul (3ea) (2fb) til agar lys oran gegul (3ea)
Glucose- Kraftig svag oran- lysegul intet asparagin- gegul (3ca) (1 2/1 fb)— agar til lys 2fb) orangegul (3ea)
Glycerol- Kraftig svag oran- lysegul intet asparagin- gegul, (3ca) (2fb) til agar til lys noget gul- orangegul liglysérød (3ea) (4gc)
Stivelse- Kraftig svag oran- lys orange- intet uorganisk gegul (3ca) gul (3ea) salt-agar til lys til lyse- orangegul gul (2fb) (3ea)
Tyrosin- Kraftig svag oran- lys organge- intet agar gegul (3ca) gul (3ea) til lys til brunlig orangegul gul (3ea) Nærings- Kraftig næsten ikke lysegul intet agar dannet; (2db) hvis dannelse findes, da noget mørk Gærekstrakt- Kraftig svag oran- lys orange- intet maltekstrakt- gegul (3ca) gul (3ea) agar til lys til svag orangegul brun (4ie) (3ea)
Havremel- Kraftig svag oran- lysegul intet agar ge (3ca) (2fb) til lys orangegul (3ea) (3) Fysiologiske egenskaber 1) Væksttemperaturområde: 10-40°C, optimum 20-30°C.
2) Omdannelse af gelatine fra fast form til flydende form (på glucose-peptoa-gelatinesubetrat}s Gelatine bliver smeltet ved dyrkning ved 20°C.
3) Hydrolyse af stivelse (på stivelse-uorganisk salt-agar-substrat): Stivelsen hydrolyseres.
4) Koagulering og peptonisering af skummetmælk: Der konstateres peptonisering men ingen koagulering.
12 145382 5) Dannelse af melanoidt pigment: der dannes intet melanoidt pigment på tyrosinagarsubstrat og peptongærionagarsubstrat og i trypton-gærekstraktvæske.
6) Udnyttelse af forskellige kulstofkilder (Pridham og Gottlieb agarsubstrat): L-Arabinose + D-Xylose + D-Glucose + D-Fructose
Saccharose
Inositol L-Rhamnose +
Raffinose D-Mannitol (+: god udnyttelse, -: ringe udnyttelse, meget ringe udnyttelse eller slet ingen udnyttelse).
Det fremgår klart af ovenstående egenskaber, at stammen A271 hører til slægten Streptomyces og har egenskaber til fælles med mikroorganismerne hørende til gruppen RA, da farven af myceliets overflade er gul eller rød, sporeoverfladen er glat, og der dannes intet vandopløseligt pigmentlignende melanoidt pigment. En undersøgelse i Waksman's "The Actinomycetes", bind 2, 1961, E.B. Shirling og D. Gottlieb1 s artikler i International Journal of Systematic Bacteriology, bind 18, side 69-189, 1968, ibid, side 279-892, 1968, ibid, bind 19, side 391-512, 1969, ibid, bind 22, side 265-394, 1972 og Ber-gey's "Manual of Determinative Bacteriology, 8th udgave, 1974, efter organismer med ovennævnte taxonomiske egenskaber viser, at lignende organismer, som hører til gruppe RA, er Actinomyces cremeus,
Actinomyces flavidovirens, Actinomyces albohelvatus, Actinomyces flavescens, Streptomyces rutgersensis, Streptomyces chryseus og Streptomyces helvaticus. Endvidere har organismen Streptomyces pluri-colorescens lignende morphologiske egenskaber, selv om den hører til gruppe RF. Ovennævnte 8 organismer, med undtagelse af Streptomyces pluricolorscens, angives at danne luftmycelium med lige eller bugtet form, idet variationen afhænger af dyrkningsbetingelserne. Typekulturer af de ovennævnte 8 arter sammenlignes med stamme A271 efter dyrkning under samme betingelser. Det viser sig, at stamme A271 er tydelig forskellig fra disse kulturer med hensyn til vækst, luftmyceliets farve, substratmyceliets farve og udnyttelse af kulstof-kilder.
13 145382 I nedenstående tabel II, III og IV anføres resultaterne af sammenligningen af stamme A271 med de kulturer, som ligner den mest.
Tabel II
Sammenligning med lignende kulturer.
Luftmyceliets farve
Actinomyces Actinomyces cremeus flavidovirens
Substrat Stamme A271 ISP 5147 ISP 5150
Saccharose- lys orangegul næsten intet intet nitrat- (3ea) agar
Glucose- svag orangegul svag orangegul hvid (b) asparagin- (3ca) til lys (3ca) agar orangegul (3ea)
Glycerol- svag orangegul svag orangegul næsten ikke dannet; asparagin- (3ca) til lys (3ca) når dannelse findes agar orangegul (3ea) da svag hvid (a)
Stivelse svag orangegul svag orangegul tyndt dannet uorganisk (3ca) til lys , (3ca) hvid (a) til saltagar orange (3ea) svag gul (3db) Nærings- næsten ikke dan- hvid (a) til hvid agar net, når dannel- svag orangegul se findes, da (3ca) noget mørk Gærekstrakt svag orange- svag gul (2db) hvid (b) til maltekstrakt- gul (3ca) svag gulligagar til lys oran- grøn- (leb) gegul (3ea)
Havremels- svag orange- hvid (b) tii hvid (b) til agar gul (3ca) svag orange- svag gullig- til lys oran- gul (3ca) grøn (lbd) gegui (3ea) 14 145382
Tabel III
Sammenligning med lignende kulturer.
Substratmyceliets farve
Actinomyces Actinomyces cremeus flavidovirens
Substrat Stamme A271 ISP 5147_ ISP 5150_
Saccharose lysegul (2fb) ringe vækst ringe vækst nitrat til lys orange- farveløs til farveløs til agar gul (3ea) hvid (b) hvid (a)
Glucose- lysegul lys orangegul svag gul asparagin (1 2/1 fb - 2fb) (3ea) (2db) agar
Glycerol- lysegul (2fb) lys orangegul svag gul asparagin til noget gul- (3ea) (2db) agar liglyserød (4gc)
Stivelse lys orangegul moderat gul- lysegul uorganisk (3ea) til lig-lyserød (2fb) saltagar lysegul (2fb) (ea)
Tyrosin lys orangegul svag brun (4ie) gråliggul (3ec) agar (3ea) til brun liggul Nærings- svag gul (2db) lys orangegul svag gul (2db) agar (3ea) Gærekstrakt lys orangegul lys orangegul mørkegul maltekstrakt (3ea) til svag (3ea) til møragar brun (4ie) kegul
Hvedemels- lysegul (2fb) noget gullig- svag gul (2db) agar -lyserød (4gc) til svag orange gul (3ca)
Tabel IV
Sammenligning med lignende kulturer Udnyttelse af kulstofkilder
Actinomyces Actinomyces cremeus flavidovirens
Kulstofkilde Stamme A271 ISP 5157 ISP 5150_ L-Arabinose + + + D-Xylose + + + D-Glucose + + + D-Fructose + +
Saccharose -
Inositol - - + L-Rhamnose + - +
Raffinose - D-Mannitol - 15 145382
Ud fra de i ovenstående tabeller anførte resultater kan der drages følgende konklusion. Hvad angår farven af luftmyceliet er denne hos Actinomyces flavidovirens sædvanligvis hvid men kan dog være gul, og er i dette tilfælde grønliggul, hvorved den klart adskiller sig fra stamme A271,
Med hensyn til substratmyceliets farve udviser Actinomyces flavidovirens svag gul farve og Actinomyces cremeus udviser lys orangegul farve i mange tilfælde, medens stamme A271 sædvanligvis udviser lysegul farve. Endvidere viser en detaljeret sammenligning af forsøgsresultater opnået på forskellige substrater, at stamme A271 er forskellig fra de to andre kulturer. Stamme A271 afviger fra Actinomyces cremeus med hensyn til udnyttelse af D-fructose og L-rhamnose og fra Actinomyces flavidovirens med hensyn til udnyttelse af D-fructose og inositol.
Stamme A271 er isåledes klart forskellig fra de to kendte kulturer, som ligner den mest. Stamme A271 er derfor forskellig fra alle kendte Streptomyces-arter og må betragtes som en hidtil ukendt art, som betegnes Streptomyces sp. A271. Denne kultur er deponeret i Fermentation Research Institute, Agency og Industrial Science and Technology, Japan, med deponeringsnummeret FERM-P No.
3984. En kultur af Streptomyces sp. A271 er endvidere deponeret hos ATCC under deponeringsnummeret No. 31358.
Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan ikke blot anvendes stamme A 271, men tillige de naturlige og kunstige mutanter deraf, som kan fremkaldes ved kemisk eller fysisk behandling, og som har væsentligt samme egenskaber som denne og derfor kan henføres til arten A271.
Næringssubstratet, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, skal indeholde carbonkilder, nitrogenkilder og uorganiske salte. Som eksempler på kulstofkilder kan nævnes carbonhy-drater såsom glucose, glycerol, maltose, saccharose, melasse, dextrin og stivelse, samt olier og fedtstoffer såsom sojabønneolie, jordnøddeolie eller svinefedt. Som eksempler på nitrogenkilder kan nævnes pepton, kødekstrakt, sojabønnemel, bomuldsfrøolie, tørgær, majsstøbevand, gærekstrakt, skummetmælk, casein, natriumnitrat, ammoniumnitrat og ammoniumsulfat. Eksempler på uorganiske salte er dikaliumphosphat, natriumchlorid, calciumcarbonat og magnesiumsulfat. Om ønsket kan der tilsættes spormængder af metaller som cobalt eller mangan. Endvidere kan der anvendes alle næringsstoffer, 145382 16 som kan udnyttes af organismerne til dannelse af antibiotiket PS-6 og/eller PS-7. For at forhindre skumdannelse under varmesterilisa-tionen og fermenteringen kan der tilsættes skumdæmpende midler såsom siliconeolier og vegetabilske olier.
Der er ingen særlige begrænsninger med hensyn til mængderne af ovennævnte næringskilder, og mængderne kan varieres inden for vide grænser. Med enkelte forsøg i lille målestok kan en fagmand let bestemme den optimale sammensætning og de optimale mængder af næringskilder for en bestemt stamme, som kan danne de antibiotiske stoffer PS-6 og PS-7.
Det har ifølge opfindelsen vist sig, at mængden af akkumuleret antibiotikum PS-6 kan forøges ved tilsætning af en aminosyre eller en organisk syre til vækstsubstratet under dyrkningen af Streptomyces sp. A271. Som aminosyre kan anvendes neutrale aminosyrer med 2-10 carbonatomer, især valin og leucin, og som organisk syre kan anvendes aliphatiske organiske syrer med 2-10 carbonatomer, især n-valerianesyre. Aminosyrer af L-, D- og DL-former kan alle anvendes, men L-aminosyrerne er de mest foretrukne. Mængden af disse aminosyrer eller organiske syrer, som skal tilsættes, er ikke kritisk, men sædvanligvis udgør de fortrinsvis 0,01-1% (vægt/rumf ang)f helst 0,1-0,5% (vægt/rumfang), henført til vækstsubstratet. Tilsætningstidspunktet er ikke begrænset. Disse forbindelser kan sættes til substratet på et vilkårligt tidspunkt under dyrkningen. Det foretrækkes imidlertid, at de tilsættes ved dyrkningens begyndelse eller i løbet af 100 timer efter påbegyndelsen af dyrkningen. Aminosyrerne og de organiske syrer kan hver især tilsættes på en gang eller opdelt i flere mængder og tilsat på forskellige tidspunkter.
Substratet kan være steriliseret inden dyrkningen. Det er fordelagtigt at indstille substratets pH-værdi i området 4-9, specielt 6-8, før eller efter steriliseringen.
Dyrkningen af de PS-6 og PS-7-producerende stammer kan principielt gennemføres under anvendelse af en fremgangsmåde, der ligner de fremgangsmåder, som sædvanligvis anvendes ved fremstillingen af antibiotika ved hjælp af Streptomyceter. Dyrkning under aerobe betingelser er sædvanligvis foretrukket. Almindeligvis kan dyrkningen gennemføres uden omrøring og/eller luftning. Selv om en vilkårlig dyrkningsmetode valgt blandt stationær dyrkning, 145382 17 rystedyrkning og submers dyrkning indbefattende luftning og omrøring kan anvendes, er den submerse dyrkning fordelagtig. Der er ingen særlige grænser med hensyn til de anvendelige dyrkningstemperaturer, og der kan anvendes temperaturer i det område, i hvilket væksten af stammerne, som danner antibiotiket PS-6 og PS-7, ikke inhibe-res i væsentlig grad, og hvor antibiotiket PS-6 og/eller PS-7 kan dannes. Selv om dyrkningstemperaturen kan variere afhængigt af den anvendte type stamme, ligger den egnede temperatur sædvanligvis i området 20-40, fortrinsvis 25-35°C.
Vækstsubstratets pH-værdi kan om ønsket reguleres under fermenteringen til en værdi i området 4-9, især 6-8, til gennemførelse af fermenteringen på fordelagtig måde. Ved fermentering i stor målestok foretrækkes det at dyrke en podestarome, hvorefter næringssubstratet inokuleres med podekulturen, hvorpå der foretages submers dyrkning.
Fermenteringen kan sædvanligvis fortsættes, indtil der er akkumuleret tilstrækkelige mængder af antibiotiket PS-6 og/eller PS-7. Fermenteringen varer sædvanligvis 30-90 timer, men fermenteringstiden afhænger af substratets sammensætning, fermenteringstemperaturen, den anvendte type stamme, etc.
En fagmand vil let kunne fastlægge de optimale dyrkningsbetingelser ved at foretage simple forsøg i overensstemmelse med egenskaberne hos en specifik stamme, som kan danne de ønskede antibiotika. Mængden af antibiotiket PS-6 og/eller PS-7 akkumuleret i vækstsubstratet kan bestemmes ved hjælp af en bioanalyse-metode og bioautografi, hvilket beskrives nærmere i det følgende.
Da de akkumulerede antibiotika PS-6 og PS-7 i fermenteringsproduktet er vandopløselige og hovedsagelig findes uden for mikroorganismecellerne, foretrækkes det at fjerne cellerne efter fermenteringen under anvendelse af en kendt separationsproces, £.eks. filtrering, centrifugering eller ekstraktion, hvorefter antibiotiket udvindes fra filtratet, den ovenstående væske eller ekstrakten.
Udvinding af antibiotiket kan gennemføres under anvendelse af forskellige kendte fremgangsmåder. Især kan der med fordel anvendes de fremgangsmåder, som ofte anvendes til udvinding af antibiotika af carboxylsyretypen. Følgende fremgangsmåder kan f.eks. anvendes enten alene i kombination eller flere på hinanden følgende gange. Ekstraktion ved en lav pH-værdi med et opløsningsmiddel såsom 145382 18 ethylacetat eller n-butanol og tilbageekstraktion fra opløsningsmidlet til en vandig fase ved en højere pH-værdi, ekstraktion ved neutral pH-værdi med et opløsningsmiddel såsom methylenchlorid eller chloroform i nærværelse af et lipofilt kvaternært ammoniumsalt såsom benzalkoniumchlorid eller tetra n-butylammoniumhydrogen-sulfat eller en macro-cyclisk polyether, såsom 1,4,7,10,13,16--hexaoxa-cyclo-octadecan (NISSO kroneether fremstillet af Nippon Soda Co., Ltd.), 1,4,7,10,13-pentaoxa-cyclo-pentadecan (NISSO kroneether 15-krone-5 fremstillet af Nippon Soda Co., Ltd.) og tilbageekstraktion fra opløsningsmiddelfasen til et neutralt vandigt lag indeholdende natriumiodid, kaliumiodid eller lignende, absorption på aktivt kul, "^mberlite" XAD, "Diaion" HP-20 eller lignende og eluering med en vandig methanolopløsning, vandig acetoneopløsning eller lignende, adsorption og eluering med ionbytterharpiks såsom "Dowex" 1x2 eller QAE-"Sephadex" A-25, gelfiltrering med "Sephadex" G-10, "Bio-Gel" P-2, "Bio-Beads" S-X3 eller lignende, søjle- eller tyndtlagschromatografering med cellulose, "Avicel" SF, DEAE-cellulose, Whatman DE-32, DEAE-"Sephadex" A-25, silicagel, aluminiumoxid eller lignende og tvunget tældning ved tilsætning af et opløsningsmiddel såsom acetone.
Til adskillelse af antibiotiket PS-7 fra analoge forbindelser med en mættet carbonkæde i svovlsidekæde, f.eks. antibiotiket PS-5 og PS-6, som kan være dannet og akkumuleret samtidig, er det især fordelagtigt at anvende følgende fremgangsmåde. De analoge forbindelser med en mættet carbonkæde isoleres ved anvendelse af gængs chroma-.tografering med en anionbytterharpiks, hvor de aktive bestanddele adsorberes på en anionbytterharpiks af polystyrentypen såsom "Dowex" 1x2, "Duolite" A-101, "Amberlite" 400 eller "Diaion" PA 306, og de analoge forbindelser elueres med et vandigt uorganisk salt, hvorefter antibiotiket PS-7 elueres med en vandig opløsning af et polært opløsningsmiddel såsom methanol eller acetone (koncentration: 1-80%, fortrinsvis 10-75%) indeholdende 0,1-10, fortrinsvis 1-5% af et uorganisk salt såsom natriumchlorid, kaliumchlorid, calciumchlorid eller natriumbromid.
145382 19
Det har endvidere vist sig, at afhængigt af dyrkningsbetingelserne dannes der i vækstsubstratet samtidig en forbindelse med formlen CH3 S-CH=CH-NHCOCHo cr \:ooh som betegnes antibiotikum PS-4, eller et salt deraf. Når derfor antibiotiket PS-4 og PS-7 dannes samtidig, kan de adskilles fra hinanden under anvendelse af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder enten i kombination eller ved at gentage disse. Det er særlige fordelagtigt at anvende følgende fremgangsmåde. En opløsning indeholdende antibiotiket PS-4 og antibiotiket PS-7 adsorheres på en adsorptionsharpiks såsom "Dianion" HP-2QAG, og de antibiotiske stoffer' elueres med en gradient fra 0 til 50%, fortrinsvis 0-10% polært opløsningsmiddel opløst i vand, f.eks. en vandig acetoneopløsning. Opførselen af antibiotiket PS-6 og/eller PS-7 under udvindings- og isoleringsprocessen kan erkendes ved at bestemme antibiotiket PS-6 og/eller PS-7 ved hjælp af en bioanalysemetode og bioautografi, som beskrives nærmere i det følgende.
Antibiotiket PS-6 og/eller PS-7 med de ovenfor beskrevne egenskaber kan fås på den ovenfor anførte måde. Da antibiotikaene PS-6 og PS-7 er noget labile som beskrevet ovenfor, må udvindingen og isoleringen gennemføres med stor omhu.
Da antibiotiket PS-6 og PS-7 sædvanligvis har tendens til at være mere stabile i saltformen end i den fri syreform, foretrækkes saltformen ved farmaceutisk anvendelse, hvilket beskrives i det følgende, ved anvendelse som mellemprodukt ved syntetisering af derivater eller under ovennævnte rensningsprocesser.
Den ovenfor beskrevne saltform indbefatter f.eks. alkalimetalsaltene såsom natriumsaltet, kaliumsaltet eller lithiumsaltet, jord-alkalimetalsaltene såsom calciumsaltet eller magnesiumsaltet samt andre salte såsom aluminiumsalte, ammoniumsalte, salte med primære, sekundære eller tertiære aminer såsom monoethylamin, diethylamin, triethylamin, monoethanolamin eller diethanolamin og endvidere salte 145382 20 med organiske baser såsom benzathin eller procain. Egnede salte er farmaceutisk acceptable salte. Særligt velegnede salte er alkali-metalsaltene såsom natrium- eller kaliumsaltene.
Som tidligere anført er antibiotikaene PS-6 og PS-7 hver især énsyrede syrer med en carboxylgruppe i molekylet. Der kan afledes forskellige estere af antibiotikaene med nedenstående almene formel R1 CH,-CH S-R2-NH-CO-CH-, 31 hvor R betyder en alkylgruppe med 1-6 carbonatomer eller en 1 2 triphenylmethylgruppe, og R og R har de ovenfor anførte betydninger .
I ovenstående almene formel (II) kan den lavere alkylgruppe være en ligekædet eller forgrenet gruppe med højst 6 carbonatomer, og specielt en gruppe med 1-4 carbonatomer. Som eksempler på den lavere alkylgruppe kan nævnes methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, iso-butyl, n-pentyl, iso-pentyl og n-hexyl.
Estrene med den almene formel (II) kan fremstilles ved at omsætte en forbindelse med formlen (I), dvs. de vundne antibiotika PS-6 eller PS-7, eller salte deraf med en forbindelse med den almene formel R31Y (III) hvor R33- har den ovenfor anførte betydning, og Y betyder et atom eller en gruppe, som kan fraspaltes, eller med en lavere diazoalkan.
Hvad angår det fraspaltelige atom eller gruppen Y i den almene formel (III) kan anvendes et vilkårligt atom eller en vilkårlig gruppe, som kan fraspaltes, når det bringes i kontakt med carboxyl-gruppen i antibiotiket PS-6 eller PS-7, f.eks. et halogenatom såsom chlor, brom eller iod, en hydroxylgruppe, en thiolgruppe, en sulfony1-oxygruppe, -COH, en reaktiv carbonyloxygruppe såsom -0-C0-CF3 eller lignende. Halogenatomer er særligt foretrukne.
Som eksempler på forbindelsen med den almene formel (III) kan nævnes følgende:
Methylalkohol, methyliodid, dimethylsulfonat, methylmercap-tan, ethanol, ethylbromid, ethyliodid, ethylmercaptan, n-propylchlorid, n-propyliodid, propylalkohol, iso-propylalkohol, iso-propylbromid, 21 145382 iso-propyliodid, n-butylalkohol, n-butylbromid, n-butyliodid, n-pen-tylalkohol, n-pentylchlorid, n-pentylbromid, n-pentyliodid, n-hexyl-alkohol, n-hexylbromid, n-hexyliodid, trityialkohol, tritylmercaptan, tritylchlorid og tritylbromid.
Som et repræsentativt eksempel på de lavere diazoalkaner kan nævnes diazomethan.
Reaktionen mellem antibiotiket PS-6 eller PS-7 med forbindelsen med den almene formel (III) eller med en lavere diazoalkan kan gennemføres under anvendelse af de gængse esterificeringsmetoder. Reaktionen mellem antibiotiket PS-6 eller PS-7 og forbindelsen med den almene formel (III) eller den lavere diazoalkan kan eksempelvis sædvanligvis gennemføres i fraværelse af et reaktionsmedium. Imidlertid gennemføres omsætningen almindeligvis i et indifferent flydende medium. Som eksempler på anvendelige flydende indifferente medier kan nævnes carbonhydrider såsom benzen, toluen, n-hexan eller cyclohexan, halogenerede carbonhydrider såsom chloroform eller methylenchlorid, amider såsom dimethylformamid eller hexamethylphosphorsyretriamid, dimethyl-sulfoxid, ethere såsom diethylether, diisopropylether, di-n-butylether, tetrahydrofuran eller dioxan, estere såsom ethylacetat eller n-butyl-acetat, samt ketoner såsom acetone eller methylethylketon. Disse opløsninger kan anvendes enkeltvis eller i blandinger af to eller flere.
Reaktionstemperaturen er ikke kritisk og kan varieres inden for vide grænser afhængigt af typen af forbindelsen med den almene formel (III), typen af den lavere diazoalkan, arten af det flydende medium osv. Reaktionstemperaturen skal vælges således, at der ikke sker en væsentlig sønderdeling af antibiotiket PS-6 eller PS-7. Sædvanligvis er den egnede temperatur ikke højere end 60°C, fortrinsvis i området 0-40°C, og helst i området mellem 5°C og stuetemperatur. Om nødvendigt kan der anvendes en reaktionspromotor såsom trimethylamin, triethylamin, pyridin eller dicyclohexylcarbodiimid.
Under disse betingelser kan reaktionen afsluttes i løbet af ca. 1-24 timer, sædvanligvis 3-12 timer.
Det antibiotiske stof PS-6 eller PS-7, som skal omsættes med forbindelsen med formlen (III) eller den lavere diazoalkan, behøver ikke at være et isoleret produkt. Således kan der anvendes det udgærede vækstsubstrat fra dyrkningen af den stamme, som danner antibiotiket PS-6 eller PS-7, eller der anvendes et filtreret vækstsubstrat, hvor mikroorganismecellerne er fjernet fra vækstsubstratet. Endvidere kan antibiotiket PS-6 eller PS-7 anvendes i rå form fremkommet ved delvis rensning af det ved dyrkningen fremkomne produkt. Som eksempel på et delvis renset produkt kan nævnes et koncentreret eluat fra aktivt kul, 22 145382 hvormed det filtrerede vækstsubstrat er blevet behandlet, et koncentreret eluat fra en "Diaion" HP-20 harpiks, hvormed det filtrerede udgærede vækstsubstrat er blevet behandlet, et afsaltet koncentrat med aktivt kul af et eluat fremkommet med gradientkoncentration af natriumchlorid i phosphatpuffere fra "QAE-Sephadex", hvorpå det koncentrerede eluat fra behandlingen med "Diaion" HP-20 er blevet adsorberet. En koncentreret ekstrakt med methylenchlorid i nærværelse af benzalkoniumchlorid, en koncentreret ekstrakt med chloroform i nærværelse af makro-cycliske polyethere og en koncentreret ekstrakt med butanol ved pH-værdien 3,5 ved lav temperatur.
Den således fremstillede ester af antibiotiket PS-6 eller PS-7 kan isoleres fra reaktionsblandingen eller renses på i og for sig kendt måde. Når reaktionen er afsluttet kan reaktionsblandingen f.eks. først hældes i et vandigt medium til fjernelse af vandopløselige urenheder såsom biprodukter. Det foretrækkes at anvende en neutral puffer som det vandige medium for at holde pH-værdien tæt ved neutralværdien. Esteren af antibiotiket PS-6 eller PS-7 i denne blanding ekstraheres derpå med et mindre polært organisk opløsningsmiddel, som praktisk taget ikke er blandbart med vand, f.eks. ethylacetat, benzen eller chloroform. Der kan tilsættes et salt såsom natriumchlorid eller ammoniumsulfat for at forøge effektiviteten af ekstraktionen ved hjælp af udsaltningseffekten.
Efter tørring med vandfrit natriumsulfat kan esteren isoleres fra opløsningsmiddelfasen på i og for sig kendt måde, f.eks. ved gel-filtrering under anvendelse af "Bio-Beads S-Xg" eller "Sephadex" LH-20 eller ved adsorptionschromatografi under anvendelse af et bærestof såsom silicagel, aluminiumoxid eller "Florisil", som kan anvendes i passende kombination og om nødvendigt anvendes gentagne gange.
Den således rensede ester kan yderligere renses ved omkrystallisation fra et opløsningsmiddel såsom benzen, toluen, xylen, ethylacetat, diethylether, methylenchlorid, chloroform, hexan og petroleumsether (kogeområde 30-60°C) enten enkeltvis eller i form af blandinger.
Blandt estrene med den almene formel (II), som kan fremstilles ved ovenstående fremgangsmåde, er antibiotikum PS-6- eller PS-7-trityl-esteren med formlen 23 145382 R1 2 , S-R -NH-COCHn
CH3“chtTY
0^ N \ Øj (II-a) coo-c-^3 0' 1 2 hvor R og R har de ovenfor angivne betydninger, karakteristiske og nyttige, idet de er mere stabile end antibiotiket PS-6 eller PS-7 med formlen (I) og følgelig lettere at isolere, og endvidere har de kraftig antibakteriel og β-lactamaseinhiberende virkning, hvorimod tritylesteren af f.eks. de kendte penicilliner ikke udviser nogen væsentlig antibakteriel virkning. Dette skyldes formentlig at trityl-gruppen i PS-6 eller PS-7-tritylesteren er så aktiv, at den let fraspaltes i analysemediet eller in vivo. Tritylesteren med formlen (II-a) er et meget vigtigt mellemprodukt ved syntetiseringen af andre farmaceutisk anvendelige derivater, da tritylgruppen i tritylesteren med formlen (II-a) er meget aktiv og let kan fraspaltes.
En detaljeret beskrivelse af de fysisk-kemiske og biologiske egenskaber for tritylesteren af antibiotiket PS-6 og PS-7 med formlen (II-a) anføres i det følgende.
[I] Tritylesteren af antibiotiket PS-6
Fysisk-kemiske egenskaber for tritylesteren af antibiotiket PS-6 (1) UV-absorptionsspektrum
CH,OH
= 3.15,0 nm (2) Farvereaktioner
Ehrlich-reagensreaktion: positiv
Iod-chlorplatinsyrereaktion: positiv
Ninhydrinreaktion: negativ (3) Tyndtlagschromatografi (TLC)
Der opnås følgende R^-værdier på de anførte plader med de anførte opløsningsmidler.
Kiselgel 60 ^254 (E. Merc^ Co., Inc)
Benzen/acetone (2/1): R^=0,37
Benzen/ethylacetat(1/8): R^=0,34 24 145382
Biologiske egenskaber for tritylesteren af antibiotiket PS-6 (1) Antimikrobielt spektrum
Tritylesteren af antibiotiket PS-6 har bredsprektret antimikro-biel virkning og udviser meget kraftig virkning mod forskellige bakterier, f.eks. grampositive bakterier, som hører til slægterne Staphylococcus, Diplococcus og Streptococcus, samt gramnegative bakterier, som hørende til slægten Alcaligenes.
Tritylesteren af antibiotiket PS-6 udviser endvidere god virkning mod gramnegative bakterier hørende til slægten Klebsiella og Proteus.
Det er karakteristisk, at tritylesteren af antibiotiket PS-6 udviser kraftig virkning mod gramnegative bakterier, som er resistente over for 3-lactamantibiotika, f.eks. bakterier hørende til slægten Citrobacter, Proteus, Klebsiella og Serratia.
(2) In vivo-virkning
Tritylesteren af antibiotiket PS-6 udviser en markant terapeutisk virkning ved indgift til mus, som er inficeret med pathogene grampositive bakterier.
(3) Toksicitet
Tritylesteren udviser ingen akut toksicitet ved intraperi-toneal indgift til mus i en dosis på bOO mg/kg.
LIX] Tritylesteren af antibiotiket PS-7
Fysisk-kemiske egenskaber af tritylesteren af antibiotiket PS-7 (1) UV-absorptionsspektrum
CH-OH
Λ = 321,0 nm ' ' max og „ CEUOH _ , Λ 3 = 230,b nm max (2) Farvereaktioner
Ehrlich-reagensreaktion: positiv
Iod-chlorplatinsyrereaktion: positiv
Ninhydrinreaktion: negativ (3) Tyndtlagschromatografering (TLC)
Der opnås følgende Rf-værdier på de anførte chromatografe-ringsplader med de anførte opløsningsmidler.
25 U5382
Kiselgel 60 F254 (E. Merck Co., Inc)
Benzen/acetone (2/1): R^=0,51
Benzen/ethylacetat (1/8): R^=0,67
Biologiske egenskaber for trityles teren af antibiotiket PS-7 (1) Antimikrobielt spektrum
Tritylesteren af antibiotiket PS-7 har bredspektret antimikrobiel virkning og udviser meget kraftig virkning mod forskellige bakterier, f.eks. grampositive bakterier, som hører til slægten Staphylococcus, Diplococcus og Streptococcus, samt mod gramnegative bakterier hørende til slægten Alcaligenes.
Tritylesteren af antibiotiket PS-7 udviser tillige god virkning mod f.eks. gramnegative bakterier hørende til slægten Klebsiella og Proteus.
Det er karakteristisk, at tritylesteren af antibiotiket PS-7 udviser kraftig virkning mod gramnegative bakterier, som er resistente over for (3-lactamantibiotika, f.eks. bakterier fra slægten Citrobacter, Proteus, Klebsiella og Serratia.
(2) In vivo-virkning
Tritylesteren af antibiotiket PS-7 udviser markant terapeutisk virkning ved indgift til mus inficeret med pathogene grampositive bakterier.
(3) Toksicitet
Tritylesteren udviser ingen akut toksicitet ved intra-peritoneal indgift til mus i en dosis på 500 mg/kg.
De omhandlede antibiotika PS-6 og PS-7 samt tritylesteren deraf udviser tilstrækkelig kraftig antimikrobiel virkning til at de kan anvendes effektivt til forebyggelse og bekæmpelse af bakterieinfektioner, som optræder ikke blot hos mennesker, men tillige hos dyr, f.eks. pattedyr, fjerkræ og fisk.
Endvidere er tritylesteren et meget vigtigt mellemprodukt ved fremstillingen af andre nyttige farmaceutika, da tritylgruppen i tritylesteren med formlen (Il-a) er meget aktiv og let fraspaltes.
Antibiotiket PS-6 og PS-7 og tritylesteren deraf kan indgives oralt, topisk eller parenteralt (intravenøst, intramuskulært, intraperitonealt, osv.) og kan anvendes i vilkårlig gængs farmaceutisk indgiftsform afhængigt af indgiftsvejen. Antibiotiket PS-6 eller tritylesteren deraf kan f.eks. formuleres med et farmaceutisk acceptabelt bærestof eller fortyndingsmiddel til faste præparatformer, f.eks. tabletter, kapsler, pulvere, granulater, sukkerovertrukne tabletter, 145382 26 drageer, pudder og suppositorier, halvfaste former som f.eks. salver, cremer og halvfaste kapsler, eller flydende former som f.eks. flydende opløsninger, emulsioner, suspensioner, lotioner, sirupper, injektionsopløsninger og væskesprøjtemidler.
Enhedsdosispræparatet indeholdende antibiotiket PS-6 eller tritylesteren deraf kan sædvanligvis indeholde 0,1-99 vægtprocent, fortrinsvis 10-60 vægtprocent af den aktive bestanddel i en vilkårlig flydende, halvfast eller fast form.
De ovenfor beskrevne farmaceutiske præparater kan indeholde antibiotiket PS-6 eller PS-7 og/eller tritylesteren alene eller i kombination med andre terapeutisk virksomme bestanddele.
Da antibiotiket PS-6 eller PS-7 og tritylesteren deraf i kombination med β-lactamforbindelser har synergistisk virkning på forskellige β-lactamaseproducerende bakterier, vil det være fordelagtigt at kombinere de omhandlede forbindelser med β-lactamforbindelser i farmaceutiske præparater, hvilket beskrives nærmere i det følgende. Som eksempler på egnede β-lactamforbindelser kan nævnes penicillinderivater såsom benzylpenicillin, phenoxymethyl-penicillin, carbenicillin, ampicillin og amoxicillin samt cephalo-sporinderivater såsom cephaloridin, cephalotin, cefazolin, cephalexin, cefoxitin, cephacetril, cephamandol, cephapirin, cephradin og cephaloglycin.
Når antibiotiket PS-6 eller PS-7 og/eller tritylesteren kombineres med en eller flere af de ovennævnte β-lactamforbindelser er kombinationsforholdet ikke kritisk men kan varieres inden for vide grænser. Fra et praktisk synspunkt vil det imidlertid være tilrådeligt at anvende de omhandlede antibiotika og den kendte β-lactam-forbindelse(r) i mængdeforhold i området 20:1 til 1:150, fortrinsvis 10:1 til 1:100.
Ved behandling af bakterieinfektioner hos mennesker kan dosis af antibiotiket PS-6 eller PS-7 og/eller tritylesteren varieres afhængigt af den pågældende person, legemsvægten, infektionernes type, sværhedsgrad og symptomer, indgiftsvejen og antallet af indgivelser osv. Til sædvanlig oral eller parenteral indgift vil det være fordelagtigt at anvende en daglig dosis i området 0,05-500, fortrinsvis 0,5-200 mg/kg, fortrinsvis i opdelte doser.
Det er klart, at en ansvarlig læge kan vælge doser, som ligger uden for det ovenfor anbefalede interval, under hensyntagen til patientens individuelle forhold.
145382 27
Antibiotiket PS-6 eller PS-7 og/eller tritylesteren kan anvendes i form af farmaceutiske præparater som beskrevet ovenfor eller kan tilsættes direkte eller som foderadditivkoncen-trat i dyrefoder. Endvidere kan de anvendes som aktive bestanddele til foderkonserveringsmidler eller desinfektionsmidler.
Opfindelsen illustreres nærmere i de nedenstående eksempler.
I eksempler er de kvantitative og kvalitative analyser af den anti-mikrobielle virkning baseret på følgende fremgangsmåder: (1) Bioanalyse af antlmikrobiel virkning
En skrårørsnæringsagarkultur af Comamonas terrigena B-996, som har været dyrket natten over, suspenderes i et næringssubstrat, hvorved der fås en podekultur med en optisk celletæt-hed på 0,040 ved 610 nm. Podesuspensionen sættes i en mængde på 1% til et smeltet agarsubstrat indeholdende 0,8% Kyokuto næringssubstratpulver (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) og 1,0% Bacto-Agar (Difco Laboratories). Portioner på 7 ml af det flydende podeagarsubstrat hældes i Petriskåle med en diameter på 9 cm og størknes. En sådan skål kaldes en Comamonasanalyseplade.
Staphylococcus aureus FDA 209P dyrkes natten over i et næringssubstrat under omrystning og fortyndes 50 gange i næringssubstrat til dannelse af en podesuspension. Et smeltet agarsubstrat indeholdende 1% Kyokuto næringssubstratpulver (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) og 1% Bacto-agar (Difco Laboratories) inokuleres grundigt med podesuspensionen i en mængde på 1% (rumfang/rumfang) portioner på 7 ml af det smeltede agarpodesubstrat ophældes i Petriskåle med en diameter på 9 cm, hvorpå skålene henstilles til størkning. En sådan skål kaldes en Staphylococcusanalyseplade.
På lignende måde fremstilles en Alcaligenes-analyseplade, idet en skrårørsnæringsagarkultur af Alcaligenes faecalis B-326, som har været dyrket natten over, suspenderes i et næringsmedium til dannelse af en podesuspension, hvori cellekoncentrationen reguleres svarende til en optisk tæthed på 0,020 ved 610 nm. Et agarsubstrat indeholdende 0,5% Kyokuto næringssubstratpulver (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) og 1,0% Bacto-agar (Difco Laboratories) smeltes ved en passende temperatur og inokuleres med podesuspensionen i en mængde på 1%. Det smeltede podeagarsubstrat hældes i portioner på 7,0 ml i Petriskåle med en diameter på 9 cm, hvorefter skålene henstilles til størkning. En sådan skål kaldes en Alcaligenesanalyse-plade.
145382 28
En pulpplade med en diameter på 8 mm gennemblødes på sædvanlig måde med prøveopløsningen, som skal analyseres, hvorefter den anbringes på et rent stykke filtrerpapir i tilstrækkelig lang tid til at overskud af opløsningen fjernes, skiven overføres til en analyseplade, og der inkuberes ved 3b°C i 20 timer. Diameteren af den konstaterede hæmningszone måles og sammenlignes med diameteren fremkommet med standardopløsninger af cephaloridin. Den antimikrobi-elle virkning af antibiotiket PS-6 og beslægtede forbindelser udtrykkes som cephaloridinækvivalentenheder/ml. Dette forklares nærmere i det følgende. En opløsning af antibiotiket PS-6 og beslægtede forbindelser, som fremkalder en hæmningszone med samme diameter som 100yug/ml cephaloridin, tillægges værdien 100 cephaloridinenheder/ml.
På tilsvarende måde når en fast prøve af antibiotiket PS-6 og beslægtede forbindelser i en koncentration på 1 mg/ml fremkalder samme diameter som 1 ug/ml cephaloridin er den specifikke virkning af den faste prøve 1 cephaloridinenhed/mg. Det er klart, at analysestandard-kurven varierer i nogen grad afhængigt af arten af testmikroorganismen. Til nærmere angivelse af arten af testorganismerne anvendes følgende udtryk for enhederne: Comamonas-cephaloridinenhed (forkortet CCU), Staphylococcus-cephaloridinenhed (forkortet SCU) og Alcaligenes--cephaloridinenhed (forkortet ACU).
(2) Bioautografi
En stor analyseplade fremstilles som beskrevet ovenfor under (1). Bioanalyse af antimikrobiel virkning foretages, med den undtagelse, at 100 ml af det smeltede podeagarsubstrat hældes i en rektangulær skål (32 x 24 cm) i stedet for en 9 cm Petriskål:
Et papirchromatogram, som skal analyseres, anbringes i 15 minutter på ovennævnte store analyseplade. Efter fjernelse af papiret inkuberes analysepladen med 35°C i 20 timer til frembringelse af inhiberingszoner. Dette tillader ikke blot beregning af Rf-værdier (kvalitativ analyse) men tillige bestemmelse af den antimikrobi-elle virkning (semi-kvantitativ analyse) baseret på størrelsen af hæmnings zonen.
I tilfælde med TLC-plader anbringes et ark tyndt papir mellem TLC-pladen og analysepladens overflade. Tilsvarende fremgangsmåde anvendes ved kvalitative og semi-kvantitative analyser.
29 145382
Eksempel 1
En 500 ml erlenmeyerkolbe indeholdende podekultursubstratet SE-4, som beskrevet nærmere i det følgende, steriliseres ved 120°C i 15 minutter. Til en skrårørskultur af Streptomyces sp. A271 med god sporedannelse sættes 1U ml opløsning indeholdende 0,02% overfladeaktivt stof "Tween 80"® (Atlas Powder Corp.), og der omrystes forsigtig til dannelse af en sporesuspension. En milliliter af sporesuspensionen inokuleres i 500 ml erlenmeyerkoIben, og der dyrkes ved 28°C i 48 timer på et roterende rystebord (200 omdrejninger pr. minut, radius i cirkel 3,5 cm). Derpå udtages 2 ml af podekulturen og inokuleres i en 500 ml erlenmeyerkolbe indeholdende 100 ml af det nedenfor beskrevne produktionssubtrat, og der foretages dyrkning ved 28°C i 48 til 96 timer på et roterende rystebord.
Podekultursubstrat (SE-4) Kødekstrakt (Difco Laboratories) 0,3% (vægt/rumfang)
Bacto-trypton (Difco Laboratories) 0,5% (vægt/rumfang)
Glucose 0,1
Opløselig stivelse 2,4 Gærekstrakt 0,5
Calciumcarbonat 0,4
Affedtet sojabønnemel 0,5 pH-værdien indstilles på 7,5 inden sterilisering.
Produktionssubstrat (1) AG-1 substrat
Glucose 1,5% (vægt/rumfang)
Majsstivelse 2,5
Majsstøbevand 2,0 Tørgær 1,0 D,L-methionin 0,1
CoCl2'6H20 0,00013 pH-værdien er 7,2 inden sterilisering.
(2) AGA-2-substrat
Glucose 1,5% (vægt/rumfang)
Kartoffelstivelse 2,5
Majsstøbevand 2,0 Tørgær 1,0
CoC12*6H20 0,00013 pH-Værdi 6,5 inden sterilisering.
145382 30 (3) AGB-substrat
Maltose 3,0% (vægt/rumfang)
Majsstøbevand 1,0 Tørgær 1,0
CoC12*6H20 0,0001 pH-Værdi 6,5 inden sterilisering.
(4) AGB-41-substrat
Maltose 5,0% (vægt/rumfang)
Opløselig stivelse 1,0
Glycerol 0,3 Tørgær 2,5
NaCl 0,5 K2HP04 0,05
MgS04-7H20 0,05
CaC03 0,3
CoC12-6H20 0,00013 pH-Værdi 7,0 inden sterilisering (5) ML-19-substrat
Glycerol 4,0% (vægt/rumfang)
Pepton 0,5
Glucose 0,2
Kartoffelstivelse 0,2
Affedtet sojabønnemel 0,5 Tørgær 0,5
NaCl 0,5
CaC03 0,2 pH-Værdi 6,4 inden sterilisering.
(6) AGO-1-substrat
Sojabønneolie 3,0% (vægt/rumfang) Tørgær 2,0
NaCl 0,5 K2HP04 0,05
MgS04-7H20 0,05%
CaC03 0,3
CoC12-6H20 0,00013 pH-Værdi 7,0 inden sterilisering.
145382 31
En lille portion af dyrkningssubstratet udtages fra hver kolbe med regelmæssige mellemrum. De aktive bestanddele i prøverne ekstraheres og koncentreres, og tilstedeværelsen af antibiotiket PS-6 og PS-7 påvises ved hjælp af papirchromatografi og bioautogra-fi som beskrevet i det følgende.
Påvisning af antibiotiket PS-6
Det udtagne dyrkningssubstrat centrifugeres, og 10 ml af den ovenstående væske elueres i en minisøjle indeholdende 1,5 ml af ionbytteren "Diaion" HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.). Efter absorption af den aktive komponent elueres den med vandig acetoneopløsning (50% rumfang/rumfang). 0,5 ml af begyndelseseluatet kasseres, og der opsamles 2 ml af det efterfølgende eluat. Dette eluat koncentreres, og 20/il af det koncentrerede eluat underkastes papirchromatografi med nedhængende filterpapir (Toyo Roshi nr. 50,
Toyo Roshi Kaisha), og der fremkaldes ved 5°C i 7-20 timer med forskellige typer opløsningsmidler. Efter fremkaldelsen anbringes filterpapiret i våd tilstand på en analyseplade for bioautografi under anvendelse af forskellige typer mikroorganismer i 15-30 minutter. Derpå fjernes filterpapiret, og analysepladen dyrkes derpå ved 30°C i ca. 18 timer. En prøve, som indeholder antibiotiket PS-6, danner en hæmningszone ved R^-beliggenheden for antibiotiket PS-6. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde påvises antibiotiket PS-6 i dyrkningssubstratet fra 6 medier.
Påvisning af antibiotiket PS-7
En prøve af dyrkningssubstratet centrifugeres, og 10 ml af den ovenstående væske sættes til en minisøjle pakket med 1,5 ml "Diaion" PA-306 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.). Søjlen vaskes med 0,5 ml 5%'s (vægt/rumfang) natriumchloridopløsning og elueres med 50%'s (vægt/rumfang) methanolopiøsning indeholdende 3% (vægt/rumfang) natriumchlorid. De første 1,0 ml af eluatet kastes bort, og de efterfølgende 5,0 ml eluat opsamles. Methanolen fordampes under formindsket tryk, hvorefter eluatkoncentratet sættes en minisøjle pakket med 1,5 ml "Diaion" HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.). En aktiv komponent adsorberet på harpiksen elueres med 50%'s rumfang/rumfang) acetoneopløsning. De første 0,5 ml af eluatet kastes bort, og de efterfølgende 2,0 ml eluat opsamles. Eluatet koncentreres, 32 145382 og 20 jal af det fremkomne koncentrat anbringes på Toyo filterpapir nr. 50 (Toyo Roshi Co.). Der gennemføres papirchromatografi med nedhængende papir under anvendelse af forskellige opløsningsmiddelsystemer ved 5°C i 7-20 timer. Efter fremkaldelse anbringes de halvtørre chroma tograxnmer i kontakt i 15-30 minutter med ag ar over fladen på bioautografianalysepladerne indeholdende forskellige testorganismer. Analysepladerne inkuberes ved 35°C i 18 timer. En prøve indeholdende antibiotiket PS-7 giver en væksthæmningszone på stedet svarende til R^-værdien for antibiotiket PS-7.
Resultater fremkommet under anvendelse af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde viser, at antibiotiket PS-7 findes i alle dyrkningssubstratfiltraterne fra ovennævnte fire typer substrater selv om de akkumulerede mængder varierer fra substrat til substrat.
Eksempel 2
Streptomyces sp. A271 dyrkes analogt med den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde, idet der dog anvendes det i det følgende anførte substrat AGB-42. Inden eller 24 timer efter dyrkningens start sættes 0,2% DL-valin eller L-valin til substratet. Mængden af antibiotiket PS-6 akkumuleret i dyrkningssubstratet efter rystedyrkning i 72 timer er mere end den firdobbelte af mængden i kontroldyrkningssubstratet, som ikke er tilsat valin.
Sammensætning af substrat AGB-42
Maltose 5,0% (vægt/rumfang)
Opløselig stivelse 1,0% (vægt/rumfang)
Glycerol 0,3% (vægt/rumfang) Tørgær 3,0% (vægt/rumfang)
NaCl 0,5% (vægt/rumfang) Κ-,ΗΡΟ^ 0,05% (vægt/rumfang)
MgSO^*7H20 0,05% (vægt/rumfang)
CaCO^ 0,3% (vægt/rumfang)
CoC12-6H20 0,00013% pH-Værdi 7,0 inden sterilisering.
33 145382
Eksempel 3
Streptomyces sp. A271 dyrkes analogt med den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde, idet der dog som substrat anvendes det ovenfor beskrevne ML-19 substrat. Inden eller 24 timer efter dyrkningens påbegyndelse sættes 0,2% DL-valin eller L-valin til substratet. Efter rystedyrkningen af kulturen i 72 timer er mængden af antibiotiket PS-6 akkumuleret i dyrkningssubstratet mere end fire gange så stor som mængden i kontroldyrkningssubstratet, som ikke er tilsat valin.
Eksempel 4
Streptomyces sp. A271 dyrkes analogt med den i eksempel 3 beskrevne fremgangsmåde, bortset fra at der tilsættes DL- eller L-leucin i stedet for DL- eller L-valin. Efter rystedyrkning af kulturen i 72 timer er mængden af antibiotiket PS-6 akkumuleret i dyrkningssubstratet mere end dobbelt så stor som i kontroldyrkningssubstratet, hvortil der ikke er sat leucin.
Eksempel 5
Streptomyces sp. A271 dyrkes analogt med den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde, idet der dog anvendes det nedenfor beskrevne substrat AGB-3. Inden dyrkningen sættes 0,1% L-valin og o,3% L-leucin til substratet. Efter rystedyrkning af kulturen i 72 timer er der akkumuleret en væsentlig mængde af antibiotiket PS-6 i dyrkningssubstratet.
Sammensætning af substrat AGB-3
Maltose 3,0% (vægt/rumfang) Tørgær 2,0%
NaCl 0,5% ' K2HP04 0,05%
MgS04-7H20 0,05%
CaC03 0,3%
CoCl2*6H20 0,00013% pH-værdi 7,0 inden sterilisering.
34 145382
Eksempel 6
Der foretages dyrkning analogt med den i eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde, idet dog n-valerianesyre sættes til substratet i stedet for DL- eller L-valin. Mængden af antibioti-ket PS-6 akkumuleret i dyrkningssubstratet efter rystedyrkning af kulturen i 72 timer er mere end fire gange så stor som mængden i kontroldyrkningssubstratet, som ikke er tilsat n-valerianesyre.
Eksempel 7
Der foretages en dyrkning analogt med den i eksempel 3 beskrevne fremgangsmåde, idet dog substratet tilsættes n-valeriane-syre i stedet for DL- eller L-valin. Mængden af antibiotiket PS-6 akkumuleret i dyrkningssubstratet er mere end to gange så stor som mængden i kontrolsubstratet, som ikke er tilsat n-valerianesyre.
Eksempel 8
Der gås frem analogt med den i eksempel 5 beskrevne fremgangsmåde, idet der dog tilsættes n-valerianesyre i stedet for L-valin. Mængden af antibiotiket PS-6 akkumuleret i dyrkningssubstratet er mere end fire så stor som mængden i kontrolsubstratet, som ikke er tilsat n-valerianesyre.
Eksempel 9 100 ml af en podekultur fremstillet som beskrevet i eksempel 1 overføres til en 30 liter fermenteringsbeholder indeholdende 15 liter SE-4-substrat, og dyrkningen gennemføres under tvungen beluftning ved 28°C i 24 timer ved 200 omdrejninger pr. minut og under tilsætning af den sterile luft i en mængde på 7,5 liter pr. minut. 1 liter af substratet inokuleres i 100 liter AGB-42 substrat, som er tilsat 0,5% L-valin inden inokuleringen, i en 200 liter rustfri fermenteringsbeholder, og der foretages dyrkning under tvungen beluftning i en mængde på 50 liter pr. minut ved 28°C i 72 timer med 100 omdrejninger pr. minut. En prøve af dyrkningssubstratet centrifugeres, og i den ovenstående væske konstateres en antibiotisk styrke på 450 CCU/ml. Til dyrkningssubstratet sættes 3% (vægt/rumfang) perlitfilterhjælpemiddel (Topco Perlite, Topco No. 34, Toko Perlite Kogyo K.K.), og der filtreres gennem en filterpresse, hvorved fås 60 liter filtrat (samlet antibiotisk aktivitet: 25,5 x 10^ CCU).
35 145382
Alle de i det følgende anførte processer gennemføres under afkøling til under 6°C. Filtratet adsorberes på en søjle pakket med 6 liter ion-bytterharpiks "Diaion" PA-306 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.). Søjlen elueres med 20 liter 5%'s (vægt/rumfang) natriumchloridopløsning, og der fås en aktiv fraktion (A) indeholdende antibiotiket PS-5 og PS-6 (samlet antibiotisk aktivitet: 4,2 x ΙΟ** CCU) . Den på denne måde eluerede søjle anvendes senere til isolering af antibiotiket PS-7. Den aktive fraktion (A) sættes til en søjle med "Diaion" HP-20 harpiks (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) (3 x 70 cm), hvorefter der elueres med 10%'s vandig acetoneopløsning. Eluatet koncentreres under formindsket tryk til fjernelse af acetonen og sættes derpå til en søjle (2,4 x 22 cm) af "QAE-Sephadex" (Pharmacia Fine Chemicals Co.), som forinden er indstillet på pH-værdi-en 8,0 med 1/100 phosphatpufferopløsning, og elueringen gennemføres med en M/'IOO phospha tpuf feropløsning med en lineær na triumchlor id-gradientkoncentration på fra 1 til 0,4 M NaCl, og eluatet opsamles i 10 g fraktioner. De opsamlede fraktioner fortyndes 100 gange, og de aktive fraktioner udtages efter påvisning ved hjælp af UV-absorption og bioanalyse. Til fuldstændig fjernelse af det indeholdte antibiotikum PS-5 sættes den aktive fraktion til en søjle (1,2 x 40 cm) af "Diaion" HP-20 AG (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) og elueres med 300 ml vandig methanolopløsning med en lineær methanolgradientkoncentration på fra 10 til 75%. Der udtages fraktioner på 4 g. Hver fraktion underkastes papirchromatografi med nedhængende papir, og der fremkaldes med et blandet opløsningsmiddel sammensat af 120 ml acetonitril, 30 ml 1/10 M tris(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl pufferopløsning (pH-værdi 7,5) og 1 ml vandig 1/10 M natriumethylendiamintetraacetatopløsning (pH-værdi 7,5) hvorpå der analyseres ved hjælp af bioautografi. Der udtages aktive fraktioner fra nr. 25 til nr. 30 indeholdende antibiotiket PS-5 og aktive fraktioner fra nr. 33 til nr. 40 indeholdende antibiotiket PS-6. De aktive fraktioner indeholdende antibiotiket PS-6 koncentreres og frysetørres efter destillation af methanolen. Det således fremkomne lyo-fiserede produkt opløses i 1 ml M/100 phosphatpufferopløsning (pH-værdi 8,0), hvor det renses på en søjle (1,2 x 80 cm) med "Sephadex" G-10 (Pharmacia Fine Chemicals Co.) og fremkaldes med samme pufferopløsning. De aktive fraktioner opsamles og indstilles på pH-værdien 8,3 med fortyndet vandig natriumhydroxidopløsning, hvorpå de sættes til en søjle (1,2 x 20 cm) med "Diaion" HP-20 harpiks (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.). Elueringen foretages med 10%'s vandig acetoneopløsning til afsaltning. De aktive fraktion opsamles og frysetørres, og der fås 2,4 mg lyofiiiseret hvidt produkt 36 145382 af antibiotiket PS-6-natriumsalt. Søjlen med "Diaion" PA-306 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.), som er blevet elueret med natriumchloridopløsning og lagt til side med henblik på isolering af antibiotiket PS-7, elueres med 50¾'s (rumfang/rumfang) vandig methanol indeholdende 3% (vægt/rumfang) natriumchlorid, og der fås en aktiv fraktion (B) (samlet antimikrobiel aktivitet: 1,1 x 10^ CCU, 4,3%'s udbytte).
Eluatet af den aktive fraktion (B) koncentreres under formindsket tryk til fjernelse af methanolen, hvorpå det absorberes på en søjle (3 x 70 cm) pakket med "Diaion" HP-20 (Mitubishi Chemical Industries Ltd.) og elueres med 10%'s (rumfang/rumfang) vandig acetone. Eluatet opsamles i 25 g's portioner.
De aktive fraktioner blandes sammen og koncentreres under formindsket tryk til fjernelse af acetonen. Koncentratet adsorberes på en "QAE-Sephadex" (Pharmacia Fine Chemicals AB) søjle (2,5 x 30 cm) som forinden er pufret med M/1000 phosphatpufferopløsning med pH-vær-di 8,0, og der elueres med M-100 phosphatpufferopløsning med en lineær gradient af natriumchloridkoncentration på fra 0,1 til 0,7 M.
Eluatet opsamles i 17 g*s portioner. Hver portion analyseres under anvendelse af bioanalyse og papirchromatografi efterfulgt af bio-autografi, og fraktionerne fra nr. 25 til nr. 33, som indeholder antibiotiket PS-7 udtages og hældes sammen.
De blandede aktive fraktioner adsorberes på en søjle (1,1 x 20 cm) pakket med "Diaion" HP-20AG (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) og elueres med i alt 400 ml med en lineær acetonekoncentrationsgradient på fra 0 til 10%. Eluatet opsamles i 5 g1s portioner. Hver portion fortyndes 50 gange med henblik på ultraviolet spektroskopi. Fraktionerne fra nr. 15 til nr. 20, som indeholder antibiotiket PS-7, hældes sammen og lyofiliseres, hvorved fås antibiotiket PS-7 i rå form.
Til yderligere rensning af antibiotiket PS-7 opløses det lyofiliserede rå produkt i M/100 phosphatpufferopløsning med pH-værdi 8,0 og sættes en "Sephadex" G-10 (Pharmacia Fine Chemicals AB) søjle (1,2 x 80 cm), hvorpå der fremkaldes med samme phosphatpufferopløsning. De aktive fraktioner blandes og adsorberes på en "QAE-Sephadex" (Pharmacia Fine Chemicals AB) søjle (1,1 x 20 cm), som forinden er blevet pufret med M/100 phosphatpufferopløsning med pH-værdi 8,0, og der elueres med i alt 200 ml med en lineær natriumchloridkoncentrationsgradient fra 0 til 0,4 M. De aktive fraktioner hældes sammen. Til de sammenblandede fraktioner sættes natriumchlorid i en koncentration på 3% (vægt/rumfang). Opløsningen adsorberes på en "Diaion" HP-20AG (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) 37 145382 søjle (1,1 x 20 cm), og den aktive komponent elueres med 10%'s (rumfang/rumfang) vandig acetone og afsaltes. Den aktive fraktion lyofiliseres, og der fås 1,5 mg natriumsalt af antibiotiket PS-7 i form af et hvidt lyofiliseret produkt.
De således fremstilledes natriumsalte af antibiotiket PS-6 og PS-7 har følgende fysisk-kemiske egenskaber.
I. Antibiotiket PS-6 1) Farve
Stoffet er farveløst 2) Opløselighed
Stoffet er opløseligt i vand og praktisk taget uopløseligt i acetone.
3) Sønderdelingstemperatur
Tii bestemmelsen anvendes et Koflermikrosmeltepunktsapparatur BY-1 (YAZAWA Scientific Mfg. Co., Ltd.) med en temperaturstigning på l°C/minut, og stoffet udviser ikke noget klart smeltepunkt. Det begynder at blive blødt omkring 143°C og bliver gradvis brunt og begynder at svinde ind ved 165°C. Omkring 220°C ændres stoffets farve langsomt til brun (harpiks).
4) Ultraviolet absorptionsspektrum 60 mikrogram antibiotikum PS-6-natriumsalt opløses i 3,0 ml vand, og bestemmelsen foretages på et Hitachi dobbeltstråle-spektrofotometer model 200-20 (Hitachi, Ltd.). Det fremkomne spektrum er vist i fig. 1 på tegningen. Nedenfor anføres de karakteristiske værdier.
V H2° Λ _. = ca. 243,0 nm Λ mm.
\ H2° A = ca. 300,0 nm max. '
Til en vandig opløsning af dette stof i destilleret vand sættes en hydroxylaminopløsning (pH-værdi 7,5) i en sådan mængde, at koncentrationen af PS-6 er 20 /ig/ml og koncentrationen af hydroxylamin 10 mM. Efter 30 minutter ved 22°C har reaktionsblandingen mistet ca. 95% af den oprindelige optiske tæthed ved 300,0 nm.
38 145382 5) Infrarødt absorptionsspektrum
Det infrarøde absorptionsspektrum for antibiotiket PS-6--natriumsalt i KBr optaget på et Hitachi infrarødt spektrofotometer model 215 ( Hitachi, Ltd.) er vist i fig. 2 på tegningen. I det følgende anføres karakteristiske absorptionsmaksima ved de angivne bølgetal.
(i) ca. 1760 cm 1 (-CO- i β-lactamringen) (ii) ca. 1660 cm (-CO- i amidbindingen) (iii) ca. 1600 cm ^ (-COO®) (iv) ca. 1555 cm ^ (-CO-NH- i amidbindingen) 6) Protonkernemagnetisk resonansspektrum 100 MHz protonkernemagnetisk resonansspektret for antibiotiket PS-6-natriumsalt i tungt vand optaget på et JEOL NMR-spektro-meter JNM PS-100 (Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.) er vist i fig. 3 på tegningen. Der findes nedenstående karakteristiske signaler: (i) et par dubletter, som er centreret omkring 0,94 ppm og omkring 0,98 ppm CH., (J=ca. 7,0 Hz) CH“ } (ii) en skarp singlet omkring 1,92 ppm (CH,-CO-)
-3 I
(iii) en multiplet i området omkring 2,42-3,50 ppm (-CH2-, -CH-)
(iv) en multiplet i området omkring 3,90-4,20 ppm N
(-CH-) 7) Farvereaktion
Ehrlichreagensreaktion: positiv
Iod-chlorplatinsyrereaktion: positiv
Ninhydrinreaktion: negativ 8) Papirchromatografi
Antibiotiket PS-6 udviser følgende R^-værdier med Toyo filterpapir No. 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) og med de nedenfor anførte opløsningsmidler ved nedhængende papirchromatografi:
Acetonitril/tris puffer/EDTA (Note 1): R^ = 0,41 Ethanol/vand (7/3): R^ = 0,65 (Note 1: En opløsningsmiddelblanding sammensat af 120 ml acetonitril, 30 ml 1/10 M tris-(hydroxy1- methyl)aminomethan-HCl pufferopløsning (pH-værdi 7,5) og 1 ml vandig 1/10 M natriumethylendiamintetraacetat-opløsning (pH-værdi 7,5).
39 145382 9) Tyndtlagschromatografi (TLC)
Antibiotiket PS-6 underkastes tyndtlagschromatografering under anvendelse af chroraatogramplade 13254 cellulose (Eastman Kodak Co.) og under anvendelse af nedenstående opløsningsmidler, hvorved der opnås de i det følgende anførte R^-værdier. n-butanol/ethanol/vand (4/1/5) det øvre lag: = 0,67 n-propanol/vand (8/2): R^ = 0,69 n-butanol/i-propanol/vand (7/7/6): R^ = 0,70
Acetonitril/vand (8/2): Rf = 0,68 10) Høj spandingspapirelektroforese
Antibiotiket PS-6 analyseres ved hjælp af højspændings-papirelektroforese under de nedenfor anførte betingelser. Der anvendes et højspændingspapirelektroforeseapparatur fra firmaet Savant Instruments Co., højspændingskilde HV 3000A og fladpladeelektroforese, model nr. FP 18A. Det anvendte filterpapir til denne analyse er Toyo filterpapir nr. 50. Der opnås følgende resultater: Når elektroforesen gennemføres i 30 minutter under afkøling (under 4°C) ved et potentiale på 42 V/cm i en pufferopløsning (pH--værdi 8,6) indeholdende 3,3 g barbital og 25,5 g natriumbarbital i 3000 ml vand migrerer antibiotiket PS-6 28 mm mod anoden.
De ovenfor anførte fysisk-kemiske egenskaber viser, at molekylstrukturen for antibiotiket PS-6 fremstillet i dette eksempel kan gengives ved følgende formel CH~ CH--CH·—. _^VS-CH2-CH2-NH-C0CH3
j—'^XcOOH
De nedenfor anførte biologiske egenskaber opnås med det ifølge dette eksempel fremstillede natriumsalt af antibiotiket PS-6: 1) Antimikrobielt spektrum
Den minimale hæmningskoncentration for natriumsaltet af antibiotiket PS-6 bestemmes på forskellige patogene mikroorganismer, herunder resistente stammer, ved hjælp af substratfortyndingsmetoden under anvendelse af hjerne-hjerte-infusionssubstrat "Eiken" (Eiken Chemical CO., Ltd.).
40 145382
Natriumsaltet af antibiotiket PS-6 opløses i hjerne-hjerte-infusionssubstrat "Eiken" (Eiken Chemical CO., Ltd.) (pH-værdi 7,0) i koncentrationer i området 5-100 /ig/ml. Der foretages passende fortyndingsserier under anvendelse af det samme flydende substrat.
De i den efterfølgende tabel V anførte mikroorganismer dyrkes i 18 timer i hjerne-hjerte-infusionssubstrat "Eiken" ved 28°C og inokuleres til fortyndingsrækkerne af antibiotiket PS-6 i en slut-podemængde på 1 x 10^ celler/ml. Efter henstand af kulturerne ved 35°C i 20 timer aflæses mikroorganismevæksten i hver fortynding af antibiotiket PS-6. Den minimale hæmningskoncentration er den laveste koncentration af antibiotiket PS-6-natriumsalt, hvor der ved visuel bedømmelse ikke konstateres nogen vækst af den pågældende mikroorganisme. Som kontrol opløses to. kendte β-lactamantibiotika, cefazorin og cefoxitin i hjerne-hjerte-infusionssubstrat med pH-værdien 7,0 i koncentrationer fra 1/ig/ml til 100/ig/ml, hvorefter der fremstilles flere fortyndingsrækker i det flydende substrat, og de behandles som beskrevet ovenfor i forbindelse med bestemmelserne af den minimale hæmningskoncentration. De opnåede resultater er anført i tabel V, Foruden de minimale hæmningskoncentrationer for antibiotiket PS-6 er anført referenceværdierne for cefazorin og cefoxitin.
41 145382 i—l s c νΓ·Η OO O m m i£> in LD LD O LD <N <N m OCNtn -H s ·>.->·«»*»«» «· ·*·*·** 'w-r v CviCMLnCM.HHrHOOVDCNlOp o o m rH ο o
rj Ilj r—} H rH
0 φ Λ Λ Λ s υ .........
id-- +3 c ιπ ^ β·Η ιηο μ ιη ο κι inn _ _ τ| α) ί_ι cviinOi-HCNinc» oji-i in ο ο
β 8 ΟΟΗΟΟΟνΟΟΟιΟπΟΟΟΙΛνΟΟΟ W
nit* o o OoocMOin S
1¾ *??*** I
c u ^ 1 ~ B1 5
JZ Λ 5 I
,_ijj μ μ Is n iD m Uflj i^Q (ηρ-,^,ΗΓΟΓηιηιηοιηιηοοο^ιηιηιη ® n OCJHOOrHHCNOMWiniiTinvOCNCNM I <> „ !> C-lHO 1-HinHrHOJCNlCN HrHiH -H T3 •h +J i § 9 a! S *2 2 ^ 0 -¾ 9 * b 5 2 __1-------------------------------- C -H to
E"1 *r4 0 <U
0 >1 Λ >i g
S 4J O
c c r-i ns <u λ cn +j id Μ M Ul Μ 0 0 -Η
(U <W M-l -H
% C +J
H C Μ M
η m Sfc Λ 03 <U M
g g 3 Π'* * ^ 0 § ω ? 3 S & ? £ ο * * * *2 1¾¾¾ giS£gS?!oæ7 Så * Ills g « « . . a i-ώ V “ * ώ . * * * ;
tn tn in id <u u coo) 2 « '’L M
ρ ρ ρ ·η β ih w ·η id oo φ c m r-- i ι-ημμλ aJ φ <u π <u λ; ·η ·η in -^i i id φ i i cu co J.2P5 MMMOtn HOPCMUdiatli I (XL^Min pppsomidciuo S P m 9 ro 01 m· & & pidHJP>iHOPU§ .OMM-H -r]OJ il J5 * Ϊ ΦΟιΗΦΦΐηρΟιΗφτΗί^ΗΟ)· T IN η •'ί <v in w in fi -ΗΐΰΜΦΦίοοιβ ΜΦ·^ i ft ·; C pppoJtn-PM-lM-lOfi Id O' Λ Ο Μ Φ ω OUO p .Q MftMMHU'+J'd +j •r-ι ouuraopinMid φφφΗ·υΜ·Φ 0 β ΟΟΟΡϋβ(υΦβιΟ·1-)4-ϊ·ΜΡΦ·Ηθ4·Η 53 3 S8Su0 B+J H00u5nainu rn oooooMaiurtr-iididid O >,>1>iU-P.-l-wIQ4->'HaOOPPD3T3 o ΓϊΛ,βΟΟι'-Ι'-ΙΟβίηΜΜΜΦΦΦΦ'Η Μ ΛΟιΡ4ΓΗΦ·Ηβ>ΗΜΛΦΦΦ-^·^·^·^&
Jsi pflPDiMUU+JSHlU'P-M-PppppO
g 101010000^01/31^1111111¾¾¾¾¾¾ 42 145382 2) Potenserende og synergistisk virkning på den antimikrobielle aktivitet af kendte β-iactamforbindelser mod β-lactamresistente mikroorganisme^^_ 10 ml fortyndet næringsagar (pH-7,0) fortyndet 2,5 gange og indeholdende 50 /ig/ml penicillin G eller cephaloridin podes med β-lactamaseproducerende og β-lactamresistente mikroorganismer og hældes i en Petriskål med en diameter på 9 cm, hvorved der fås en bioanalyse-agarplade. På denne analyseplade anbringes 8 mm pulpskiver hver indeholdende 20 /il af en opløsning af antibiotiket PS-6 i en koncentration på 240 /ig/ml, og der inkuberes ved 35°C i 18 timer inden hæmningszonerne måles. En kontrolanalyseplade fremstilles på tilsvarende måde men uden indhold af penicillin G eller cephaloridin. Som referenceantibiotika analyseres 10.000 jig/ml penicillin G eller 20 /il cephaloridin under samme betingelser. Resultaterne er anført i den efterfølgende tabel VI.
Det fremgår af de i tabel VI anførte resultater, at tilsætningen af antibiotiket PS-6 til penicillin G eller cephaloridin i en koncentration under den påviselige grænse bevirker en klar synergistisk virkning mod β-lactamresistente mikroorganismer. Tilsætningen af penicillin G eller cephaloridin i stedet for antibiotiket bevirker ingen synergistisk virkning.
43 145382 c Η τ) •Η μ Οίηοο οοο ο ο ο ^ ' ·*>*> (doomtNj ιηοίΝ νο ο Η ,C Ν Η Η μ 1-1 Ν Η Ό Λ — cd ω I e Ο <υ ο c ο c Ν -Η m η en ή ΰ -Η οοο οοο οοο •Η ο-» - V»·. » *· ' c! -γΗοιΠΓΊ ΓΟΟίΝ ΟΊ Ο ι-Η g Ά C Μ Η Η CN Η <Ν Η 3 ο <ϋ κ ε α Η > Η 0 Η ΡΟΟΟΟΟΟΟΟΟ d) 4-J ** *» κ ** »* * «»·* *« ,υ ρ| ιη ΓΊ CN Ο (Μ Ο Ο .Η
(ΰ Ο Η ι—I r—1 CN rH CN i I
&Η K__ ο c ο c ο c Η -Η Ή 0) CO C 13 C 13 Γφ ·Η -Η *Η -Η -Η ·Η
ίΟ r—l C Ή Μ ι—I C
Η Η Ο Ή Ο Η Ο flj ·Η Η *Η t—I -Η ι—Ι ο Λ υ ιβ ο re VO ·Η Λ ΙΟ Ή ί ίο Ή ί ico. ι α α ι α α.
en ο α> en α) <u en cd <u
CLiCUU OjC^O 1¾ & U
•p c CD 00
•P CD H
ω g ι •h en m o cn m ή ι Μ ι a) c cu a) m m p ni -p c g cji m ο ή ra ai
(¾ s-l m -H ifl -Η -HU
+J0 CP £! Ό -P tn υο <0 nj oc c <u re p -pen PC P ej
r-ι,ν Ο Ή -P 0) PP
I -H p C Ή P ¢) ni 1 mg a. > uu eng 44 145382 3) In vivo-virkning
Den terapeutiske virkning af natriumsaltet af antibiotiket PS-6 undersøges ved behandling af mus, som er blevet inficeret in-traperitonealt med 5 x 10^ celler/mus af Staphylococcus aureus Smith. Kort tid efter inficeringen injiceres en vandig opløsning af natriumsaltet af antibiotiket PS-6 subcutant. Med DDY hanmus (Shizuoka) som forsøgsdyr fås en 50%'s kurativ dosis på 5,2 mg/kg.
4) Toksicitet
En vandig injektionsopløsning af natriumsaltet af antibiotiket PS-6 injiceres intraperitonealt til DDY hanmus (Shizuoka) i en dosis på 500 mg/kg. Der registreres ingen akut toksicitet.
5) Følsomhed over for kendte β-lactamaser (egenskaber ved antibiotiket PS-6 som enzymsubstrat) _ Følsomheden over for β-lactamase af natriumsaltet af antibiotiket PS-6 som enzymsubstrat undersøges mod exo-penicillinase fra Bacillus licheniformis 749/C (ATCC 25972) og inducerbar penicillinase fra Bacillus cereus 569 (ATCC 27348) under nedenstående reaktionsbetingelser: (A) Reagens (1) Substrat
Natriumsaltet af antibiotiket PS-6 opløses i 25 nM phosphat-puffer (pH=6,8) i de angivne koncentrationer.
(2) β-Lactamase (a) Exo-penicillinase fra Bacillus licheniformis 749/C (ATCC 25972). Renset under anvendelse af cephalexin-Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals AB) affinitetssøjlechromatografi. Dette enzymapparat har en styrke på 16.600 enheder/ml når hydrolysen af penicillin G kalium måles ved hjælp af iodometri ved 30°C i en M/10 phosphatpuffer med pH-værdi 6,8. En enhed penicillinase er den mængde af enzymet, som kan hydrolyseres 1 mikromol penicillin G i 60 minutter ved 30°C ved en pH-værdi på 6,8.
(b) Inducerbar penicillinase fra Bacillus cereus 569 (ATCC 27348). Denne β-lactamase induceres ved hjælp af ampicillin og renses ved søjlechromatografi på CM-cellulose. Dette præparat har en titer på 26.900 penicillin G kaliumenheder/ml.
45 145382 (B) Reaktions- og analysebetingelser
Til en 1 cm kvartskuvette indeholdende 3 ml af den pufrede opløsning af natriumsaltet af antibiotiket PS-6 ved 30°C sættes 3-lactamase i de angivne mængder, og der foretages straks grundig blanding for at starte reaktionen. Tidsforløbet for hydrolysen følges ved 30°C ved at bestemme formindskelsen i optisk tæthed ved 301 nm, som svarer specifikt til koncentrationen af antibiotiket PS-6. Som anført i beskrivelsen til dansk patentansøgning 1% nr. 1936/78 giver natriumsaltet af antibiotiket PS-5 en cm værdi på 267,5 ved Xmax på 301 nm. Hvis dette stof ikke indeholdt krystallisationsvand ville epsilonværdien være 8560.
Da 5% af den optiske tæthed fra starten for antibiotiket PS-5 ved 301 nm stadig er tilbage selv efter fuldstændig sønderdeling med hydroxylamin eller 3-lactamase, antages forskellen i optisk tæthed for dette substrat ved 301 nm at være = 8132. Dette antages at kunne anvendes på antibiotiket PS-6, og der gennemføres følgende beregning.
(C) Resultater (a) Exo-penicillinase fra Bacillus licheniformis 749/C.
0,5 ml af ovennævnte enzympræparat og 2,5 ml af substratopløsningen indeholdende 30 nyi, mol af antibiotiket PS-6 blandes (slutkoncen-tration for antibiotikum PS-6 = 10 pmol/ml = 3,3 /ig/ml, optisk tæt^-hed ved start ved 301 nm = 0,086), og der inkuberes i 15 minutter under de ovenfor anførte betingelser uden væsentlig hydrolyse af antibiotiket PS-6.
(b) Inducerbart penicillinase fra Bacillus cereus 569. Tidsforløbet for hydrolysen af antibiotiket PS-6 ved hjælp af denne 3-lactamase følges under de ovenfor beskrevne betingelser ved at bestemme den optiske tæthed ved 301 nm for reaktionsblandingerne indeholdende 7,5/ul af ovennævnte enzympræparat og 77,5 pmol af antibiotiket PS-6 som substratet i alt 3,0 ml (slutkoncentration af antibiotiket PS-6 = 25,8 pmol/ml = 8,63 ug/ml, optisk tæthed ved 301 nm = 0,366).
Ud fra disse data beregnes Km-værdien til 17,7yuM under anvendelse af metoden ifølge Shyun-Long Yun og H. Clarence Suelter (Biochemica et Biophysica Acta, bind 480, side 1-13, 1977).
II Antibiotiket PS-7 1) Farve stoffet er farveløst 2) Opløseliqhed
Stoffet er opløseligt i vand, men praktisk taget uopløseligt i acetone.
46 145382 3) Sønderdelingstemperatur
Stoffet har ikke noget veldefineret smeltepunkt, og det bliver gradvist blødt ved 145-150°C, krymper sammen og virker størknet med farve ved 220°C ved måling under anvendelse af Kofler's metode under anvendelse af en temperaturstigningshastighed på 1°C pr. minut og under anvendelse af et mikrosmeltepunktsapparatur af typen BY-1 (Yazawa Kagaku Kikaikogyo Co.).
4) Ultraviolet absorptionsspektrum
Det ultraviolette absorptionsspektrum optaget ved måling på en opløsning indeholdende 45 mikrogram af natriumsaltet af antibiotiket PS-7 i 3 ml M/100 phosphatpuffer (pH-værdi 7,0) med et Shimadzu Digital dobbeltstrålespektrofotometer UV 210A er vist i fig. 4 på tegningen. De karakteristiske værdier er som følger: \ H2° = ca. 220,0 nm og max ^H2® = ca. 308,0 nm max
Ca. 95% af absorbansen ved 308,0 nm går tabt, når en vandig hydroxylaminopløsning med pH-værdi 7,5 sættes til en deioniseret vandig opløsning af stoffet, hvor koncentrationen af stoffet og hydroxylamin er indstillet på henholdsvis ca.
20 ;ug/ml og 10 mM, og blandingen inkuberes ved 22°C i 30 minutter.
5) Infrarødt absorptionsspektrum
Det infrarøde absorptionsspektrum målt i en KBr tablet under anvendelse af et Hitachi infrarødt spektrofotometer type 215 er vist i fig. 5 på tegningen. De karakteristiske maksimumabsorptionsbølgelængder er som følger: (i) ca. 1760 cm 1 (-CO- fra β-lactamring) (ii) ca. 1670 cm 1 (-C0- fra amid) (iii) ca. 1620 cm"1 (-C00® og -CH=CH-).
47 145382 6) Protonkernemagnetisk resonansspektrum 100 MHz protonkernemagnetisk resonansspektret målt i tungt vand ved hjælp af et Nihon Denshi JNM type PS-100 apparatur er vist i fig. 6 på tegningen. De karakteristiske signaler er som følger:
CH
(i) en triplet centreret ved ca. 0,96 ppm ( — 3\ ) CH2- (ii) en mulitplet centreret ved ca. 1,72 ppm (-CH^CH^) (iii) en skarp singlet ved ca. 2,05 ppm (CH^-CO-) (iv) en multiplet ved ca. 2,96-3,38 ppm (-CH2-, N~CH-) (v) et signal centreret ved ca. 3,96 ppm (-CH-) (vi) et par dubletter centreret ved ca. 6,06 ppm og ca. 1,76 ppm (J = ca. 14 Hz) (-CH=CH-) 7) Farvereaktion
Ehrlich-reagensreaktion: positiv lod-chlorplatinsyrereaktion: positiv
Ninhydrinreaktion: negativ 8) Papirchromatografi
Antibiotiket PS-7 giver følgende Rf-værdier ved papirchroma tograf i med nedhængende papir på Toyo filterpapir nr. 50 (Toyo Roshi CO.) med følgende opløsningsmiddelsystem: Acetonitril/Tris/EDTA1^: Rf = 0,41 Ethanol/vand (7/3): R^ = 0,68 9) Tyndtlagschromatografi (TLC)
Antbiotiket PS-7 giver nedenstående R^-værdier ved tyndtlags-chromatografi under anvendelse af cellulosechromatogramplade 13254 (No. 6065) (Eastman KOdak Co.) med følgende opløsningsmiddelsystem: n-Butano1/ethano1/vand (4/1/5) (øvre lag): R^ = 0,65 n-Propano1/vand (7/3): R^ = 0,81 n-Butanol/isopropanol/vand (7/7/6): Rf = 0,71
Acetonitril/vand (8/2): R^ = 0,65 48 145382 10) Hø j spændingspapirelektroforese
Der konstateres følgende migrering med antibiotiket PS-7 ved elektroforese på Toyo filterpapir nr. 50 med en pufferopløsning med den nedenfor anførte pH-værdi under anvendelse af et højspændings-papirelektroforeseapparatur fra firmaet Savant Instruments Co., højspændingskilde HV 3000A, elektroforesebeholder Fp 18A.
Antibiotiket PS-7 migrerer mod anoden over en længde på 28 mm i en pufferopløsning bestående af 3,3 g barbital, 25,5 g natriumbarbital og 3000 ml vand (pH-værdi 8,6) ved gennemledning af en strøm ved 42 volt/cm i 30 minutter.
De ovenfor anførte fysisk-kemiske egenskaber viser, at antibiotiket PS-7 fremstillet i dette eksempel har følgende molekylstruktur:
O
CH,-CH,-,_^sS-CH=CH-m-Z-CH3
3 2J~OC
cr xooh
Natriumsaltet af antibiotiket PS-7 fremstillet i dette eksempel har de i det følgende anførte biologiske egenskaber.
1) Antlmikrobielt spektrum
De minimale hæmningskoncentrationer bestemmes under anvendelse af forskellige pathogene stammer, herunder resistente stammer for antibiotiket PS-7 under anvendelse af substratfortyndingsmetoden med et hjerne-hjerteinfusionssubstrat "Eiken" (Eiken chemical Co., Ltd.).
Natriumsaltet af antibiotiket PS-7 opløses og fortyndes med hjerne-hjerteinfusionssubstratet "Eiken" til koncentrationer mellem 5 /ig/ml og 100 /lg/ml. Opløsningen fortyndes yderligere med det samme substrat til dannelse af en række geometriske koncentrationer. Til rækkefortyndingerne sættes podekulturer fremstillet ved rystedyrkning af forskellige testorganismer anført i tabel V i hjerne-hjerteinfusionssubstratet ved 28°C i 18 timer, idet det 5 endelige celletal er ca. 1 x 10 /ml. Cellevæksten undersøges efter inkubation ved 35°C i 20 timer. Den laveste koncentration, ved hvilken der ikke konstateres cellevækst, er den minimale hæmningskoncentration for antibiotiket PS-7 over for testorganismen. Som kontrol opløses de kendte antibiotika cephazolin og cephoxitin i hjerne--hjernteinfusionssubstratet ved pH-værdien 7,0 i en koncentration mellem 1 og 100 /ug/ml, og der fortyndes geometrisk med samme substrat til dannelse af rækkefortyndinger. Den minimale hæmningskoncentration 49 145382 på testorganismerne bestemmes på samme måde som beskrevet ovenfor. Resultaterne er anført i tabel VII. Til sammenligningsformål er resultaterne med de kendte antibiotika cephazolin og cephoxitin også anført i tabel VII.
Tabel VII
Minimal hæmningskoncentration
Mikroorganisme ""
Antibiotikum Cephazolin Cefoxitin PS-7
Staphylococcus aureus FDA 209P <0,19 0,25 2,50
Diplococcus pneumoniae type III <0,19 0,125 2,50
Alcaligenes faecalis B-326 0,78 6,25 1,56
Citrobacter freundii E-9X 3,13 >100 >100
Enterobacter cloacae E-16X 6,25 ;>100 s100 x β-lactamaseproducerende stamme an
Substratet tilsættes hesteserum i en mængde på 10%.
2) Potenserende og synergistisk virkning på den antimikrobielle aktivitet af β-lactamantibiotika mod β-lactamresistente mikroorganismer_
Cephaloridin sættes til et næringsagarsubstrat, der er fortyndet 2,5 gange, og som har pH-værdien 7,0, og substratet inoku-leres med en β-lactamproducerende stamme, som danner β-lactamase.
10 ml af substratet udhældes og fordeles i en petriskål med en diameter på 9 cm, hvorefter substratet størkner til dannelse af en analyseplade. Antibiotiket PS-7 opløses i en koncentration på 50 /ig/ml eller 29 /tg/ml. I 20 /il af opløsningerne samt de 2-dobbelte og 4-dobbelte fortyndinger deraf udblødes en pulpskive med en diameter på 8 mm. Pulpskiven anbringes på overfladen af ovennævnte analyseplader, og størrelsen af væksthæmningszonen omkring skiven bedømmes efter 18 timers inkube-ring ved 35°C. Som kontrol gennemføres samme forsøgsrække med samme substrat, der dog ikke er tilsat cepholoridin. Til yderligere sammenligning gennemføres en lignende forsøgsrække med pulpskiver udblødt i 20 /il 10.000 ;ug/ml penicillin G opløsning eller 10.000 /ig/ml cephaloridinopløsning i stedet for antibiotiket PS-7. Resultaterne er anført i nedenstående tabel VIII.
50 145382
Tabel VXII
(3-lactam-resistent Diameter af hæmningszone (mm) stamme Skive - — —— cephaloridin- ingen tilsætning ti^sætning
Antibiotikum PS-7 ixl 0,0 19,0 x2 0,0 15,0 x4 0,0 11,0
Penicillin G 15,0 15,0
Cephaloridin 12,0 12,0
Antibiotikum PS-7 'xl 12,5 13,5
Citrobacter J
freundn E-9 ' jc4 0,0 0,0
Penicillin G 0,0 0,0
Cephaloridin 12,0 12,0
Antibiotikum PS-7 (xl 11,0 18,0 x2 0,0 14,0 x4 0,0 0,0
Penicillin G 0,0 0,0
Cephaloridin 11,0 11,0
De ovenfor anførte resultater viser, at der ved tilsætning af antibiotiket PS-7 opnås tydelig forøgelse af den antimikrobielle virkning på β-lactamresistente stammer af penicillin G eller cephaloridin i sådanne koncentrationer, hvor der uden tilsætning ikke konstateres nogen antimikrobiel virkning. Der konstateres ingen forøgelse af den antimikrobielle virkning ved tilsætning af penicillin G eller cephaloridin i stedet for antibiotiket PS-7.
3) In vivo-virkning
Virkningen af det ovenfor fremstillede antibiotikum PS-7 påvises under anvendelse af mus, som intraperitonealt er inficeret 5 med Staphylococcus aureus Smith i en mængde på 5 x 10 celler pr. mus. Natriumsaltet af antibiotiket PS-7 indgives subcutant til musene umiddelbart efter inficeringen. Med DDY hanmus (Shizuoka) opnås en 51 145382 CD5o-værdi På 7,5 mg/kg.
4) Toksicitet
Ved intraperitoneal indgift af natriumsaltet af antibiotiket PS-7 til DDY hanmus (Shizuoka) konstateres ingen akut toksicitet.
5) Følsomhed over for kendte β-lactamaser (egenskaber ved antibiotiket PS-7 som enzymsubstrat)_
Virkningen af antibiotiket PS-7 i form af natriumsaltet som substrat over for penicillinase af den inducerede type produceret af Bacillus cereus 569 (ATCC 27348) undersøges på følgende måde: (A) Reagenser (1) substrat:
Natriumsaltet af antibiotiket PS-7 opløses i 100 mM phosphat-pufferopløsning (pH-værdi 6,8) i den angivne koncentration.
(2) β-lactamase:
Penicillinase af den inducerede type fra Bacillus cereus 569 (ATCC 27348) induceres ved hjælp af ampicillin og der foretages delvis rensning ved søjlechromatografering under anvendelse af CM-cellu-lose (Brown Co.). Enzympræparatet har en enzymstyrke på 14.800 enhe-der/ml med kaliumsaltet af penicillin G som substrat.
(B) Reaktions- og analysebetingelser.
Opløsningen af antibiotiket PS-7, der tjener som substrat, opvarmes til 30°C. 3,0 ml af opløsningen hældes i en kvartskuvette med en optisk vejlængde på 1 cm, og reaktionen startes ved tilsætning og blanding af den angivne enzymmængde. Reaktionen gennemføres ved 30°C, og en formindskelse af substratet, antibiotiket PS-7, registreres ved hjælp af absorbansen ved 308 nm.
Restabsorbansen ved 308 nm bestemmes til £ = 9720 ud fra den . forudsætning, at £-værdien for antibiotiket PS-7 er 10.800 baseret på formindskelsen af absorbensen, når antibiotiket PS-7 i ren form spaltes fuldstændigt under anvendelse af ovennævnte enzym.
(C) Resultater.
En reaktionsblanding indeholdende 10 /il af penicillinasepræpa-ratet og 102 mol af antibiotiket PS-7 (slutkoncentration 34 nyu mol/ml) i et samlet rumfang på 3,0 ml inkuberes under de ovennævnte betingelser, og formindskelsen af koncentrationen af antibiotiket PS-7 bestemmes i relation til inkubationstiden.
52 145382
Under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Shyun-Long Yun og Η» Clarence Sudlter's fremgangsmåde, Biochemica et Biophysica Acta 480, 1-13 (1977) beregnes Km-værdien ud fra ovenstående resultater til 13,0 /am i PS-7.
Eksempel 10
Tritylesteren af antibiotiket PS-6 25,9 mg af det frysetørrede antibiotikum PS-6-natriumsalt fremstillet analogt med den i eksempel 9 beskrevne fremgangsmåde opløses i 5 ml dimethylformamid, og der tilsættes 20 jul triethylamin og derpå 50 mg tritylchlorid.
Efter omrøring ved stuetemperatur i 3 timer fortyndes reaktionsblandingen med 200 ml benzen og vaskes 3 gange med 70 ml 0,1 M phosphatpufferopløsning (pH-værdi 6,8). Efter dehydratisering ved tilsætning af 3 ml mættet vandig natriumchloridopløsning tørres benzenopløsningen ved tilsætning af vandfri natriumsulfat. Benzenet destilleres under formindsket tryk, og der fås ca. 0,5 ml benzenopløsning, som ledes gennem en søjle (1,2 x 96,0 cm) med "Bio-Beads" S-X3 (Bio-Rad Laboratories). Søjlen fremkaldes med benzen. De således fremkomne aktive fraktioner kombineres og koncentreres til tørhed under formindsket tryk. Remanensen opløses i 0,5 ml acetone og sættes til en søjle (1,2 x 96,0 cm) med "Sephadex" LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals AB), som forinden er kvældet med acetone, og søjlen fremkaldes med acetone. De aktive fraktioner kombineres og koncentreres til tørhed under formindsket tryk, hvorved der fås 23,7 mg af et hvidt pulver. Ved omkrystallisation af dette pulver i en blanding af benzen og n-hexan fås 17,5 mg af tritylesteren af antibiotiket PS-6 i form af et farveløst krystallinsk pulver.
Dette farveløse krystallinske pulver har følgende fysisk--kemiske egenskaber: 1) Farve
Farveløst 2) Ultraviolet absorptionsspektrum
Det ultraviolette absorptionsspektrum for tritylesteren af antibiotiket PS-6 optages på et Hitachi dobbeltstrålespektrofotome-ter model 200-20 (Hitachi, Ltd.) ved en koncentration på 100 jug/3 ml methanol.
λmax - 315'° ^ 53 145382 3) IR-absorptionsspektrum 200 /ig af tritylesteren af antibiotiket PS-6 opløses i 0,3 ml CHCl^, og det infrarøde absorptionsspektrum optages under anvendelse af et Hitachi infrarødt spektrofotometer model 260-30 (Hitachi Limited) under anvendelse af en KBr-fikseret celle. Det infrarøde absorptionsspektrum er vist i fig. 7 på tegningen.
Der findes følgende karakteristiske absorptionsmaksima ved de angivne bølgetal: (i) ca. 1780 cm 1 (-CO i β-lactamringen) (ii) ca. 1700 cm ^ (-CO- i amidbindingen) “1 Θ (iii) ca. 1675 cm 1 (-C00 i esterbindingen).
4) Opløselighed
Opløseligheden af trityleringsproduktet af antibiotiket PS-6 bestemmes ved under rystning at opløse 5 mg af trityleringsproduktet af antibiotiket PS-6 i 0,1 ml af de nedenfor anførte opløsningsmidler ved 20°C. Der opnås følgende resultater:
Praktisk taget uopløseligt i vand og n-hexan,
Let opløselig i benzen, ethylacetat, chloroform, methanol, ethanol, acetone, dimethylformamid (DMF) og dimethylsulfoxid (DMSO).
5) Farvereaktion
Ehrlich-reagensreaktion: positiv
Iod-chlorplatinsyrereaktion: positiv
Ninhydrinreaktion: negativ 6) Tyndtlagschromatograf1 (TLC)
Tritylesteren af antibiotiket PS-6 giver nedenstående R^-vær-dier under de anførte betingelser. Migreringen påvises ved bioautograf i på Comamonas terrigena B-996.
Silicageltyndtlagschromatograferingsplader (Merck, kiselgel 60 F254) anvendes, og inden anbringelse af pletterne anbringes 2,5/il acetoneopløsning indeholdende 10% dimethylformamid. Der fås følgende R^-værdier:
Opløsningsmiddelsystem: benzen/acetone (2/1): R^ = 0,37 benzen/ethylacetat (1/8):
Rf = 0,34
Ud fra molekylstrukturen af antibiotiket PS-6 og de ovenfor anførte fysisk-kemiske egenskaber for tritylesteren af antibiotiket PS-6 antages tritylesteren af antibiotiket PS-6 at have følgende struktur: 54 145382 ?H3 s-ch~-ch9-nh-coch, ^C. o ^ coo-c- o o
De biologiske egenskaber for tritylesteren af antibiotiket PS-6 omtales nærmere i det følgende: 1) Antimlkrobielt spektrum
Den minimale hæmningskoncentration for forbindelsen på forskellige patogene mikroorganismer, herunder flere resistente stammer, bestemmes under anvendelse af substratfortyndingsmetoden » med hjerne-hjerteinfusionssubstrat "Eiken” (Eiken Chemical Co., Ltd.).
Ved denne bestemmelse opløses tritylesteren af antibiotiket PS-6 i en lille mængde methanol og fortyndes hurtigst muligt i hjerne--hjerteinfusionssubstrat "Eiken" (pH-værdi 7,0} (Eiken Chemical Co., Ltd.), indtil koncentrationen af tritylesteren af antibiotiket PS-6 ligger i området fra 40 yug/ml til 20 jig/ml, og koncentrationen af methanol i den færdige opløsning ikke overstiger 10%. Denne opløsning fortyndes i en dobbelt geometrisk række. Mikroorganismerne anført i tabel IX dyrkes i 18 timer ved 28°C i hjerne-hjerteinfusionssub-strat "Eiken" og inokuleres til ovennævnte fortyndingsrække i en 5 slutpodemængde på 1 x 10 celler/ml. Resultaterne aflæses efter inkubering ved 35°C i 20 timer. Den minimale hæmningskoncentration er den laveste koncentrationsenhed af trityleringsproduktet af antibiotiket PS-6, hvor der ikke konstateres nogen vækst af mikroorganismen under de ovenfor beskrevne betingelser. Som kontrolantibiotika fremstilles opløsninger af ampicillin og cephaloridin i hjerne-hjerteinfusionssubstrat "Eiken" (pH-værdi 7,0) i en koncentration på 100 ug/ml, og de behandles på samme måde som tritylesteren.
I nedenstående tabel IX anføres de minimale hæmningskoncentrationer for tritylesteren af antibiotiket PS-6 sammen med de med cephaloridin som kontrolantibiotikum opnåede kontrolværdier.
55 145382
i—I
ε c \ ft !ji T3 3- ft β ft ft Γ0
Ο Ο Ο O ft O
β ft » - ' *· * 0 3ooorooooo
•H xl fM Ο Ο O
X) Oi ft ft ft 3 3 A λ λ u o X) β 3 ϋ--—- β Ο Μ
CO
CJl CO β I H CO
β βι 'β g n ro ro ^ 0) 0 1 Η nrnnnomoo S1-1 XJ i>i CO ΧΪ χ) OOOftOCNLnin ·Η J) i—C ft (N ft (N ΓΜ βχ)
3 β 3 CD
g Eh O’ ® •η β χ; β ο X ft <#>
Η S 3 O
Ό Η 1—I ----— — 3 tu ωχ) Λ β 3
(0 0) CD
ΕΗ Ο ft 3 ·Η
* t) 4J
* Ο Η β Μ ft η ο- a cd σ\ Η 1 3 Ο CD χ) μ ω tn , μ. roe) • a ι to * ε χ) <; >ι >t cn γί * to 33 QE-iSSfniat ft χ) β ft I X I I OX> 3 to ffl pq ft 33 3 3 0 0) * ft J3 3 ft fi to 3 ft tn 3 13 cu c a) ft ft ft i 3 ca cd hOtPftfiOftO „ ± 3 ε O 3 Ο β 3 33>i0g3CD0 Λα) ft 3 3 a) ft ft
3 CD3 3 3 β β U
g 3 aJ to m e m 3 3 CD ϋ 3 ftl tr β χ) •η o to u to β ft 3 o
C 0303333X) Z
3 0003ftX>>0 tn O O O 3 ft O 3 β ft00033caX3 O >ιϋχ)·Η·ΗΧ!30 ΟΧίΟΛΉΜΟΦβ β &.Η33Χ!βΧ)3 χ; 3αβοα)χ)οχ> ft X) ft X) ι—I ft ft β β SWQCOCftUiftft 56 145382
Det fremgår af de ovenfor anførte data, at tritylesteren af antibiotiket PS-6 har bredspektret antimikrobiel virkning og særlig kraftig antibiotisk virkning på forskellige β-lactamresisten-te (β-lactamaseproducerende) mikroorganismestammer.
2) In vivo-virkning
In vivo-virkningen af trityleringsproduktet af antibiotiket PS-6 bestemmes på mus, som intraperitonelt inficeres med 5 x 10^ celler pr. mus af Staphylococcus aureus Smith. Trityleringsproduktet af antibiotiket PS-6 injiceres subcutant efter inficeringen. 50%'s kurativ dosis på han DDY mus (SHIZUOKA) er 5,5 mg/kg.
3) Toksicitet
Med DDY hanmus (Shizuoka) konstateres ingen akut toksicitet med tritylesteren af antibiotiket PS-6 ved en intraperitoneal dosis på 500 mg/kg.
Eksempel 11 24,5 mg af natriumsaltet af antibiotiket PS-7 i form af et hvidt frysetørret produkt fremstillet på samme måde som beskrevet i eksempel 9 opløses i 5 ml dimethylformamid, og der tilsættes 20 /il triethylamin og derpå 50 mg tritylchlorid. Efter omrøring ved stuetemperatur i 3 timer fortyndes reaktionsblandingen med 200 ml benzen og vaskes 3 gange med 70 ml 0,1 M phosphatpufferopløsning (pH-værdi 6,8). Efter dehydratisering ved tilsætning af 3 ml mættet vandig natrium-chloridopløsning tørres benzenopløsningen ved tilsætning af vandfri natriumsulfat. Benzenet destilleres delvis under formindsket tryk, og der fås ca. 0,5 ml af benzenopløsningen, som derpå ledes gennem én søjle (1,2 x 96,0 cm) med "Bio-Beads" S-X3 (Bio-Rad Laboratories). Søjlen fremkaldes med benzen. De således fremkomne aktive fraktioner hældes sammen og koncentreres til tørhed under formindsket tryk.
Den fremkomne remanens opløses i 0,5 ml acetone og sættes til en søjle (1,2 x 96,0 cm) med "Sephadex" LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals AB), som forinden er blevet kvældet med acetone, og søjlen fremkaldes med acetone. De aktive fraktioner hældes sammen og koncentreres til tørhed under formindsket tryk, hvorved der fås 20,5 mg hvidt pulver.
Ved omkrystallisation af dette pulver i en blanding af benzen og n-hexan fås 15,5 mg af tritylesteren af antibiotiket PS-7 i form af et farveløst krystallinsk pulver. Dette farveløse krystallinske pulver har følgende fysisk-kemiske egenskaber.
1) Farve farveløst 57 145382 2) UV absorptionsspektre
Det ultraviolette absorptionsspektrum for tritylerings-produktet af antibiotiket PS-7 optages på et Hitachi dobbeltstråle-spektrofotometer model 200-20 (Hitachi, Ltd.) ved en koncentration på 100/ig/3 ml methanol.
Ama°H = 230,5 ηπ1' 321,5 ““· 3) Opløselighed
Opløseligheden af trityleringsproduktet af antibiotiket PS-7 bestemmes ved under omrystning af opløse 5 mg af trityleringsproduktet af antibiotiket PS-7 i 0,1 ml af de nedenstående opløsningsmidler ved 20°C. Der opnås følgende resultater:
Praktisk taget uopløseligt i vand og n-hexan,
Let opløseligt i benzen, ethylacetat, chloroform, methanol, ethanol, acetone, dimthylformamid (DMF) og dimethylsulfoxid (DMSO).
4) Farvereaktion
Ehrlich-reagensreaktlon: positiv
Iod-chlorplatinsyrereaktion: positiv
Ninhydrinreaktion: negativ 5) Tyndtlagschromatografi (TLC)
Tritylesteren af antibiotiket PS-7 giver nedenstående Rf-værdier under de anførte betingelser. Positionen af migrerings-pletten konstateres ved hjælp af bioautografi på Comamonas terrrigena B-996.
Der anvendes silicageltyndtlagschromatograferingsplader (Merck, kiselgel 60 F254), °9 inden anbringelse af pletten anbringes 2,5/ul acetoneopløsning indeholdende 10%'s dimethylformamid. Der fås følgende Rf-værdier:
Opløsningsmiddelsystem: benzen/acetone (2/1): Rf = 0,51 benzen/acetone (1/1): R^ = 0,67 Ud fra molekylstrukturen af antibiotiket PS-7 og de ovenfor anførte fysisk-kemiske egenskaber for tritylesteren af antibiotiket PS-7 tillægges tritylesteren af antibiotiket PS-7 følgende struktur: 58 145382 CH -CH - ^J3-CH=CH-NH-COCH3 3 2 ( ||
\ O
'coo-c-J ^ 0"
De biologiske egenskaber for tritylesteren af antibiotiket PS-7 beskrives i det følgende: 1) Antimikrobielt spektrum
Den minimale hæmningskoncentration for forbindelsen bestemmes på forskellige patogene mikroorganismer, herunder flere resistente stammer, under anvendelse af substratfortyndingsmetoden med hjerne--hjerteinfusionssubstrat "Eiken" (Eiken Chemical Co., Ltd.).
Tritylesteren af antibiotiket PS-7 opløses i en lille mængde methanol og fortyndes hurtigst muligt i hjerne-hjerteinfusionssusbtrat "Eiken" (pH-værdi 7,0) (Eiken Chemical Co., Ltd.), indtil koncentrationen af tritylesteren af antibiotiket PS-7 ligger i området fra 40 /ig/ml til 20 /ig/ml og koncentrationen af methanol i den færdige opløsning ikke er større end 10%. Denne opløsning fortyndes i en todobbelt geometrisk række. De i tabel X anførte mikroorganismer dyrkes i 18 timer ved 28°C i hjerne-hjerteinfusionssubstrat "Eiken" og inokuleres til ovennævnte rækkefortyndinger i en slutpodekoncen-c tration på 1 x 10' celler/ml. Resultaterne aflæses efter inkubering ved 35°C i 20 timer. Den minimale hæmningskoncentration er den laveste koncentration af trityleringsproduktet af antibiotiket PS-7, hvor der ikke konstateres nogen vækst af den pågældende mikroorganisme under de ovenfor beskrevne betingelser. Som kontrolantibiotika fremstilles opløsninger af ampicillin og cephaloridin i hjerne-hjerteinfusionssubstrat "Eiken" (pH-værdi 7,0) i en koncentration på 100/ig/ml, og opløsningerne behandles på samme måde som opløsningerne af forsøgsforbindelsen. I den efterfølgende tabel X er anført de minimale hæmningskoncentrationer for tritylesteren af antibiotiket PS-7 sammen med de minimale hæmningskoncentrationer for cephaloridin som kontrolantibiotikum.
59 145382
rH
a
Di C GL -H ti
Ή i—l i—I CO
CM O O O H O
O O *· * *· * *
H rH ΟΟΟΓΟΟΟΟΟ 4J ftJ CM O O O
ni Λ T* 7* T1 M Dj Λ λ λ 4J φ
G U
<u u
G
o--
M
M
tn G Γ- _ Η I Ό G W 2 9 fci_i a i I V£> ΙΩ ΙΩ "3· ΙΠ 0) X3 ί ri i—ΙιΗι-ΗΜΟ(ΝΟΟ -Η φ
>, ....... G -P
i—I -p OOOiHOVDLDin id tn
φ -ri i—i cm cm Cn <U
a g g λ X ·Μ E-l o G <*p
rH -H <U O
φ s -O H
XI G
<d--Φ +J
EH M id * Φ in * ϋ Η
H G tH
Pj h ^ -P
σ> h + O
o * MM
CM Φ LO ϋ Φ i ft I LO * * Φ
(¾ >, >, N N * LD Μ -P
Q Eh Z m I σ* H cd <U
pL, I X I I a -G
Φ tn m w W td id
tn id φ φ * -PM
G-HGtnid-Μΐοφ 0-P
Φ c Φ -Μ ·Η -Η i id id tn MOD'HG'DPlD rHX!
GBOGOGid I G
idGl^ua^030 catn Φ0]φ3Φ·ΜγΗ Hk **· φωΰΛΦΜΜϋ Hf g G D| tn Ή C Ή Λ
tn ϋ G Qj tn M
•η utnotnMr-io Φ
C OGOtUGOJG-P 4J
GUUOGiH+J>U 0
Cn OUOtUrHO G SS
M HOOtnQJGWrQ
O >, φ -P ·Η -Η X3 G O '
O xJOftHtnOdiM
Μ αΗΦΦΧ3Μ-ΡΦ
idD-MUdi-PO-P •H -U -H -M i—I rH -Η M G
2 æQco<dWUCHW
60 145382
Det fremgår klart af de i den ovenstående tabel anførte data, at tritylesteren af antibiotiket PS-7 har bredspektret anti-mikrobiel virkning og især kraftig antibiotisk virkning på forskellige β-lactamresistente (β-lactamaseproducerende) mikroorganismestammer.
2) In vivo-virkning
In vivo-virkningen af trityleringsproduktet af antibiotiket 5 PS-7 bestemmes på mus, som intraperitonealt inficeres med 5 x 10 celler pr. mus af Staphylococcus aureus Smith. Trityleringsproduktet af antibiotiket PS-7 injiceres subcutant straks efter inficeringen. Med hanmus DDY (SHIZUOKA) fås en 50% kurativ dosis på 4,5 mg/kg.
3) Toksicitet
Ved intraperitoneal indgift af 500 mg/kg af tritylesteren af antibiotiket PS-7 konstateres ingen akut toksicitet på hanmus DDY (SHIZUOKA).
Eksempel 12
Methylesteren af antibiotiket PS-6 2,0 mg lyofiliseret antibiotikum PS-6-natriumsalt fremstillet ifølge eksempel 9 suspenderes i 1 ml tør dimethylformamid (DMF), og der tilsættes 20 μΐ triethylamin og 50 μΐ methyliodid. Efter omrøring af blandingen i 2 timer ved stuetemperatur udtages 20 μΐ blanding, som opløses i methanol, og methanolopløsningen undersøges på et Hitachi sjSektrofotometer model EPS-3T (Hitachi Ltd.) til bestemmelse af forøgelsen af absorbansen ved 315 nm med henblik på at følge reaktionens forløb. Når dette er sket, sættes hele .reaktionsblandingen til 20 ml benzen, og der vaskes straks med to gange 10 ml 0,1 M phosphatpufferopløsning (pH-værdi 7,0). Benzenopløsningen tørres over vandfri natriumsulfat og koncentreres til 1 ml ved 35°C under formindsket tryk. Den koncentrerede opløsning sættes til en søjle (1,2 x 85 cm) med "Bio-Beads" S-X3 (Bio-Rad Laboratories), og søjlen fremkaldes med benzen. Eluatet underkastes tyndtlagschromatografi (kiselgel 60 benzen/acetone (1/1)), og eluatfraktionerne, som ved UV-absorption viser sig at indeholde methylesteren af antibiotiket PS-6, hældes sammen. Fraktionerne koncentreres til tørhed under formindsket tryk, hvorved fås en olieagtig remanens, der opløses i 1 ml acetone. Acetoneopløsningen sættes til en søjle (1,2 x 85 cm) med "Sephadex" LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals AB), der forinden er blevet fyldt med acetone, og der fremkal- 61 145382 des med acetone. Efter identificering af fraktionerne indeholdende methylesteren af antibiotiket PS-6 som beskrevet ovenfor sammenhældes disse fraktioner. De sammenblandede fraktioner koncentreres til tørhed hvorved der fås 1,0 mg af methylesteren af antibiotiket PS-6 i form af et hvidt olieagtigt produkt.
(1) Tyndtlagschromatografi
Rf = 0,45 (Kiselgel 60 F254, benzen:acetone = 1:1) (2) Ultraviolet absorptionsmaksimum i methanol 316,6 nm (3) Molekylvægt (højopløsningsmassespektrometri) fundet: 326.128683 beregnet for ci5H22N2°4S: 326.130000 (4) Protonkernemagnetisk resonansspektrum
Fig. 8 på tegningen viser 100 MHz proton NMR spektret for methylesteren af antibiotiket PS-6 (opløsning af 2 mg af methylesteren i 0,5 ml deuterochloroform) målt på et JEOL NMR spektrometer JNM PS-100 (Japan Electron Optics Laboratory CO., Ltd.). Der opnås følgende karakteristiske signaler: (i) triplet som er centreret omkring 1,06 ppm (CH.-CH-) % (ii) skarp singlet omkring 2,0 ppm (CH^-CO-) (iii) multiplet i området 2,6-3,6 ppm (-CH2-, -CH-) (iv) skarp singlet omkring 3,83 ppm (-COCH,)
II J
o x et par dubletter, som overlapper hinanden under dannelse af en tilsyneladende triplet med 6 protoner.
På baggrund af den tidligere anførte struktur for antibiotiket PS-6 og de ovenfor anførte fysisk-kemiske data, tillægges methylesteren af antibiotiket PS-6 følgende molekylstruktur: CH, CH,-CH- ^_^^S-CH2-CH2-NH-COCH3 3 iιϊ-Κ 0^ nCOOCH3 62 165382
Eksempel 13
Methylesteren af antibiotiket PS-7 2,0 mg af det lyofiliserede antibiotikum PS-7-natrium-salt fremstillet ifølge eksempel 9 suspenderes i 1 ml tør di-methylformamid (DMF), og der tilsættes 20 ;il triethylamin og 50 ;ul methyliodid. Efter omrøring af blandingen i 2 timer ved stuetemperatur udtages ca. 20 μΐ blanding, som opløses i methanol og analyseres under anvendelse af et Hitachi spektrofotometer model EPS-3T (Hitachi Ltd.) til bestemmelse af forøgelsen af absorbansen ved 32,15 nm for at følge reaktionens forløb. Når reaktionen er løbet til ende, hældes hele reaktionsblandingen i 20 ml benzen, og der vaskes straks med to gange 10 ml 0,1 M phosphatpufferopløsning (pH-værdi 7,0). Benzenopløsningen tørres over vandfri natriumsulfat og koncentreres til 1 ml ved 35°C under formindsket tryk. Den koncentrerede opløsning sættes til en søjle (1,2 x 85 cm) med "Bio-Beads" S-X3 (Bio-RAd Laboratories) og fremkaldes med benzen. Eluatet underkastes tyndtlagschromatografe-ring (kiselgel 60 F254' kenzen/acetone (2/1)), og efter identificering af fraktionerne indeholdende methylesteren af antibiotiket PS-7 med UV-absorption opsamles disse fraktioner. Fraktionerne koncentreres til tørhed under formindsket tryk, hvorved fås en farveløs olieagtig forbindelse, der opløses i 1 ml acetone. Acetoneopløsningen sættes til en søjle (1,2 x 85 cm) med "Sephadex" LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals AB) der forinden er blevet fyldt med acetone, og der fremkaldes med acetone. Efter identificering af fraktionerne indeholdende methylesteren af antibiotiket PS-7 som beskrevet ovenfor opsamles disse fraktioner. De opsamlede fraktioner koncentreres til tørhed, og fås ca. 1,0 mg af methylesteren af antibiotiket PS-7 i form af et hvidt olieagtigt stof.
(1) Tyndtlagschromatografi
Rf = 0,44 (kiselgel 60 F254 plade, benzen:acetone = 2/1)
Rf = 0,07 (kiselgel 60 F254 Plade' chloroformrmethanol = 99:1) (2) UV-absorptionsmaksimum i methanol 230,5 nm og 321,5 nm (3) Molekylvægt (højopløsningsmassespektrometri) fundet 310.37443 beregnet for C^H^g^O^S: 310.375760 145382 63
Ud fra den tidligere anførte struktur af antibiotiket PS-7 og de ovenfor anførte fysisk-kemiske data tillægges methylesteren af antibiotiket PS-7 følgende molekylstruktur: ch3-ch2X^__-Vv^s-ch=ch-nh-coch3 3—N_\ cr nCOOCH3
DK454378A 1977-10-13 1978-10-12 Fremgangsmaade til fremstilling af beta-lactamantibiotika kaldet ps-6 og ps-7 eller salte eller estere deraf DK145382C (da)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP12185777A JPS5459295A (en) 1977-10-13 1977-10-13 Antibiotic ps-6, its derivative and their preparation
JP12185777 1977-10-13
JP16042477 1977-12-29
JP16042477A JPS5492983A (en) 1977-12-29 1977-12-29 Antibiotics ps-4 and ps-7

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK454378A DK454378A (da) 1979-04-14
DK145382B true DK145382B (da) 1982-11-08
DK145382C DK145382C (da) 1983-04-05

Family

ID=26459119

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK454378A DK145382C (da) 1977-10-13 1978-10-12 Fremgangsmaade til fremstilling af beta-lactamantibiotika kaldet ps-6 og ps-7 eller salte eller estere deraf

Country Status (9)

Country Link
US (1) US4368203A (da)
EP (1) EP0001567B1 (da)
CA (1) CA1113872A (da)
DE (1) DE2861413D1 (da)
DK (1) DK145382C (da)
HU (1) HU179788B (da)
IT (1) IT1099738B (da)
SU (1) SU1039446A3 (da)
YU (1) YU42049B (da)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0005349A1 (en) * 1978-05-06 1979-11-14 Beecham Group Plc Alkylcarbapenems, their preparation, use in pharmaceutical compositions and intermediates
EP0024832B1 (en) * 1979-08-10 1985-03-13 Beecham Group Plc Beta-lactam antibiotics, their preparation, pharmaceutical compositions containing them and their preparation
US5213974A (en) * 1986-05-20 1993-05-25 Sankyo Company, Limited Fermentation process for preparing antibiotics mureidomycins A, B, C and D
GB8928373D0 (en) * 1989-12-15 1990-02-21 Erba Carlo Spa Beta-lactam derivatives
EP1049459B1 (en) * 1998-01-20 2009-04-22 Applied Analytical Industries, Inc. Oral liquid compositions
US20100069827A1 (en) * 2008-09-12 2010-03-18 Barry Neil Silberg Pre-Surgical Prophylactic Administration of Antibiotics and Therapeutic Agents
US9446227B2 (en) 2008-09-12 2016-09-20 Sonescence, Inc. Ultrasonic dispersion of compositions in tissue
RU2433169C1 (ru) * 2010-07-20 2011-11-10 Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук (НИИНА РАМН) ШТАММ Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ Ас-1083 - ПРОДУЦЕНТ ТОБРАМИЦИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОБРАМИЦИНА
WO2015187968A1 (en) 2014-06-04 2015-12-10 Sonescence, Inc. Systems and methods for therapeutic agent delivery

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235922A (en) * 1979-06-15 1980-11-25 Merck & Co., Inc. 3-(2-Aminoethylthio)-6-ethyl-7-oxo-1-azabicyclo [3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid

Also Published As

Publication number Publication date
EP0001567A1 (en) 1979-05-02
DK454378A (da) 1979-04-14
IT7828782A0 (it) 1978-10-13
EP0001567B1 (en) 1981-12-02
HU179788B (en) 1982-12-28
US4368203A (en) 1983-01-11
SU1039446A3 (ru) 1983-08-30
IT1099738B (it) 1985-09-28
DK145382C (da) 1983-04-05
CA1113872A (en) 1981-12-08
YU42049B (en) 1988-04-30
YU215182A (en) 1983-01-21
DE2861413D1 (en) 1982-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
IE42067B1 (en) Antibiotic azetidinopyrrole derivative
US4337199A (en) Antibiotic β-lactam compounds, production thereof, and their use as antimicrobial agent
Okamura et al. PS-5, A NEW β-LACTAM ANTIBIOTIC. I TAXONOMY OF THE PRODUCING ORGANISM, ISOLATION AND PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES
US4141986A (en) Antibiotics 890A2 and 890A5
DK145382B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af beta-lactamantibiotika kaldet ps-6 og ps-7 eller salte eller estere deraf
US4162324A (en) Antibiotics 890A1 and 890A3
DK144098B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af antibiotikum ps-5 eller salte eller estere deraf
US4518529A (en) Antibiotics C-19393S2
US4423218A (en) Antibiotic neplanocin A
US4426390A (en) Novel β-lactam compounds, process for producing thereof, and use thereof as medicines
US4451401A (en) Antibiotics and process for production thereof
US4656288A (en) Antibiotics, their production and use
KR820000513B1 (ko) β-락타마제 저지활성을 갖는 항생물질 유도체의 제조방법
CA1220746A (en) Luzopeptin e.sub.2
US4667027A (en) Cephem compounds and their production
KR810002059B1 (ko) β-락타마제 저해 활성을 갖는 항생물질 PS-5의 제조법
US4719109A (en) EM5596--an antibiotic
US5213974A (en) Fermentation process for preparing antibiotics mureidomycins A, B, C and D
BE865578A (fr) Antibiotique rs-5 et ses derives, ainsi que leur production
JPS6215557B2 (da)
US4745202A (en) Aerocyanidin-antibiotic
JPS6332792B2 (da)
JPS6330915B2 (da)
JPH0349909B2 (da)
JPS6213355B2 (da)