DK145583B - Fremgangsmaade til fremstilling af 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxycephalosporin-derivater - Google Patents

Description

(S)

(19) DANMARK

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od H5583B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 2$54/81 (51) |nt.CI.3 C 12 P 35/08 (22) Indleveringsdag 26. jun. 1981 G 07 D 501/57 (24) Løbedag 22. dec. 1976 (41) Aim. tilgængelig 26. jun. 1981 (44) Fremlagt 15· dec. 1982 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag *~ (85) Videreførelsesdag " (62) Stamansøgning nr. 5797/76

(30) Prioritet 25· dec. 1975, 155646/75, JP

(71) Ansøger YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO. LTD., Tokyo, JP.

(72) Opfinder Takashi Osono, JP: Yoshihiko Oka, JP* Shunlchi Wa= tanabe, JP: Takeshi £3aito, JP: Hiroshi Gushima, JP: m. fl.

(74) Fuldmægtig Patentbureauet Hofman-Bang & Boutard.

(54)Fremgangsmåde til fremstilling af 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxycephalosporin-derivater.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-cephalosporin-derivater>:med den almene formel OCH, D H00C. 0 I NjKæjJjCcra-j-^Sn1 o V QJ-Ύ^οη2-^

C00M

t 3 2 2 145583 hvori R betyder en 5-leddet heterocyclisk gruppe, som indeholder 2-4 nitrogenatomer og yderligere kan indeholde et svovlatom og som kan være substitueret med en lavere-alkylgruppe eller en carboxy-lavere-alkylthiogruppe, og M betyder et hydrogenatom eller en salt-dannende kation udvalgt blandt alkalimetaller, jordalkalimetaller, tungmetaller og baser, der danner kvaternære salte eller aminsal-te.

2

Som eksempler på den heterocycliske gruppe angivet for R i den ovenstående formel kan nævnes 5-carboxymethylthio-l,3>4-thiadiazol-2-yl, l-methyl-lH-tetrazol-5-yl, 5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl og l,3,4-thiadiazol-2-yl.

Eksempler på alkalimetaller er natrium og kalium, eksempler på jord-alkalimetaller er calcium, magnesium og barium, eksempler på tungmetaller er jern, kobber og zink, og eksempler på baser, der danner kvaternære salte eller aminsalte er triethylamin, diethanolamin, piperidin og morpholin.

Nogle af de forbindelser, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er angivet at være fremstillet ved kemiske synteser i britisk patentskrift nr. 1 321 412 (1970), men der er ikke angivet nogen praktiske fysiske og kemiske egenskaber for disse forbindelser i det britiske patentskrift.

De ved den foreliggende fremgangsmåde fremstillede 7-methoxycephalo-.sporinderivater må derfor betragtes som hidtil ukendte.

Cephalosporiner viser udmærkede antimikrobielle aktiviteter overfor Gram-positive og Gram-negative bakterier, men de foreliggende ce-phalosporinderivater, som har en methoxygruppe i 7-stillingen og en heterocycklisk thiomethylgruppe i 3-stillingen, viser særlig udmærket virkning ved behandling af alvorlige sygdomme forårsaget af infektion med sådanne bakterier som Pseudomonas- og Pro-teus-arter, overfor hvilke almindelige antibiotica er ineffektive, eller med bakterier, som er resistente overfor almindelige cephalosporiner, der ikke har nogen methoxy-gruppe i 7-stillingen.

Cephalosporansyre-derivater med en heterocyclisk thiomethylgruppe 3 145583 i 3-stillingen fremstilles sædvanligvis ved først at fremstille de tilsvarende forbindelser, som har en acetoxymethylgruppe eller en carbamoyloxymethylgruppe i 3-stillingen, ved en gæringsmetode og derpå omsætte produkterne med en heterocyklisk thiol-forbindelse.

Det har imidlertid ifølge den foreliggende opfindelse vist sig, at forbindelserne, som har en heterocyklisk thiomethylgruppe i 3-stillingen, kan opnås direkte ved et enkelt gæringstrin.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

De fremstillede forbindelser viser som nævnt udmærkede antimikro-bielle aktiviteter i sig selv, og yderligere kan forbindelsernes antimikrobielle aktivitet forøges og deres antimikrobielle spektre ændres ved udskiftning af acylsidekæden i 7-stillingen, dvs. r2Nv ^5*CH-(CH_)_-CO-, med andre acylgrupper, som f.eks. a-amino-nUuC * ό phenylacetyl, a-carboxylphenylacetyl, α-sulfophenylacetyl, a-hydroxy-phenylacetyl, pyridylthioacetyl, thiadiazolylthioacetyl, triazolyl-acetyl, cyanmethylthioacetyl og trifluormethylthioacetyl, således at forbindelserne med formlen Aa også er nyttige som mellemprodukter ved fremstilling af derivaterne med disse acylgrupper, f. eks. 7j3-cyanmethylthioacetamido-7^-niethoxy-3- (l-methyltetrazol-5-yl-thiomethyl)~/\?~c ephem-4-carboxylsyre og 7«--methoxy-3-(l-methyltetrazol-5-yl-tMomethyl)-7/3 - (trif luormethylthioacetaaiido)-^\^-cephera-4-carboxylsyre.

En særlig foretrukken mikroorganisme, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er en hidtil ukendt stamme, som betegnes Streptomyces oganonensis Y-G19Z, og som er isoleret fra jorden i Ogano-Town, Chichibugun, Saitama Prefecture, Japan.

Denne stamme er blevet deponeret i the Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, under accessionsnr.

FERM-P 2725 og også i the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland 20852, USA under accessionsnr.

ATCC 31167. Stammens mycologiske egenskaber er som følger: I. Morphologiske egenskaber af stammen S. oganonensis Y-G19Z: den vokser både på naturlige og syntetiske medier under dannelse 4 145BS3 af et velforgrenet substratmycelium, medens dannelsen af luftmycelium ikke er tilstrækkelig og dannelsen af sporer derfor ringe. Sporekæder er lige, tilhører Rr (rectus) eller RF (recti-flexibiles).type og bærer 10-50 sporer på hver kæde. sporerne er i elliptiske, sfæriske eller cylindriske af form og har en størrelse på 0,45-0,60 x 0,55-0,90 jm. Sporeoverfladen er glat. Der blev hverken iagttaget flagellatsporer eller sporangium.

II. Kulturegenskaber af stammen S. oganonensis Y-G19Z:

Opløseligt

Medium Vækst Luftmycelium pigment

Czapek’s agar meget ringe sparsomt intet hvid' hvidt

Czapek’s glucose- god moderat intet agar flødegul gulliggråt’ meget lidt· gluco se-aspara- god ringe intet gin-agar hvid hvidt glycerol-aspara- god ringe intet gin-agar hvid til hvidt til gullighvid gullighvidt uorganisk salt- god ringe intet stivelse-agar gulliggrå til gulliggråt blegt gulligbrun tyrosin-agar god ringe lidt bleggul gulliggråt blegt gullig gråt jern og gærekstrakt god godt meget lidt -tyrosin-agar bleggul til brunlig hvidt lyst brunlig- gulligbrun til gulliggråt gråt nærings-agar god godt, pulver- lidt blegt gullig- agtigt blegt gulligbrunt brun orange til blegt brunt 3 145583

Opløseligt

Medium Vækst Luftmycelium pigment

Bennett’s agar god godt meget lidt blegt gulligbrun brunliggråt blegt orange til blegt lyserødt calciummalat-agar moderat intet intet flødefarvet kartoffelprop god godt brunliggråt til blegt gulligbrun gulliggråt til mørkt gulligblegt brunliggråt brunt blodagar god intet gulliggråt til olivengrå til mørkt rødligmørk olivengrå brunt

Lo e filer's god intet intet serummedium III. Fysiologiske egenskaber af stammen S. oganonensis y -G19Z: tyrosinasedannelse negativ nitratreduktion positiv koagulering af skummetmælk positiv, svagt peptonisering af skummetmælk' positiv, svagt hydrolyse af stivelse positiv smeltning af gelatine positiv cellulosenedbrydning negativ hæmolyse positiv solubilisering af calciummalat positiv 6 145583

Udnyttelse af carbonforMndelser:

Carbonkilde Udnyttelse glucose . + arabinose + saccharose xylose +.

inositol mannitol + fructose + rhamnose - rhaffinose

Karakteristiske træk ved stammen Streptomyces oganonensis Y-G19Z kan sammenfattes som følger: 1. Den tilhører de ikke-chromogene Streptomyces-stammer.

2. Dens luftmycelium er lige,uden verticilier (R eller RF type).

3. Sporerne er sfæriske eller elliptiske.

4. Sporeoverfladen er glat.

5. Den giver blegt gulliggrå til blegt gulligbrun vækst på forskellige medier.

6. Luftmyceliets farve er brunlighvid, gullighvid og gulliggrå.

7. Den producerer et antibiotisk stof kaldet Y-G19ZD3 tilhørende gruppen 7-methoxycephalosporiner.

Ved eftersøgelse af kendte stammer med de ovennævnte egenskaber kan der som den nærmest beslægtede stamme nævnes Streptomyces globis-porus, beskrevet i S.A. ¥aksman: the Antinomycetes 2, 218 (l96l) og International Journal of Systematic Bacteriology, 18, (4) 324-323 (1968).

Ved sammenligning med den ovennævnte S. globisporus adskiller stamme Y-G19Z sig imidlertid fra denne på de punkter, som er anført i den følgende tabel·: 7 145583

Egenskab Y-G19Z . . . S. globisporus sporestørrelse (pn) 0,45-0,60 x 0,55-0,90 1,2-1,4 x 1,8-2,0 eller 0,9-1,4 sfærisk opløseligt pigment intet gult til grønliggult på glycerol-aspara- gin-medium rhamnoseudnyttelse negativ positiv stivelsehydrolyse stærk svag koagulering af positiv negativ skummetmælk peptonisering af svag stærk skummetmælk produktion af positiv negativ cephalosporin- antibiotica

Som det klart fremgår af de forskelle, som er anført i den. ovenstående» tabel, er stammen Y-G19Z, som kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, en hidtil ukendt stamme. Den har fået navnet "Streptomyces oganonensis" og er deponeret under nr.

ATCC 31167.

Ud over denne hidtil ukendte stamme kan de følgende kendte stammer anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen: Streptomyces virido-chromogenes IFO 13347, Streptomyces rochei IFO 12908, Streptomyces lipmanii IFO 13306 (se US patentskrift nr. 3 719 563) og Streptomyces clavuligerus IFO 13307 (se japansk fremlæggelsesskrift nr.

45 594/74).

Fremstillingen af de ønskede forbindelser med formlen Aa udføres ved dyrkning af en af de ovennævnte stammer i et almindeligt næringsmedium, hvortil der er sat en heterocyclisk thiol svarende til den heterocycliske thiogruppe, som skal indføres i 3-stil-lingen.

8 145583

Som eksempler på de heterocycliske thioler, som kan tilsættes næringsmediet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan nævnes imidazoltMol, dihydroimidazolthiol, pyrazolthiol, triazolthiol, tetrazolthiol, thiadiazolthiol og thiatriazolthiol. Disse heterocycliske ringe kan være substitueret med en lavere alkylgruppe eller en carboxy-lavere-alkylthiogruppe.

Disse heterocycliske thioler kan anvendes som saltene deraf, og disse salte kan være uorganiske salte, såsom alkalimetalsalte, jordalkalimetalsalte, ammoniumsalte osv., og salte med organiske baser, såsom triethylamin, triethanolamin, dicyclohexylamin, lysin, arginin, histidin, et basisk vandopløseligt antibioticum, f.eks. kanamycin, alkaloid, basisk protein, osv. Der kan om nødvendigt vælges salte med høj vandopløselighed, og hvis de heterocycliske thioler viser en stærk toxicitet overfor de antibiotica-producerende stammer, kan der vælges salte, som er tungtopløselige i vand.

Også to molekyler af den samme heterocycliske thiol bundet sammen af S/S-bindingen, dvs. R S-SR , kan anvendes.

Fremstillingen af de ønskede antibiotica ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres ved dyrkning af en af de ovennævnte stammer i et næringsmedium med tilsætning af den ovenfor beskrevne heterocycliske thiol eller et salt eller et derivat deraf. Dyrkningen udføres ved konventionelle metoder til dyrkning af mikroorganismer, men sædvanligvis foretrækkes submers dyrkning i et flydende dyrkningsmedium. Ethvert dyrkningsmedium, som indeholder næringsstoffer for den anvendte stamme, kan anvendes. Det kan være både syntetiske og .halvsyntetiske dyrkningsmedier og naturlige dyrkningsmedier indeholdende de .førnævnte næringsstoffer. Til sammensætning af dyrkningsmediet kan .glucose, saccharose, mannitol, glycerol, dextrin, stivelse, vegetabilske olier osv. anvendes som carbonkilder, og kødekstrakt, pepton, glutenmel, majsfrømel, sojabønnemel, jord-nøddemel, fiskemel, majsstøbevand, tørgær, gærekstrakt, ammoniumsulfat, ammoniumnit'rat, urinstof og andre organiske og uorganiske nitrogenkilder som nitrogenkilder. Om nødvendigt kan der også sættes et metalsalt, såsom sulfaterne, nitraterne, carbonaterne og phosphaterne af Na, K, Mg, Ca, Zn og Fe, til dyrkningsmediet. Endvidere kan der om nødvendigt sættes materialer til fremme af 9 145583 dannelsen af antibiotica eller skumdæmpende midler, såsom methionin, cystein, cystin, methyloleat, svinefedt, silicpneolie, overfladeaktive midler osv.,til dyrkningsmediet.

Den førnævnte heterocycliske thiol eller saltet eller derivatet deraf tilsættes sædvanligvis i en koncentration på 0,1-5 mg/ml, fortrinsvis 0,5-2 mg/ml, beregnet som den heterocycliske thiol, og kan tilsættes dyrkningsmediet på én gang før dyrkningens begyndelse eller i flere opdelte portioner i de første stadier af dyrkningen.

Det er almindeligvis ønskeligt at udføre dyrkningen under aerobe forhold, og dyrkningstemperaturen er sædvanligvis fra omkring 18 til omkring 35°C, fortrinsvis omkring 30°C. Endvidere opnås ønskelige resultater, når dyrkningsmediets pH-værdi holdes ved fra omkring 5 til omkring 10, fortrinsvis 6-8. Dyrkningstiden afhænger af det anvendte dyrkningsmediums sammensætning og temperaturen, men er almindeligvis fra omkring 3 dage til omkring 10 dage, og således er det ønskede materiale selektivt dannet i mediet efter dyrkningens afslutning.

Det ønskede produkt kan isoleres eller udvindes fra dyrkningsvæsken på konventionel måde til isolering af antibiotica fra dyrkningsvæsken eller myceliet. Det ønskede antibioticum indeholdes hovedsageligt i dyrkningsvæsken, og derfor fjernes myceliet derfra ved centrifugering eller filtrering, og det effektive materiale ekstraheres fra filtratet. Det ønskede materiale adskilles, udvindes og renses fra filtratet ved midler, der almindeligvis anvendes til fremstilling af antibiotica, såsom udnyttelse af forskellene i opløselighed i et egnet opløsningsmiddel, forskellene i adsorbtiv affinitet til forskellige adsorbenser eller forskellene i opdeling mellem 2 væskefaser. Disse metoder kan anvendes hver for sig eller om nødvendigt som en passende kombination, eller de kan gentages flere gange.

Flere praktiske eksempler på de hidtil ukendte 7-methoxycephalosporin-forbindelser, som kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er anført nedenfor: 10 145583 I. 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carbo:xymethylthio-l,3,4- thiadiazol-2-yl) thiomethyl-7-methoxy-//^-cephem~4-carboxylsyr e;

0CH3 S

hox-ch-ch2ch2ch2conh--( > _'

NH2 ^Lii^^J-CHg-si-.gXs-CH^OOH

COOH ·

Tilsætningsforbindelse ϊ 2-carboxymethylthio-5-mercapto-l,3,4-thiadiazol;

N-N

hs—1> IL s-ch2cooh

De fysiske og kemiske egenskaber af den ovennævnte forbindelse I

P N—N

med den almene formel Aa ( R = li Π , M = H) iS^SCHgCOOH.

er som følger li 145583 S værdi (ppm): 2,35 (4H, multiplet), 2,96 (2H, multeplet), 4,00 (3H, singlet), 3,73-4,33 (2H, kvartet, J=18Hz), 4,25 (IH, multeplet), 4,44 (2H, singlet), 4,42-4,91 (2H, kvartet, J=l4Hz), 5,63 (IH, singlet); (8) produktet opnået i den hidtil reneste tilstand viser de følgende elementanalytiske værdier; C; 35,95%; H; 3,87%; N: 10,85%, S; 18,33%; (9) giver a-aminoadipinsyre, når den hydrolyseres med 6N saltsyre; (10) forbindelsens massespektrum efter N-chloracetylering af forbindelsen og omdannelse af produktet, til methylesteren giver det følgende fragment med m/e 392, dvs.

Hil*x^CH2-S- \ -^^S-CHgCOOCHj C 00(¾ 5 I betragtning af aile de ovennævnte resultater er det klart, at denne forbindelse er en 7-methoxycephalosporin-forbindelse, da den giver en absorption ved 1763 cm"1 (cyklisk iactam) i det infrarøde absorptionsspektrum og viser signalerne ved 4,00 ppm (3H, singlet, 7-OCH^), 5,63 ppm (IH, singlet, 6-CH), 3,73-4,33 (2H, kvartet, J=18 Hz, 2-CH2) og 4,42-4,91 (2H, kvartet, J=14 Hz, 3-sidekæde-CH2) i det magnetiske kerneresonansspektrum, og den giver α-aminoadipinsyre ved sur hydrolyse, og da den yderligere giver absorptionen ved 4,44 ppm (2H, singlet, CH2 i -S-CHg-COOH) i det magnetiske kemeresonansspektrum og giver fragmentet med m/e 392 i derivatets massespektrum, er forbindelsen blevet bestemt til at have den førnævnte struktur, hvori der er indført den heterocykliske thiol.

II. 7- (5-amino-5-carboxyvaleramido )-3-( l-methyl-lH-tetrazol-5-yl) - thi omethyl-7-methoxy-/\^-c ephem-4-carboxylsyre; 12 145583 och3 .s

H00C-CH-CH2CH2CH2C0NH---S N _N

m2 LaJ_cH2.-s4 3 Q> T >„ m COOH CH3

Tilsætningsforbindelse: 5-mercapto-l-methyl-lH-tetrazol.

r\

HS-"\ N

£h3

De fysiske og kemiske egenskaber af den ovennævnte -forbindelse II med formlen Aa - (R2= , M=H) er som følger: ch3 13 165583 (8) Det ovennævnte materiale, opnået i den hidtil reneste tilstand, viser de følgende elementanalytiske værdier: C: 37,48%, H: 4,25%, N: 16,74% og S: 10,90%; (9) Forbindelsen giver α-aminoadipinsyre, når den hydrolyseres med 6 N saltsyre, og giver 5-mercapto-l-methyl-lH-tetrazol, når den hydrolyseres i methanol med "Dowex ® 50 Wn (H-type).

I betragtning af alle de ovennævnte resultater er det klart,, at forbindelsen er en 7-methoxycephalosporin-forbindelse, da den giver signalerne ved 3,98 ppm (3H, singlet, 7-0CH^) og 5,59 ppm (IH, singlet, 6-CH) i det magnetiske kerneresonansspektrum, ab-sorptionen ved 1765 cm x (cyklisk lactam) i det infrarøde absorptionsspektrum og giver α-aminoadipinsyre ved sur hydrolyse, og da den yderligere viser absorptionen ved 4,50 ppm (3H, singlet, 'tétrazol-N-methyl) i det magnetiske kerneresonansspektrum og også giver 5-mercapto-l-methyl-lH-tetrazol ved mild hydrolyse, er forbindelsen blevet bestemt til at have den før nævnte struktur, hvori der er indført den heterocykliske thiol.

III. 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl- A^-cephem-4-carboxylsyre.

OCH·}

J S

HOOC-CH-CH^CH^CH^CONH---^ X N_N

®2 /Lk ic¥ J— OHj

COOH

Tilsætningsforbindelse: 2-mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol;

N-—N

' HS

S

De fysiske og kemiske egenskaber af den ovennævnte forbindelse III med formlen Aa (R2 = „ . .

As>-ch3» 14 = h) 14 145583 er som følger: (1) lyst gulligt hvidt pulver; (2) viser intet distinkt smeltepunkt og giver brun misfarvning og dekomponering ved omkring 170°C; (3) let opløselig i Vand, tungt opløselig i methanol, men uopløselig i andre organiske opløsningsmidler; (4) amphotert materiale, som viser positiv ninhydrin-reaktion; (5) giver det i fig. 5 viste ultraviolette adsorptionsspektrum,. målt i en l/lOO M phosphatpuffer-opløsning med en pH værdi på 6,4, og har absorptionsmaksimum ved 272 mm; (6) giver det i fig. 6 viste infrarøde absorptionsspektrum, målt som kaliumbromid-tablet, og viser absorptioner ved 3420 cm-'1', 2930 cm-1, 1765 cm-1, 1610 cm-'1', 15.15 cm-1 og 1385 cm-1/ (7) Det magnetiske kerneresonansspektrum, målt under anvendelse af IMS som ydre standard i tungt vand, giver de følgende signaler: værdi (ppm): 2,34 (4H, multiplet), 2,95 (2H, multiplet), 3,19 (3H, singlet), 3,72-4,31 (2H, kvartet, J = 18 Hz), 3,99 (3H, singlet), 4,26 (IH, multiplet), 4,40-4,95.

(2H, kvartet, J = 14 Hz), 5,63 (IH, singlet); (8) forbindelsen fremstillet i den hidtil reneste tilstand viser de følgende elementanalytiske værdier: C: 37,82$, H: 4,01$, N: 12,90$, S: 14,97$; (9) giver α-aminoadipinsyre, når den hydrolyseres med 6 N saltsyre, og giver 2-mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol, når den 15 U5583 hydrolyseres i methanol med "Dowex®50 W" (H type).

I betragtning af alle de ovennævnte resultater er det klart, at forbindelsen er en 7-methoxycephalosporin-forbindelse, da den giver absorptionen ved 1765 cnT^ .(cyklisk lactam) i det infrarøde absorptionsspektrum, signalerne ved 3»99 ppm (3H, singlet, 7-OCH^), 5,63 ppm (lH, singlet, 6-CH), 3,72-4,31 ppm (2H, kvartet, J = 18 Hz, 2-CH2), 4,40-4,95 (2H, kvartet, J = 14 Hz, 3-sidekæde CHg) i det magnetiske kerneresonansspektrum og giver oc-aminoadi-pinsyre ved sur hydrolyse, og da den endvidere viser absorptionen ved 3,19 ppm (3H, singlet, thiadiazol C-CH^) i det magnetiske kerneresonansspektrum og giver 2-mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadia-zol ved mild hydrolyse, er forbindelsen blevet bestemt til at have den ovennævnte struktur, hvori der er indført den hetero-cykliske thiol.

IV. 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(1,3,4-'thiadiazol-.

7 2-yl)thiomethyl- Δ -cephem-4-carboxylsyre OCH-j . · HOO'C-CH-CHo CH p CHp C ORH--f h v—N '

I 2 2 2 I I

2 <f T s

C00H

Tilsætningsforbindelse:

2-mercapto-l,3,4-thiadiazol N—N

hsJ)n^

De fysiske og kemiske egenskaber af den ovennævnte forbindelse IV med formlen Aa (R2 = N—N

1 ! ».o] er som følger: m (1) lyst gulligt hvidt pulver; (2) viser intet distinkt smeltepunkt, men giver brun misfarvning og dekomponering ved omkring 175-180°C; 16 145583 (3) let opløselig i vand, tungt opløselig i·methanol, men uopløselig, i. organiske opløsningsmidler; (4) amphotert materiale, som viser positiv ninhydrin reaktion; (5) giver det i fig. 7 viste ultraviolette absorptionsspektrum, målt i en 1/100 M phosphatpuffer-opløsning med en pH på 6,4, og har maksimal absorption -ved 274 mm; (6) giver det i fig. 8 viste infrarøde absorptionsspektrum, målt som kaliumbromid-tablet, og viser absorptioner ved 3400 cm"”'**, 2925 cm-1, 1765 cm-1, 1610 cm”1, 1515 cm"1 og 1365 cm”1; (7) det magnetiske kerneresonansspektrum, målt under anvendelse af IMS som ydre standard i tungt vand, giver de følgende signaler: é værdi {ppm): .

2,30 (4H, multiplet), 2,93 (2H, multiplet), 3,69-4,29 (2H, kvartet, J = 18 Hz), 3,97 (3H, singlet), 4,26 (IH, multiplet), 4,45-4,99 (2H, kvartet, J = 14 Hz), 5,56 (IH, singlet), 9,85 · (IH, singlet); (8) det ovennævnte materiale, opnået i den hidtil reneste tilstand, viser de følgende elementanalytiske værdier: C: 37,53%, H: 4,36%, N: 12,77%, S: 16,42%; (9) giver oc-aminoadipinsyre, når den hydrolyseres med 6 N saltsyre, og giver 2-mercapto-l,3,4-thiadiazol, når den hydrolyseres i methanol med "Dovex^50 Ψι (H type).

betragtning af alle de ovennævnte resultater er det klart, at forbindelsen er en 7-methoxycephalosporin-forbindelse, da den giver absorptionen ved 1765 cm”1 i det infrarøde absorptionsspektrum, giver signalerne ved 3,97 ppm (3H, singlet, 7-OCH^), 5,56 ppm (IH, singlet, 6-CH), 3,69-4,29 ppm (2H, kvartet, J s 18 Hz, 2-CH2), 4,45-4,99 (2H, kvartet, J = 14 Hz, 3-sidekæde-CH2-) i det magnetiske kerneresonansspektrum og giver a-aminoadipinsyre ved sur hydrolyse, og da den endvidere viser absorptionen ved 9,85 17 145583 ppm (lH, singlet, thiadiazol-CH) i det magnetiske kerneresonansspek-trum og giver 2-mercapto-l,3>4-thiadiazol ved mild hydrolyse, er forbindelsen blevet bestemt.til at have den ovennævnte struktur, hvori der er indført den heterocykliske thiol.

Resultaterne af de forskellige chromatografiske og papirelektro-phoretiske analyser af de ovennævnte forbindelser I, XI, III og IV, fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er anført nedenfor.

Rf-værdierne for disse forbindelser ved tyndtlagschromatografi under anvendelse af mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel SFM, handelsnavn) er anført i den følgende tabel.

1 .2 3

Forbindelse I 0,39 0,37 0,32

Forbindelse II 0,39 0,34 0,31

Forbindelse III 0,43 0,43 0,40

Forbindelse IV 0,39 0,38 0,33

Cephalosporin C 0,37 0,36 0,31 7-methoxy-cephalspo- rinC 0,41 0,36 0,32

Cephamycin C 0,37 0,36 0,31 Y-G19Z-D3 0,26 0,26 0,22 Y-G19Z-D2 .0,39 0,32 0,26

Udviklingssystem/(volumenforhold): 1. Isopropanol : n-butanol : eddikesyre : vand (21 :3:7:9).

2. n-butanol : eddikesyre : vand (4:1:2).

3. n-butanol : eddikesyre : vand (6 : 1,5 : 2,5).

Kontrolprøven, cephamycin C, er 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)- z 3~carbamoyloxymethyl-7-methoxy-Δ -cephem-4-carboxylsyre.

Kontrolprøverne Y-G19Z-D3 og Y-G19Z-D2, er de 7-methoxycephalos-porin-forbindelser, som tidligere er udskilt fra dyrkningsvæsken . af Streptomyces oganonensis af de samme opfindere (se de japanske tilgængelige patentansøgninger nr. 109 753/74' og 146 593/75).

• 18 145583

Rf-værdierne, opnået ved papiradskillelseschromatografi under anvendelse af Wattman nr. 1 filterpapir og også et udviklings system bestående af n-butanol : eddikesyre : vand (volumenforhold 4 : 1 : 2), er som følger:

Rf-værdi

Forbindelse I 0,40

Forbindelse II 0,39

Cephalosporin C 0,36 7-methoxy-cephalosporin C 0,40

Cephamycin C 0,35 Y-G19Z-D3 0,24 Y-G19Z-D2 0,25

Derpå blev forbindelserne analyseret under anvendelse af et "Hitachi 635 High Speed Liquid Chromatography Apparatus", og resultaterne er som følger: Søjle: 3 x 500 mm rustfast stålkolonne

Harpiks: "Hitachi 2610" (kationbytterharpiks, handelsnavn)

Udviklings sy stem: 0,2 M citratpufferopløsning (pH 3»6) Strømningshastighed: 0,6 ml/min.

Korthastighed: 1,0 cm/min.

Tilbageholdelsestid

Forbindelse I 5 min. 33 sek.

Forbindelse II 6 min. 00 sek.

Forbindelse III 9 min. 35 sek.

Cephalosporin C 5 min. 18 sek.

7-methoxy-cephalosporin C 5 min. 09 sek.

Cephamycin C 5 min. 18 sek.

Y-G19Z-D3 3 min. 42 sek.

Y-GI9Z-D2 3 min. 42 sek.

Endvidere er resultaterne, opnået ved analyse under anvendelse af det ovennævnte apparat under de følgende betingelsen anført i den følgende tabel.

19 145583 Søjle: n^u Bondapak C^g" (fremstillet af Waters Ltd.) på 4 x 300 mm.

Udviklingssystem: acetonitril : 0,1% eddikesyreopløsning (pH 3,3)/ (volumenforhold 1:9)

Strømningshastighed: 0,8 ml/min.

Korthastighed: 1,0 cm/min.

Tilbageholdelsestid Forbindelse I 3 min. 14 sek.

Forbindelse II 1 min. 52 sek.

Forbindelse III 2 min. 55 sek.

Forbindelse IV 1 min. 56 sek.

Resultaterne opnået ved højspændings-papirelektrophorese er som følger:

Filterpapir: Wattman Nr. 1.

Udviklingsmiddel: 10% eddikesyre (pH 2,2).

Spænding: 42 V/cm.

Løbetid: 1 time.

Vandringsafstand

Forbindelse I - 3,6 cm

Forbindelse II - 3»3 cm

Forbindelse III - 3)6 cm

Forbindelse IV - 3,9 cm

Cephalosporin C - 3,5 cm

7-methoxy-cephalospo- J

rin C - 3,4 cm

Cephamycin C - 3,5 cm Y-G19Z-D3 - 6,1 cm Y-G19Z-D2 - 6,1 cm

Cysteinsyre - 7,5 cm

Glutathion - 1,2 cm

Herefter er den antibakterielle aktivitet af de ovennævnte forbindelser I, II, III og IV, fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, anført i den følgende tabel sammen med værdienae for 20 145583 cephalosporin C til sammenligning.

Der anvendtes hjerteinfusionsagar-skive-metoden (500 yug/ml opløsning).

Talværdierne i den nedenstående tabel angiver diameteren · (mm) af inhiberingszonen.

X ΪΙ III IV C

Sarcina lutea ATCC 9341 0 0 0 0 14,0

Staphylococcus aureus 209 P 0 0 0 0 12,8

Bacillus subtilis ATCC 6633 0 0 0 0 23,1

Escherichia coli NIHJ 19,2 18,7 14,2 13,0 10,4

Klebsiella pneumoniae 21,8 25,5 25,0 25,0 13,0

Salmonella gallinarum 24,0 25,2 23,5 25,1 23,5

Proteus vulgaris OX 19 22,6 20,2 20,0 21,0 17,5

Proteus mirabilis IMF 0M-9 22,2 19,8 19,5 25,0 23,0 (Note): I: Forbindelsen I (opfindelsen).

II: Forbindelsen II " III: Forbindelsen III " IV: Forbindelsen IV " C: Cephalosporin C (sammenligning)

Hver af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser I, II, III og IV kan indgives i forskellige former alene eller i kombination med andre lægemidler. Således kan forbindelserne indgives oralt, ved intramuskulær injektion, ved intravenøs injektion osv. i form af kapsler, tabeletter, pulvere, granulater, opløsninger og suspensioner. Forskellige bærere tilsættes præparaterne, f.eks. mannitol, saccharose, glucose, steriliseret destilleret vand, saltopløsning og en vegetabilsk olie, såsom Jordnøddeolie eller sesamolie. Endvidere kan der tilsættes andre ingredienser, såsom stabilisatorer, bindemidler, antioxi-danter, konserveringsmidler, glittemidler til fremstilling af tabletter, suspensionsmidler, viskositetsforøgende midler, perfumer osv.

2i 145583

Som salte af de Ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser anvendes saltene af uorganiske eller organiske baser, som er farmaceutisk acceptable eller nyttige. Doserne af lægemidlerne afhænger hovedsageligt af patientens tilstand og vægt og også af indgivnings-måden, dvs. oral eller parenteral indgivning. I almindelighed indgives 50 mg/kg på en gang eller nogle få gange om dagen.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser viser udmærkede antimikrobielle aktiviteter og er nyttige til prophylaxe og behandling af sygdomme hos mennesker og dyr og kan endvidere anvendes som mellemprodukter til fremstilling af andre effektive 7-methoxycephalosporin-derivater. I alle tilfælde foretrækkes det, at forbindelsen isoleres som det rene produkt eller som et højkoncentreret råprodukt.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved de efterfølgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Fremstilling af 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-ca3:bo«yinethylthio- 1,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-/\^-cephem-4-carboxylsyre I.

Et dyrkningsmedium indeholdende 1% stivelse, 1% glucose, 1,596 sojabønnemel, 0,596 gærekstrakt, 0,196 dikaliumhydrogenphosphat, 0,0596 magnesiumphosphat og 0,3/6 natriumchlorid blev anbragt i 500 ml Sakaguchi-kolber med 100 ml i hver og steriliseret ved 120°C i 20 min. Hvert medium blev podet med Streptomyces oganonensis stamme Y-G19Z og dyrket i 48 timer ved 30°C.

Et dyrkningsmedium med den ovennævnte sammensætning blev anbragt i 2000 ml Sakaguchi-kolber med 400 ml i hver, steriliseret ved 120°C i 20 min. og podet med det ovenfor fremstillede podemateriale i en koncentration på 2-396 efterfulgt af dyrkning i 24 timer ved 30°C til frembringelse af en podekultur.

Derefter blev 60 1 af et dyrkningsmedium indeholdende 796 stivelse', 296 glutenmel, 296 sojabønnemel, 0,896 glycerol, 0,196 "Casamino,,-syre, 0,01% jern(III)-sulfat og 55 g natriumhydroxid fordelt i to 100 22 145583 liters fermentorer sammen med 10 ml af et skumdæmpende middel bestående af en stabil højmolekylær polyoxyalkylenforbindelse forhandlet under navnet "Adecanol", og efter sterilisering i 30 min. ved 120 °C blev hvert medium podet med 800 ml af podekulturen og dyrket i 24 timer ved 30 °C. I en vandig natriumhydroxidopløsning opløstes 2-carboxymethylthio-5-mercapto-l,3,4-thiadiazol, og den således dannede opløsning blev steriliseret ved højt tryk og sat til hver fermentor op til 0,05% af podematerialet, hvorpå der blev dyrket i yderligere 90 timer.

Efter at dyrkningen var fuldført blev dyrkningsvæsken indstillet til pH 2,0 og derpå blandet med et filtreringshjælpemiddel bestående af finpulveriseret diatomejord forhandlet under navnet "Radio-lite". Blandingen blev filtreret ved hjælp af en filterpresse, og filtraterne blev kombineret til opnåelse af omkring 100 1 filtrat. Filtratet blev indstillet til pH 3,0 med en vandig natriumhydroxidopløsning, sendt igennem en 12 liters søjle af ionbytterhar-piks "Amberlite®XAD-2", og søjlen blev vasket med 30 1 vand og derpå elueret med 30 1 50% vandig acetone. Det opsamlede eluat blev koncentreret til 5,5 1, og efter fjernelse af dannede urenheder sattes vand til remanensen til frembringelse af 10 1 opløsning. Den således fremstillede opløsning blev indstillet til pH

3,5 med fortyndet saltsyre og derpå sendt igennem en 3 liters søjle af ionbytterharpiks "Amberlite®IRA-68". Efter vaskning af .søjlen med 6 1 vand udførtes eluering ved hjælp af .en vandig opløsning (pH 7,2) indeholdende 1 M .natriumnitrat og 0,1 M natriumacetat til opnåelse af omkring 5 1 opløsning indeholdende antimikro-bielt aktivt materiale. Opløsningen blev indstillet til pH 3,0, sendt igennem en 1 liters "Amberlite® XAD-2"søjle, og efter vaskning af søjlen med vand blev den elueret med 50% vandig acetone til opnåelse af omkring 400 ml vandig opløsning indeholdende antimikro-bielt aktivt materiale. Ved lyophilisering af opløsningen blev der opnået omlering 18 g råt pulver af den ønskede forbindelse I.

De 18 g råt pulver blev underkastet søjlechromatografi under anvendelse af omkring 800 ml tværbunden dextran substitueret med di-ethylaminoethylgrupper forhandlet under navnet "DEAE-Sephadex® A-25" (eddikesyre-type) fyldt med en lille mængde 0,5 M ammonium-bromid/eddikesyre-pufferopløsning og fraktioneret i effektive komponenter. De opnåede antimikrobielt aktive fraktioner blev op- 23 145583 samlet, sendt igennem en 500 ml "Amberlite®XAD-2"søjle, og efter vaskning med vand blev søjlen elueret med 25% vandig acetone, og eluatet blev inddampet til tørhed.

Derpå blev den opnåede produktremanens underkastet søjlechromatografi under anvendelse af mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel"), præpareret med en opløsningsmiddelblanding af isopropanol og vand i volumenforholdet 7:3, og under anvendelse af den samme opløsningsmiddelblanding. Den opnåede antimikrobielt aktive fraktion blev anbragt som en plet på en tyndtlagsplade af "Avicel SF", udviklet med en blanding af isopropanol: n-butanol: eddikesyre: vand (volumenforhold 21:3:7:9), og derpå blev der sprøjtet en 0,25% opløsning af ninhydrin i pyridin på pladen efterfulgt af opvarmning til frembringelse af farvning, De fraktioner, som udviste en Rf-værdi på 0,39, blev opsamlet. Fraktionen blev vacuuminddampet til tørhed ved 45-50°C og derpå underkastet søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel"), præpareret med en opløsningsmiddelblanding af isopropanol/n-buta-nol/eddikesyre/vand (volumenforhold 21:3:7:9). Den således opnåede antimikrobielle fraktion blev underkastet tyndtlagschromatografi på "Avicel SF" med den ovennævnte opløsningsmiddelblanding, og ved at følge den samme procedure som.ovenfor blev de fraktioner, som udviste en Rf-værdi på 0,39 opsamlet og vacuuminddampet til tørhed.

Produktremanensen blev yderligere renset ved en søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol/eddikesyre/vand (volumenforhold 6:1,5: 2,5). Den rensede aktive fraktion blev inddampet til tørhed og derpå opløst i en lille mængde destilleret vand. Opløsningen blev udviklet på en søjle af tværbundet dextrangel forhandlet under navnet "Sephadex®G-10" under anvendelse af destilleret vand.

De fraktioner, som udviste antimikrobiel aktivitet, blev opsamlet og underkastet tyndtlagschromatografi som angivet ovenfor under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol/ eddikesyre/vand (volumenforhold 6:1,5:2,5). De fraktioner, som udviste Rf 0,32 blev opsamlet, koncentreret og derpå underkastet lyophilisering, hvorved der blev opnået omkring 80 mg hvid 1-(5-amino-5-carboxy-valeramido)-3-(5-carboxymethyl-l,3,4-thiadia- 24 145583 o zol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy- -cephem-4-carboxylsyre.

EKSEMPEL 2

Fremstilling af 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(1-methyl-lH-tetrazol-5-vl)thiomethvl-7--methoxy-/\^-cephem-4-carboxvlsvre II.

Et dyrkningsmedium indeholdende 1% stivelse, 1% glucose, 1,5% sojebønnemel, 0,5% gærekstrakt, 0,1% dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% magnesiumsulfat og 0,3% natriumchlorid blev anbragt i 500 ml Sakaguchi-kolber med 100 ml i hver og steriliseret i 20 min. ved 120°C. Derpå blev hvert medium podet med Streptomyces oganonensis stamme Y-G19Z efterfulgt af dyrkning i 48 timer ved 30°C. Et yderligere dyrkningsmedium med den ovennævnte sammensætning blev anbragt i 2 liters Sakaguchi-kolber med 400 ml i hver, og efter sterilisering i 20 min. ved 120°C blev hvert medium podet med op til 2.-3% af den ovenfor fremstillede dyrkningsvæske og dyrket i yderligere 24 timer ved 30°C til opnåelse af et podemateriale.

Derefter blev 60 1 af et dyrkningsmedium indeholdende 7% stivelse, 2% glutenmel, 2% sojabønnemel, 0,8% glycerol, o,l% "Casamino"-syre, 0,01% jern(Hl)-sulfat og 55 g natriumhydroxid anbragt i 2 100 liters fermentorer, hver portion sammen med 10 ml af det skumdæmpende middel "Adecanol", og efter sterilisering i 30 min. ved 120 °C, blev hvert medium podet med 800 ml af det ovenfor fremstillede podemateriale efterfulgt af dyrkning i 24 timer ved 30 °C. Derpå opløstes l-methyl-5-mercapto-lH-tetrazol i en vandig natriumhydroxidopløsning, og opløsningen blev steriliseret ved højt tryk og tilsat dyrkningsvæsken i en koncentration på 0,05%, hvorefter blandingen blev dyrket i yderligere 90 timer.

Efter at dyrkningen var fuldført, blev den således dannede dyrkningsvæske indstillet til pH 2,0 og derpå blandet med filtreringshjælpmidlet "Radiolite" under omrøring. Blandingen blev filtreret under anvendelse af en filterpresse, og de opnåede filtrater blev kombineret til opnåelse af omkring 100 1 filtrat.

Filtratet blev indstillet til pH 3,0 med en vandig natriumhydroxidopløsning, sendt igennem en 12 liters "Amberlite XAD-2"søjle, og efter vaskning af søjlen med 30 1 vand blev den elueret med 30 1 50% vandig acetone. Eluatet blev koncentreret til 5,5 1, og 25 145583 koncentratet indstillet til pH 3,5 med fortyndet saltsyre og sendt igennem en 3 liters "Amberlite®IRA-68" (Cl-type) søjle.

Søjlen blev vasket med 6 1 vand og fraktioneret med en vandig opløsning (pH 7,2) indeholdende 1 M natriumnitrat og 0,1 M natriumacetat til opnåelse af omkring 5 1 af en opløsning indeholdende et antimikrobielt aktivt materiale. Opløsningen blev indstillet til pH 3,0, sendt igennem en 1 liters "Amberlite ^XAD-2" søjle, vasket med vand og elueret med 50% vandig acetone , til opnåelse af omkring 400 ml af en vandig opløsning indeholdende det anitmikrobielt aktive materiale. Ved lyophilisering af opløsningen blev der opnået omkring 54 g råt pulver af den ønskede forbindelse II. Det rå pulver blev underkastet søjlechromatografi med omkring 800 ml "Sephadex®A-25" (eddikesyre-type) fyldt med en lille mængde 0,5 M ammoniumbromid/eddikesyre-pufferopløsning til fraktionering af aktive komponenter. De antimikrobielt aktive fraktioner blev opsamlet, sendt igennem en 500 ml "Amberlite^\XAD-2" søjle, og søjlen blev vasket med vand og elueret med en vandig 25% acetoneopløsning. De antimikrobielt aktive fraktioner blev opsamlet og vacuuminddampet til tørhed.

Den dannede remanens blev underkastet søjlechromatografi under anvendelse af mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") fyldt med en blanding af isopropanol og vand (volumenforhold 7:3), under anvendelse af den samme opløsningsmiddelblanding. Den opnåede antimikrobielt aktive fraktion blev opsamlet, anbragt som plet på en tyndtlagsplade af "Avicel SF", udviklet med en blanding af n-butanol"eddikesyre/vand (volumenforhold 6:1,5:2,5) og derpå sprøjtet med en opløsning af 0,25% ninhydrin i pyridin, efterfulgt af opvarmning til frembringelse af farvning. De fraktioner, som udviste Rf 0,31 blev opsamlet. Fraktionerne blev koncentreret under formindsket tryk og tørret, og derefter blev den dannede remanens underkastet søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel"), præpareret med en opløsningsmiddelblanding af isopropanol/n-butanol/eddikesyre/vand (volumenforhold 21:3:7:9). De opnåede antimikrobielt aktive fraktioner blev underkastet tyndtlagschromatografi på "Avicel SF" med en opløsningsmiddelblanding med samme sammensætning som ovenfor, og ved at følge den samme procedure som ovenfor blev de fraktioner, som udviste Rf 0,39, opsamlet og vacuuminddampet til tørhed.

26 145583

Den således dannede remanens blev yderligere underkastet en søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol/eddikesyre/ vand (volumenforhold 6:1,5:2,5) til rensning af den effektive komponent. Den således rensede aktive fraktion blev vacuumind-dampet til tørhed, opløst i en lille mængde destilleret vand og udviklet på en søjle af den tværbundne dextrangel "Sephadex ®G-10" under anvendelse af destilleret vand. Fraktionerne med antimikrobiel aktivitet blev opsamlet og underkastet tyndtlags-chromatografi under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol/eddikesyre/vand (volumenforhold 6:1,5:2,5) som angivet ovenfor. Derpå blev fraktionerne med Rf 0,31 opsamlet, koncentreret og derpå lyophiliseret, hvorved der blev opnået 60 mg hvid 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thio-. methyl-7-methoxy-/^ -cephem-4-carboxylsyre.

EKSEMPEL 5

Fremstilling af 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3~ (5-methyl-l, 3,4-thiadiazol-2-yl) thiomethyl-A^-cephem-4-carboxvlsyre III.

Et dyrkningsmedium indeholdende 1% stivelse, 1% glucose, 1,5% sojabønnemel, 0,5% gærekstrakt, 0,1% dikaliumhydrogenphosphat, 0,0596 magnesiumsulfat og 0,-3% natriumchlorid blev anbragt i 500 ml Sakaguchi-kolber med 100 ml i hver og steriliseret i 20 min. ved 120°C. Hvert medium blev derpå podet med Streptomyces ogano-nensis stamme Y-G19Z og dyrket i 48 timer ved 30°C. Yderligere dyrkningsmedium med den ovenfor beskrevne sammensætning blev anbragt i 2 liters Sakaguchi-kolber med 400 ml i hver og steriliseret i 20 min. ved 120°C. Hvert medium blev podet med den ovenfor fremstillede dyrkningsvæske i en koncentration på 2-3% og derpå dyrket i 24 timer ved 30°C til dannelse af en podekultur.

Eor sig blev 60 1 af et dyrkningsmedium indeholdende 7% stivelse, ·· 2% glutenmel, 2% sojabønnemel, 0,8% glycerol, 0,1^ · "Casamino''-syre, 0,01 % jern(III>sulfat og 55 g natriumhydroxid anbragt i 2 100 liters fermentorer sammen med i hver portion 10 ml af det skumdæmpende middel "Adecanol", steriliseret i 30 min. ved 120 °C og podet med 800 ml podekultur efterfulgt af dyrkning i 24 timer 27 14S583 ved 30 °C. Derpå blev 2-mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol opløst i vandig natriumhydroxidopløsning, steriliseret ved højt tryk og tilsat dyrkningsvæsken i en koncentration på 0,05%, efterfulgt af yderligere dyrkning i 90 timer.

Efter at dyrkningen var fuldført, blev dyrkningsvæsken indstillet til pH 2,0 og blandet med filtreringshjælpemidlet "Radiolite" under omrøring. Blandingen blev filtreret under anvendelse af en filterpresse, og filtraterne blev kombineret til opnåelse af omkring 1 1 filtrat.

Filtratet blev indstillet til pH 3,0 ved tilsætning af vandig . natriumhydroxidopløsning, sendt igennem en 12 liters "Amberlite ®XAD-2"søjle, og søjlen blev vasket med 30 1 og elueret med 30 1 vandig 50% acetoneopløsning. Eluatet blev koncentreret til 5,5 1 og koncentratet blev indstillet til pH 3,5 med fortyndet saltsyre og sendt igennem en 3 liters "Amberlite^ IRA-68"søjle. Søjlen blev vasket med 6 1 vand og elueret med en vandig opløsning (pH 7,2) indeholdende 1 M natriumnitrat og 0,1 M natriumacetat til opnåelse af en opløsning indeholdende omkring 5 1 antimikro-bielt aktivt materiale. Opløsningen blev indstillet til pH 3,0, sendt igennem en 1 liters "Amberlite® XAD-2"søjle, og efter vaskning af søjlen med vand blev den elueret med en vandig 509f> acetoneopløsning til opnåelse af omkring 400 ml af en vandig opløsning indeholdende det antimikrobielt aktive materiale. Produktet blev lyophiliseret.

Under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol/ eddike syr e/vand (volumenf orh’old 4:1:2) blev remanensen underkastet søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") fyldt med den samme opløsningsmiddelblanding som ovenfor. De opnåede antimikrobielt aktive fraktioner bliver kombineret og anbragt som plet på en tyndtlagsplade af "Avicel SF", udviklet med en opløsningsmiddelblanding af isopropanol/n-butanol/eddikesyre/ vand (volumenforhold 21:3:7:9) og derpå påsprøjtet en 0,25% opløsning af ninhydrin i chloridin til frembringelse af farvning ved opvarmning. Således blev de fraktioner, der udviste Rf 0,43 opsamlet, vacuuminddampet til tørhed ved 45-50°C og derpå underkastet søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel"), præpareret med en opløsningsmiddelblanding af acetonitril/vand 28 145583 (volumenforhold 7:3). Den opnåede antimikrobielt aktive fraktion blev underkastet tyndtlagschromatografi på "Avicel SF" som ved den ovenstående procedure, og derpå blev de fraktioner, der udviste Rf 0,43, opsamlet og inddampet til tørhed, hvorved der blev opnået 0,78 g råt pulver.

Pulveret blev opløst i en lille mængde destilleret vand og ud- viklet på en søjle af den tværbundne dextrangel "Sephadex^G 10" under anvendelse af destilleret vand. De antimikrobielt aktive fraktioner blev kombineret og underkastet tyndtlagschromatografi under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol/ed- dikesyre/vand (volumenforhold 4:1:2) som angivet ovenfor, og fraktionerne med Rf 0,43 blev opsamlet, koncentreret og lyophi- liseret, hvorved der blev opnået 82 g hvid 7-(5-amino-5-carboxyl- valeramido)-7-methoxy-3-(5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thio-3 methyl-^ -cephem-4-carboxylsyre.

EKSEMPEL 4

Ved den samme procedure som i eksempel 1, men under anvendelse af en opløsning af bis-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)di-siifid, fremstillet ved opløsning af disulfidet i vandholdigt methanol og sterilisering ved filtrering under anvendelse af Millipore-filter, i stedet for opløsningen af 5-mercapto-l, 3,4-thiadiazol-2-thioeddike-syre i vand, fremstillet under anvendelse af vandig natriumhydroxid-opløsning og sterilisering ved højt tryk, blev der opnået 23 g råt pulver af den ønskede forbindelse I, og rensning af produktet som i eksempel 1 gav 45 mg 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(5-carboxymethylthio-l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-7-methoxy-/\ cephem-4-carboxylsyre (forbindelse I).

EKSEMPEL 5

Ved den samme procedure som i eksempel 2, men under anvendelse af en opløsning af bis-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)disulfid, fremstillet ved opløsning af disulfidet i vand indeholdende methanol og sterilisering ved filtrering under anvendelse af Millipore-filter, i stedet for opløsningen af l-methyl-5-mercapto-lH-tetrazol i vand, fremstillet under anvendelse af en vandig natriumhydroxidopløsning og sterilisering ved højt tryk, blev der opnået omkring 26 g råt pulver af den ønskede forbindelse II, og rens 29 145583 ning af produktet som i eksempel 2 gav 37 mg 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-(l-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-7-metIioxy-Δ3- cephem-4-carboxylsyre (forbindelse II).

EKSEMPEL 6

Ved den samme procedure som i eksempel 3, men under anvendelse af en opløsning af bis-(5-methyl-l,3,4-thladiazol-2-yl)disulfid, fremstillet ved opløsning af disulfidet i vandholdigt methanol og sterilisering ved filtrering under anvendelse af Millipore-filter, i stedet for opløsningen af 2-mercapto-5-methyl-l,3,4-thiadiazol i vand, fremstillet under anvendelse af en vandig natriumhydroxidopløsning og sterilisering ved højt tryk, blev der opnået omkring 19 g råt pulver af den ønskede forbindelse III, og rensning af produktet som i eksempel 3 gav 50 mg 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)- 7-methoxy-3-(5-methyl~l,3,4-thiadiazol-2-yl)thiomethyl-/\^-cephem- 4-carboxylsyre (forbindelse III).

EKSEMPEL 7

Fremstilling af 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(1,3,4~thladiazol-2~yl)thiomethyl~/\^-cephem-4-carboxylsyre IV.

Et dyrkningsmedium indeholdende 1% stivelse, 1% glucose, 1,5% sojabønnemel, 0,5% gærekstrakt, 0,1% dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% magnesiumsulfat og 0,3% natriumchlorid blev anbragt i 500 ml Sakaguchi-kolber med 100 ml i hver, steriliseret i 20 min. ved 120°C og podet med Streptomyces oganonensis stamme Y-G19Z efterfulgt af dyrkning i 48 timer ved 30 °C. Yderligere dyrkningsmedium med den ovennævnte sammensætning blev anbragt i 2 1 liters Sakaguchi-kolber med 400 ml i hver, steriliseret i 20 min. ved 120°C og derpå podet med 2-3% af den ovenfor fremstillede dyrkningsvæske efterfulgt af yderligere dyrkning i 24 timer ved 30°C til dannelse af en podekultur.

Separat blev 60 1 af et dyrkningsmedium indeholdende 7% stivelse,

2% glutenmel, 2% sojabønnemel, 0,8% glycerol,'0,1% "Casamino"-syre, 0,01% jern(III)-sulfat og 53 mg natriumhydroxid anbragt i 2 100 liters fermentorer sammen med i hver portion 10 ml af det skumdæmpende middel "Adecanol", steriliseret i 30 minutter ved 120 °C

30 145583 og podet med 800 ml af podekulturen efterfulgt af dyrkning i 24 timer ved 30 °C. Derefter sattes en opløsning af 2-mercapto-l,3,4-thiadiazol, fremstillet ved opløsning af thiediazolen i vand under anvendelse af en vandig natriumhydroxidopløsning og sterilisering ved højt tryk, til dyrkningsvæsken, således at koncentrationen af thiadiazolen blev 0,05%, og derefter blev systemet dyrket i yderligere 90 timer.

Efter at dyrkningen var fuldført blev dyrkningsvæsken indstillet til pH 2,0 og blandet med filtreringshjælpemidlet "Radiolite" under omrøring. Blandingen blev filteret under anvendelse af en filterpresse, og filtraterne blev kombineret til omkring 100 1 filtrat.

' Filtratet blev indstillet til pH 3,0, sendt igennem en 12 liters "Amberlite ®XAD-2"søjle, og søjlen blev vasket med 30 1 vand og elueret med 30 1 vandig 50% acetoneopløsning* Eluatet blev koncentreret til 5,5 1, og koncentratet blev indstillet til pH 3,5, sendt igennem en 3 liters "Amberlite 'S' IRA-68" (Cl-type) søjle.

Søjlen blev vasket med 6 1 vand og elueret med en- vandig opløsning (pH 7,2) indeholdende 1 M natriumnitrat og 0,1 M natriumacetat til opnåelse af omkring 5 1 opløsning indeholdende et anti-mikrobielt aktivt materiale. Opløsningen blev indstillet til pH

3,0, sendt igennem en 1 liters "Amberlite® XAD-2"søjle, vasket med vand og elueret med en vandig 50% acetoneopløsning til opnåelse af omkring 400 ml af en vandig opløsning indeholdende det antimikrobielt aktive materiale. Opløsningen blev lyophilise-ret.

Under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol/ eddikesyre/vand (volumenforhold 4:1:2) blev den dannede remanens underkastet søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") fyldt med den samme opløsningsmiddelblanding som ovenfor. De antimikrobielt aktive fraktioner blev kombineret og anbragt som plet på en tyndtlagsplade af "Avicel", udviklet under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af isopropanol/n-butanol/ eddike syre/vand (volumenfornold 21:3:7:9) og derefter sprøjtet med en 0,25% opløsning af ninhydrin i pyridin til frembringelse af farvning under opvarmning. Fraktionerne, som udviste Rf 0,39, blev opsamlet og vacuuminddampet til tørhed ved 45-50°C. Produkt 31 145583 remanensen blev underkastet søjlechromatografi på mikrokrystallinsk cellulose ("Avicel") fyldt med en opløsningsmiddelblanding af acetonitril/vand (volumenforhold 7:3). De antimikrobielt aktive fraktioner blev også underkastet tyndtlagschromatografi på "Avicel SF” som ved den ovenstående procedure, og derpå blev fraktionerne med Rf 0,39 opsamlet og vacuuminddampet til tørhed, hvorved der blev opnået 0,92 g råt pulver.

Det rå pulver blev opløst i en lille mængde destilleret vand og underkastet søjlechromatografi under anvendelse af "Amberlite (H-type)søjle med destilleret vand, og de antimikrobielt aktive fraktioner blev opsamlet, koncentreret og lyophiliseret. Remanensen blev opløst i en lille mængde destilleret vand og udviklet på en søjle af den tværbundne dextrangel "Sephadex^C 10" under anvendelse af destilleret vand. Den antimikrobielle aktivitet af hver fraktion blev undersøgt, og de effektive fraktioner blev underkastet tyndtlagschromatografi under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af n-butanol/eddikesyre/vand (volumenforhold 4:1:2) som beskrevet ovenfor. Fraktionerne med Rf 0,38 blev opsamlet, koncenteret og lyophiliseret, hvorved der blev opnået 75 mg hvid 7-(5-amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxy-3-(1,3,4-thiadia-zol-2-yl)thiomethvl-/\^-cephem-4-carboxylsvre.

EKSEMPEL 8

Et dyrkningsmedium, som indeholdt 1,0# glucose, 1,0# stivelse, 1,5$ sojabønnemel, 0,5# gærekstrakt, 0,1# dikalium-hydrogenphosphat og 0,05# magnesiumsulfat (7 H20), blev fordelt i 500 ml Sakaguchi-kolber med 100 ml i hver og steriliseret. Medierne blev podet med Streptomyces clavu-ligerus IF0 13307 og dyrket på en rystemaskine i 3 dage ved 270 C.

Separat blev der i hver af 100 Erlenmeyer-kolber med et volumen på 500 ml fyldt 50 ml af et dyrkningsmedium, som indeholdt 3,0# kartoffelstivelse, 1,5# sojabønnemel, 1,5# bomuldsfrømel, 0,45# natriumcitrat, 0,06# mangansulfat, 0,06# magnesiumsulfat (7 H^O) og 0,05# jern(III)-sulfat, og kolberne blev steriliseret og afkølet på sædvanlig måde.

5 32 145583

Medierae blev podet med stamkulturen i kimfri tilstand og dyrket ved 27° C på et roterende rysteapparat (220 omdr./ min.). Efter 24 timers dyrkning blev dyrkningsvæsken tilsat en vandig opløsning af 5-mercapto-l-methyl-lH-tetra-zol, som var fremstillet ved hjælp af en vandig opløsning af natriumhydroxid, i en mængde på 0,06%, beregnet på den samlede mængde dyrkningsvæske.

Efter 160 timers dyrkning blev dyrkningsvæsken filtreret fra fast stof, hvorved der blev udvundet 2,5 liter filtrat.

Filtratet pH-værdi blev indstillet 2,0, og det blev vasket med en lige så stor mængde ethylacetat, hvorefter den vandige fase blev skilt. fra. Den vandige fase blev adsorberet på en 50 ml søjle af ionbytterharpiks "Dowéx®50W", og søjlen blev efter vaskning med vand elueret med 125 ml 0,2 M natrium-phosphatopløsning (pH 4,60). Eluatet blev inddampet, og den således opnåede koncentrerede opløsning blev underkastet søjlechro-matografi på filtereringshjælpemidlet "Avicel" med en opløsningsmiddelblanding af n-propanol, methanol og vand i volumenforholdet 7:0,5:2,5. De således opnåede virksomme komponenter blev underkastet en yderligere søjlechromatografi på "Avicel" ved hjælp af en opløsningsmiddelblanding af n-propanol, eddikesyre og vand i volumenforholdet 4:1:2.

Den antimikrobielle aktivitet blev iagttaget i fraktionerne nr. 24 - 33. Disse fraktioner blev inddampet, nedfros-set og tørret i vacuum, hvorved der blev opnået 29,5 mg af det rå produkt. Produktet blev ved hjælp af en høj-hastigheds-væskechromatograf opdelt i fire dele. Delen II blev skilt fra, hvorved der blev opnået ca. 4,9 mg af et rent, hvidt produkt, som på grundlag af NMR-, UV- og IR-absorptionsspektre blev fastslået at være 7-(5-amino- 5-carboxyvaleramido)-7a-methoxy-3-(Ι-methyl-lH-tetrazol-5-yl)thiomethyl-Δ cephem-4-carboxylsyre.

Når denne procedure blev gentaget under anvendelse af henholdsvis Strep, rochei IFO 12908, Strep, lipmanii IFO 13306 og Strep, viridochromogenes IFO 13347 i stedet for Strep, clavuligerus IFO 13307, blev der opnået henholdsvis 28 mg, 23 mg og 25 mg af det rå produkt og henholdsvis 3 mg, 7 mg og 5 mg af de rensede produkter.

Claims (1)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af 7- (5-amino-5-cart>-oxyvaleramid o)-7-methoxycephalosporin-derivater med den almene formel OCH, HOOCv 3 g ^>CH(CH2)3C0NH ~--S N h2nX Li 1 ^ |\h2-s-r2 C O OM 2 hvori R betyder en 5-leddet heterocyclisk gruppe, som indeholder 2-4 nitrogenatomer og yderligere kan indeholde et svovlatom, og som kan være substitueret med en lavere-alkylgruppe eller en carboxy-lavere-alkylthiogrup-pe og M betyder hydrogen eller en saltdannende kation udvalgt blandt alkalimetaller, jordalkalimetaller, tungmetaller og baser, der danner kvaternære salte eller amin-salte, kendetegnet ved, at en af mikroorganismerne Streptomyces rochei IFO 12908, Streptomyces lipmanii IFO 13306, Streptomyces viridochromogenes IFO 13347, Streptomyces clavuligerus IFO 13307, og Streptomyces oganonensis ATCC 31167 dyrkes i et næringsmedium med tilsætning af en heterocyclisk thiol med formlen r2sh eller et salt deraf eller en forbindelse med formlen R2S-SR2 2 hvori R har den ovennævnte betydning, hvorpå det dannede cephalosporinderivat isoleres.