BE865578A - Antibiotique rs-5 et ses derives, ainsi que leur production - Google Patents

Description

  "Antibiotique PS-5 et ses dérivés,ainsi que leur production"

  
La présente invention est relative à une nouvelle substance antibiotique et à ses dérivés, présentant une forte activité antibiotique et un puissant effet inhibiteur de la P-lactamase, ainsi qu'à un procédé de production de cette substance antibiotique et de ses dérivés par une culture aérobie de Streptomyces A 271.

  
On connaît des antibiotiques ayant une activité inhibi-trice de la P-lactamase ou des agents inhibiteurs de la �-lactamase. A titre d'exemple, on peut signaler les composés suivants:
les MC696-SY2-A et B isolés du bouillon de culture de la souche produisant le MC696-SY2 appartenant au genre Streptomyces (brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3.981.788, Derwent CPI 19171X), les MM4550 ou MM13902 isolés des matières cultivées de la souche produisant le MM4550 ou le MM13902, qui appartient au genre Streptomyces (demande de brevet allemand: publiée 2.513.855:
Derwent CPI 67721W; demande de brevet allemand publiée 2.513.854:
Derwent CPI 67720W), l'acide clavulanique isolé des matières cultivées du Streptomyces clavuliqerus (demande de brevet allemand publiée 2.517.316: Derwent CPI 72840W), etc.

   L'antibiotique thiénamycine, ayant un squelette chimique ressemblant à celui de la pénicille et ses dérivés ont également été décrits (brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3.950.357: Derwent CPI 31696X; demande de brevet allemand publiée 2.652.677: Derwent CPI 40282Y; brevet belge n[deg.] 848.346: Derwent CPI 34505Y; brevet belge n[deg.] 848.349: Derwent CPI 34507; demande de brevet allemand publiée n[deg.] 2.652.680:

  
Derwent CPI 40283Y; demande de brevet allemand publiée 2.652.675:
Derwent CPI 4028OY; demande de brevet allemand publiée 2.652.674:
Derwent CPI 40279Y; demande de brevet allemand publiée n[deg.] 2.652.676:
Derwent CPI 40281Y).

  
La présente invention est donc relative au nouvel antibiotique désigné par PS-5 et à ses dérivés, qui ont une forte activité antibiotique, une forte activité inhibitrice de la �-lactamase et la capacité de renforcer par voie synergique l'activité antibiotique des pénicillines, des céphalosporines, etc, vis-à-vis des producteurs de p-lactamase, l'invention englobant également le procédé de production de ces nouvelles substances antibiotiques, ainsi que les compositions antibiotiques contenant de telles substances.

  
Le premier but de la présente invention est de prévoir la nouvelle substance antibiotique PS-5, ayant à la fois une forte activité antibiotique et une forte activité inhibitrice de la  lactamase.

  
Le second but de la présente invention est de prévoir des dérivés, en particulier le dérivé tritylé, de cet antibiotique PS-5, qui également montrent une forte activité antibiotique et une forte activité inhibitrice de la P-lactamase.

  
Un autre but de l'invention est de montrer que le nouvel antibiotique PS-5 et son dérivé tritylé sont en outre capables de renforcer par un effet synergique l'activité antibiotique des péni-  cillines, des céphalosporines, etc, vis-à-vis des bactéries résistantes, productrices de �-lactamase.

  
Un autre but de l'invention est de prévoir la production de l'antibiotique PS-5 par un procédé de fermentation et de prévoir une culture pure d'un micro-organisme capable de produire cet antibiotique.

  
Un autre but encore de l'invention est de prévoir la production des dérivés de l'antibiotique PS-5, et plus particulièrement du dérivé tritylé.

  
Encore un autre but de l'invention est de prévoir des méthodes préventives et thérapeutiques et des compositions de l'antibiotique PS-5 ou de son dérivé tritylé, utilisables dans les maladies infectieuses provoquées par les bactéries gram-positives et gram-négatives, notamment des combinaisons synergiques avec des pénicillines, des céphalosporines et d'autres antibiotiques sensibles au P-lactamase. D'autres buts encore de l'invention apparaîtront plus complètement de la description suivante.

  
L'antibiotique PS-5 peut être produit par un procédé comprenant la culture d'un micro-organisme producteur d'un tel antibiotique, dans un milieu nutritif, et l'isolement de l'antibiotique PS-5 ainsi obtenu.

  
Des exemples de micro-organismes des souches susdites, productrices de l'antibiotique PS-5, appartiennent au genre Streptomyces . A titre d'exemple le plus approprié, on envisage ici une souche Streptomyces qui a été isolée d'un échantillon de sol récolté près de Eiheiji Temple dans le district de Yoshida de la préfecture de Fukui au Japon et qui a reçu le numéro de souche A271.

  
Les caractéristiques taxonomiques de la souche Streptomyces A271 sont les suivantes:

  
(1) Caractéristiques morphologiques

  
Ramification du mycélium aérien sporulé: ramification simple. Forme du mycélium aérien sporulé: le haut du mycélium aérien montre des crochets, des boucles ou des spirales incomplètes.

  
Ceci est considéré comme appartenant à la section Retinaculum-Apertum. Ces formes s'observent particulièrement lors d'une culture sur un milieu de gélose à farine d'avoine et sur un milieu de gélose à glycérine-asparagine, tandis qu'une forme droite ou flexueuse s'observe occasionnellement sur un milieu de gélose à extrait de levure-extrait de malt. Forme et nombre de spores dans la chaîne: spores ovales ou cylindriques formant une chaîne de plus de dix spores (habituellement de 10 à 50). Dimension et structure superficielle des spores: 0,8-1,0 x 1,0-1,8 micron, surface lisse. On n'observe ni flagelles ni sporanges. Des hyphes se forment sur le mycélium aérien.

  
(2) Caractéristiques de culture 

  
Les caractéristiques de culture de la souche A271 sont présentées par le Tableau 1, où les résultats d'observation après une culture de 2 semaines à 28[deg.]C sont présentés, à moins d'indications contraires. L'expression du ton de couleur est principalement basée sur la méthode de H.D. Tresner et E.J. Backus "System of color wheels for Streptomycetestaxonomy", (voir Appli.Microbiol. 11, 335,
1963) et sur le code des tons de couleur paru dans "Guide to Color Standard" publié par le Japan Color Institute Foundation. 

  
 <EMI ID=1.1> 

  
TABLEAU 1 

  

 <EMI ID=2.1> 


  
(3) Caractéristiques physiologiques

  
 <EMI ID=3.1> 

  
2[deg.]) liquéfaction de la gélatine (sur milieu de glucosepeptone-gélatine): liquéfaction (culture à 20[deg.]C);

  
3[deg.]) hydrolyse de l'amidon (sur un milieu de gélose à sel minéral-amidon): hydrolyse;

  
4[deg.]) coagulation et peptonisation du lait écrémé : peptonisation mais pas de coagulation observée;

  
5[deg.]) formation du pigment mélanoîde: pas de formation de pigment mélanoîde sur un milieu de gélose-tyrosine et sur un mi-

  
fer,

  
lieu de gélose à peptone-levure-/ainsi que dans un bouillon de

  
tryptone-extrait de levure;

  
6[deg.]) utilisation des diverses sources carbonées suivantes (milieu de gélose du Pridham et Gottlieb):

  

 <EMI ID=4.1> 


  
(+: bien utilisée; _+ : légèrement utilisée; - : très légèrement utilisée ou pas du tout).

  
Il est évident des caractéristiques précédentes que la souche A271 appartient au genre Streptomyces et montre des caractéristiques partagées par les micro-organismes appartenant à la Section RA, puisque le ton de couleur de la surface de mycélium est jaune ou rouge, la surface des spores est lisse et il n'y a pas de formation de pigment soluble dans l'eau, tel que le pigment de mélanolde. Des cultures ayant ces caractéristiques taxonomiques sont envisagées dans le manuel "The Actinomycetes" vol.2"(1961) de Waksman, dans les documents de E.B. Shirling et D. Gottlieb, "International Journal of Systematic Bacteriology",vol. 18, pages 69-
189 (1968), ibid., pages 279 - 892 (1968), ibid.,vol. 19, pages
391 - 512 (1969), ibid., vol. 22, pages 265 - 394 (1972), et dans "Mannual of determinative Bacteriology", de Bargey , 8ème édition
(1974).

   On a trouvé que des cultures similaires appartenant à la Section RA sont: Actinomyces cremeus, Actinomyces flavidovirens, Actinomyces albohelvatus, Actinomyces flavescens, Streptomyces rutgersensis, Streptomyces chryseus, Streptomyces helvaticus. A titre de l'une des cultures ressemblantes, on a également choisi

  
 <EMI ID=5.1> 

  
tiques morphologiques, bien qu'il appartienne à la Section RF. Ces 8 cultures, sauf la dernière, à savoir le Streptomyces pluricolorescens, produisent, d'après ce que l'on a signalé, un mycélium aérien ayant une forme droite ou des boucles, la variation dépendant des conditions de culture. Des cultures types des 8 espèces précédentes ont été comparées avec la souche A271 suivant l'invention après culture sous les mêmes conditions. En considérant les résultats, la souche A271 se distingue nettement de ces cultures par des différences en ce qui concerne la croissance, la couleur du mycélium aérien et la couleur du mycélium de substrat, ainsi que par des différences marquées en ce qui concerne l'utilisation des sources carbonées.

  
Dans les Tableaux 2, 3 et 4, on donne les résultats de la comparaison réalisée entre la souche A271 et les deux cultures qui y ressemblent de la manière la plus proche.

  
TABLEAU 2 
 <EMI ID=6.1> 
 
 <EMI ID=7.1> 
 TABLEAU 3

  
Comparaison avec les cultures ressemblantes

Couleur du mycélium de substrat

  

 <EMI ID=8.1> 
 

  

 <EMI ID=9.1> 


  
TABLEAU 4

  
Comparaison avec les cultures ressemblantes

  

 <EMI ID=10.1> 


  
Les considérations suivantes sont émises au départ des résultats présentés par les Tableaux précédents. En ce qui concerne la couleur du mycélium aérien, le Actinomyces flavidovirens est généralement blanc mais, lorsqu'il est jaune, il est jaune verdatre, en étant nettement différent de la souche A271 suivant la présente invention, et le Actinomyces cremeus montre généralement un ton rougeâtre plus faible de la couleur jaune orange pale que la souche A271, en se distinguant nettement de celle-ci.

  
En ce qui concerne la couleur du mycélium de substrat, le Actinomyces flavidorens montre une couleur jaune pale et le Actinomyces cremeus montre une couleur jaune orange clair dans de nombreux cas, tandis que la souche A271 montre généralement une couleur jaune clair. De plus, une comparaison détaillée des résultats expérimentaux obtenus dans divers milieux montre de façon nette que la souche A271 est différente des deux autres cultures. 

  
La souche A271 diffère du Actinomyces cremeus en ce qui concerne l'utilisation du D-fructose et du L-rhamnose, et elle diffère du Actinomyces flavidovirens en ce qui concerne l'utilisation du Dfructose et de l'inositol.

  
En conséquence, la souche A271 suivant l'invention diffère nettement des deux cultures connues qui s'en rapprochent le plus étroitement. En conséquence, la souche A271 est différente de toutes les espèces connues de Streptomycetes et elle doit être considérée comme une nouvelle espèce que l'on désigne par Streptomyces sp. A271. Cette culture a été déposée au "Fermentation Research Institute", Agency of Industrial Science and Technology, où elle a reçu le numéro de culture FERM-P numéro
3984. Un échantillon de ce Streptomyces sp. A271 a également été déposé auprès de l'organisme ATCC, où elle a reçu le numéro de collection 31358.

  
Suivant l'invention, on peut utiliser non seulement la souche A271 elle-même mais également les mutants naturels et les mutants artificiels, qui peuvent être produits par des traitements chimiques ou physiques.

  
Les agents producteurs de l'antibiotique PS-5 peuvent être choisis dans une large gamme de micro-organismes qui ne sont pas limités à un genre particulier. Le choix des micro-organismes producteurs du PS-5 peut être réalisé par un spécialiste en utilisant la méthode suivante. Des filtrats de bouillon de culture de micro-organismes isolés d'un sol sont analysés en utilisant une plaque de gélose de bio-titration, inoculée d'un micro-organisme

  
 <EMI ID=11.1> 

  
tion, contenant du P-lactamase et inoculée par le même organisme. Les micro-organismes donnant des filtrats de bouillon qui montrent de plus petites zones inhibitrices sur la dernière plaque de biotitration que sur la première plaque de bio-titration sont choisis pour les travaux ultérieurs. Ensuite, les composants actifs du bouillon de culture des micro-organismes choisis par la méthode précédente sont adsorbés sur du charbon activé et ensuite élués. Les éluats concentrés sont développés par une chromatographie sur papier ou une chromatographie en couche mince, que l'on fait suivre

  
 <EMI ID=12.1> 

  
lactame à titre d'organisme d'essai. La méthode d'examen est expliquée de façon plus concrète par l'exemple suivant. La plaque

  
de bio-titration de Comamonas, que l'on décrira par la suite, est utilisée comme plaque de gélose de bio-titration, inoculée par l'organisme d'essai sensible au &#65533;-lactame. La plaque de bio-titration de Comamonas CV et la plaque de bio-titration de Comamonas CM sont préparées par addition, à la plaque de bio-titration susdite de Comamonas, du P-lactamase produit respectivement par le Proteus vulgaris P-5 et le Citrobacter freundii E-9.

  
Des disques de pâte d'un diamètre de 8 mm, additionnés des filtrats de bouillon de culture des micro-organismes isolés d'un sol sont placés sur les plaques susdites de bio-titration et ces plaques sont incubées à 35[deg.]C pendant 20 heures. Après l'incubation, les micro-organismes dont le filtrat de bouillon donne

  
une zone inhibitrice sur la plaque de bio-titration de Comamonas

  
et une plus petite zone inhibitrice sur la plaque de bio-titration de Comamonas CV ou sur la plaque de bio-titration de Comamonas CM sont choisis. Aux filtrats de bouillon de ces micro-organismes, on ajoute 2% (en poids/volume) de charbon activé ("Tokusei Shirasagi", Takeda Chemical Industries, Ltd.) et, après agitation pendant 15 minutes, la matière insoluble est récoltée par centrifugation. Cette matière insoluble est lavée avec de l'eau distillée

  
 <EMI ID=13.1> 

  
nouveau par centrifugation. La matière insoluble lavée est éluée en ajoutant 50% (en volume/volume) d'acétone aqueuse en un demivolume de celui du filtrat de bouillon utilisé et on agite à la température ambiante pendant 30 minutes. Après centrifugation, la  <EMI ID=14.1> 

  
teur rotatif pour obtenir une solution concentrée à vingt fois, comparativement au filtrat de bouillon utilisé. La solution concentrée est soumise à une chromatographie sur papier descendant en utilisant un papier filtre (Toyo Filter Paper, Toyo Roshi Kaisha Ltd.), en développant pendant 16 heures avec un solvant à 30% d'acétonitrile/tris-EDTA (composé de 120 ml d'acétonitrile, de 80 ml d'un tampon de tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane-HCl 1/10 M,de

  
 <EMI ID=15.1> 

  
d'éthylènediaminetétraacétique). Cette opération est suivie par une bio-autographie avec du Comamonas terriqena B-996 comme organisme d'essai ou de titration.

  
Les micro-organismes isolés d'un sol dont le produit ac-

  
 <EMI ID=16.1> 

  
me distance de migration (ou la même valeur Rf) que celle de l'antibiotique PS-5 sont choisis comme candidats pour les productions de cet antibiotique. Les micro-organismes candidats choisis sont ensuite examinés pour confirmer leur capacité de production de l'antibiotique PS-5, par des études supplémentaires par chromatographie sur papier et par chromatographie en couche mince.

  
En utilisant les méthodes définies ci-dessus, un spécialiste peut choisir d'autres agents producteurs de l'antibiotique PS-5, en outre de la souche Streptomyces sp. A271 décrite cidessus.

  
Suivant une forme de réalisation de la présente invention, l'antibiotique PS-5 peut être produit en inoculant des spores du mycélium d'une souche microbienne capable de produire cet antibiotique, par exemple le Streptomyces sp. A271, dans un milieu nutritif et en procédant à une culture de manière aérobie.

  
Comme agents nutritifs, on peut utiliser de nombreux types d'agents habituellement employés pour les Streptomycetes, par exemple une source de carbone, des sources d'azote , les sels minéraux, etc. Des agents nutritifs utilisables sont, par exemple, les sources de carbone formées par les hydrates de carbone, comme le glucose, la glycérine, le maltose, le sucrose, les mélasses, la dextrine, l'amidon, etc, et des huiles ou graisses, comme l'huile de soya, l'huile d'arachide, le saindoux, etc; les sources azotées,

  
la

  
comme /peptone, l'extrait de viande, la farine de soya, l'huile de coton, la levure séchée, une liqueur de macération de mars, un extrait de levure, de la caséine de lait écrémé, du nitrate de sodium, du nitrate d'ammonium, du sulfate d'ammonium, etc; et les sels minéraux, comme le phosphate dipotassique, le chlorure de sodium, le carbonate de calcium, le sulfate de magnésium, etc; et des traces de métaux, par exemple le cobalt, le manganèse, etc, peuvent être ajoutées suivant les nécessités. En outre, on peut employer tous les nutritifs qui sont utilisables par l'organisme pour produire l'antibiotique PS-5. Pour empêcher une formation de mousse durant la stérilisation par chauffage et la fermentation,on peut ajouter des agents antimousses, comme une huile de silicone, une huile végétale, etc.

  
La proportion des nutritifs dans la formulation n'est pas limitée par la description précédente mais peut au contraire être modifiée dans une large gamme. La formulation et la composition les plus appropriées pour les nutritifs peuvent facilement se déterminer par de simples expériences à petite échelle, faites par un spécialiste. Le milieu peut être stérilisé avant la culture.

  
Le pH du milieu est de préférence ajusté dans l'intervalle de 4 à 9, de préférence dans l'intervalle de 6 à 8, avant ou après la stérilisation. La culture de la souche productrice de l'antibiotique PS-5 peut être réalisée essentiellement par une méthode semblable

  
à celle qui a été utilisée d'une façon générale dans la production d'antibiotiques obtenue au départ de Streptomycetes. Une culture sous des conditions aérobies, c'est-à-dire une culture sous agitation et/ou aération, est généralement préférable. 

  
Bien que l'on puisse utiliser n'importe quelle méthode de culture, parmi les cultures fixes, les cultures secouées et les cultures submergées, la culture submergée est la plus intéressante. La température de fermentation utilisable n'est pas particulièrement limitée mais elle est généralement choisie dans l'intervalle pour lequel la croissance de l'agent producteur de l'antibiotique PS-5 n'est pratiquement pas inhibée et peut donner cet antibiotique PS-5. Bien que la température de fermentation puisse être modifiée avec le type de souche productrice que l'on utilise, la température appropriée est généralement de l'ordre de 20 à 40[deg.]C, de préférence de 25 à 35[deg.]C.

  
Le pH du bouillon de culture peut être ajusté durant

  
la fermentation dans l'intervalle de 4 à 9, de préférence de 6 à

  
8. Dans une fermentation à grande échelle, il est préférable de cultiver une culture d'ensemencement appropriée et d'inoculer ensuite le milieu nutritif prévu pour la culture submergée, en utilisant la culture d'ensemencement susdite. La fermentation peut habituellement être poursuivie jusqu'à accumulation d'une quantité suffisante de l'antibiotique PS-5. La durée de fermentation est habituellement de l'ordre de 30 à 90 heures mais elle varie avec la composition du milieu, la température de fermentation, la souche productrice utilisée, etc. Les conditions optimales de fermentation à utiliser peuvent être facilement déterminées après de petites expériences menées par un spécialiste. La quantité accumulée de l'antibiotique PS-5 dans le bouillon de fermentation peut être déterminée par la méthode de bio-titration et la bio-autographie que l'on décrira.

  
Lorsque l'antibiotique PS-5 accumulé, se trouvant dans les matières fermentées, est soluble dans l'eau et est principalement localisé à l'extérieur du mycélium, il est préférable de séparer le mycélium après fermentation en utilisant des procédés connus de séparation, par exemple une filtration, une centrifugation,  <EMI ID=17.1> 

  
une extraction, etc, et de récupérer l'antibiotique au départ du filtrat, de la matière surnageante, de l'extrait, etc. La récupération de l'antibiotique peut être menée par divers procédés bien connus. En particulier, un procédé préféré à appliquer pour la récupération de l'antibiotique est constitué par un procédé que l'on a fréquemment utilisé pour la récupération d'antibiotiques du type à acide carboxylique.

   A titre d'exemple, on peut employer les procédés suivants indépendamment ou en combinaison, ou de façons répétées, pour la récupération et l'isolement de l'antibiotique PS-5:
(a) extraction à un faible pH avec un solvant, tel que de l'acétate d'éthyle, du n-butanol, etc, et réextraction à partir de la couche au solvant dans une couche aqueuse à un pH plus élevé;

   (b) extraction au pH neutre avec des solvants comme le chlorure de méthylène, le chloroforme, etc, en présence d'un sel d'ammonium quaternaire lipophile, comme le chlorure de benzalconium, le bisulfate de tétra-n-butyl ammonium, etc, ou un composé en couronne, tel que les éthers en couronne Nisso de dicyclohexyl-18-couronne-6 et dicyclohexyl-15-couronne-5 (Nippon Soda Co., Ltd) et réextraction à partir de la couche au solvant dans une couche aqueuse neutre contenant de l'iodure de sodium, de l'iodure de potassium, etc;
(c) adsorption sur du carbone activé ou des résines de styrènedivinylbenzène très poreuses, par exemple l'Amberlite XAD (Rohm & Haas Co.), le Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) etc, et élution avec du méthanol aqueux, de l'acétone aqueuse, etc;

  
(d) adsorption et élution avec une résine échangeuse d'ions, par exemple Dowex 1-X2 (Dow Chemical Co.), QAE-Sephadex A-25 (Pharmacia Fine Chemicals AB), etc; (e) filtration sur gel avec du Sephadex G-10 (Pharmacia Fine Chemicals AB), du Bio-Gel P-2 (Bio-Rad Loboratories), du Bio-Beads S-X3 (Bio-Rad Laboratories), etc;
(f) chromatographie sur colonne ou en couche mince avec de la cellulose, de l'Avicel SF (American Viscose Corp.), du DEAE-Cellulose Whatman DE-32 (Whatman Ltd.) du DEAE-Sephadex A-25 (Pharmacia Fine 

  
Chemicals AB), un gel de silice, de l'alumine, etc; et (g) précipitation forcée par addition d'un solvant, tel que de l'acétate, etc. Le comportement de l'antibiotique PS-5 dans les procédés de récupération et d'isolement peut être mis en évidence en déterminant l'antibiotique PS-5 par une méthode de bio-titration et une bio-autographie que l'on décrira par la suite. De la manière indiquée précédemment, on peut obtenir l'antibiotique PS-5 montrant les caractéristiques décrites ci-après.

  
Propriétés physico-chimiques de l'antibiotique PS-5

  
(1) Solubilité

  
L'antibiotique PS-5 est soluble dans l'eau au pH de 6

  
à 9. De façon plus particulière, cet antibiotique est soluble non seulement dans l'eau au pH de 7 mais également dans un milieu aqueux légèrement acide, ajusté au pH de 6 ou à un pH supérieur à 6, en ajoutant, par exemple, de l'acide chlorhydrique, etc, et dans un milieu aqueux légèrement alcalin, ajusté à un pH inférieur à 9, par addition, par exemple, de bicarbonate de sodium, d'hydroxyde de sodium, etc. Cet antibiotique est pratiquement insoluble dans l'acétate d'éthyle et le benzène à un pH supérieur à 4.

  
(2) Chromatographie en couche mince (TLC) L'antibiotique PS-5 (sel sodique) donne les valeurs Rf suivantes lorsqu'on l'essaye avec les plaques de chromatographie en couche mince et les solvants mentionnés ci-après. Les proportions des solvants dans le mélange de solvants que l'on utilise sont exprimées en volume/volume à moins d'indications contraires.

  
(a) Plaque de chromatographie en couche mince Avicel
(marque déposée) SF cellulose
 <EMI ID=18.1> 
(b) Plaques de qel de silice préalablement enrobées
 <EMI ID=19.1> 
 (3) Chromatographie sur papier

  
L'antibiotique PS-5 (sel sodique) donne les valeurs Rf suivantes, lorsqu'on utilise le papier filtre Toyo n[deg.] 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) et lorsqu'une chromatographie sur papier descendant est développée avec les solvants suivants:

  

 <EMI ID=20.1> 


  
Note 1: Solvant mixte comprenant 120 ml d'acétonitri-

  
le, 30 ml d'un tampon de tris-(hydroxyméthyl)aminométhane-acide chlorhydrique 1/10 M de pH 7,5

  
et 1 ml de sel sodique d'acide éthylènediaminetétraacétique 1/10 M de pH 7,5.

  
(4) Electrophorèse sur papier à haute tension

  
Le comportement suivant s'observe lorsque l'antibiotique PS-5 (sel sodique) est soumis à électrophorèse sur un papier filtre Toyo n[deg.] 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) en utilisant un appareil d'électrophorèse sur papier à haute tension (Savant Instruments Inc., puissance de 3000A à haute tension, chambre d'électrophorèse à plaque plane FP18A): au moins 5 mm, habituellement 10-40 mm de migration vers l'anode par une charge pendant 30 minutes sur un gradient de potentiel de 42 volts par cm dans un tampon de pH 8,6, composé de 3000 ml d'eau, de 3,3 g de barbital et de 25,5 g de barbital sodium.

  
(5) Acidité

  
L'antibiotique PS-5 est un acide monobasique comportant un acide carboxylique dans la molécule.

  
(6) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet

  
Le maximum d'absorption dans l'ultraviolet de l'anti-

  
biotique PS-5 (sel sodique) est le suivant:

  

 <EMI ID=21.1> 


  
(7) Spectre d'absorption dans l'infrarouge Les maximas d'absorption caractéristiques dans l'infrarouge de l'antibiotique PS-5 (sel sodique), mesurés par la méthode à comprimés de KBr sont les suivants:

  

 <EMI ID=22.1> 


  
(8) Spectre de résonance magnétique nucléaire des protons

  
L'antibiotique PS-5 (sel sodique) donne les signaux caractéristiques suivants dans un spectre de résonance magnétique

  
 <EMI ID=23.1> 

  
(i) un triplet centré approximativement à 1,06 ppm avec des constantes de couplage d'environ 7,5 HZ (CH -CH -) ; 

  
(ii) un multiplet à environ 1,72-2,00 ppm (CH3-CH2-);

  
(iii) un singlet net à environ 2,05 ppm (CH3-CO-) ;

  
(iv) un multiplet à environ 2,88-3,58 ppm (CH ,-

  
 <EMI ID=24.1> 

-CH-);

  
(v) un multiplet à environ 3,92-4,20 ppm

  

 <EMI ID=25.1> 


  
(9) Rotation spécifique

  
 <EMI ID=26.1> 

  
(10) Poids moléculaire et formule moléculaire

  
Le poids moléculaire est d'environ 298 (calculé à partir des résultats de la spectrométrie de masse à haute résolution pour l'ester méthylique de l'antibiotique PS-5). La formule moléculaire est:

  

 <EMI ID=27.1> 


  

 <EMI ID=28.1> 


  
Par les propriétés physico-chimiques précédentes, il est démontré de façon définitive que les groupes CH3-CH2-, CH3CC-, 

  

 <EMI ID=29.1> 


  
 <EMI ID=30.1>  tibiotique PS-5 (sel sodique).

  
Une analyse élémentaire de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 (Exemple 10) révèle la présence de soufre. Les valeurs du maximum et du minimum d'absorption dans l'ultraviolet ainsi que le pouvoir d'absorption et le coefficient d'extinction donnent une confirmation de la présence du squelette de thiénamycine dans la molécule. Ceci est encore confirmé par le fait que le maximum d'absorption dans l'ultraviolet est déplacé de 301 nm à
315 nm par estérification du fragment carboxylé (16 th Interscience Conférence on Antimicrobial Agents X Chemotherapy, Chicago, 29 octobre 1976).

  
Sur la base de preuves précédentes, on considère que l'antibiotique PS-5 a une structure moléculaire telle que ci-après:

  

 <EMI ID=31.1> 


  
Ceci est confirmé par l'épreuve supplémentaire que, comme on le décrira par la suite (Exemple 9), l'antibiotique PS-5 donne 13 signaux dans le spectre de résonance magnétique nucléaire de
13C et que les déplacements chimiques sont compatibles avec la

  
 <EMI ID=32.1> 

  
namycine.

  
Bien que l'antibiotique PS-5 semble être instable lorsque, par exemple, l'isolement est réalisé à la température ambiante, il est assez stable à basse température, par exemple en des-

  
 <EMI ID=33.1> 

  
ou

  
ble en solution aqueuse à un pH au voisinage de la neutralité/faiblement alcalin. Il subsiste au moins 50% et habituellement plus de 70% de l'activité antibiotique de l'antibiotique PS-5 après au moins 15 minutes de chauffage à 60[deg.]C dans une solution aqueuse à un pH voisin de la neutralité ou faiblement alcalin, inférieur à 9. 

  
Propriétés biologiques de l'antibiotique PS-5

  
(1) Spectres antibiotiques

  
L'antibiotique PS-5 suivant la présente invention, ayant une activité antibiotique de large spectre, montre une très forte activité contre diverses bactéries, par exemple les bactéries gram-positives appartenant aux genres Staphylococcus, Diplococcus, Streptococcus, Sarcina, Bacillus, etc, et les bactéries gram-négatives appartenant aux genres Alcaliqenes, Comamonas, etc. L'antibiotique PS-5 de l'invention montre également une bonne activité contre les bactéries gram-négatives appartenant aux genres Escherichia, Klebsiella, Proteus, etc.

  
L'antibiotique PS-5 montre une forte activité contre les bactéries gram-négatives qui sont résistantes aux antibiotiques ayant une structure à noyau de 5-lactame, par exemple les bactéries appartenant aux genres Citrobacter, Proteus, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, etc.

  
(2) Augmentation de Inactivité antibiotique d'autres

  
antibiotiques vis-à-vis de bactéries produisant

  
 <EMI ID=34.1> 

  
L'antibiotique PS-5 de l'invention est capable d'accroître l'activité antibiotique d'autres antibiotiques, en particulier d'antibiotiques à &#65533;-lactame, tels que les pénicillines et les céphalosporines, contre les bactéries produisant du p-lactamase, telles que Citrobacter freundii, Proteus vulqaris, Enterobacte&#65533; aeroqenes, Serratia marcescens, etc. On rencontre une activité synergique dans la plupart des cas.

  
(3) Activité in vivo 

  
L'antibiotique PS-5, lorsqu'il est administré à des souris infectées de bactéries gram-positives pathogènes, montre un effet thérapeutique marqué.

  
(4) Toxicité

  
L'antibiotique PS-5 ne provoque pas de mortalité chez les animaux d'essai lorsqu'on l'administre par la voie du péritoi-ne à des souris à une dose de 500 mg/kg.

  
Dérivés de l'antibiotique PS-5

  
Comme l'antibiotique PS-5 est assez labile, les procédés de récupération et d'isolement doivent être menés avec grand soin. Comme l'antibiotique PS-5 est en général plus stable sous la forme de sel que sous la forme d'acide libre, la forme sel est préférable lors d'une utilisation pour un usage pharmaceutique et lors d'un emploi à titre de matière intermédiaire pour la synthèse des dérivés, ainsi que durant le procédé d'isolement.

  
La forme sel citée ci-dessus englobe, par exemple, les

  
 <EMI ID=35.1> 

  
le sel de lithium, etc, les sels de métaux alcalino-terreux, tels que le sel de calcium, le sel de magnésium, etc, d'autres sels métalliques, tels que le sel d'aluminium, etc, le sel d'ammonium, les sels avec des amines primaires, secondaires ou tertiaires, par exemple la monoéthylamine, la diméthylamine, la triéthylamine, la monoéthanolamine, la diéthanolamine, etc, et les sels avec des bases organiques, comme la benzathine, la procaïne, etc. Des sels appropriés sont les sels acceptables en pharmacie, c'est-à-dire les sels comportant des cations qui n'influencent pas de façon défavorable les propriétés pharmacologiques et toxicologiques de l'acide libre. Des sels particulièrement appropriés sont les sels de métaux alcalins, tels que les sels de sodium, de potassium, etc.

  
Comme on l'a mentionné précédemment, l'antibiotique PS5 de l'invention est un acide monobasique comportant un groupe carboxylique dans la molécule. Il est par conséquent évident que divers esters peuvent dériver de l'antibiotique avec divers alcools, mercaptans ou dérivés de ceux-ci, pour former des esters, de la même manière que pour les esters des antibiotiques connus constitués par l'acide clavulanique ou la thiénamycine par exemple. En conséquence, l'invention englobe également de tels esters.

  
Suivant la présente invention, un ester approprié de l'antibiotique PS-5 est un ester répondant à la formule générale 
 <EMI ID=36.1> 
 dans laquelle R est un groupe alcoyle inférieur ou un groupe triphénylméthyle. Dans la formule (II) précédente, le groupe alcoyle inférieur désigne un groupe à chaîne droite ou à chaîne ramifiée, en particulier un groupe alcoyle comportant moins de 6 atomes de carbone, et plus particulièrement encore un groupe comportant de

  
1 à 4 atomes de carbone. Des exemples sont le méthyle, l'éthyle, le n-propyle, l'isopropyle, le n-butyle, l'isobutyle, le n-pentyle, l'isopentyle, le n-hexyle, etc.

  
Suivant l'invention, on peut préparer des esters de la formule (II) précédente en faisant réagir l'antibiotique PS-5 de la formule (I) ou les sels de celui-ci avec des composés répondant à la formule générale (III):

  

 <EMI ID=37.1> 


  
dans laquelle R a la signification donnée ci-dessus et Y désigne un atome ou un groupe qui peut être séparé, la réaction pouvant également se faire avec des diazoalcanes inférieurs.

  
En ce qui concerne les atomes ou groupes Y dans la formule (III) précédente, on peut employer n'importe quel type d'atome ou de groupe pouvant être séparé lors d'une mise en contact avec le groupe carboxyle de l'antibiotique PS-5, par exemple des atomes d'halogène, tels que le chlore, le brome ou l'iode, des groupes sulfonyloxy, des groupes carbonyloxy réactifs, tels que <EMI ID=38.1>  logène.

  
Des exemples de composés répondant à la formule générale
(III) précédente sont: alcool méthylique, iodure de méthyle, sulfate de diméthyle, méthyl mercaptan, éthanol, bromure d'éthyle, io-dure d'éthyle, éthyl mercaptan, chlorure de n-propyle, iodure de npropyle, alcool propylique, alcool isopropylique, bromure d'isopropyle, alcool n-butylique, bromure de n-butyle, iodure de n-butyle, alcool n-pentylique, chlorure de n-pentyle, bromure de npentyle, iodure de n-pentyle, alcool n-hexylique, bromure de nhexyle, iodure de n-hexyle, alcool tritylique, trityl mercaptan, chlorure de trityle, bromure de trityle, etc.

  
L'un des exemples des diazoalcanes inférieurs convenant pour la production des esters de l'antibiotique PS-5 est le diazométhane.

  
La réaction de l'antibiotique PS-5 avec les composés de la formule générale (III) ou avec les diazoalcanes inférieurs peut être menée en utilisant des méthodes connues d'estérification. A titre d'exemple, la réaction de l'antibiotique PS-5 avec les composés de la formule générale (III) ou avec les diazoalcanes inférieurs est de préférence réalisée dans un milieu liquide inerte, bien qu'on puisse également la réaliser en l'absence d'un tel milieu.

  
Le milieu inerte utilisable est par exemple choisi parmi:(a) les hydrocarbures, tels que le benzène, le toluène, le n-hexane, le cyclohexane, etc; (b) les halo-hydrocarbures, tels que le chloroforme, le chlorure de méthylène, etc; (c) des amides, comme le diméthylformamide, l'hexaméthylphosphotriamide, etc; (d) le sulfoxyde de diméthyle; (e) des éthers, tels que l'éther diéthylique, l'éther diisopropylique, l'éther di-n-butylique, le tétrahydrofuranne, le dioxane, etc; (f) des esters, tels que l'acétate d'éthyle, l'acétate de n-butyle, etc; et (g) des cétones, tels que l'acétone, la méthyl éthyl cétone, etc. On peut utiliser ces solvants seuls ou sous forme d'un mélange de deux ou plus d'entre eux. 

  
La température de réaction n'est pas critique et peut varier largement avec le type des composés de la formule générale
(III), le type des diazoalcanes inférieurs, le type de milieu liquide, etc, que l'on utilise. La température de réaction peut être  <EMI ID=39.1> 

  
choisie dans la gamme sur laquelle l'antibiotique PS-5 n'est pas décomposé de façon marquée mais, en général, une température appropriée se situe en dessous de 60[deg.]C, de préférence dans l'intervalle de 0 à 40[deg.]C, et plus particulièrement encore dans l'intervalle allant de 5[deg.]C à la température ambiante. Dans la mise en oeuvre de cette réaction, un stimulateur de réaction, tel que de la triméthylamine, de la triéthylamine, de la pyridine, du dicyclohexylcarbodiimide, etc, peut être utilisé suivant les nécessités. Sous ces conditions, la réaction peut être achevée en 1-24 heures, habituellement en 3-12 heures.

  
Suivant une forme de réalisation préférée de l'invention, l'antibiotique PS-5 utilisé pour la réaction avec le dérivé réactif de formule III, dans laquelle R est le triphénylméthyle, n'est pas nécessairement une préparation purifiée isolée. On peut même employer la matière de culture ou le bouillon filtré après séparation des mycélia à partir de la matière de culture, ainsi que la préparation brute de l'antibiotique PS-5 qui a été partiellement purifiée par les procédés de récupération et d'isolement décrits précédemment.

   Des exemples de la préparation partiellement purifiée sont: (a) un éluat concentré issu du charbon activé avec lequel le bouillon filtré a été traité; (b) un éluat concentré issu d'une résine de styrène-divinylbenzène, telle que le Diaion HP-20
(Mitsubishi Chemical Industries Ltd.), à laquelle le bouillon filtré a été soumis ; (c) un concentré désalé avec du charbon activé d'un éluat obtenu avec une concentration en gradient de chlorure de sodium dans un tampon phosphate en provenance d'une résine échangeuse d'ions, telle que par exemple le QAE-Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals), sur laquelle 1'éluat concentré ci-dessus

  
 <EMI ID=40.1> 

  
rure de méthylène concentré en présence de chlorure de benzalconium; (e) un extrait concentré avec du chloroforme en présence de composés en couronne; et (f) un extrait au butanol concentré à un pH de 3,5 à basse température.

  
L'ester de l'antibiotique PS-5 ainsi formé peut être isolé du mélange de réaction et purifié par diverses méthodes connues. A titre d'exemple, après la réaction, le mélange de réaction est d'abord versé dans un milieu aqueux pour séparer les impuretés aqueuses, telles que les sous-produits, etc. Il est préférable d'utiliser un tampon neutre comme milieu aqueux pour garder le pH aussi proche que possible de la neutralité. L'ester tritylique d'antibiotique PS-5 se trouvant dans ce mélange est ensuite extrait avec un solvant organique moins polaire, essentiellement non miscible à l'eau, par exemple de l'acétate d'éthyle, du benzène, du chloroforme, etc. Durant la phase d'extraction, on peut ajouter

  
un sel, tel que du chlorure de sodium, du sulfate d'ammonium, etc, pour renforcer l'efficacité de l'extraction.

  
Après séchage de l'extrait organique sur du sulfate de sodium anhydre, on peut isoler l'ester tritylique à partir de la couche de solvant par des méthodes connues, par exemple par une filtration sur gel en utilisant du Bio-Beads S-X3 (Bio-Rad Laboratories), du Séphadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals AB), etc, ou

  
une chromatographie à adsorption, en employant un véhicule, tel qu'un gel de silice, de l'alumine, de la terre à foulon,(Floridin Co.), etc, que l'on peut utiliser dans certaines combinaisons appropriées et de façon répétée si nécessaire.

  
L'ester tritylique peut encore être purifié par cristallisation dans un solvant ou un mélange de solvants, tels que

  
le benzène, le toluène, le xylène, l'acétate d'éthyle, l'éther diéthylique , le chlorure de méthylène, le chloroforme, l'hexane, l'éther de pétrole (bouillant dans l'intervalle de 30 à 60[deg.]C),etc.

  
Parmi les esters de la formule générale (II) que l'on peut produire par les procédés ci-dessus, l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5, répondant à la formule (II-a): 

  

 <EMI ID=41.1> 


  
se caractérise comme étant l'un des esters les plus intéressants

  
en raison des propriétés suivantes: il est plus stable comparativement à l'antibiotique PS-5 de formule (I) de sorte qu'il rend l'isolement plus facile, et il conserve une puissante activité antibiotique et une puissante activité inhibitrice du P-lactamase, alors que l'ester tritylique des pénicillines connues, par exemple, ne montre pas d'activité antibiotique essentielle quelconque. En outre, l'ester tritylique de formule (II-a) est très important en tant que l'un des esters actifs et intermédiaires intéressants

  
pour la synthèse d'autres produits intéressants du point de vue pharmaceutique, car le groupe trityle peut être facilement séparé. Les propriétés physico-chimiques et biologiques de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 suivant l'invention sont présentées en détails ci-après.

  
Propriétés physico-chimiques de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5
(A) Point de fusion

  
L'ester tritylique fond entre 83 et 88[deg.]C. Le point de fusion est mesuré, dans ce cas, par la méthode de Kofler avec un taux d'augmentation de la température de 1[deg.]C par minute (appareil:
appareil d'essai de point de fusion type BY-1, Yazawa Scientific Mfg. Co. Ltd.).

  
(B) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet
 <EMI ID=42.1> 
(C) Spectre d'absorption dans l'infrarouge 00 00 .60 au.0 0.

  
Les maximas d'absorption les plus caractéristiques en solution dans du chloroforme se présentent aux longueurs d'onde suivantes: 3430, 3100-3000, 3990, 2950, 1770, 1695, 1665, 1445,

  
 <EMI ID=43.1> 

  
(D) Solubilité

  
Cet ester est essentiellement insoluble dans l'eau, l'hexane et l'éther de pétrole (point d'ébullition: 30-600C), et il est soluble dans le benzène, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'acétone et le sulfoxyde de diméthyle.

  

 <EMI ID=44.1> 


  
(F) Couleur de la substance: incolore
(G) Chromatoqraphie en couche mince (TLC) Les valeurs Rf sur les plaques et avec les solvants in-  diqués ci-après se présentent comme suit:
(a) "feuille de chromatogramme n[deg.] 6065" (Eastman

  
Kodak Co.)
 <EMI ID=45.1> 
(b) Plaques de gel de silice préalablement enrobées
60 F254

  
(E. Merck), benzène/acétone (2/1) Rf=0,29
(H) Spectre de résonance magnétique nucléaire des

  
protons Le spectre de résonance magnétique à 100 MHz de l'ester tritylique dans du CDC13 montre les signaux caractéristiques suivants:

  
(i) Un triplet centré approximativement à 1,10 ppm avec des constantes de couplage d'environ 7,0 Hz;

  
(ii) Un singlet au voisinage de 1,86 ppm

  
(iii) Un multiplet à environ 7,0-7,67 ppm.

  
Les propriétés physico-chimiques précédentes sont compatibles avec la structure (II-a).

  
En particulier, les faits suivants confirment de façon nette que le produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 est un ester:

  
 <EMI ID=46.1> 

  
à environ 1640-1540 cm , qui se présente dans le spectre dans l'infrarouge de l'antibiotique PS-5 (sel sodique), ne s'observe pas dans le spectre dans l'infrarouge de son ester tritylique. Au contraire, l'ester tritylique montre une absorption nette d'un groupe
-CO- dans un fragment d'ester à environ 1695 cm ;

  
(ii) L'antibiotique PS-5 ne peut essentiellement pas être extrait avec un solvant au départ d'une solution aqueuse neutre ou faiblement alcaline, alors que l'ester tritylique peut être facilement extrait;

  
(iii) Le maximum d'absorption dans l'ultraviolet de l'antibiotique PS-5 est 301 nm, tandis que celui de l'ester tritylique est de 315,5 nm. Ce décalage est analogue au cas de l'ester méthylique de N-acétyl-thiénamycine.

  
Propriétés biologiques de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5

  
(1) Spectres antibiotiques

  
L'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 a une activité antibiotique de large spectre et il montre en particulier une très forte activité contre diverses bactéries gram-positives appar-tenant aux genres, tels que Staphylococcus, Diplococcus, Streptococcus, Sarcina, Bacillus etc , et contre diverses bactéries gramnégatives appartenant aux genres tels que Alcaligenes, Comamonas, etc.

  
L'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 montre également une bonne activité contre des bactéries gram-négatives appartenant aux genres tels que Escherichia, Klebsiella, Proteus, etc.

  
Une caractéristique remarquable montrée par l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 est sa forte activité contre les bactéries gram-négatives qui sont résistantes aux antibiotiques ayant une structure à noyau de 0-lactame et appartiennent, par exemple, aux genres Citrobacter, Proteus, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, etc.

  
(2) Augmentation de l'activité antibiotique d'autres

  
antibiotiques contre les bactéries produisant du

  
 <EMI ID=47.1> 

  
L'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 est également capable de renforcer l'activité antibiotique d'autres antibiotiques, spécialement des antibiotiques à (3-lactame, comme les pénicillines et les céphalosporines, vis-à-vis de.bactéries produisant du &#65533;-lactamase, telles que Citrobacter freundii, Proteux vulqaris, Enterobacter aeroqenes, Serratia marcescens, etc.

  
(3) Activité in vivo

  
L'ester tritylique de l'antibiotique PS-5, lorsqu'on l'administre à des souris infectées d'une bactérie gram-positive pathogène, montre un effet thérapeutique remarquable.

  
(4) Toxicité

  
L'ester tritylique ne provoque pas de mortalité pour des animaux d'essai lorsqu'on l'administre par la voie du péritoine à des souris à une dose de 500 mg/kg.

  
Méthode d'utilisation et préparations pharmaceutiques

  
de l'antibiotique PS-5 et de ses dérivés

  
L'antibiotique PS-5 et ses dérivés décrits précédemment peuvent être représentés par la formule générale suivante:

  

 <EMI ID=48.1> 


  
 <EMI ID=49.1> 

  
le triphénylméthyle, cette formule englobant les sels du composé

  
 <EMI ID=50.1> 

  
la formule II présentée précédemment et représentant les esters de l'antibiotique PS-5. L'expression "sels du composé pour les-

  
 <EMI ID=51.1> 

  
PS-5 de la façon définie précédemment pour les dérivés de l'antibiotique PS-5, et cette expression englobe également les sels acceptables en pharmacie de cet antibiotique.

  
L'antibiotique PS-5 et ses dérivés, en particulier l'ester tritylique, montrent une activité in vitro et in vivo contre les micro-organismes gram-négatifs et gram-positifs, et en conséquence ils sont intéressants pour lutter contre et prévenir des infections bactériennes chez des animaux d'essai.

  
L'antibiotique PS-5 ou son ester tritylique et les compositions en contenant peuvent s'administrer par voie orale, topique ou parentérale (intraveineuse, intramusculaire, dans le péritoine, etc) et on peut les utiliser dans toute une série de préparations pharmaceutiques traditionnelles suivant la méthode d'ad-

  
 <EMI ID=52.1> 

  
tritylique peuvent être combinés avec un véhicule, diluant, etc, acceptable du point de vue pharmacologique, sous des formes solides
(par exemple des comprimés, des capsules, des poudres, des granu-

  
de sucre

  
lés, des comprimés enrobés/, des bougies, des pulvérisations de pou- . 

  
dre, des suppositoires, etc), des formes semi-solides (par exemple des pommades, des crèmes, des capsules semi-solides, etc), ou des formes liquides (par exemple des solutions, des émulsions, des suspensions, des lotions, des sirops, des solutions pour injection, des pulvérisations liquides, etc).

  
La préparation d'une dose unitaire contenant l'antibiotique PS-5 ou son ester tritylique peut contenir, d'une façon générale, de 0,1 à 99% en poids du composant actif sous l'une quelconque des formes liquide, semi-solide et solide. Des exemples d'additifs constituant des véhicules, des charges, des diluants, etc, que l'on peut utiliser pour ces préparations et également leur procédé de préparation seront décrits plus complètement par la suite.

  
Les comprimés et les capsules destinés à une administration par voie orale peuvent être sous la forme d'une préparation

  
en dose unitaire et peuvent contenir des agents liants, par exemple un sirop, de la gomme de caroube, de la gélatine, du sorbitol, de la gomme adraganthe, de la polyvinylpyrrolidone, etc; des charges, par exemple du lactose, du sucrose, de l'amidon, du phosphate de calcium, du sorbitol, de la glycine, etc; des lubrifiants, par exemple du stéarate de magnésium, du talc, du polyéthylène gly-  col, de la silice, etc; des agents de désintégration, par exemple de l'amidon de pommes de terre, etc; ou des agents mouillants, par exemple du lauryl sulfate de sodium, etc. Les comprimés peuvent être enrobés suivant des procédés bien connus en pratique.

  
Les préparations liquides destinées à une utilisation par voie orale peuvent être sous la forme de suspensions, solutions, émulsions, sirops, etc, huiles ou aqueux, ou bien elles peuvent 

  
se présenter sous forme de produits secs qui peuvent être combinés avec de l'eau ou d'autres véhicules appropriés avant l'utilisation. Les préparations liquides susdites destinées à une utilisation par voie orale peuvent contenir les ingrédients suivants, admissibles du point de vue pharmaceutique: des agents de mise en suspension
(par exemple de la méthyl cellulose, un sirop de sorbitol, un sirop de sucre, de l'hydroxyéthyl cellulose, de la gélatine, de la carboxyméthyl cellulose, du stéarate d'aluminium en gel, des graisses et des huiles comestibles hydrogénées); des agents émulsionnants (par exemple de la lécithine, du mono-oléate de sorbitane); des véhicules non aqueux (par exemple de l'alcool éthylique, du propylène glycol, des esters huileux, de l'huile de coprah fractionnée, de l'huile d'amandes);

   des agents de conservation (par exemple du p-hydroxybenzoate de méthyle, du p-hydroxybenzoate de propyle,

  
de l'acide sorbique).

  
Des suppositoires peuvent contenir des bases traditionnelles pour suppositoires, comme le beurre de cacao et divers glycérides.

  
Les compositions pour injection peuvent se préparer sous la forme de doses unitaires en ampoules ou en récipients à doses multiples avec un agent de conservation. Elles peuvent se trouver sous la forme de suspensions, de solutions,et d'émulsions dans des véhicules huileux ou aqueux et, si nécessaire, elles peuvent contenir des agents de combinaison, tels que des agents de mise en suspension, des agents dispersants et des agents stabilisants. A titre de variante, l'antibiotique suivant la présente invention peut être préparé sous la forme d'une poudre que l'on peut combiner avec de l'eau stérile, exempte de pyrogène, avant l'utilisation.

  
Des compositions contenant l'antibiotique PS-5 et/ou son ester tritylique peuvent être prévues sous diverses formes convenant pour une absorption à travers la membrane muqueuse du nez, de la gorge et des bronches. A titre d'exemple, la forme de pulvérisations en poudre ou en liquide, d'agents d'inhalation, de pastilles, etc, sera avantageuse pour les besoins susdits. Pour le traitement des oreilles et des yeux, l'antibiotique suivant la présente invention peut être préparé sous forme de capsules individuelles, sous forme de gouttes, sous une forme liquide ou semi-solide, etc.

  
 <EMI ID=53.1> 

  
présenté sous forme de formulations dans des bases hydrophiles ou hydrophobes, par exemple des poudres, des lotions, des crèmes, des pommades, etc.

  
Si on le désire, en plus d'un véhicule, les compositions décrites ci-dessus peuvent contenir d'autres ingrédients, par exemple des agents de conservation, des antioxydants, des lubrifiants, des agents de viscosité, des agents aromatisants, des agents de mise en suspension, des liants, des agents stabilisants, etc.

  
Lorsque l'antibiotique PS-5 et/ou son ester tritylique sont destinés à une utilisation telle que le traitement d'infections chez les porcs, les vaches, les moutons, etc, les formulations peuvent &#65533;tre présentées sous forme de préparations intramammaires dans des bases à longue durée d'action ou à libération rapide, ou sous forme de concentrés servant d'additifs d'alimentations. Les compositions pharmaceutiques décrites ci-dessus suivant la présente invention peuvent contenir l'antibiotique PS-5 et/ou son ester tritylique à titre de seul ingrédient actif ou sous forme d'une combinaison avec d'autres ingrédients efficaces du point thérapeutique.

  
Comme on l'a expliqué en détails précédemment, comme l'antibiotique PS-5 et son ester tritylique ont un effet synergique sur diverses bactéries produisant du P-lactamase, en combinaison avec des composés à &#65533;-lactame, il sera avantageux de combiner cet antibiotique et/ou son ester tritylique avec des composés à 5-lactame dans des compositions pharmaceutiques. A titre d'exemples de composés à &#65533;-lactame, on peut mentionner les dérivés de pénicillines, comme la benzylpénicilline, la phénoxyméthylpénicilline, la carbénicilline, l'ampicilline et l'amoxicilline; et des dérivés de céphalosporines, tels que la céphaloridine, la céphalotine, la céfazoline, la céphalexine, la céfoxitine, le céphacétrile, le céphamandole, la céphapirine, la céphradine et la céphaloglycine.

   Lorsque l'antibiotique PS-5 et/ou son ester tritylique sont combinés avec un ou plusieurs membres des composés à bêta-lactame mentionnés ci-dessus, le rapport de combinaison de l'antibiotique suivant l'invention avec le ou les composés à b&#65533;ta-lactame connus n'est pas critique mais peut varier suivant une large gamme. Cependant, du point de vue pratique, il sera à conseiller d'utiliser le rapport quantitatif de l'antibiotique suivant l'invention au ou aux composés à b&#65533;ta-lactame connus, se situant dans l'intervalle de 20/1 à 1/150, de préférence dans l'intervalle de 10/1 à 1/100.

   Dans le traitement d'infections bactériennes chez les mammifères, la dose de l'antibiotique PS-5 et/ou de son ester tritylique peut varier suivant le sujet à traiter, le poids de corps, le type, la sévérité et le symptôme des infections, le mode et le nombre d'administrations, etc. Pour une administration orale ou parentérale traditionnelle, il sera avantageux d'utiliser la dose journalière de l'ordre de 0,05 à 500 mg/kg, de préférence de 0,5 à 200 mg/kg, plus particulièrement encore sous forme de doses subdivisées. Il est évident qu'une dose se situant au-delà de la gamme recommandée ci-dessus peut également être utilisée suivant les états individuels des sujets à traiter.

  
L'antibiotique PS-5 et/ou son ester tritylique peuvent non seulement être utilisés dans des compositions pharmaceutiques de la façon expliquée ci-dessus mais peuvent en outre être ajoutés directement ou sous forme de concentrés additifs dans des alimentations pour animaux. De plus, on peut les utiliser à titre d'ingrédients actifs pour des agents de conservation pour aliments ou des agents désinfectants.

  
Les Exemples suivants illustreront plus complètement encore la présente invention. Dans tous ces Exemples, les titrations ou essais quantitatifs et qualitatifs de l'activité antimicrobienne ont été basés sur les méthodes suivantes: 

  
(1) Bio-titration de l'activité antimicrobienne

  
Une culture faite pendant la nuit de Comamonas terrigena B-996 sur un gélose nutritif est mise en suspension dans un bouillon nutritif de manière à obtenir une densité optique de cellules de 0,040 à 610 nm.

  
La suspension d'ensemencement est ajoutée en une quantité de 1% à un milieu de gélose fondu contenant 0,8% de Kyokuto Nutrient Broth Powder (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) et 1,0% de Bacto-Agar (Difco Laboratories). On répartit 7 ml du milieu de gélose fondu ensemencé dans une botte de Petri (diamètre de 9 cm) et ce milieu est solidifié. Ceci est défini comme étant la plaque de titration de Comamonas.

  
Du Staphylococcus aureus FDA 209P est cultivé pendant

  
la nuit dans un bouillon nutritif avec secouement et dilué 50 fois dans un bouillon nutritif pour donner la suspension d'ensemencement. On mélange une quantité de 1% (volume/volume) de la suspension d'ensemencement avec un milieu de gélose fondu contenant 1% deKyokuto Nutrient Broth Powder (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) et 1% de Bacto-Agar (Difco Laboratories). 7 ml du milieu de gélose fondu ensemencé est versé et gélifié dans une botte de Petri
(diamètre de 9 cm). Ceci est défini comme étant une plaque de titration de Staphylococcus.

  
D'une manière similaire, on prépare une plaque de titration d'Alcaligenes. La culture inclinée de gélose nutritif , préparée pendant une nuit, d'Alcaliqenes faecalis B-326 est mise en suspension dans un bouillon nutritif pour donner la suspension d'ensemencement, la concentration de cellules étant ajustée à une densité optique de 0,020 à 610 nm. On fait fondre un milieu de gélose comprenant 0,5% de Kyokuto Nutrient Broth Powder (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) et 1,0% de Bacto-Agar (Difco Laboratories) à une température admissible et on ensemence avec 1,0% d'inoculum de la suspension d'ensemencement. 7 ml du milieu gélose fondu ensemencé sont répartis dans une botte de Petri d'un diamètre de

  
9 cm et gélifiés. Ceci est défini comme étant une plaque de titration d'Alcaliqenes.

  
Un disque de pate d'un diamètre de 8 mm est imbibé de la façon habituelle par une solution d'échantillon à titrer, puis on le laisse sur une feuille propre de papier-filtre sur une période de temps suffisante pour séparer l'excès de solution, puis on

  
 <EMI ID=54.1> 

  
pendant 20 heures, le diamètre de la zone d'inhibition observée

  
est mesuré et comparé avec des solutions normalisées de céphaloridine. L'activité antimicrobienne de l'antibiotique PS-5 et des composés apparentés est exprimée en unités équivalentes de céphaloridine par ml.

  
De façon plus particulière, une solution de l'antibiotique PS-5 et des composés apparentés de la présente invention, qui montrent le même diamètre de zone d'inhibition que 100 &#65533;g/ml de

  
 <EMI ID=55.1> 

  
De façon similaire, lorsqu'un échantillon solide de l'antibiotique PS-5 et des composés apparentés suivant l'invention montre- , à

  
une concentration de 1 mg/ml, le même diamètre que 1 &#65533;g/ml de céphaloridine, l'activité spécifique de l'échantillon solide est désignée par 1 unité de céphaloridine/mg. Comme le savent les spécialistes dans ce domaine, la courbe normalisée de titration varie dans une certaine mesure suivant l'espèce des micro-organismes d'essai. Pour désigner l'espèce des micro-organismes d'essai, l'expression unitaire suivante est utilisée: unité de céphaloridine

  
de Comamonas (abréviation CCU); unité de céphaloridine de Staphylo-

  
 <EMI ID=56.1> 

  
(abréviation ACU).

  
(2) Bio-autographie

  
On prépare une grande plaque de titra\ion de la façon décrite sous (1) ci-dessus, sauf que 100 ml du milieu de gélose fondu ensemencé sont versés dans une botte rectangulaire de

  
32 x 24 cm, au lieu d'une botte de Petri de 9 cm de diamètre.

  
Un chromatogramme sur papier à titrer est placé pendant
15 minutes sur cette grande plaque de titration. Après enlèvement

  
 <EMI ID=57.1> 

  
nutes pour révéler la ou les zones d'inhibition. Cette technique permet non seulement de calculer la ou les valeurs Rf (titration qualitative), mais également de déterminer l'activité antimicrobienne (titration semi-quantitative) sur la base de la dimension de l'halo.

  
Dans le cas de l'utilisation d'une plaque de TLC, on intercale une feuille de papier mince entre la plaque de TLC et

  
la surface de la plaque de titration. Le même processus est réalisé pour les titrations qualitatives et semi-quantitatives.

Exemple 1

  
Un ballon d'Erlenmeyer de 500 ml, contenant le milieu

  
de culture d'ensemencement suivant (SE-4) est stérilisé à 120*C pendant 15 minutes. A la culture inclinée bien sporulée de Streptomyces sp. A271, on ajoute 10 ml d'une solution à 0,02% de Tween-80 (agent tensio-actif de la société Atlas Powder Corp.) et on agite légèrement le mélange pour former la suspension de spores. Le ballon d'Erlenmeyer de 500 ml est inoculé par 1 ml de la suspension de spores et soumis à culture avec secouement à 28[deg.]C pendant 48 heures sur une secoueuse rotative (200 tor.rs par minute; rayon de cercle de 3,5 cm). Ensuite, on inocule 2 ml de la culture d'ensemencement dans chacun des six ballons d'Erlenmeyer' de

  
500 ml, contenant chacun 100 ml des milieux de production décrits ci-après et on soumet à une culture avec secouement à 28[deg.]C pendant
48 à 96 heures sur une secoueuse rotative.

  
Milieu de culture d'ensemencement (SE-4) 
 <EMI ID=58.1> 
 pH de 7,5 avant la stérilisation; pH de 7,1 après la stérilisation; pH de 7,4 après fermentation de 2 jours.

  
Milieux de production

  
(1) Milieu AG-1

  

 <EMI ID=59.1> 


  
pH de 7,2 avant la stérilisation; pH de 6,1 après la stérilisation; pH de 7,8 après fermentation de 4 jours

  
(2) Milieu AGA-2

  

 <EMI ID=60.1> 


  
pH de 6,5 avant stérilisation, pH de 5,8 après stérilisation; pH de 7,8 après fermentation de 4 jours.

  
(3) Milieu AGB-1

  

 <EMI ID=61.1> 


  
pH de 6,5 avant stérilisation; pH de 5,9 après stérilisation;

  
pH de 7,9 après fermentation de 4 jours. 

  
(4) Milieu AGB-41

  

 <EMI ID=62.1> 


  
pH de 7,0 avant stérilisation; pH de 6,9 après stérilisation; pH de 7,9 après fermentation de 4 jours.

  
(5) Milieu ML-19

  

 <EMI ID=63.1> 


  
pH de 6,4 avant stérilisation; pH de 7,0 après stérilisation; pH de 7,0 après fermentation de 4 jours.

  
(6) Milieu AGO-1

  

 <EMI ID=64.1> 


  
pH de 7,0 avant stérilisation; pH de 7,2 après stérilisation; 

  
pH de 7,2 après fermentation de 4 jours.

  
La puissance antibiotique du filtrat de bouillon a été déterminée par la titration sur disque de la façon décrite précédemment, en utilisant du Comamonas terrigena B-996, du Staphylococcus aureus 209P et du Alcaligenes faecalis B-326. Les résultats observés 72 heures après l'inoculation sont les suivants:

  
TABLEAU 5

  

 <EMI ID=65.1> 

Exemple 2

  
100 ml de la culture d'ensemencement préparée de la façon décrite dans l'Exemple 1 sont transférés dans un appareil de fermentation de 30 litres, contenant 15 litres de milieu ML-19 et cultivés sous aération forcée à 28[deg.]C pendant 96 heures à 200 tours par minute, l'air stérile étant alimenté à 7,5 litres/minute. On utilise une huile de silicone (Silicone KM-75, Shin-Etsu Chemical Industries Co., Ltd.) à titre d'agent antimousse à une concentration de 0,05%. Le bouillon de fermentation est récolté et centrifugé après les temps indiqués. La puissance antibiotique du filtrat de bouillon est la suivante:

  

 <EMI ID=66.1> 

Exemple 3

  
En utilisant un procédé semblable à celui décrit dans l'Exemple 1, on cultive du Streptomyces sp. A271 dans un ballon d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu SE-4 et on inocule dans un appareil de fermentation de 30 litres contenant 15 litres de milieu SE-4. Après culture à 28[deg.]C pendant 24 heures à

  
200 tours par minute sous une aération forcée de 7,5 litres/minute, on verse 1 litre de la culture d'ensemencement dans un appareil de fermentation à réservoir en acier inoxydable de 200 litres, contenant 100 litres de ML-19. L'appareil de fermentation à réservoir est aéré sous agitation à 28[deg.]C pendant 72 heures et à 100 tours par minute, la vitesse d'aération étant entretenue à 50 litres/minute. Le pH initial est de 7,0, tandis que le pH final est de 7,1. Le bouillon est mélangé avec 5% (poids/volume) de perlite (Topco Perlite, Topco n[deg.] 34, Toko Perlite Kogyo K.K.) et filtré à travers

  
un filtre-presse pour donner 80 litres de filtrat de bouillon. La puissance antibiotique de la liqueur claire est de 60 CCU/ml.

Exemple 4

  
Préparation du concentré sur charbon actif

  
Comme décrit dans l'Exemple 1, on soumet à incubation

  
10 ballons d'Erlenmeyer de 500 ml, contenant 100 ml chacun de milieu ML-19, avec secouement pendant 2 heures. Au bouillon combiné, on ajoute 2% (poids/volume) d'un adjuvant de filtration de perlite
(Topco Perlite, Topco n[deg.] 34, Toko Perlite Kogyo K.K.) et on filtre à travers un entonnoir de Buchner pour obtenir 800 ml du filtrat

  
de bouillon. Après confirmation que le pH est de l'ordre de 7-8, on ajoute 16 g de charbon activé (Charcoal Activated, Shirasagi; Takeda Chemical Industries, Ltd.) et on agite pendant 15 minutes. Le charbon activé est récolté par centrifugation, on le lave avec
800 ml d'eau distillée et on centrifuge. Le charbon activé ainsi récupéré est dilué avec 400 ml d'acétone à 50% (volume/volume) sous agitation à la température ambiante pendant 30 minutes. La solution surnageante obtenue (éluat) (52 CCU/ml) est concentrée à 50 ml à une température de 30-35[deg.]C dans un évaporateur rotatif. La titra-tion antibiotique du concentré est de 800 CCU/ml.

  
Les expériences suivantes ont été réalisées afin de prouver de façon nette que l'antibiotique PS-5 de l'invention est différent du MM4550 (Complex) qui a été décrit comme étant un inhibiteur de bêta-lactamase dans les demandes de brevet allemand publiées 2.513.855 et 2.513.854.

  
Trois souches de Streptomyces olivaceus ATCC 31126 (=ATCC

  
 <EMI ID=67.1> 

  
pendant 72 heures sur une secoueuse rotative dans un ballon d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml du milieu suivant:

  

 <EMI ID=68.1> 


  
pH de 7,0 avant le traitement à l'autoclave

  
L'activité antibiotique dans le bouillon filtré est adsorbée sur du charbon activé, puis on lave à l'eau et on élue avec de l'acétone à 50%. L'éluat obtenu est concentré à un faible volume sous pression réduite Et soumis à une chromatographie sur papier descendant sous les conditions ci-après:

  

 <EMI ID=69.1> 


  
Les valeurs Rf ont été déterminées par bio-autographie sous les conditions précédentes sur du Comamonas terrigena B-996.

  
Parallèlement aux trois souches énumérées ci-dessus de Streptomyces olivaceus, la souche Streptomyces sp. A271 suivant la présente invention a été mise à fermenter dans un milieu composé de 4,0% de glycérine, de 0,2% de glucose, de 0,5% de peptone, d'amidon de pommes de terre 0,2 %, de 0,5% de farine de soya dégraissée, de 0,5% de levure sèche, de 0,5% de NaCl et de 0,2% de

  
 <EMI ID=70.1> 

  
et la titration ultérieurs sont les mêmes que précédemment.

  
Les essais bio-autographiques ont démontré que l'antibiotique PS-5, qui est un produit de Streptomyces sp. A271 suivant l'invention, est un nouveau produit différent du MM 4550 (complex) décrit dans les demandes de brevet allemand mentionnées précédemment.

Exemple 5

  
Préparation de l'éluat d'antibiotique PS-5 sur Diaion HP20

  
Comme décrit dans l'Exemple 1, 15 litres de milieu ML-

  
19 sont amenés à fermenter dans 150 ballons pendant 72 heures. Au bouillon récolté, on ajoute 100 mg d'éthylènediaminetétraacétate disodique et 2% (poids/volume) de Topco Perlite, Topco n* 34, et on filtre à travers un grand entonnoir de Buchner pour obtenir 4,1 litres du filtrat de bouillon (pH 7,9). On charge sur une colonne

  
de Diaion HP20 de 7 x 50 cm (copolymère de styrène et de divinylbenzène, très poreux, sous la forme de perles, ayant une structure macroréticulaire et fabriqué par la société Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.), puis on lave avec 7 litres d'eau distillée et on élue avec du méthanol à 50% (volume/volume). Le schéma d'élution de l'activité antibiotique est le suivant (Tableau 7): 

  
TABLEAU 7

  

 <EMI ID=71.1> 


  
Les éluats- 8 à 14 sont combinés, concentrés à 100 ml

  
 <EMI ID=72.1> 

  
puis lyophilisés pour donner 2,6 g d'une poudre brun jaunatre dont la puissance est de 54 CCU/mg. Cette poudre brun jaunâtre est dissoute dans de l'eau distillée à une concentration de 500 CCU/ml.

  
Les solutions dans un tampon phosphate, ayant les pH indiqués, sont préparées en ajustant du phosphate dipotassique M/15

  
à un pH désiré avec du NaOH 5N ou de l'acide phosphorique 5N. A 1 ml de la solution d'antibiotique PS-5, on ajoute 1 ml du tampon phosphate et, si nécessaire, on réajuste la valeur de pH à la valeur initiale. Les solutions de l'antibiotique PS-5 ayant des pH

  
 <EMI ID=73.1> 

  
puis refroidies dans de l'eau de robinet et neutralisées jusqu'au pH de 7,0 avec une petite quantité de NaOH 5N ou d'acide phosphorique de 5N. Le tube témoin contenant la solution d'antibiotique PS-5 d'un pH de 7,0 est placé dans un bain de glace pendant 30 minutes. L'activité antimicrobienne restante est déterminée de la façon décrite précédemment, en utilisant du Comamonas terrigena B-996 comme micro-organisme de titration. Les résultats présentés par le Tableau suivant ont été calculés en % du témoin:

  

 <EMI ID=74.1> 


  
Ces résultats montrent que la poudre de couleur brun jaunâtre, obtenue suivant le présent Exemple, est assez stable à un pH de l'ordre de 6,0 à 9,0 pendant 30 minutes à 60[deg.]C. En outre, la stabilité de l'antibiotique PS-5 semble augmenter à une température plus basse, même à un pH acide. A titre d'exemple, après que l'antibiotique PS-5 a été traité au pH de 3,0 pendant 5 minutes à <EMI ID=75.1>  initiale.

Exemple 6

Extraction à basse température avec du n-butanol

  
Un grand tube d'essai contenant 20 ml d'eau distillée,
12 ml de n-butanol et 7 g de chlorure de sodium est refroidi jus-

  
 <EMI ID=76.1> 

  
de l'antibiotique PS-5, obtenue suivant l'Exemple 5, est diluée à une concentration de 200 mg/ml dans de l'eau distillée et préalablement réfrigérée. On ajoute 1 ml de la solution froide de l'antibiotique PS-5 dans ce tube d'essai et on règle rapidement à un pH de 2,75, à un pH de 3,0 ou à un pH de 3,25 avec de l'acide sulfurique, tandis que la température du mélange est maintenue en dessous de
-10[deg.]C. Après mélange à fond, la couche au n-butanol est récupérée et bien mélangée avec 5 ml d'un tampon phosphate 0,5 M (pH de 6,8), de sorte que le composant actif est transféré dans la couche aqueu-se. La bio-titration de la solution aqueuse donne la possibilité suivante d'extraction de l'antibiotique PS-5 à partir de la poudre de couleur brun jaunatre:

  

 <EMI ID=77.1> 

Exemple 7

  
Préparation de la poudre sur QAE-Sephadex

  
Par le même procédé que celui décrit dans l'Exemple 5, on obtient 27,7 g de la poudre de couleur brun jaunatre de l'antibiotique PS-5, au départ de 100 litres d'un filtrat de bouillon après lyophilisation. Cette poudre (activité spécifique de 13,2 CCU/mg) est dissoute dans 30 ml d'un tampon phosphate 25 mM (pH

  
de 6,8) et appliquée sur une colonne de QAE-Séphadex A-25 (résine échangeuse d'anions fortement basique, totalement quaternisée, obtenue par l'introduction de groupes de diéthyl-2-hydroxypropyl ammonium dans un gel de dextrane, production de la société Pharmacia Fine Chemicals AB) (3,3 x 25,0 cm), qui a été équilibrée avec le même tampon. Après lavage avec une petite quantité du même tampon phosphate, l'activité est éluée avec le même tampon contenant du chlorure de sodium, la concentration du chlorure de sodium étant modifiée linéairement de zéro à 0,5 % durant l'élution. La

  
 <EMI ID=78.1> 

  
de charbon activé. Le charbon activé est récolté, lavé à l'eau et élue avec 50% d'acétone (volume/volume). Après séparation de

  
 <EMI ID=79.1> 

  
récupère par lyophilisation, 727 mg d'une poudre jaune brunatre du sel sodique de l'antibiotique PS-5. L'activité spécifique de cette préparation est de 264 CCU/mg. 

Exemple 8

  
Préparation de la poudre sur DEAE-cellulose La poudre de couleur jaune brunâtre (727 mg) de l'antibiotique PS-5, qui a été obtenue suivant l'Exemple 7, est dissoute dans 1 ml d'un tampon phosphate 25 mM (pH de 6,8) et chargée sur une colonne (1,5 x 27,0 cm) de Bio-Gel P-2 (composition de gel formée par un polymère synthétique réticulé en perles, à base d'un

  
 <EMI ID=80.1> 

  
phosphate. En développant avec le même tampon phosphate, on obtient la fraction active (15 ml).

  
La fraction active obtenue est ensuite alimentée sur une colonne (2,5 x 28,0 cm) de diéthylaminoéthyle (DEAE) cellulose DE32 (Whatman Ltd.), qui a été équilibrée avec le même tampon phosphate. L'élution est réalisée avec un gradient linéaire de chlorure de sodium dans le même tampon phosphate allant de 0 à 0,5 M.La fraction active récupérée (240 ml) est adsorbée sur 4,5 g de char-

  
 <EMI ID=81.1> 

  
qu'à ce qu'on ne décèle plus d'acétone, puis on lyophilise pour obtenir 120 mg d'une poudre blanche brunâtre du sel sodique de l'antibiotique PS-5. L'activité spécifique de cette préparation est de 600 CCU/mg.

Exemple 9

Préparation très purifiée d'antibiotique PS-5

  
On remplit deux réservoirs de fermentation de 200 litres, en acier inoxydable, par 100 litres du milieu ML-19 contenant 2,5% de farine de soya dégraissée, on traite en autoclave, on inocule avec du Streptomyces sp. A271 de la même manière que dans le cas de l'Exemple 3 et on procède à fermentation pendant 72 heures sous aération et agitation. Les contenus des deux réservoirs de fermentation sont combinés, mélangés avec 5% (poids/volume) de Topco Perlite, Topco n[deg.] 34 (Topco Perlite Kogyo K.K.) et on filtre à tra-vers un filtre-presse pour obtenir 160 litres du filtrat de bouillon. La titration antibiotique de ce filtrat est de 235 CCU/ml.

   On fait passer ce filtrat de bouillon à travers une colonne de résine échangeuse d'ions Diaion ?A-306 (résine échangeuse d'anions, fortement basique, comportant une matrice de polystyrène réticulée et des fragments de chlorure de triméthylammonium, production de la société Mitsubishi Chemical Industries Ltd,; 10 x 52 cm; 4,5 litres de volume humide) sans retenue de ce filtrat dans cette colonne. Ensuite, l'activité ayant traversé cette colonne est adsorbée sur une colonne de Diaion HP-20 (14 x 97 cm; 15 litres) et on élue avec du méthanol à 75%. L'éluat actif récolté (2 litres; 9854 CCU/ml) est dilué trois fois avec 4 litres d'eau et appliqué sur une colonne de 2 litres (5,5 x 84 cm) de Diaion PA-306S.

   Après lavage avec
500 ml d'eau, l'activité antibiotique est éluée avec 8 litres de chlorure de sodium en gradient linéaire de 0 à 3%, puis on récolte en fractions de 200 ml. Les fractions actives n[deg.] 17 à 31 sont combinées pour donner 2,8 litres de l'éluat actif (4120 CCU/ml). Cet éluat est ensuite chargé sur une colonne de Diaion HP-20 de 1 li-  tre (4,5 x 63 cm) et on élue avec 3 litres d'acétone de gradient linéaire de 0 à 25%. Le volume de chaque fraction est de 30 ml. L'éluat actif (390 ml; 27220 CCU/ml) est récupéré en combinant les fractions actives du point de vue antimicrobien n[deg.] 54 à 66.

  
Après séparation de l'acétone par distillation sous pression réduite, on fait passer l'éluat sur Diaion HP-20 à travers une colonne de 200 ml de QAE-Sephatex A-25 (2,5 x 41 cm). L'activité antimicrobienne est recueillie en fractions de 10 ml par élution avec 2 litres de chlorure de sodium en gradient linéaire (0-1,5%). On réunit les fractions 68 à 81 à titre d'éluat actif (140 ml;
42120 CCU/ml).

  
 <EMI ID=82.1> 

  
au pH de 8,3 avec 1% de NaOH et on charge ensuite sur une colonne

  
DIAION HP-20 AG (Mitsubishi Chemical

  
de 200 ml de/Industries, Ltd.; 2,5 x 41 cm). Une élution à gradient linéaire est réalisée avec 1 litre d'acétone aqueuse, de 0 à 10%. 

  
Le volume de chaque fraction est de 10 ml. On combine les fractions
48 à 53 pour obtenir 60 ml de l'éluat actif (45000 CCU/ml). Une lyophilisation donne 249 mg de poudre jaune (8.000 CCU/mg).

  
En vue d'une autre purification, on dissout 150 mg de la poudre jaune susdite dans une petite quantité d'un tampon de phosphate de sodium 0,01 M (pH de 8,0) et on fait passer à travers une colonne de 130 ml (1,5 x 73 cm) de Séphadex G-10 (gel de dextrane en forme de perles, préparé par réticulation de fractions de dextrane avec de l'épichlorohydrine; Pharmacia Fine Chemicals AB).

  
L'antibiotique PS-5 est développé avec un tampon de phosphate de sodium 0,01 M, pH de 8,0, l'éluat étant fractionné en quantités de

  
2 ml. On obtient 36 ml de l'éluat actif à partir des fractions

  
38 à 55 (65.800 CCU/ml).

  
L'éluat sur Séphadex G-10 est ensuite soumis à une chromatographie sur colonne de QAE-Séphadex A-25 (100 ml; 2,0 x 32 cm), que l'on fait suivre par une élution à gradient linéaire avec 1 litre d'une solution de chlorure de sodium, de 0 à 1,5%. Le volume de fraction est de 10 ml. On combine les cinq fractions actives
48 à 52 (50 ml; 22.000 CCU/ml) à titre d'éluat actif.

  
Cet éluat actif est soigneusement ajusté au pH de 8,3 avec du NaOH à 1% et chargé sur une colonne de 50 ml de Diaion HP-20 (1,2 x 44 cm).

  
Le sel sodique d'antibiotique PS-5 est récupéré en fractions de 5 ml par une élution avec gradient linéaire en utilisant 400 ml d'acétone aqueuse, de 0 à 10%. On combine les fractions actives 39 à 41 et on lyophilise pour donner 51 mg de poudre blanche (21.000 CCU/mg).

  
Cette préparation particulière du sel sodique d'antibiotique PS-5 a montré les propriétés physico-chimiques suivantes:

  
(1) Couleur

  
Blanche

  
(2) Solubilité

  
Soluble dans l'eau et pratiquement insoluble dans l'acétone (6) Spectre de résonance magnétique nucléaire des protons La Figure 3 annexée présente le spectre de résonance magnétique des protons à 100 Mhz du sel sodique de l'antibiotique PS-5 dans <EMI ID=83.1> 

  
Laboratory Co., Ltd.). Les signaux caractéristiques suivants ont été confirmés:

  
(i) Un triplet qui a son centre aux environs de 1,06 ppm (J =

  
 <EMI ID=84.1> 

  
(ii) Un multiplet dans la zone de 1,72-2,00 ppm (CH -CH-)

  
 <EMI ID=85.1> 

  
(IV) Multiplet dans la zone de 2,88-3,58 ppm (-CH2-, -CH-)

  
(v) Multiplet dans la zone de 3,9 à 4,20 ppm (-CH-).

  
1

N

  
(7) Réaction colorée

  

 <EMI ID=86.1> 


  
(8) Rotation spécifique

  
 <EMI ID=87.1> 

D 

  
(9) Chromatoqraphie en couche mince (TLC)

  
Le sel sodique de l'antibiotique PS-5 est soumis à chromatographie en couche mince sous les conditions mentionnées. Les valeurs Rf ont été déterminées par bio-autographie.

  
(a) Plaque TLC AVICEL/SF cellulose (American Viscose Corp.)
 <EMI ID=88.1> 
(b) Plaque TLC en gel de silice (E. Merck, Darmstadt; plaque de gel de silice enrobée 60 F254) 
 <EMI ID=89.1> 
(10) Chromatographie sur papier

  
Le sel sodique de l'antibiotique PS-5 donne les valeurs Rf suivantes sur un papier-filtre Toyo n[deg.] 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) sous les conditions indiquées:

  

 <EMI ID=90.1> 


  
Mélange solvant comprenant 120 ml d'acétonitrile, 30 ml de tampon tris (hydroxyméthyl)aminométhane-acide chlorhydrique M/10 (pH de 7,5) et 1 ml d'éthylènediaminetétraacétate M/10 (pH

  
de 7,5).

  
(11) Electrophorèse sur papier à haute tension

  
Le sel sodique de l'antibiotique PS-5 a été analysé par une électrophorèse sur papier à haute tension sous les conditions indiquées. L'appareil est un appareil de la société Savant Instru-.. ments Inc. (puissance à haute tension, modèle n[deg.] HV 3000V et électrophorèse sur plaque plane, modèle n[deg.] EP 18A). Le papier-filtre utilisé pour cette analyse est un papier-filtre n[deg.] 50 Toyo. Les résultats obtenus sont les suivants.

  
Lorsque l'électrophorèse est réalisa pendant 30 minutes sous refroidissement (en dessous de 4[deg.]C) à un potentiel de 42 V/cm dans un tampon (pH de 8,6) contenant 3,3 g de barbital et 25,5 g de barbital sodium dans 3000 ml d'eau,_l'antibiotique PS-5 se déplace de
28 mm vers l'anode.

  
 <EMI ID=91.1>  (3) Point de décomposition

  
Lors d'une mesure dans un appareil de Kofler BY-1 (Yazawa Scientific Mfg. Co., Ltd.), avec une élévation de température à

  
 <EMI ID=92.1> 

  
de fusion net. Elle commence à virer au jaune aux environs de
148[deg.]C et se ramollit graduellement au-dessus de 160[deg.]C, Aux envi-

  
 <EMI ID=93.1> 

  
du jaune au brun. A 2200C, on a une résine brune.

  
(4) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet

  
On dissout 60 microgrammes du sel sodique de l'antibiotique PS-5 dans 3,0 ml d'eau et on mesure sur un spectrophotomètre d'enregistrement Hitachi, modèle EPS-3T (Hitachi Ltd.). L'allure enregistrée est représentée par la Figure 1. Les valeurs caractéristiques suivantes ont été calculées:

  

 <EMI ID=94.1> 


  
A une solution aqueuse de cette préparation (21.000 CCU/mg) dans de l'eau distillée, on ajoute une solution d'hydroxylamine (pH de 7,5) pour donner un mélange de réaction contenant
21,3 &#65533;g/ml du sel sodique d'antibiotique PS-5 et 10 mM d'hydroxy-

  
 <EMI ID=95.1> 

  
ron 94% de la densité optique initiale à 301 nm.

  
(5) Spectre d'absorption dans l'infrarouge La Figure 2 présente le spectre d'absorption dans l'infrarouge du sel sodique d'antibiotique PS-5 dans du KBr, ce spectre ayant été enregistré sur un spectrophotomètre à infrarouge Hitachi, modèle 215 (Hitachi Ltd.). Les maximas caractéristiques suivants d'absorption ont été localisées aux valeurs indiquées de longueur d'onde:

  
 <EMI ID=96.1>  En utilisant du dioxane comme étalon interne, le spectre de

  
 <EMI ID=97.1> 

  
tique PS-5 dans du D20 a été mesuré sur un spectromètre Varian CFT-20. Les signaux caractéristiques suivants ont été observés:

  

 <EMI ID=98.1> 


  
Les propriétés physico-chimiques décrites précédemment montrent que la structure moléculaire de l'antibiotique PS-5 peut être représentée de la façon suivante:

  

 <EMI ID=99.1> 


  
Les propriétés biologiques suivantes ont été confirmées dans le cas de la préparation de sel sodique d'antibiotique PS-5 du présent exemple:

  
(1) Spectre antimicrobien

  
Les valeurs MIC du sel sodique d'antibiotique PS-5 ont été déterminées sur divers micro-organismes pathogènes englobant des sou-ches résistantes par la méthode de dilution avec bouillon en utilisant le bouillon d'infusion cerveau-coeur Eiken (Eiken Chemical CO. , LTD.).

  
Le sel sodique de l'antibiotique PS-5 a été dissous dans le bouillon d'infusion coeur-cerveau Eiken (pH de 7,0) à une concentration de l'ordre de 5-50 microgrammes/ml, et à partir de cela on a préparé des séries de dilution appropriées dans le même milieu liquide. Les micro-organismes énumérés par le Tableau 8 ont été cultivés pendant 18 heures dans ce bouillon Eiken à 28[deg.]C et inoculés dans la même série de dilution d'antibiotique PS-5 à une

  
 <EMI ID=100.1> 

  
reposer les cultures à 35[deg.]C pendant 20 heures, puis la croissance des micro-organismes a été lue à chaque dilution de l'antibiotique PS-5. La concentration inhibitrice minimum (MIC) représente la plus petite concentration de l'antibiotique PS-5 (sel sodique), pour laquelle aucune propagation du micro-organisme en cause n'a été confirmée visuellement. A titre de témoins, on a dissous deux antibiotiques connus à &#65533;-lactame, à savoir la céphaloridine et la céfoxitine, dans un bouillon d'infusion coeur-cerveau au pH de 7,0 à des

  
 <EMI ID=101.1> 

  
pour préparer plusieurs séries de dilution dans le même milieu liquide. Ces échantillons ont été traités de la façon décrite précédemment pour les déterminations de MIC. Le Tableau 8 résume les résultats obtenus. Outre les valeurs de MIC pour l'antibiotique PS-5, les valeurs pour la céphaloridine et la céfoxitine ont été indiquées à titre de référence. 

  

 <EMI ID=102.1> 


  

 <EMI ID=103.1> 


  

 <EMI ID=104.1> 
 

  
(2) renforcement de l'activité antimicrobienne de composés connus à bêta-lactame vis-à-vis des micro-organismes résistant au bêta-lactame.

  
(A) 10 ml de gélose nutritive fondue contenant 50 &#65533;g/ml de pénicilline G ou de céphaloridine, 0,8 &#65533; d'une poudre de bouillon nutritif Kyokuto et 1,0% de Difco Bacto-Agar (pH de 7,0) ont été ensemencés par les micro-organismes producteurs de bêta-lactamase, résistant au bêta-lactame, mentionnés dans les Tableaux 9 et 10, et on a ensuite déversé dans une boite de Petri de 9 cm pour former la plaque de gélose de bio-titration. Sur cette plaque de biotitration, on a placé des disques de pate.de 8 mm, contenant 25 <EMI ID=105.1> 

  
lecture des zones d'inhibition. La plaque de titration témoin a été préparée de façon similaire sans pénicilline G ou céphaloridine. A titre d'antibiotiques de référence, on a titré sur disque sous les mêmes conditions la pénicilline G, l'ampicilline, l'oxacilline et la céfazoline. Les Tableaux 9 et 10 résument les résultats obtenus.

  
TABLEAU 9
 <EMI ID=106.1> 
 
 <EMI ID=107.1> 
 TABLEAU 10
 <EMI ID=108.1> 
 
 <EMI ID=109.1> 
 
 <EMI ID=110.1> 
 &#65533; CER = Cephaloridine

  
Comme cela apparatt des résultats précédents, lorsqu'on combine de la pénicilline G ou de la céphaloridine à une concentration inférieure à la limite décelable avec l'antibiotique PS-5 à une concentration inférieure au seuil de la titration sur disque, on observe une zone d'inhibition, ce qui signifie le renforcement de l'activité de la pénicilline G et de la céphalosporine par l'antibiotique PS-5. Par contre, la pénicilline G, l'ampicilline, l'oxacilline et la céfazoline ne pouvaient augmenter l'activité antimicrobienne de la céphaloridine.

  
(B) L'expérience suivante a été réalisée pour démontrer que l'effet de renforcement de l'antibiotique PS-5 est synergique.

  
Sur une plaque de titration en gélose nutritive, ensemencée par une souche résistant au bêta-lactame de Proteus vulgaris P-5 (productrice de bêta-lactamase), on a appliqué deux bandes de papierfiltre contenant de la pénicilline G ou de la céphaloridine et deux bandes contenant l'antibiotique PS-5 pour former un carré où deux bandes du même antibiotique sont en contact à un coin. L'activité antimicrobienne a été lue après incubation pendant 18 heures à 35[deg.]C. Lorsqu'on choisit des concentrations appropriées de pénicilline G ou de céphaloridine et de l'antibiotique PS-5,on n'observe la zone d'inhibition qu'aux coins lorsqu'à la fois l'antibiotique PS-5 et la pénicilline G ou la céphaloridine sont présents, mais rien aux coins oÙ il n'y a seulement que l'antibiotique PS-5, la pénicilline G ou la céphaloridine.

   Ce fait peut être expliqué par une synergie entre l'antibiotique PS-5 et la pénicilline G ou la céphaloridine. Cela signifie que, lorsque deux types de composés sont combinés à des concentrations qui sont suffisamment basses pour ne pas donner une zone d'inhibition avec un composant seul, la grande inhibition apparaissant de la sorte dans le cas de la combinaison est due à un effet synergique.

  
(3) Activité in vivo

  
L'activité thérapeutique du sel sodique de l'antibiotique PS-

  
5 a été étudiée par traitement de souris infectées dans le péritoine par 5 x 105 cellules/souris de Staphylococcus aureux Smith. Immédiatement après l'infection, on injecte par voie sous-cutanée une solution aqueuse du sel sodique d'antibiotique PS-5. Sur des souris mâles (Shizuoka), on a trouvé que la dose de cette préparation guérisant 50% des cas est de 2,45 mg/kg.

  
(4) Toxicité

  
Une solution aqueuse du sel sodique de l'antibiotique PS-5 a été administrée dans le péritoine à des souris mâles (Shizuoka) à la dose de 500 mg/kg. On n'a enregistré aucune mortalité.

  
(5) Activité d'inhibition du b&#65533;ta-lactamase

  
 <EMI ID=111.1> 

  
mase en provenance de Proteus vulgaris P-5, et ce suivant les manières ci-après:
(A) Réactif
(1) Substrat: sel potassique de pénicilline G

  
1 p mole/ml(= 372,3 &#65533;g/ml) dans un tampon phosphate

  
 <EMI ID=112.1> 

  
(2) B&#65533;ta-lactamase : b&#65533;ta-lactamase provenant de Proteus

  
 <EMI ID=113.1> 

  
sur colonne de cellulose CM. 

  
(3) Inhibiteur: la préparation de sel sodique de l'antibiotique PS-5

  
0,6 &#65533; mole/ml (- 192 &#65533;g/ml) (4) Tampon de phosphate 25 mM, pH de 6,8
(B) Composition de réaction et conditions de titration

  
Le substrat (pénicilline G), l'inhibiteur (antibiotique PS-5) et le tampon ont été mélangés convenablement à 30[deg.]C dans les quantités indiquées dans le Tableau suivant (Tableau 11). La réaction a été amorcée immédiatement par addition des quantités indiquées de

  
 <EMI ID=114.1>  

  

 <EMI ID=115.1> 


  

 <EMI ID=116.1> 


  

 <EMI ID=117.1> 
 

  
L'hydrolyse de pénicilline G a été tracée par mesure de la diminution de la densité optique à 240 nm, en supposant que l'extinction moléculaire différentielle de pénicilline G à 240 nm est de
556, ce qui dérive de plusieurs expériences préliminaires.

  
(C) Résultats La Figure 4 montre le temps de développement de l'hydrolyse de pénicilline G en l'absence de l'inhibiteur (antibiotique PS-5) sous les conditions spécifiées ci-dessus. Une forte inhibition de pénicillinase de Proteus vulgaris par l'antibiotique PS-5 est très évidente sur la Figure 4, c'est-à-dire que, lorsque 1,42 équivalent <EMI ID=118.1> 

  
substrat, il y a plus de 50% d'inhibition de l'activité de bêtalactamase de Proteus vulgaris P-5.

Exemple 10

  
Procédé de préparation de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5

  
On traite 160 litres du filtrat de bouillon préparé comme décrit dans l'Exemple 3, et ce de la manière décrite dans l'Exemple 4 pour produire 30,0 g d'une poudre lyophilisée de couleur brun jaunâtre du sel sodique de l'antibiotique PS-5 (activité spécifique de 27 CCU/mg. Cette poudre est dissoute dans 100 ml de diméthylformamide et on ajoute 3,0 g de triéthylamine. Sous refroidissement à la glace, on ajoute 9,0 g de chlorure de trityle au mélange de réaction, tandis que la température de la solution est maintenue

  
 <EMI ID=119.1> 

  
l'activité de l'antibiotique PS-5 est convertie en le produit de tritylation. La solution de réaction est versée dans 1000 ml d'un tampon phosphate 0,5 M (pH de 6,8) et on extrait ensuite trois fois avec 1000 ml d'acétate d'éthyle dans chaque cas. Les extraits à l'acétate d'éthyle sont combinés, déshydratés sur du sulfate de sodium anhydre et évaporés jusqu'à siccité sous pression réduite. Le reste d'évaporation est dissous dans 20 ml de benzène et envoyé

  
à travers une colonne de Bio-Beads S-X3 (copolymère poreux de styrè-ne-divinylbenzène en perles pour la formation de gel, limite d'exclusion de poids moléculaire : 2.000, production de la société BioRAD Laboratories) (colonne de 4,5 x 60,0 cm), cette colonne ayant

  
été préalablement équilibrée avec du benzène. La colonne est développée au benzène. La fraction active qui montre une activité antibiotique sur la plaque de titration de Comamonas est concentrée jusqu'à siccité sous pression réduite. Le reste obtenu est dissous dans 1 ml de benzène et chargé sur une colonne de gel de silice

  
(gel de silice 60; 70-230 mailles ASTM; E. Merck, Darmstadt) (25 g;

  
1,5 x 24,0 cm). Après lavage avec un mélange de benzène-acétate d'éthyle (10/1) pour séparer les réactifs résiduaires, l'activité

  
est éluée avec un mélange de benzène-acétate d'éthyle (1/2). L'éluat actif est évaporé jusqu'à siccité sous pression réduite et dissous

  
à nouveau dans 0,5 ml de benzène. La solution au benzène est appliquée sur une colonne d'oxyde d'aluminium neutre (oxyde d'aluminium Woelm neutre; M. Woelm; 20 g, 0,9 x 22,0 cm) et développée. 

  
avec un mélange de benzène-acétate d'éthyle à des proportions variables de mélange (10/1; 6/1; 4/1; 3/1; 2/1 et 1/1). Les éluats actifs sont combinés et évaporés jusqu'à siccité sous pression ré-  duite. Le reste d'évaporation est dissous dans 0,3 ml de benzène

  
et chargé sur une colonne de gel de silice (10 g; 0,9 x 22,0 cm; description précédente). Après séparation des impuretés avec un mélange de benzène-acétate d'éthyle (10/1), l'activité est éluée  avec un mélange de benzène-acétate d'éthyle (1/2) et concentrée en  une poudre solide sous pression réduite. La poudre obtenue est dis- ; soute dans 0,5 ml de benzène et purifiée sur une colonne de Bio-  Beads S-X3 (1,2 x 96 cm) avec du benzène comme agent de développe- i ment. L'effluent actif est évaporé jusqu'à siccité sous vide. 

  
La poudre sèche obtenue est dissoute dans 0,5 ml d'acé- 

  
tone et soumise à une filtration sur gel en utilisant une colonne 

  
de Sephadex LH-20 (gel de dextrane en forme de perles, préparé par 

  
 <EMI ID=120.1>  

  
tion de la société Pharmacia Fine Chemical AB) (1,2 x 96,0 cm), cette colonne ayant été préalablement gonflée dans de l'acétone.La fraction active est évaporée jusqu'à siccité pour donner 23 mg de poudre blanche. La recristallisation de cette poudre dans un mélange de benzène-hexane donne 12 mg d'une poudre cristalline incolore du produit (10.800 CCU/mg). La poudre cristalline incolore du produit visé, c'est-à-dire l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 suivant l'invention, présente les propriétés physico-chimiques suivantes:

  
(1) Couleur

  
Incolore

  
(2) Solubilité

  
La solubilité du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5

  
a été déterminée en dissolvant,sous secouement., 5 mg dans chaque cas du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 dans 0,1 ml

  
 <EMI ID=121.1> 

  
présentés ci-après:

  
Pratiquement insoluble dans l'eau, le n-hexane et l'éther de

  
 <EMI ID=122.1> 

  
Très soluble dans le benzène, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, l'éthanol, le méthanol, l'acétone, le diméthylformamide (DMF) et le sulfoxyde de diméthyle (DMSO).

  
(3) Stabilité

  
L'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 est dissous dans un volume de méthanol et ensuite dilué avec neuf volumes d'eau distillée aussi vite que possible pour donner une solution de 125 CCU/ml. Une solution de phosphate dipotassique 0,1 N est ajustée avec de l'acide phosphorique 5N ou de l'hydroxyde de sodium 5N au pH indiqué de l'ordre de 3 à 9.

  
A 1 ml de chacun des tampons phosphates, on ajoute 1 ml dans chaque cas de la solution susdite de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 et, si nécessaire, la valeur du pH du mélange est réajustée avec de l'acide phosphorique ou de l'hydroxyde de sodium jusqu'à la valeur de pH désirée. La solution de mélange est conservée au bain-marie à 60[deg.]C pendant 30 minutes, puis refroidie avec de l'eau de ville et neutralisée au pH de 7,0 en utilisant une petite quantité d'acide phosphorique ou d'hydroxyde de sodium.

  
La solution témoin (pH de 7,0) est conservée dans un bain de glace pendant la période expérimentale. L'activité antibiotique résiduaire est titrée par la méthode de titration de routine sur disque avec du Comamonas terrigena B-996 comme micro-organisme d'essai. Le pourcentage d'activité des solutions traitées à la chaleur par rapport à la solution témoin est présenté par le Tableau 12.

  
TABLEAU 12

  

 <EMI ID=123.1> 


  
En considérant ces résultats, il est évident que l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 est stable dans une solution aqueuse à 60 [deg.]C pendant 30 minutes à un pH de l'ordre de 6,0 à 9,0.

  
En outre, aucune perte importante d'activité ne s'est confirmée après qu'une solution aqueuse du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 a été incubée au pH de 7,5 pendant 90 minu-

  
 <EMI ID=124.1> 

  
(4)Point de fusion

  
Ce point de fusion a été mesuré dans un appareil de Kofler PY1 (Yazawa Scientific Mfg. Co., Ltd), la température étant élevée à

  
 <EMI ID=125.1> 

  
PS-5 fond à 83,5-85,5[deg.]C et vire graduellement au brun au-dessus de
140 [deg.]C.

  
(5) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet

  
Le spectre d'absorption dans l'ultraviolet du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 de la présente invention a été enre-gistré sur un spectrophotomètre d'enregistrement Hitachi,modèle EPS-3T (Hitachi, Ltd.) à une concentration de 128 &#65533;g/3 ml de méthanol (Figure 5).

  

 <EMI ID=126.1> 


  
(6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge La Figure 6 annexée présente le spectre d'absorption dans l'infrarouge du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 (4,5 mg) dans 0,6 ml de chloroforme, ce spectre ayant été enregistré sur un spectrophotomètre à infrarouge Hitachi, modèle 215 (Hitachi Ltd). Les maximas caractéristiques d'absorption ont été observés aux valeurs suivantes de longueur d'onde :

  

 <EMI ID=127.1> 


  
(7) Spectre de résonance magnétique des protons La Figure 7 présente le spectre de résonance magnétique des protons à 100 MHz pour l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5, ce spectre ayant été enregistré avec 4,5 mg de cet ester tritylique dans 0,3 ml de deutérochloroforme, en utilisant le spectromètre de résonance magnétique nucléaire JEOL JNM PS-100 (Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.). Les signaux les plus caractéristiques sont les suivants:

  
Triplet aux environ de 1,10 ppm (J = environ 7,0 Hz) Singlet à 1,86 ppm Multiplet dans la zone de 7,10-7,56 ppm (protons dans le noyau de benzène du groupe trityle)

  
(8) Analyse élémentaire

  
On a séché 3,5 mg du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 à la température ambiante pendant 4 heures à une pression ré-

  
 <EMI ID=128.1> 

  
les résultats suivants ayant été obtenus.

  

 <EMI ID=129.1> 


  
(9) Réaction de coloration

  

 <EMI ID=130.1> 


  
(10) Chromatographie en couche mince (TLC)

  
L'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 donne les valeurs Rf suivantes sous les conditions indiquées. Le site de migration est révélé par bio-autographie sur du Comamonas terriqena B-996.

  
(a) Chromatographie en couche mince sur gel de silice

  
 <EMI ID=131.1> 

  
E. Merck, Darmstadt

  
Système solvant: benzène/acétone (2/1)

  
Rf : 0,29
(b) Chromatoqraphie en couche mince sur cellulose

  
Plaque: feuille de chromatogramme d'Eastman 13254 en cellulo-

  
 <EMI ID=132.1>  
 <EMI ID=133.1> 
 La structure moléculaire de l'antibiotique PS-5 et les propriétés physico-chimiques spécifiées ci-dessus confirment la structure suivante pour l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5:

  

 <EMI ID=134.1> 


  
Les propriétés biologiques de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 sont présentées ci-après.

  
(1) Spectre antimicrobien

  
Les valeurs de concentration inhibitrice minimum (MIC) du composé ont été déterminées sur divers micro-organismes pathogènes englobant plusieurs souches résistantes, en utilisant la méthode de dilution avec bouillon,dans un bouillon d'infusion coeur-cerveau Eiken (Eiken Chemical Co., LTD.).

  
De façon plus particulière, l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 a été dissous dans une petite quantité de méthanol et dilué dès que possible dans le bouillon d'infusion coeur-cerveau Eiken
(pH de 7,0), jusqu'à ce que la concentration de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 soit de l'ordre de 40 &#65533;g/ml à 20 &#65533;g/ml. La concentration de méthanol dans la solution finale n'excède pas 10%. Cette solution est diluée dans une série géométrique de deux fois. Les micro-organismes énumérés par le Tableau 13 ont été cultivés pendant 18 heures à 28[deg.]C dans le bouillon d'infusion coeur-cerveau de Eiken et inoculés dans la série de dilutions à la dimension d'inoculum finale de 1 x 10 5 cellules/ml. Les résultats sont lus  après incubation à 35 [deg.]C pendant 20 minutes.

   La concentration inhibitrice minimum (MIC) signifie l'unité de concentration la plus basse du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 à laquelle aucune croissance du micro-organisme correspondant n'est observée

  
sous les conditions décrites ci-dessus. En ce qui concerne les antibiotiques témoins, les solutions d'ampicilline et de céphaloridine ont été préparées dans un bouillon d'infusion coeur-cerveau de Eiken (pH de 7,0) à une concentration de 100 &#65533;g/ml et traitées de

  
la même manière que le composé d'essai de la présente invention.

  
Le Tableau 13 résume les valeurs MIC de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 en même temps que celles de l'ampicilline et de la céphaloridine à titre d'antibiotiques témoins. Comme cela apparait du Tableau, l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 montre

  
un large spectre antimicrobien et il présente particulièrement une puissante activité antibiotique sur plusieurs souches de micro-organismes, résistant au bâta-lactame (produisant du bêta-lactamase).

  
TABLEAU 13

  

 <EMI ID=135.1> 


  
 <EMI ID=136.1> 

  
PS-5 sur l'activité antibiotique de composés de pénicilline et de céphalosporine contre des micro-organismes résistants. 

  
(A) Des boites de Petri de titration (diamètre de 9 cm) contenant des micro-organismes résistants ont été préparées en prévoyant une couche de 10 ml de la gélose nutritive fondue ensemencée par les micro-organismes résistant au bêta-lactame (produisant du bêta-lactamase) au-dessus de la couche de base solide de gélose nutritive (pH de 7,0) (15 ml) contenant 50 &#65533;g/ml de pénicilline G ou de céphaloridine. Comme décrit précédemment, les solutions antibiotiques à essayer ont été appliquées en une quantité de 25 &#65533;litres sur un disque de pâte de 8 mm et placées sur les boites de titration. Après incubation pendant 18 heures à 35[deg.]C, les halo d'inhibition ont été mesurés et comparés avec les résultats obtenus sur les boites de titration correspondantes/contenant ni pénicilline

  
G, ni céphaloridine. Le Tableau 14 résume les résultats. En considérant ces résultats, il est très clair que la combinaison du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 à une concentration inférieure à la limite inférieure de la titration sur disque, avec de la pénicilline G ou de la céphaloridine, à une concentration inférieure à cette limite, produisait un halo significatif d'inhibition. Ce fait démontre clairement le pouvoir de renforcement de l'activité antibiotique de la pénicilline G ou de la céphaloridine par le produit de tritylation de l'antibiotique PS-5.

  
TABLEAU 14
 <EMI ID=137.1> 
 (B) A titre d'autres preuves du renforcement, la synergie antimicrobienne du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 avec de la céphaloridine a été confirmée par la méthode de dilution avec bouillon sur une souche de Proteus vulqaris résistant au bêtalactame. En premier lieu, cinq échantillons de solutions de réserve contenant de la céphaloridine et l'ester tritylique d'antibiotique PS-5 aux diverses concentrations indiquées par le Tableau
15 ont été préparés, en utilisant le bouillon d'infusion coeur-cerveau de Eiken (pH de 7,0) à titre de solvant.

  
TABLEAU 15

  

 <EMI ID=138.1> 


  
A partir de chaque solution de réserve, on a préparé trois échantillons de solutions de sous-réserve par dilution à des taux de 1/2, de 2/5 et de 3/10, dans ce bouillon d'infusion coeurcerveau. Au total, on a obtenu 15 échantillons de solutions de sous-réserve. Avec chaque solution de sous-réserve, on a réalisé quinze phases de dilution double dans le bouillon d'infusion coeurcerveau. A chacune des quinze dilutions, on a inoculé du Proteus vulqaris P-5 à une concentration finale de 1 x 105 cellules/ml et on a procédé à incubation à 35[deg.]C pendant 20 heures. La dilution inhibitrice minimum est lue pour chaque solution de réserve. Les résultats obtenus sont résumés par le Tableau 16 suivant. 

  
TABLEAU 16

  

 <EMI ID=139.1> 


  
Bien que la synergie ne soit pas compréhensible au départ du Tableau 16, il sera plus facile de réaliser l'effet synergique de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 sur la céphaloridine lorsque les résultats de MIC sont exprimés par la valeur relative vis-à-vis de la valeur MIC de chaque antibiotique seul. Le Tableau 17 montre de façon évidente la synergie entre les deux com-

  
 <EMI ID=140.1> 

  
étant exprimées par 100.

  
TABLEAU 17

  

 <EMI ID=141.1> 


  
Le Tableau 17 précédent montre que l'effet synergique de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 sur de la céphaloridine

  
 <EMI ID=142.1> 

  
est résistant aux composés à bêta-lactame à raison de la production de bêta-lactamase est utilisé comme micro-organisme d'essai, la combinaison de 7,5% de la valeur MIC de la céphaloridine avec 12,5%

  
de la valeur MIC de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 inhibe la croissance de ce micro-organisme d'essai.

  
(3) Activité in vivo L'activité in vivo du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 a été mesurée sur des souris infectées par la voie du péritoine par 5 x 10<3> cellules/souris de Staphylococcus aureus Smith. L'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 a été injecté par voie sous-cutanée juste après infection.

  
La dose guérissant à 50% sur des souris males (Shozuoka) est de 2,55 mg/kg (27.540 CCU/kg). 

  
(4) Activité d'inhibition du bêta-lactamase
(A) Méthode de titration

  
 <EMI ID=143.1> 

  
tamase pendant 10 minutes (de 1 à 10 minutes après le début de l'incubation).

  
Le taux d'hydrolyse de la céphaloridine est mesuré par la diminution de la densité optique à 225 mu. Pour des titrations d'inhibition de routine, on a utilisé du bêta-lactamase de Citrobacter freundii E-9 et du Proteus vulqaris P-5 après purification par une chromatographie d'affinité avec de la céphalexine-Sépharose 4B.

  
(B) Réactif

  
Tampon: tampon phosphate 0,1 M (phosphate de Na-K) (pH de 6,8) Substrat: 0,05 micromole/ml dans le tampon phosphate.

  
Bêta-lactamase: l'enzyme est diluée suffisamment pour donner une chute d'environ 0,1 unité de densité optique par 10 minutes à

  
 <EMI ID=144.1> 

  
Hitachi UV-VIS 139, Hitachi, Ltd).

  
Cet appareil peut contenir une cuvette témoin et trois cuvettes d'échantillon. On utilise quatre cuvettes de quartz de 1 cm (vo-

  
 <EMI ID=145.1> 

  
action.

  
Inhibiteur: la dilution est réalisée dans un tampon phosphate 0,1 M (pH de 6,8) ou dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO).

  
La cuvette témoin contient la même quantité de solution de dilution que la cuvette d'échantillon mais sans inhibiteur. 

  
Conditions de réaction: le mélange enzyme-inhibiteur de la composition suivante a été préalablement incubé pendant 15 minutes à 30[deg.]C.

  

 <EMI ID=146.1> 


  
Après l'incubation préalable, la solution de substrat

  
 <EMI ID=147.1> 

  
pidement pour amorcer la réaction. La réaction est suivie par en-

  
 <EMI ID=148.1> 

  
tion de l'inhibiteur jusqu'à ce que la dilution donne 50% du taux

  
la

  
d'hydrolyse de/céphaloridine, enregistré dans le témoin sans inhibiteur pendant 10 minutes (de 1 à 11 minutes après l'addition du substrat).

  
(C) Résultats

  
Sous les conditions de réaction décrites précédemment, les va-

  
 <EMI ID=149.1> 

  
l'antibiotique PS-5:

  

 <EMI ID=150.1> 


  
De la sorte, 50% de l'hydrolyse de la céphaloridine sont inhibés avec 0,060 &#65533;g/ml et 0,80 &#65533;g/ml du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 lors d'un essai avec des bêta-lactamases provenant respectivement de Proteus vulgaris P-5 et de Citrobacter freundii E-9, sous les conditions spécifiées ci-dessus.

  
(5) Toxicité

  
L'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 ne provoque pas de mortalité chez des souris mâles (Shizuoka) lors d'une administration par la voie du péritoine à une dose de 500 mg/kg.

Exemple 11 

  
Procédé de préparation du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5

  
La poudre de sel sodique d'antibiotique PS-5 de couleur jaune brunâtre (715 mg; 235 CCU/mg), préparée par le même procédé que celui décrit dans l'Exemple 7, a été dissoute dans 3,5 ml

  
 <EMI ID=151.1> 

  
Le mélange est agité à 100[deg.]C pendant 7 heures pour assurer la réaction de tritylation. Le mélange de réaction est versé dans 50 ml  d'eau glacée et on le laisse reposer jusqu'à ce que la glace solide soit fondue.

  
L'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 est extrait trois fois avec 15 ml de benzène chaque fois et traité comme décrit dans l'Exemple 10 pour donner 9,4 mg d'une poudre cristalline incolore du produit désiré. Les propriétés physico-chimiques de cette préparation sont pratiquement identiques à celles données dans le cas de l'Exemple 10.

Exemple 12

  
Préparation du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 en présence d'un éther du type couronne

  
La poudre de lyophilisation brute, de couleur blanc brunâtre (10,1 g), préparée par le même procédé que celui décrit dans l'Exemple 5, a été mis en suspension dans 200 ml de chlorure

  
dicyclohexylde méthylène et dissoute avec agitation sous addition de 1 ml de/
15-couronne-5 (Nippon Soda Co., Ltd.). Tandis que la température

  
 <EMI ID=152.1> 

  
on ajoute 8,5 g de chlorure de trityle. Le mélange de réaction est chauffé jusqu'à la température ambiante et agité pendant 3 heures à cette température. Après filtration, le filtrat est évaporé jusqu'à siccité sous pression réduite. Le reste est dissous immédiatement dans 10 ml de benzène, puis on filtre et en purifie par le même procédé que celui décrit dans l'Exemple 10 pour obtenir une poudre cristalline incolore (7,3 mg). Cette poudre a les mêmes propriétés physico-chimiques que celles présentées par l'Exemple 10.

Exemple 13

  
Procédé de préparation du produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 en présence d'un sel d'ammonium quaternaire

  
L'antibiotique PS-5 est extrait au départ de 48 litres d'un filtrat de bouillon (11,7 CCU/ml), et ce deux fois avec 15 litres dans chaque cas de dichlorométhane contenant 0,5% de chlorure

  
 <EMI ID=153.1> 

  
méthane: 24,0 CCU/ml; activité du filtrat de bouillon épuisé:

  
5,7 CCU/ml). L'extrait au dichlorométhane est séché sur 400 g de sulfate de sodium anhydre et évaporé jusqu'à 500 ml sous pression réduite dans un évaporateur rotatif. Le concentré (450 CCU/ml)

  
est déshydraté préalablement sur 10 g de sulfate de sodium anhydre et ensuite, après filtration, avec 5 g d'un tamis moléculaire de

  
4 Angstroems (Union Carbide Corp.).

  
A cette solution sèche, on ajoute 4,5 g de chlorure de trityle à une température inférieure à 5[deg.]C et on agite le mélange pendant 5 heures à 5[deg.]C. Après séparation du dichlométhane par évaporation à la température ambiante, le reste est dissous dans 15

  
ml de benzène et purifié d'une manière semblable à celle décrite dans l'Exemple 10 pour donner 8 mg d'une poudre cristalline anhydre de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5. Les caractéristiques physico-chimiques de cette préparation sont presque les mêmes
-que celles présentées dans l'Exemple 10.

Exemple 14

  
Ester méthylique de l'antibiotique PS-5

  
On met en suspension 90 mg du sel sodique de l'antibiotique PS-5, obtenu suivant l'Exemple 9 (8000 CCU/mg) dans 3 ml de diméthylformamide sec, puis on ajoute 50 mg de triéthylamine et 0,3 ml d'iodure de méthyle. Après agitation pendant 2 1/2 heures

  
à la température ambiante, on ajoute 100 ml de benzène et on mélan-ge convenablement pour extraction. La couche au benzène est séparée, lavée avec 100 ml d'un tampon phosphate 0,1 M, pH de 6,8, puis on sèche sur sulfate de sodium anhydre. La solution au benzène ainsi séchée est concentrée à un petit volume sous pression réduite et appliquée sur une colonne de Bio-Beads S-X3 (Bio-RAD Laboratories)
(1,2 x 90 cm).

  
L'ester méthylique est développé avec du benzène. Les fractions d'éluat contenant l'ester sont combinées et évaporées jusqu'à siccité sous pression réduite pour donner une huile incolore. La matière huileuse est dissoute dans une petite quantité d'acétone et chromatographiée sur une colonne de Sephadex LH-20
(1,2 x 90 cm) avec de l'acétone comme agent de développement. Les fractions d'éluat contenant l'ester méthylique de l'antibiotique PS-5 sont récoltées et évaporées jusqu'à siccité pour donner 11,2

  
mg de l'ester méthylique d'antibiotique PS-5. Cet ester méthylique montre les propriétés physiques et chimiques suivantes:

  
(1) Chromatographie en couche mince

  
 <EMI ID=154.1> 

  
tone: 1/1)

  
(2) Maximum d'absorption dans l'ultraviolet dans du méthanol

  

 <EMI ID=155.1> 


  
(3)Maximas d'absorption dans l'infrarouge dans du chloroforme

  
 <EMI ID=156.1> 

  
(4) Signaux dans le spectre de résonance magnétique des protons

  
 <EMI ID=157.1> 

  
1,05 (3H, t, J=7,5 Hz)

  
1,7 - 2,0 (2H, m)

  
2,00 (3H, s)

  
2,8 - 3,65 (7H, m)

  
3,83 (3H, s)

  
3,84 - 4,06 (1H, m) (5) Poids moléculaire (spectrométrie de masse à haute résolu- 

  
tion)

  
312,1131 (trouvé)

  
 <EMI ID=158.1> 

  
La structure suivante est attribuée à l'ester méthylique de l'antibiotique PS-5 sur la base de la structure décrite précédemment pour l'antibiotique PS-5 et sur la base des résultats physicochimiques spécifiés ci-dessus:

  

 <EMI ID=159.1> 


  
Le procédé expliqué ci-dessus dans l'Exemple 14 a été répété avec de l'iodure d'éthyle, de l'iodure d'isopropyle, de l'iodure d'isobutyle, de l'iodure de n-pentyle ou de l'iodure de nhexyle, au lieu de l'iodure de méthyle, et ce pour obtenir respectivement les esters suivants:

  
Ester éthylique d'antibiotique PS-5

  
Ester isopropylique d'antibiotique PS-5

  
Ester isobutylique d'antibiotique PS-5

  
Ester n-pentylique d'antibiotique PS-5

  
Ester n-hexylique d'antibiotique PS-5

  
La formation de ces esters peut être confirmée par chromatographie en couche mince, spectrométrie d'absorption dans l'infrarouge, spectrométrie de résonance magnétique des protons et spectrométrie de masse.

  
Comme expliqué précédemment, une composition contenant l'antibiotique PS-5 et/ou l'ester tritylique de l'antibiotique PS-

  
5 peut être administrée sous diverses formes de dosages unitaires, par exemple sous une forme de dosage pour la voie orale, à l'état solide ou liquide. Cette composition en dosage unitaire, à l'état solide ou liquide, peut contenir la matière active en une quantité de 0,1 à 99%, de préférence de 10 à 60%. La quantité de l'ingrédient actif dans la composition peut changer suivant la forme du dosage et le poids total de la composition, et elle est habituelle-

  
 <EMI ID=160.1> 

  
1000 mg.

  
Pour des administrations parentérales, la dose unitaire

  
 <EMI ID=161.1> 

  
est habituellement formée par l'antibiotique PS-5 pur ou très purifié, un sel acceptable en pharmacie et/ou le produit de tritylation de l'antibiotique PS-5 en solution dans de l'eau stérile ou sous la forme d'une poudre soluble destinée à dissolution. Des formulations contenant l'antibiotique PS-5 et/ou le produit de tritylation de cet antibiotique peuvent se préparer par les processus suivants.

Exemple A: Capsules

  

 <EMI ID=162.1> 


  
Le composé actif et les diluants sont mélangés convenablement pour produire une mixture uniforme. On charge 200 mg du mélange dans des capsules en gélatine dure n[deg.] 3.

Exemple B: Comprimés

  

 <EMI ID=163.1> 


  
Le composant actif est mélangé avec le lactose et la moitié de l'amidon de mats. Le mélange est granulé avec 10% de la quantité susdite d'empois d'amidon de mats et tamisé. Le reste de l'amidon de mais et le stéarate de magnésium sont ajoutés, puis le mélange est transformé en comprimés d'environ 1 cm de diamètre, chaque comprimé pesant 500 mg.

  
Exemple C: Forme lyophilisée pour injection

  

 <EMI ID=164.1> 


  
Le composant actif est dissous dans de l'eau distillée stérile pour injection, puis on filtre et on stérilise. La solution est subdivisée dans des ampoules stériles et l'eau est séparée de manière aseptique par lyophilisation. Les ampoules contenant la matière solide sèche stérile sont bouchées de manière aseptique.

  
Pour permettre l'administration parentérale, on ajoute

  
2 ml d'une solution saline physiologique stérile au contenu d'une ampoule.

Exemple D: Comprimés

  

 <EMI ID=165.1> 


  
On mélange l'antibiotique PS-5 et la céphaloridine avec les autres ingrédients et on les transforme en comprimés de la façon décrite dans l'Exemple B. Les comprimés sont recouverts d'abord d'un enrobage de sucre et ensuite d'un enrobage entérique.

Exemple E: Comprimés

  

 <EMI ID=166.1> 
 

  
Les comprimés contenant l'antibiotique PS-5 et l'aminobenzylpénicilline sont obtenus par le même procédé que celui décrit dans l'Exemple 8.

Exemple F: Capsules

  

 <EMI ID=167.1> 


  
L'ingrédient actif et les diluants sont mélangés convenablement pour former un mélange uniforme. On charge environ 200 mg du mélange dans une capsule dure n[deg.] 3.

Exemple G: Comprimés

  

 <EMI ID=168.1> 


  
L'ingrédient actif est mélangé avec le lactose et la moitié de l'amidon de mais. Ce mélange est granulé avec 10% de la quantité indiquée d'amidon de mats, puis on tamise. On ajoute ensuite le stéarate de magnésium et le reste de l'amidon de mais, et on transforme le mélange en comprimés d'un diamètre de 1 cm, pesant chacun 500 mg. Ces comprimés sont revêtus d'abord d'un enrobage

  
de sucre et ensuite d'un enrobage entérique.

  
Exemple H: Forme lyophilisée pour injection

  

 <EMI ID=169.1> 


  
Le composant actif est dissous dans de l'eau distillée stérile pour injection et on stérilise par filtration. La solution est subdivisée dans des ampoules et lyophilisée de manière aseptique. Les ampoules contenant la matière solide sèche stérile sont bouchées de manière aseptique.

  
Lors d'une injection à réaliser, on ajoute, au contenu d'une ampoule, 20 ml de N-(bêta-hydroxyéthyl)lactamide à 70% stérile.

Exemple I: Comprimés

  

 <EMI ID=170.1> 


  
L'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 et la céphaloridine sont mélangés, puis par le même procédé que celui décrit dans l'Exemple G, on transforme en comprimés et on procède à enrobage.

Exemple J: Comprimés

  

 <EMI ID=171.1> 


  
Les ingrédients actifs (l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 et l'aminobenzylpénicilline) sont mélangés et traités . par le même procédé que celui décrit dans l'Exemple I.

  
Les dessins annexés représentent: La Figure 1 est le spectre d'absorption dans l'ultraviolet du sel sodique de l'antibiotique PS-5, préparé suivant l'Exemple 9 précédent. La Figure 2 est le spectre d'absorption dans l'infrarouge de l'antibiotique PS-5 sous la forme du sel sodique. La Figure 3 est le spectre de résonance magnétique des protons du sel sodique de l'antibiotique PS-5. La Figure 4 montre le développement dans le temps de la dégradation de la pénicilline G par du bêta-lactamase de Proteus vulqaris P-5, en montrant l'activité inhibitrice de l'antibiotique PS-5 préparé suivant l'Exemple 9 précédent. La Figure 5 est le spectre d'absorption dans l'ultraviolet de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5 préparé suivant l'Exemple 10. La Figure 6 est le spectre d'absorption dans l'infrarouge de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5.

   La Figure 7 est le spectre de résonance magnétique des protons de l'ester tritylique de l'antibiotique PS-5.

REVENDICATIONS

  
1. Composés répondant à la formule:

  

 <EMI ID=172.1> 


  
 <EMI ID=173.1> 

  
le triphénylméthyle, ainsi que les sels de ces composés, dans la

  
 <EMI ID=174.1> 

Claims (1)

1. 2. Un composé suivant la revendication 1, dans lequel R1 est l'hydrogène.

   3. Un composé suivant la revendication 1, dans lequel <EMI ID=175.1> est le méthyle.

   5. Un composé suivant la revendication 1, qui est un sel

   <EMI ID=176.1>

   6. Un compcsé suivant la revendication 1, qui est le sel

   <EMI ID=177.1>

   7. Le sel sodique de l'antibiotique PS-5 sous une forme essentiellement pure.

   8. Une composition efficace du point de vue antibiotique, comprenant un véhicule pharmaceutique approprié et, à titre d'ingrédient actif, un composé de la formule (A):

   <EMI ID=178.1>

   <EMI ID=179.1>

   triphénylméthyle, ou un sel d'un tel composé, dans lequel R1 est l'hydrogène.

   9. Une composition suivant la revendication 8, dans laquelle l'ingrédient actif est un sel acceptable en pharmacie du com-

   <EMI ID=180.1>

   10. Une composition suivant la revendication 8, dans laquelle l'ingrédient actif est le composé dans lequel R1 est le triphénylméthyle.

   11. Une composition suivant l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans laquelle l'ingrédient actif est contenu en une quantité efficace du point de vue antibiotique.

   12. Une composition active du point de vue antibiotique suivant la revendication 8, dans laquelle le composé de la formule A est mélangé avec un antibiotique sensible au bêta-lactamase en une proportion suffisante pour créer un effet synergique vis-à-vis des antibiotiques sensibles aux bactéries productrices de bêta-lactamase. 13. La composition suivant la revendication 12, dans laquelle le composé de la formule A est choisi parmi les sels accep-

   <EMI ID=181.1>

   ou le triphénylméthyle.

   14. La composition suivant la revendication 12, dans laquelle l'antibiotique sensible au bêta-lactamase est choisi parmi les dérivés de pénicilline et de céphalosporine.

   15. Une composition suivant la revendication 12, dans laquelle la proportion du composé de la formule A à l'antibiotique sensible au bêta-lactamase est de 10/1 à 1/100.

   16. Procédé de production d'un composé répondant à la formule:

   <EMI ID=182.1>

   <EMI ID=183.1>

   triphénylméthyle, ainsi que des sels de ces composés, dans lesquels

   <EMI ID=184.1>

   bie, dans un milieu nutritif, d'un micro-organisme capable de produire l'activité antibiotique du composé de la formule A, dans la-

   <EMI ID=185.1>

   des-matières cultivées, ce procédé comprenant la phase facultative

   <EMI ID=186.1>

   drogène, ou de ses sels en un composé de la formule A, dans laquel-

   <EMI ID=187.1>

   avec un diazoalcane inférieur ou un composé de la formule RY, dans laquelle R est un alcoyle inférieur ou le triphénylméthyle et Y représente un atome ou un groupe qui peut être aisément séparé.

   17. Procédé suivant la revendication 16, dans lequel la souche microbienne est choisie parmi le Streptomyces A271, ses mu-tants naturels et ses mutants artificiels capables de produire cette activité antibiotique.

   18. Procédé suivant la revendication 16, dans lequel la souche microbienne est le Streptomyces A271.

   19. Procédé suivant la revendication 16, dans lequel la fermentation est réalisée à une température comprise entre 20 et

   <EMI ID=188.1>

   30 à 90 heures.

   20. Procédé suivant la revendication 14, dans lequel l'isolement du produit de fermentation actif du point de vue antibiotique est réalisé suivant l'un des procédés couramment employés pour la récupération d'antibiotiques du type à acide carboxylique à partir de leurs matières de fermentation.

   21. Procédé suivant la revendication 16, dans lequel l'activité antibiotique est isolée sous forme du sel sodique du

   <EMI ID=189.1>

   22. Procédé suivant la revendication 16, dans lequel le

   <EMI ID=190.1>

   d'un tel composé est transformé en un composé de formule A dans laquelle R1 est un alcoyle inférieur ou le trityle par réaction avec un composé de formule RY, dans laquelle R est un alcoyle inférieur ou le triphénylméthyle et y représente un atome ou un groupe qui peut aisément se séparer.

   23. Procédé pour combattre ou prévenir une infection bactérienne chez les mammifères, qui consiste à administrer à ceux-ci une quantité efficace du point de vue antibiotique d'un composé répondant à la formule A définie précédemment, et/ou un sel d'un tel composé.

   24. Procédé pour combattre ou prévenir une infection bactérienne chez les mammifères, qui consiste à administrer à ceux-ci un composé de la formule A telle que définie précédemment ou un sel d'un tel composé, en combinaison avec un antibiotique sensible au bêta-lactamase en une quantité efficace du point de vue antibiotique.

   25. Procédé suivant la revendication 23, dans lequel le composé est un sel acceptable en pharmacie du composé de la formule

   <EMI ID=191.1>

   26. Procédé suivant la revendication 23, dans lequel le

   <EMI ID=192.1>

   phénylméthyle.

   27. Procédé suivant la revendication 24, dans lequel le composé de la formule A est choisi parmi les sels acceptables en

   <EMI ID=193.1>

   <EMI ID=194.1>

   l'antibiotique sensible au bêta-lactamase est choisi parmi les dérivés de pénicilline et de céphalosporine.

   28. Procédé suivant la revendication 24, dans lequel le produit de la formule A et l'antibiotique sensible au bêta-lactamase sont employés dans un rapport mutuel allant de 10/1 à 1/100.

   <EMI ID=195.1>

   tomyces A271.

   30. Les nouveaux antibiotiques et leur préparation, comme décrit ci-dessus et notamment dans les Exemples donnés. <EMI ID=196.1>