DK145745B

DK145745B - Immobiliseret katalytisk aktivt materiale samt fremgangsmaade til fremstilling og anvendelse af samme

Info

Publication number: DK145745B
Application number: DK291977AA
Authority: DK
Inventors: I Chibata; T Tosa; I Takata
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co
Priority date: 1976-07-02
Filing date: 1977-06-29
Publication date: 1983-02-14
Also published as: FR2356664A1; JPS5629516B2; DE2728622C2; JPS536483A; GB1573181A; SE432948B; DE2728622A1; US4138292A; DK145745C; DK291977A; SE7707599L; FR2356664B1; IT1083435B

Description

(19) DANMARK

m) (2) fremlæggelsesskrift <«) 145745 b

DIREKTORATHT FOR PATENT· OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 2919/77 (51) Int.CI.3 C 12 N 11/10 (22) Indleveringsdag 29· jun. 1977 (24) Løbedag 29. jun. T977 (41) Aim. tilgængelig 3· jan. 1978 (44) Fremlagt 14. féb. 1983 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 2. jul. 1976, 79346/76, JP

(71) Ansøger TANABE SEIYAKU COMPANY LIMITED, Osaka-shi, JP.

(72) Opfinder Ichiro Chib at a, JP: Tetsuya Tosa, JP: Isao Takata, JP.

(74) Fuldmægtig Th. Ostenfeld Patentbureau A/S.

(54) Immobiliseret katalytisk aktivt materiale samt fremgangsmåde til fremstilling og anvendelse af samme.

Den foreliggende opfindelse angår et immobiliseret katalytisk aktivt materiale samt en fremgangsmåde til fremstilling og anvendelse af samme.

Enzymer og mikroorganismer er blevet anvendt som katalysatorer til fremkaldelse af forskellige kemiske eller enzymatiske reaktioner. De er f.eks. blevet anvendt som katalysatorer, ikke kun ved fremstilling af organiske syrer, aminosyrer, 6-aminopenicillansyre osv., ® men også til nedbrydning af uønskede stofskifteprodukter, såsom urin- LO e stof. Nar de anvendes til katalyse af reaktioner, som finder sted i ^ vandige opløsninger, gennemføres adskillelsen eller fjernelsen af «3· dem fra reaktionsopløsningen imidlertid ved kogning eller surgøring af opløsningen til denaturering af enzymerne eller mikroorganismerne efterfulgt af frafiltrering af bundfaldene deraf. Enzymerne og mikro-® organismerne kan således kun anvendes én gang og må bortkastes der efter.

2 145745

Immobiliserede enzymer og mikroorganismer (dvs. enzymer og mikroorganismer, som er bundet til bærere) er blevet af stor betydning inden for de seneste år. Sådanne immobiliserede præparater kan anvendes som heterogene katalysatorer og kan, efter at reaktionerne er afsluttet, let fjernes fra reaktionsblandingerne. Desuden kan de immobiliserede enzymer eller mikroorganismer anvendes gentagne gange eller kontinuerligt til frembringelse af specifikke kemiske ændringer i store substratmængder. I denne forbindelse er forskellige fremgangsmåder til binding af enzymer eller mikroorganismer til bærere blevet kendte, indbefattende (a) kovalent binding af enzymerne eller mikroorganismerne til vand-uopløselige bærere; (b) ionisk binding af enzymerne eller mikroorganismerne til bærere; (c) fysisk adsorption af enzymerne eller mikroorganismerne på bærere; (d) kovalent tværbinding af enzymerne eller mikroorganismerne ved hjælp af bifunktionelle midler; (e) inklusion af enzymerne eller mikroorganismerne i polymeres gelgitter; og (f) mikro-indkapsling af enzymerne eller mikroorganismerne med semi-permeable polymermembraner. Typiske eksempler på disse fremgangsmåder vises i "Annual Review of Biochemistry", Bind. 35, 2. del, side 873 - 903 (1966); "Biochemistry" (USSR) (engelsk oversættelse) , Bind 31, side 337 - 345 (1966); USA-patentskrift nr. 3.278.392; "Enzymologia", Bind 39, side 12 - 14 (1970); og "Applied Microbiology", Bind 27, side 878 - 885 (1974).

Disse immobiliserede enzymer eller mikroorganismer er imidlertid, når de pakkes i en søjle og anvendes til reaktioner med substrater, tilbøjelige til at sammenpresses og deformeres, hvorved strømningshastigheden af substratopløsningerne i søjlen reduceres.

Det er endvidere kendt, at mikroorganismer indesluttes i Japan agars gelmatrix ved afkøling af en vandig opløsning af agaren blandet med mikroorganismerne (offentligt tilgængelig japansk patentansøgning nr. 95470/1975). Men den omtalte Japan agar med indesluttede mikroorganismer har dårlig evne til at bevare sin form i vandigt medium. Anvendt til enzymatiske reaktioner ved temperaturer højere end 40°C mister den sin netværksstruktur og omdannes til "sol" inden for så kort et tidsrum som 60 minutter.

Ud over de ovenfor nævnte kendte teknikker er det kendt, at enzymer kan indesluttes i gelmatrixen af carragenan (dvs. et sulfa-_teret polysaccharid) ved simpel afkøling af en vandig opløsning af carragenanet og enzymerne. Ligesom det er tilfældet ved Japan agaren, er carregenan - gelmatrixen, som fås ved 3 145745 denne fremgangsmåde imidlertid også for blød og ustabil til anvendelse ved enzymatiske reaktioner med substrater. F.eks. bliver gelstrukturen af carragenan, som fås ved denne fremgangsmåde, løs og fremkalder udsivning af enzymerne derfra ved anvendelse til enzymatiske reaktioner med substrater i vandigt medium.

Det har nu vist sig, at et stabilt immobiliseret katalytisk aktivt materiale kan fås ved indeslutning af enzymer eller mikroorganismer i gelmatrixen af et sulfateret polysaccharid i nærværelse af ammoniumion, en metalion, en vand-opløselig organisk amin eller et vandblandbart organisk opløsningsmiddel. Med andre ord, når immobiliseringen eller indeslutningen af enzymer eller mikroorganismer med det sul-faterede polysaccharid udføres i nærværelse af ionen, aminen eller opløsningsmidlet nævnt ovenfor, udviser det således opnåede immobili-serede præparat et højt niveau af katalytisk aktivitet i et langt tidsrum, og gelmatrixen deraf er på samme tid tilstrækkelig stabil til at afværge udsivning af enzymer eller mikroorganismer derfra. Desuden deformeres det sulfaterede polysaccharid med enzymer eller mikroorganismer indesluttet deri i nærværelse af ionen, aminen eller opløsningsmidlet ikke i vandigt medium og kan selv ved anvendelse til enzymatiske reaktioner ved pakning i en søjle fungere effektivt, således at substraterne omdannes til deres omdannelsesprodukter. Det har endvidere vist sig, at de tidligere nævnte til bærere bundne enzymer eller mikroorganismer kan benyttes til denne immobiliseringsfremgangsmåde til forbedring af kvaliteten deraf. Det vil sige, at den katalytiske aktivitet af de til bærere bundne enzymer eller mikroorganismer kan bibeholdes, og at sammenpakningen eller deformationen deraf kan afværges eller reduceres væsentligt ved indeslutning af det bundne enzym eller den bundne mikroorganisme i gelmatrixen af det sulfaterede polysaccharid i nærværelse af ammoniumion, en metalion, en amin eller et organisk opløsningsmiddel.

Betegnelsen "til bærer bundet enzym eller mikroorganisme" betyder, som den anvendes heri, det produkt, som er frembragt ved binding af et enzym eller en mikroorganisme til en bærer ved hjælp af en hvilken som helst af de ovenfor nævnte seks mekanismer (a) - (f), som er beskrevet i de nævnte publikationer.

Det immobiliserede katalytisk aktive materiale ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommeligt ved, at det omfatter et katalytisk aktivt enzym eller en katalytisk aktiv mikroorganisme eller et vand-uopløseligb hydrofilt, katalytisk aktivt til bærer bundet enzym eller en vand-uopløselig, hydrofil, katalytisk aktiv til bærer bundet mikroorganisme, som er indesluttet i gel- 4 U5745 matrixen af et sulfateret polysaccharid med et sulfatrest-indhold i molekylet på mere end 10 vægt-%,og indeholdende ammoniumion/ en metalion med en atomvægt, som er højere end 24, en vand-opløselig organisk amin eller et vandblandbart organisk opløsningsmiddel.

Det sulfaterede polysaccharid, som anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse,skal indeholde mere end 10 vægtprocent, fortrinsvis 12 - 62 vægtprocent sulfatrest (-SO^H) i molekylet. Repræsentative eksempler på sådanne polysaccharidsulfatestere er carragenan, furcellaran og cellulosesulfat. Carragenan er galactosesulfatestere, som er fremkommet ved ekstraktion med vand af tang tilhørende Rhodo-phyceae, såsom Ginartinacea og Solieriaceae (f.eks. Chondrus crispus, Gigartina acicularis, Eucheuma cottonii). Blandt de nævnte galactose-sulfatestere er specielt kappa-carragenan og iota-carragenan egnede til brug i forbindelse med den foreliggende opfindelse. Kappa-carragenan består hovedsagelig af 3-D-galactopyranosyl-4-sulfat og 3,6-anhydro-a-D-galactopyranose, og det indeholder ca. 20 - 30 vægtprocent sulfatrest (-SOgH) i molekylet. Iota-carragenan er hovedsagelig en blanding af 3-D-galactopyranosyl-4-sulfat og 3,6-anhydro-a-D-galacto-pyranosyl-2-sulfat, og det indeholder ca. 20 - 30 vægtprocent sulfatrest i molekylet. Derudover er furcellaran et sulfateret polysaccharid, som fås ved ekstraktion af tang tilhørende Furcellariaceae (f.eks. Furcellaria fastigiana) med vand, og det består hovedsagelig af D-galactose, 3,6-anhydro-D-galactose og halvestersulfatet af disse sukkerarter. Furcellaran indeholder ca. 12 - 16 vægtprocent sulfatrest i molekylet. Af andre passende sulfaterede polysaccharider, som kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse, kan nævnes cellulosesulfat indeholdende 12 - 62 vægtprocent sulfatrest i molekylet. Sådanne cellulosesulfater findes i handelen under handelsbetegnelsen "KELCO SCS" (sulfat-indhold ca. 53%) eller kan, om nødvendigt, fremstilles ved konventionel esterificering af cellulose med svovlsyre.

I forbindelse med den foreliggende opfindelse kan der som et af de katalytisk aktive materialer anvendes et bredt spektrum af enzymer. Eksempler på sådanne enzymer er oxidoreduktaser, såsom aminosyre-oxidase, catalase, xanthinoxidase, glueoseoxidase, glucose-6-phosphat-dehydrogenase, glutamatdehydrogenase, cytochrom C oxidase, tyrosinase, lactatdehydrogenase, peroxidase, 6-phosphogluconatdehydrogenase og malatdehydrogenase; transferaser såsom aspartatacetyltransferase, aspartataminotransferase, glycinaminotransferase, glutamin-oxaleddike-syreaminotransferase, glutaniin-pyrodruesyre-aminotransferase, creatin- 5 145745 phosphokinase, histaminmethyltransferase, pyruvatkinase, hexokinase, ε-lysinacetyltransferase og leucinaminopeptidase, hydrolaser, såsom asparaginase, acetylcholinesterase, aminoacylase, amylase, arginase, L-arginindeiminase, invertase, urease, uricase, urokinase, esterase, kallikrein, chymotrypsin, trypsin, thrombin, naringinase, nucleotidase, papain, hyaluronidase, plasmin, pectinase, hesperidinase, pepsin, penicillinase, penicillinamidase, phospholipase, phosphatase, lactase, lipase, ribonuclease og renin; lyaser såsom aspartatdecarb-oxylase, asparta.se, citratlyase, glutamiatdecarboxylase, histidin-ammoniak-lyase, phenylalaninammoniak-lyase, fumarase, fumarathydratase og malatsynthetase; isomeraser såsom alaninracemase, glucoseisomerase, glucosephosphatisomerase, glutaminatracemase, lactatracemase og methioninracemase; og lygaser såsom asparaginsynthetase, glutathion-synthetase, glutaminsynthetase og pyrodruesyresynthetase. De ovenfor nævnte enzymer er ikke nødvendigvis i ren form, idet rå enzymopløsninger direkte kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse. For eksempel kan ekstrakterne af dyre- eller plantevæv og de cellefrie ekstrakter af mikroorganismer fortrinsvis anvendes i form af enzymopløsningen. Disse ekstrakter kan naturligvis renses delvis før anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse. Også en blanding af to eller flere af de ovenfor nævnte enzymer kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse.

Katalytisk aktive mikroorganismer såsom bakterier, gær, skimmelsvampe, lav og protozoer er andre eksempler på katalytisk aktive materialer, som kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse. Alle mikroorganismer, som inden for deres levende celler akkumulerer i det mindste ét af de ovenfor nævnte enzymer, kan anvendes som de katalytisk aktive mikroorganismer.

Af mikroorganismer, som kan anvendes, kan f.eks. nævnes Achromobacter aquatilis, Achromobacter liquidum, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Bacillus megatherium, Bacillus subtilis, Bacterium succinium, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium flavum, Corynebacterium glutamicum, Erwinia herbicola, Escherichia coli, Gluconobacter melano-genus, Lactobacillus bulgaris, Micrococcus ureae, Penicillium vina-ceum, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas dacunhae, Pseudomonas putidum, Sarcina lutea, Streptomyces griseus, Serratia marcescens, Streptomyces phaeochromogenus samt bagegær. Disse mikroorganismer behøver ikke nødvendigvis at være intakte levende celler, men kan være lyofiliserede, varmebehandlede eller behandlet med acetone før deres anvendelser forbindelse med den foreliggende opfindelse.

6 145745

Desuden kan der son nævnt i gelmatrixen af det sulfaterede polysac-charid indesluttes en vanduopløselig,hydrofil bærer,hvortil der er bundet et katalytisk aktivt enzym eller en katalytisk aktiv mikroorganisme. Med betegnelsen "hydrofil" menes i den foreliggende forbindelse, at bæreren er gjort befugtelig eller opkvældelig i vand, men i det væsentlige ikke er opløselig deri. Alle bærere med disse egenskaber kan anvendes hertil, og enzymet eller mikroorganismen kan være bundet _ . dertil på en hvilken som helst kendt måde, dvs. de tidligere nævnte.

P.eks. omfatter de polymere, som kan anvendes som bærere for enzymerne, diazoteret p-aminobenzylcellulose, diazoteret p-aminobenzoylcellulose, diazoteret m-aminobenzyloxymethylcellulose, den diazoterede copolymer af p-aminophenylalanin og leucin, diazoteret poly-p-aminostyren, carboxymethylcellulose, aminoethylcellulose, carboxymethyl tværbundet dextran, carboxymethylcelluloseazid, ethylen-maleinsyreanhydrid-copolymere, carboxymethylcelluloseisocyanat, cyanogenbromid-aktiveret cellulose, cyanogenbromid-aktiveret agarose, aminosillanderivaterne af porøst glas, bromacetylcellulose, iodacetylcellulose, dichlor-s-triazinylcellulose, methacrylsyre-methacrylsyre-3-fluor-4,6-dinitro-anilidcopolymere, diethylaminoethylcellulose, triethylaminoethyl-cellulose, diethylaminoethyl tværbundet dextran, acrylamid-methylen-bisacrylamidcopolymer, polyvinylalkohol, nylon, polyurinstof og lignende. Eksempler på andre bærere, som kan anvendes, er trækul, porøst glas, surt ler, kaolinit, aluminiumoxid og lignende. Desuden indbefatter polymere, som kan anvendes som bærere for de katalytisk aktive mikroorganismer, acrylamid-methylenbisacrylamidcopolymer, cellulose-triacetat, carboxymethylcellulose, diethylaminoethylcellulose og lignende. Bindingen af enzymet eller mikroorganismerne til de hydrofile bærere kan gennemføres på en hvilken som helst kendt måde, dvs. de i de førnævnte publikationer beskrevne. Når der f.eks. anvendes en bærer, som indeholder visse grupper, hvormed enzymerne er reaktive, omsættes enzymerne med bæreren ved en temperatur under den temperatur, hvorved enzymerne deaktiveres. Temperaturen, hvorved specifikke enzymer deaktiveres, er velkendt for fagmanden og behøver derfor ikke at blive angivet heri. Det er tilstrækkeligt at sige, at der almindeligvis bør anvendes en temperatur under 75°C, fortrinsvis fra ca. 5°C til ca. 65°C. Omsætningen gennemføres fortrinsvis i nærværelse af puffere til styring af pH-værdien af reaktionsblandingen 7 145745 på et ønsket niveau, idet den særlige pH-værdi dirigeres af det særlige enzym, som bindes, i overensstemmelse med kendte teknikker.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af det immobili-serede katalytisk aktive materiale er ejendommelig ved, at den omfatter trin til blanding af ét katalytisk aktivt enzym, en katalytisk aktiv mikroorganisme, et vand-uopløseligt, hydrofilt, katalytisk aktivt til bærer bundet enzym eller en vand-uopløselig, hydrofil, katalytisk aktiv til bærer bundet mikroorganisme med en vandig opløsning af et sulfateret poly-saccharid, der indeholder mere en 10 vægt% sulfatrest i molekylet, hvorefter den vandige blanding bringes i kontakt med ammoniumion, en metalion med en atomvægt, som er højere end 24, en vand-opløselig organisk amin eller et vandblandbart organisk opløsningsmiddel. Eksempelvis kan det sulfaterede polysaccharid opløses i vand ved en temperatur på ca.

30° til ca. 90°C efterfulgt af en blanding af opløsningen af det sulfaterede polysaccharid med det katalytisk aktive materiale.Alternativt kan det aktive materiale anvendes i form af en opløsning eller suspension. Det katalytisk aktive materiale opløses eller suspenderes i vand, en fysiologisk saltvandsopløsning eller en pufferopløsning, og opløsningen eller suspensionen kan sættes til den vandige opløsning af det sulfaterede polysaccharid. Pufferopløsninger, såsom phosphatpufferopløsninger, carbonatpufferopløsninger og acetatpufferopløsninger, som er indstillet til en pH-værdi på 1 til 13, specielt en pH-værdi på 4 til 10, kan anvendes til opløsning eller suspendering af det aktive materiale.

En passende mængde af det sulfaterede polysaccharid i den vandige blanding er ca.0,05 til ca. 20 vægtprocent, specielt ca. 0,4 til ca.

10 vægtprocent. Til sammenblanding med det sulfaterede polysaccharid er en passende mængde af det katalytisk aktive materiale ca. 1 mg til ca. 50 g, specielt ca. 100 mg til ca. 10 g, pr. g sulfateret polysaccharid. Ved sammenblanding med det katalytisk aktive materiale eller en opløsning eller suspension deraf foretrækkes det at anvende en vandig polysaccharidopløsning, hvis temperatur holdes på ca. 30 til ca. 70°C. Desuden kan der til den ovenfor nævnte vandige blanding om nødvendigt sættes proteiner, såsom gelatine, kollagen, albumin, globulin, zein, fibrinogen, myosin og kasein; polysaccharider, såsom stivelse, cellulose og dextran; gummier, såsom Johannesbrødgummi, gummi arabicum, tragantgummi, guargummi og Psylliiumfrøgummi; alkoholer, såsom glycerol, ethylenglycol og polyethylenglycol; eller syntetiske polymere, såsom polyvinylalkohol og polyvinylpyrrolidon. I realiteten kan den sulfaterede polysaccharidgels evne til at bevare sin form i vandigt medium forøges ved til den vandige blanding at sætte ca. 10 til ca. 250 vægtprocent (baseret på vægten af det sulfaterede polysaccharid)af disse materialer. Også vand-uopløselige,uorganiske 8 145745 porøse materialer kan sættes til den vandige blanding af det sulfa-terede polysaccharid og det katalytisk aktive materiale til styring af den makromolekylære struktur eller porestørrelsen af den sulfatere-de polysaccharid-gelmatrix. Sellait, kiselsand, bentonit og aktiveret trækul kan være passende som de . nævnte vand-uopløselige, uorganiske porøse materialer. Yderligere kan om nødvendigt glutaraldehyd, tanniner og lignende sættes til den vandige blanding af det sulfaterede polysaccharid og det katalytisk aktive materiale før det efterfølgende kontakttrin. Tilsætning af glutaraldehyd og tanniner kan være virkningsfuldt til forøgelse af partikelstørreisen af det enzymatisk aktive materiale, hvorved udsivning af det aktive materiale fra gelen forebygges.

Den vandige blanding af det sulfaterede polysaccharid og det katalytisk aktive materiale bringes dernæst i kontakt med ammoniumion, en metalion med en atomvægt, som er højere end 24, en vandopløselig organisk amin eller et vandblandbart organisk opløsningsmiddel. Som passende eksempler på metalioner, som kan anvendes ifølge opfindelsen, kan nævnes alkalimetalioner tilhørende en gruppe, som ikke er lavere end serie (4) i Mendeleev's Periodiske System (f.eks. kalium-, rubidium-, og cæsiumioner), jordalkalimetalioner (f.eks. magnesium-, calcium-, strontium- og bariumioner), aluminiumioner, blyioner, manganioner, ferri-ioner og ferro-ioner. Desuden kan organiske aminer, som er opløselige i vand, anvendes. Sådanne aminer er f. eks. alkylendiaminer med 1 til 20 carbonatomer (f.eks. methylendiamin, N-methyl-methylendiamin, N,N-dimethyl-methylendiamin, ethylendiamin, trimethylendiamin, tetramethylendiamin, pentamethylendiamin, hexa-methylendiamin, heptamethylendiamin, octamethylendiamin, nonamethylen-diamin, decamethylendiamin, dodecamethylendiamin, eicosamethylen-diamin); phenylendiaminer (f.eks. p-phenylendiamin, m-phenylendiamin, o-phenylendiamin, dimethyl-p-phenylendiamin); hydroxamater, hydra-zider, alkylestere eller amider af basiske aminosyrer (f.eks. lysin-hydroxamat, histidinhydroxamat, tryptophanhydroxamat, lysinhydrazid, histidinhydrazid, lysinmethylester, histidinmethylester, lysinamid); S-aminoalkyl-cysteiner (f.eks. S-aminomethyl-cystein, S-(2-aminoethyl)-cystein); aminoalkylguanidiner (f.eks. agmatin); o-hydroxy-lysin; melanin? aminoalkyl-imidazoler (f.eks. histamin); aminoalkyl-indoler (f.eks. serotonin); guanidinoalkyl-aniliner (f.eks. 2-guanidinomethyl-anilin); aminoalkyl-pyrroler (f.eks. 2-aminomethyl-pyrrol); amino-alkyl-pyrroliner (f.eks. 2-aminomethyl-pyrrolin) ? aminoalkyl-pyrrolir..'. diner (f.eks. 2-aminomethyl-pyrrolidin); aminoalkyl-thiazoler (f.eks.

9 145745 2-aminomethyl-thiazol) ·, aminoalkyl-pyrazoler (f.eks. 3-aminomethyl-pyrazol); aminoalkyl-thiazoliner (f.eks. 5-aminomethyl-thiazolin)} aminoalkyl-thiazolidiner (f.eks. 2-aminomethyl-thiazolidin); amino-alkyl-pyridiner (f.eks. 2-aminomethyl-pyridin); aminoalkyl-piperidi-ner (f.eks. 2-aminomethyl-piperidin); aminoalkyl-pyrimidiner (f.eks.

5-aminomethyl-pyrimidin); aminoalkyl-quinoliner (f.eks. 3-aminomethyl-quinolin); aminoalkyl-morpholiner (f.eks. 4-aminomethyl-morpholin); peptider (f.eks. lysyllysin, histidyllysin, histidylarginin, histidyl-arginyllysin, polylysin); og polyalkyleniminer (f.eks. polyethylen-amin). Som eksempler på passende organiske opløsningsmidler, som kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse, kan nævnes alkanoner med 3 til 5 carbonatomer (f.eks. acetone), alkanoler med 1 til 3 carbonatomer (f.eks. methanol, ethanol, propanol), dioxan, tetrahydrofuran, dimethylformamid, dimethylsulfoxid, ethylenglycol og glycerin.

Behandlingen af den vandige opløsning af det sulfaterede poly-saccharid og det katalytisk aktive materiale med den ovenfor nævnte ammoniumion, metalion eller amin gennemføres fortrinsvis ved en temperatur på -5° til 70°C, specielt ved 0° til 55°C. Det foretrækkes, at fuldføre denne behandling ved at den vandige opløsning sættes til en vandig opløsning af ionen eller aminen. Ionen eller aminen bør anvendes i en koncentration på 0,1 mM til 10 M, især 10 mM til 2 M. Behandlingen af den vandige blanding af det sulfaterede polysaccharid og det katalytisk aktive materiale med det vandopløselige organiske materiale kan' fortrinsvis udføres ved -5° til 70°C, især ved -5° til 30°C. I sammenligning med præparaterne, som er gjort faste med ionen eller aminen, kan det katalytisk aktive materiale, som er immobilise-ret med polysaccharidet i nærværelse af det vandblandbare organiske opløsningsmiddel, udvise et højere niveau af katalytisk aktivitet pr. volumen af præparaterne, fordi gelmatrixen af det sulfaterede polysaccharid dehydreres delvist og sammenpresses med opløsningsmidlet under behandlingen deraf. Når Escherichia coli (en af de aspartase-producerende mikroorganismer) immobiliseres med det sulfaterede polysaccharid i nærværelse af acetone eller ethanol, kan på denne måde immobiliseret Escherichia coli udvise katalytisk aktivitet, som er ca. 2 til 3 gange så høj som aktiviteten af de intakte celler.

Ved en hvilken som helst af de ovenfor nævnte operationer geleres det sulfaterede polysaccharid og gøres fast, hvorved det katalytisk aktive materiale indesluttes i den resulterende gelmatrix af polysaccharidet. Det vil sige, at det ovenfor opnåede immobiliserede 10 U5745 katalytisk aktive materiale omfatter et katalytisk aktivt enzym eller vand-uopløseligt,hydrofilt, katalytisk aktivt, til bærer bundet enzym eller en katalytisk aktiv mikroorganisme eller vand-uopløselig hydrofil, katalytisk aktiv, til bærer bundet mikroorganisme, som er indesluttet i gelmatrixen af det sulfaterede polysaccharid, som indeholder i det mindste én af følgende: ammoniumion, metalion, vandopløselig organisk amin og vandblandbart organisk opløsningsmiddel.

En foretrukket mængde af ionen, aminen eller opløsningsmidlet, som skal indeholdes i gelmatrixen af det sulfaterede polysaccharid, er —14 3 ca. 10 til 10 millimol, især 1 til 10 millimol pr. gram af det sulfaterede polysaccharid, som anvendes. Afhængig af den påtænkte anvendelse kan det immobiliserede katalytisk aktive materiale udformes som partikler, perler, plader, stænger, rør, film og fibre. F.eks. kan det immobiliserede aktive materiale fås i form af partikler eller perler, når det ovenfor nævnte geleringstrin udføres ved, at blandingen af det sulfaterede polysaccharid og det katalytisk aktive materiale dråbevis sættes til den vandige ion- eller amin-opløsning eller det vandblandbare organiske opløsningsmiddel. Når det immobiliserede katalytisk aktive materiale udformes som partikler eller perler, er den størrelse, som er passende til brug ved den enzymatiske reaktion, ca. 0,1 til 20 mm, fortrinsvis 1 til 5 mm, i diameter. Fibrene af det immobiliserede katalytisk aktive materiale kan fås ved indføring af den vandige blanding i.den vandige ion- eller amin-opløsning eller det vandblandbare organiske opløsningsmiddel gennem en lille åbning i en beholder. Det immobiliserede aktive materiale kan fås som film eller rør ved dannelse af et tyndt lag af den vandige opløsning af det sulfaterede polysaccharid og det katalytisk aktive materiale på overfladen af glasplader, formstofplader, metalplader, glasrør eller formstofrør, hvorefter blandingen bringes i kontakt med den vandige ion- eller amin-opløsning eller det vandblandbare organiske opløsningsmiddel på overfladen af pladerne eller rørene. Tykkelsen af den således opnåede membran af det immobiliserede katalytisk aktive materiale kan udformes til bestemmelse af såvel hastigheden for diffusion af substrat hen i nærheden af det katalytisk aktive materiale som hastighed for diffusion af produkterne bort fra reaktionsstedet. Tykkelsen kan være 0,01 til 5 mm, fortrinsvis 0,1 til 1 mm.

Jævnsides hermed kan det ovenfor opnåede immobiliserede katalytisk aktive materiale om nødvendigt behandles yderligere med et gelhærdningsmiddel til forøgelse af hårdheden, elasticiteten og evnen til at bevare formen i vandigt medium. Med betegnelsen "gelhærdningsmiddel" 11 145745 menes, som den anvendes heri, en forbindelse, som gennem ionisk, semi-polar eller kovalent binding kan bindes til eller adsorberes til det immobiliserede katalytisk aktive materiale, hvorved dets hårdhed, elasticitet og/eller dets evne til at beholde form i vandigt medium forøges. Eksempler på sådanne gelhærdningsmidler er alifatiske dialdehyder med 3 til 5 carbonatomer (f.eks. glutaraldehyd, glyoxal), tanniner, dihydroxyacetone, epichlorhydrin, ethylchlorformiat, hexa-methylendiisocyanat, toluendiisocyanat, hexamethylendiisothiocyanat, carbodiimider (f.eks. l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid), Woodward-reagens (dvs. 2-ethyl-5-m-sulfophenyl-isoxazoliumhydroxid), og blandinger af ammoniak eller alkylendiaminer med 1 til 20 carbon-atomer (f.eks. methylendiamin, ethylendiamin, trimethylendiamin, tetramethylendiamin, pentamethylendiamin, hexamethylendiamin, hepta-methylendiamin, octamethylendiamin, nonamethylendiamin, decamethylen-diamin, dodecamethylendiamin, eicosamethylendiamin) og alifatiske dialdehyder med 3 til 5 carbonatomer (f.eks. glutaraldehyd, glyoxal). Behandlingen af det immobiliserede katalytisk aktive materiale med gelhærdningsmidlet kan fortrinsvis udføres ved opløsning af gelhærdningsmidlet i et opløsningsmiddel, hvorefter det immobiliserede materiale nedsænkes deri. Det foretrækkes at udføre behandlingen ved en temperatur på 0° til 50°C, især 5° til 37°C. Det foretrækkes også at anvende en opløsning indeholdende 0,01 til 1 gram (pr. ml af opløsningsmidlet) af gelhærdningsmidlet. Når det immobiliserede katalytisk aktive materiale hærdes ved behandling med et alifatisk dialdehyd (f.eks. glutaraldehyd, glyoxal) i nærværelse af ammoniak eller en alkylendiamin (f.eks. hexamethylendiamin), kan det immobiliserede præparat, som fås i form af en Schiff-base, yderligere behandles med et reduktionsmiddel, såsom natriumborhydrid. Da det immobiliserede katalytisk aktive materiale, som er behandlet med gelhærdningsmidlet, har en forbedret evne til at bevare sin form i vandigt medium, kan det være egnet til brug ved længe varende kontinuerlige enzymatiske reaktioner med substrater. Tilmed kan den katalytiske aktivitet af det immobiliserede aktive materiale, som er behandlet med gelhærdningsmidlet, ofte være mere stabil end aktiviteten af det ikke behandlede materiale. F.eks. udviser aminoacylase, glucoseisomerase, Pseudomonas dacunhae (L-aspartat fi-decarboxylase-producerende mikroorganisme) , Streptococcus faecalis (glucoseisomerase-fremstillende mikroorganisme) og E. coli (aspartase-producerende mikroorganisme), som er immobili-seret ved den førnævnte fremgangsmåde ifølge opfindelsen og yderligere behandlet med gelhærdningsmidlet, den katalytiske aktivitet ca.dobbelt ‘ ' *' - '~ί 'x*" 12 145745 så lang tid, som det immobiliserede materiale, der ikke er behandlet med gelhærdningsmidleb eller mere.

Det immobiliserede katalytisk aktive materiale ifølge den foreliggende opfindelse udviser et højt niveau af katalytisk aktivitet i et langt tidsrum. Enzymerne eller mikroorganismerne eller de til bærer bundne enzymer eller mikroorganismer bevares fast i gelmatrixen af det sulfaterede polysaccharid, hvorimod molekyler af substrater og reaktionsprodukter af mindre størrelse vil være i stand til at bevæge sig frit i det polymere netværk af polysaccharidet. Et enzym- eller mikroorganismepræparat (herefter betegnet som "kontrolprøven"), som er opnået ved simpel afkøling af en vandig blanding af det sulfaterede polysaccharid og enzymerne eller mikroorganismerne, er fortsat uegnet til brug ved de enzymatiske reaktioner med substrater. Når f.eks. en vandig substratopløsning ledes gennem en søjle, som er fyldt med kontrolprøven, deformeres den inden for et kort tidsrum og virker ikke effektivt med hensyn til omdannelse af substrater til omdannelsesprodukter deraf. I sammenligning med denne kontrolprøve har det immobiliserede katalytisk aktive materiale ifølge den foreliggende opfindelse derimod bemærkelsesværdig større evne til at bibeholde sin form i vandigt medium, og selv når det er pakket i en kolonne kan den enzymatiske reaktion med substrater fortsættes i et længere tidsrum uden ompakning eller bevægelse af søjlen. Desuden er polysaccharidgelen af den ovenfor nævnte kontrolprøve ustabil og omdannes let til en "sol" (dvs. en kolloidal opløsning) ved ca. 30^ til 40°C.

Dette bevirker uundgåeligt udsivning af enzymer eller mikroorganismer fra gelmatrixen. I modsætning til kontrolprøven har det immobiliserede katalytisk aktive materiale ifølge opfindelsen imidlertid fortræffelig varmestabilitet. F.eks. omdannes polysaccharidgelen af det katalytisk aktive materiale ifølge opfindelsen ikke til en "sol", selv ved en temperatur på mere end 40°C, og det kan anvendes til enzymatiske reaktioner ved temperaturer så høje som 60° til 70°C uden udsivning af enzymer eller mikroorganismer derfra. Ydermere har polysaccharidgelen af det immobiliserede katalytisk aktive materiale ifølge opfindelsen fortræffelig hårdhed og elasticitet og kan udformes i alle ønskede former, såsom partikler, perler, film, rør og fibre, afhængigt af den påtænkte anvendelse, hvorimod gelen af den ovenfor nævnte kon-, trolprøve er for blød til at kunne udformes som ovenfor. Som det tidligere kort er blevet omtalt, bliver de hidtil kendte, til bærer bundne enzymer eller mikroorganismer sammenpresset og deformeret under brug, og de kan under sådanne betingelser ikke fungere effektivt på normal måde med hensyn til omdannelse af substrater til omdannel- 13 145745 sesprodukter deraf. Sammenpresningen, deformationen og/eller kanaldannelsen af til basrer bundne enzymer eller mikroorganismer reduceres imidlertid reelt, når de indesluttes i gelmatrixen af det sulfa-terede polysaccharid i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse. Dette kan gøre det unødvendigt at ompakke eller bevæge søjlen af det bundne enzym eller den bundne mikroorganisme under de enzymatiske reaktioner med substrater.

Det immobiliserede katalytisk aktive materiale ifølge opfindelsen kan anvendes til et hvilket som helst af et bredt spektrum af enzymatiske reaktioner, som er blevet gennemført ved hjælp af enzymer, levende mikroorganismer eller til bærer bundne enzymer eller mikroorganismer. P.eks. kan aminoacylase eller en aminoacylase-producerende mikroorganisme (f.eks. Aspergillus orizae), som er indesluttet i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, anvendes ved fremstilling af L-aminosyrer ved asymmetrisk hydrolyse af N-acyl-DL-aminosyrer. Det indesluttede aspartase eller den indesluttede aspar-tase-producerende mikroorganisme (f.eks. Escherichia coli) kan i stedet for det tilsvarende intakte enzym eller den tilsvarende intakte mikroorganisme anvendes til den enzymatiske reaktion med fumarsyre og ammoniak til frembringelse af L-asparaginsyre. Når asparaginase eller en asparaginase-producerende mikroorganisme (f.eks. Proteus vulgaris) er immobiliseret i overensstemmelse med opfindelsen, kan det immobiliserede enzym eller den immobiliserede mikroorganisme -anvendes til enzymatisk reaktion med L-asparagin til dekomponering af denne forbindelse til L-asparaginsyre og ammoniak. L-alanin kan fremstilles ud fra L-asparaginsyre ved anvendelse af indesluttet aspara-ginat-3-decarboxylase eller asparaginat-3-decarboxylase-producerende mikroorganisme (f.eks. Pseudomonas dacunhae). Derudover kan L-arginin-deiminase (eller en L-arginindeiminase-producerende mikroorganisme såsom Pseudomonas putidum), L-histidinammoniak-lyase (eller en L-histidinammoniak-lyase-producerende mikroorganisme såsom Achromo-bacter liquidum) og fumarase (eller en fumarase-producerende mikroorganisme såsom Brevibacterium flavum), som er indesluttet i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse, anvendes til enzymatiske reaktioner med L-arginin, L-histidin eller fumarsyre til frembringelse af hhv. L-citrullin, urocansyre eller L-æblesyre. Desuden fremstilles L-isoleucin eller arginin, når en L-isoleucin- eller arginin-producerende mikroorganisme (f.eks. Serratia marcescens, Bacillus subtilis) er immobiliseret i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse ved dyrkning af den immobiliserede mikroorga- 14 145745 nisme i et konventionelt næringsmiddel indeholdende glucose. Fructose kan fremstilles ud fra glucose ved enzymatisk reaktion mellem dette og indesluttet glucoseisomerase eller glucoseisomerase-producerende mikroorganisme (f.eks. Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces griseus). 6-Aminopenicillansyre kan fremstilles ud fra penicilliner ved anvendelse af indesluttet penicillinamidase eller indesluttet penicillinamidase-producerende mikroorganisme (f.eks. Escherichia coli). Jævnsides hermed kan urinstof dekomponeres til ammoniak og carbondioxid ved anvendelse af indesluttet urease eller urease-producerende mikroorganisme (f.eks. Sarcina lutea) ifølge opfindelsen. De reaktionsbetingelser, som er blevet anvendt ved de enzymatiske reaktioner mellem intakte enzymer eller mikroorganismer og deres sædvanlige substrater, kan anvendes ved gennemførelse af den enzymatiske reaktion med det immobiliserede katalytisk aktive materiale ifølge opfindelsen. Ved udførelsen af de enzymatiske reaktioner med det immobiliserede katalytisk aktive materiale foretrækkes det sædvanligvis til reaktionsopløsningerne at sætte en lille mængde (f.eks. 0,1 mM til 10 M, fortrinsvis 10 mM til 5M) ammoniumion, metalion, vandopløselig organisk amin eller vandblandbart organisk opløsningsmiddel som anvendt ved det tidligere nævnte gelatineringstrin. ved anvendelse af det immobiliserede katalytisk aktive materiale til en enzymatisk reaktion med substrater udføres reaktionen således fortrinsvis i nærværelse af ammoniumion, en metalion med en atomvægt, som er højere end 24, en vand-opløselig organisk amin eller et vand-blandbart organisk opløsningsmiddel. Når det inmobiliserede katalytisk aktive materiale ifølge opfindelsen, som er behandlet med gelhærdningsmidlet,anvendes, kan den enzymatiske reaktion med substrater imidlertid udføres uden ion, amin eller opløsningsmiddel. Når f.eks. immobiliseret glucoseisomerasepræparat ifølge opfindelsen, som er forbehandlet med en blanding af glutaraldehyd og hexamethylen-diamin anvendes til enzymatisk reaktion med glucose, kan den enzymatiske reaktion fortsættes i et tidsrum på 120 dage eller mere i fravær af ion, amin og opløsningsmiddel. Desuden kan reaktionen af det immobiliserede katalytisk aktive materiale med substrater udføres på en hvilken som helst konventionel måde. F.eks. opløses substratet i vand. Det immobiliserede katalytisk aktive materiale suspenderes i den vandige substratopløsning, og suspensionen omrøres. Da det immobiliserede rede katalytisk aktive materiale er uopløseligt i vand, kan det efter reaktionen let genvindes ved filtrering eller centrifugering, og reaktionsprodukterne udvindes fra filtratet eller den ovenstående opløsning. Alternativt kan de ovenfor nævnte enzymatiske reaktioner gennemføres ved en søjlemetode. Søjlemetoden muliggør, at reaktionen kan udføres på en fortløbende måde. F.eks. pakkes det immobiliserede 15 145745 katalytisk aktive materiale i en søjle, og en vandig substratopløsning ledes gennem søjlen med en passende strømningshastighed. En vandig opløsning indeholdende reaktionsproduktet fås som udgangsstrøm. Ved gennemførelse af den enzymatiske reaktion afhænger hastigheden for omdannelse af substraterne til deres omdannelsesprodukter hovedsagelig af den katalytiske aktivitet af det immobiliserede aktive materiale, af temperaturen og af reaktionstiden. Når det drejer sig om søjlemetoden, kan de reaktionsbetingelser, som er optimale for fuldstændig omdannelse af substrater til deres omdannelsesprodukter, let fås ved indstilling af strømningshastigheden af substratopløsningerne.

Den foreliggende opfindelse beskrives i det efterfølgende nærmere ved eksempler på foretrukne udførelsesformer.

Eksempel 1 (1) 4 mg aminoacylase (20 enheder/mg) hidrørende fra Aspergillus oryzae opløses i 5 ml vand. 20 ml af en vandig 4,4% carragenan-(GENU GEL Type WG") opløsning, som på forhånd er opvarmet til 45°C, sættes til aminoacylase-opløsningen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchloridopløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig 2% kaliumchloridopløsning. Der fås 18,1 g (våd form) af et immobiliseret aminoacylase-præparat. Præparatet udviser en amino-acylase-aktivitet på 2,1 enheder/g.

[En aminoacylase-enhed defineres som den enzymatiske aktivitet, som frembringer et mikromol L-methionin ved reaktion med N-acetyl-DL- methionin ved 37°C og en pH-værdi på 7,0 i en time. Reaktionen med N-acetyl-DL-methionin gennemføres ved, at 15 g af det immobiliserede præparat sættes til 40 ml af en vandig 0,6 M N-acetyl-DL-methionin- opløsning (indstillet til en pH-værdi på 7,0 med kaliumhydroxid) inde--4 holdende 5 x 10 M koboltochlorid, hvorefter blandingen rystes ved 37°C i en time. Mængden af fremstillet L-methionin analyseres kolori-metrisk ved ninhydrinmetoden.] (2) 15 g af det under (1) fremstillede immobiliserede aminoacylase-præparat pakkes i en søjle (1,6 cm i diameter og med en højde på 14 cm). En vandig 0,6 M N-acetyl-DL-methionin-opløsning (indstillet til en pH-værdi på 7,0 med kaliumhydroxid) indeholdende 5 x 10-4 M kobolto-chlorid ledes gennem søjlen ved 37°C og med en strømningshastighed på 10 ml/time. Den enzymatiske aktivitet af det immobiliserede amino-acylase-præparat analyseres med mellemrum. Resultaterne vises i Tabel I. Halveringstiden for den enzymatiske aktivitet af det immobiliserede aminoacylase-præparat er ca. 60 dage. Som det fremgår af disse data, udviser det immobiliserede aminoacylase-præparat høj enzymatisk aktivi- 16 145745 tet i et langt tidsrum, når det anvendes til den kontinuerlige enzymatiske reaktion.

Til sammenligning fremstilles immobiliserede præparater ved kovalent binding af aminoacylase til iodacetyl-cellulose i overensstemmelse med den i "Fermentation Technology Today", side 383 -389 (1972) beskrevne fremgangsmåde eller ved indeslutning af aminoacylase i et polyacrylamidgitter i overensstemmelse med den i ovennævnte reference beskrevne fremgangsmåde.Den enzymatiske aktivitet af disse immobiliserede præparater formindskes til 50% af begyndelsesaktiviteten allerede efter 5 eller 30 dages kontinuerlig enzymatisk reaktion som nævnt ovenfor.

TABEL I

Driftsperiode Aminoacylase- Relativ enzymatisk (dage) aktivitet aktivitet* (%) (enheder) 1 32 100 2 30 94 5 29 91 7 29 91 9 29 91 * Den relative enzymatiske aktivitet beregnes ved hjælp af følgende formel: >

Aktivitet af det immobiliserede enzym- eller mikroorganisme-præparat bestemt efter det i

tabellen specificerede tidsrum_ χ 10Q

Begyndelsesaktivitet af det immobiliserede enzym- eller mikroorganisme-præparat

Eksempel 2 5 mg aminoacylase (20 enheder/mg) hidrørende fra Aspergillus

oryzae opløses i 5 ml vand. 20 ml af en vandig 4,4% carragenan ("GENO

GEL Type WG") opløsning, som på forhånd er opvarmet til 45°C, sættes til aminoacylase-opløsningen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 0,2 M N-acetyl-DL-methionin-opløsning (indstillet til en pH- -4 værdi på 7,0 med kaliumhydroxid) indeholdende 5 x 10 M kobolto-chlorid. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles 17 145745 ved filtrering. Der opnås 19/1 g (våd form) af et immobiliseret aminoacylase-præparat. Det udviser en aminoacylase-aktivitet på 4,7 enheder/g.

Eksempel 3 5 mg aminoacylase (20 enheder/mg) hidrørende fra Aspergillus oryzae opløses i 5 ml vand. 20 ml af en vandig 4,4% carragenan- (GENU GEL Type WG") opløsning, som på forhånd er opvarmet til 45°C, sættes til aminoacylase-opløsningen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 0,2 M N-acetyl-DL-tryptophan-opløsning (indstillet til -4 en pH-værdi på 7,0 med kaliumhydroxid) indeholdende 5 x 10 M kobolto-chlorid. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. Der opnås 18,6 g (våd form) af et immobiliseret aminoacylase-præparat. Det udviser en aminoacylase-aktivitet på 3,6 enheder/ g·

Eksempel 4

Brevibacterium ammoniagenes IAM (Institute of Applied Microbiology, Tokyo University, Japan) 1645, inokuleres i 500 ml af et vandigt medium (pH 7,0) indeholdende 2,0% glucose, 0,5% fumarsyre, 0,2% urinstof, 0,2% monokaliumphosphat, 0,05% magnesiumsulfat-hepta-hydrat og 1,0% majsstøbevæske. Mediet dyrkes ved 30°C i 24 timer under rystning. Mikroorganismecellerne opsamles dernæst ved centrifugering.

10 g af mikroorganismecellerne suspenderes i 100 ml af en 0,01 M phosphatpufferopløsning. Mikroorganismecellerne i suspensionen sprænges med et apparat af typen "Sonicator" ved 9 Kc i 10 minutter og centrifugeres dernæst. Ammoniumsulfat sættes gradvis til den ovenstående væske, og bundfald, som udsaltes fra delvis mættet ammoniumsulfat-opløsning (40 - 70% mætning) opsamles ved centrifugering. Bundfaldene opløses i 15 ml af en 0,01 M phosphatpufferopløsning (pH 7,0), og opløsningen dialyseres natten over mod en 0,01 M phosphatpufferopløsning. Den dialyserede opløsning anvendes som fumarase-opløsning.

2 ml af en 0,01 M phosphatpufferopløsning sættes til 1 ml af fuma-rase-opløsningen. 12 ml af en vandig 4,2% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, som på forhånd er opvarmet til 40°C, sættes til fumarase-opløsningen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. Der fås 15 g (våd form) af et immobiliseret fumarase-præparat. Det udviser en fumarase-aktivitet på 111,6 μ mol/time/g. Aktivitetsudbytte [= j(enzymatisk aktivitet af 18 145745 det ud fra 1 gram af det intakte enzym eller de intakte mikroorganismeceller opnåede immobiliserede præparat) : (enzymatisk aktivitet af 1 gram af det intakte enzym eller de intakte mikroorganismeceller )| x 100] = 62%.

[Fumarase-aktiviteten angives i fom af millimol L-æblesyre, som fremstilles ved reaktion med kaliumfumarat. Reaktionen med kalium-fumarat gennemføres ved, at 15 g af det immobiliserede præparat sættes til 30 ml af en 0,2 M kaliumfumarat-0,01 M kaliumphosphatpufferopløsning, hvorefter blandingen rystes ved 37°C i 1 time. Efter reaktionen sættes saltsyre til blandingen efterfulgt af filtrering til fjernelse af bundfald af fumarsyre. Mængden af L-æblesyre (dvs. L-æble-syre indeholdt i filtratet) analyseres dernæst kolorimetrisk ved anvendelse af 2,7-naphthalendiol som farvereagens.]

Eksempel 5

Escherichia coli ATCC 11303 inokuleres i 500 ml af et vandigt medium (pH 7,0) indeholdende 3% ammoniumfumarat, 0,2% dikalium-phosphat, 0,05% magnesiumsulfat-heptahydrat, 4% majsstøbevæske og 0,05% calciumcarbonat. Mediet dyrkes ved 37°C i 24 timer under rystning. Dernæst opsamles mikroorganismecellerne ved centrifugering.

8 g af mikroorganismecellerne suspenderes i 8 ml vand. Mikroorganismecellerne i suspensionen sprænges ved hjælp af et apparat af typen "Sonicator" ved 9 Kc i 15 minutter, hvorefter der centrifugeres. Ammoniumsulfat sættes gradvis til den ovenstående væske, og bundfaldet, som udsaltes fra delvis mættet ammoniumsulfat-opløsning (30 - 50% mætning) opsamles ved centrifugering. Bundfaldet opløses i 5 ml vand, og opløsningen dialyseres natten over mod vand. Den dialyserede opløsning anvendes som aspartase-opløsning.

2 ml af den ovenfor opnåede aspartase-opløsning blandes med 12 ml af en vandig 3,2% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning ved 37°C. Blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning.

De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diamter) opsamles ved filtrering. Der opnås 10,6 g (våd form) af et immobiliseret aspartase-præparat. Det udviser en aspartase-aktivitet på 2868 μ mol/time/g. Aktivitetsudbytte: 46%.

[Aspartase-aktiviteten angives i form af mikromol L-asparagin-syre, som er fremstillet ved reaktion med ammoniumfumarat ved 37°C og en pH-værdi på 8,5. Reaktionen med ammoniumfumarat gennemføres ved, at 2 g af det immobiliserede aspartase-præparat sættes til 30 ml af en vandig 1 M ammoniumfumarat-opløsning (pH 8,5) indeholdende 1 mM

19 145765 magnesiumchlorid efterfulgt af rystning af blandingen ved 37°C i 1 time. Den fremstillede L-asparaginsyremængde bioanalyseres under anvendelse af Leuconostoc mesenterioides P-60 (J. Biol. Chem., 172, 15 (1948)].

Eksempel 6 10 mg glucoseisomerase (223 enheder/mg) hidrørende fra Streptomy-ces phaeochromogenus opløses i 5 ml vand. 20 ml af en vandig 4,4% carragenan- · ("GENU GEL Type WG") opløsning, som på forhånd er opvarmet til 45°C, sættes til glucoseisomerase-opløsningen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 23,0 g (våd form) af et immobiliseret glucoseisomerase-præparat. Det udviser en glucoseisomerase-aktivitet på 13,6 enheder/g.

[En glucoseisomerase-enhed defineres som den enzymatiske aktivitet, som frembringer et mikromol fructose ved reaktion med glucose ved 37°C og en pH-værdi på 7,0 i et minut. Reaktionen med glucose gennemføres ved, at 2 g af det immobiliserede glucoseisomerase-præparat sættes til 20 ml af en vandig 0,1 M glucoseopløsning (pH 7,0) indeholdende 0,01 M magnesiumsulfat, 1 mM koboltochlorid og 0,1 M natriumsulfit efterfulgt af rystning af blandingen ved 37°C i 1 time. Mængden af fremstillet fructose måles ved cystein-carbazol-svovlsyre-metoden.]

Eksempel 7 20 mg aminoacylase (20 enheder/mg) hidrørende fra Aspergillus oryzae opløses i 4 ml vand. 16 ml af en vandig 4,4% carragenan-("GENU GEL Type WG") opløsning, som på forhånd er opvarmet til 45°C, sættes til aminoacylase-opløsningen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 1 M ammoniumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 18,8 g (våd form) af et immobiliseret aminoacylase-præparat. Det udviser en aminoacylase-aktivitet på 66 enheder/g.

Eksempel 8

Pseudomonas dacunhae IAM 1152 inokuleres i 500 ml af et vandigt medium (pH 7,0) indeholdende 0,5% ammoniumfumarat, 1,0% natriumfumarat, 0,55% majsstøbevæske, 1,8% pepton, 0,05% monokaliumphosphat og 0,01% U5745 20 magnesiumsulfat-heptahydrat. Mediet dyrkes ved 30°C i 24 timer under rystning. Dernæst opsamles mikroorganismecellerne ved centrifugering.

10 g af mikroorganismecellerne suspenderes i 100 ml af en 0,01 M phos-phatpufferopløsning. Mikroorganismecellerne i suspensionen sprænges med et apparat af typen "Sonicator" ved 9 Kc i 10 minutter og centrifugeres dernæst. Den således opnåede ovenstående væske anvendes som asparaginat-Ø-decarboxylase-opløsning.

1 ml af den ovenfor opnåede asparaginat-p-decarboxylase-opløsning behandles på samme måde som den i Eksempel 4 beskrevne. Der opnås 12 g (våd form) af et immobiliseret asparaginat-p-decarboxylase-præparat som gelpartikler med en diameter på ca. 3 mm. Det udviser en aspara-ginat-p~decarboxylase-aktivitet på 36 μ mol/time/g. Aktivitetsudbytte: 57%.

[Asparaginat-p-decarboxylase-aktivitet angives i form af mikro- mol L-alanin, som fremstilles ved reaktion med 0,2 M L-asparaginsyre.

Reaktionen med L-asparaginsyre gennemføres ved, at 12 g af det immo- biliserede præparat sættes til 30 ml af en vandig 0,2 M ammonium- -4 L-asparaginat-opløsning (pH 5,5) indeholdende 10 M pyridoxalphosphat efterfulgt af rystning af blandingen ved 37°C i 1 time. Mængden af fremstillet L-alanin bioanalyseres under anvendelse af Leuconostoc mesenterioides P-60.]

Eksempel 9 2 ml af en asparaginat-opløsning opnået på samme måde som den i Eksempel 5 beskrevne blandes med 12 ml af en vandig 3,2% carragenan-("GENU GEL Type WG") opløsning ved 37°C. Blandingen sættes dråbevis til en vandig 1 M ammoniumfumarat-opløsning (pH 8,5). De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. Der opnås 9,4 g (våd form) af et immobiliseret aspartasepræparat. Det udviser en aspartase-aktivitet på 1966 μ mol/time/g. Aktivitetsudbytte: 52,4%.

Eksempel 10 100 mg aminoacylase (20 enheder/mg) hidrørende fra Aspergillus oryzae opløses i 4 ml vand. 16 ml af en vandig 4,4% carragenan-("GENU GEL Type WG") opløsning, som på forhånd er opvarmet til 40°C, sættes til aminoacylase-opløsningen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 0,5 M hexamethylendiamin-opløsning (indstillet til en pH-værdi på 7,0 med saltsyre). De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig 21 145745 1% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 18,9 g (våd form) af et immo-biliseret aminoacylase-præparat. Det udviser en aminoacylase-aktivitet på 11,9 enheder/g.

Eksempel 11 100 mg aminoacylase (20 enheder/mg) hidrørende fra Aspergillus oryzae opløses i 4 ml vand. 16 ml af en vandig 4,4% carragenan-("GENU GEL Type WG") opløsning, som på forhånd er opvarmet til 40°C, sættes til aminoacylase-opløsningen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 0,5 M nonamethylendiamin-opløsning (indstillet til en pH-værdi på 7,0 med saltsyre). De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig 1% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 19,1 g (våd form) af et immo-biliseret aminoacylase-præparat, som udviser en aminoacylase-aktivitet på 13,5 enheder/g.

Eksempel 12 200 mg aminoacylase (20 enheder/mg) hidrørende fra Aspergillus oryzae opløses i 4 ml vand. 16 ml af en vandig 4,4% carragenan-("GENU GEL TYPE WG") opløsning indeholdende 5% gelatine (carragenan-opløsningen er på forhånd opvarmet til 45°C) sættes til aminoacylase-opløsningen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 19,4 g (våd form) af et immobiliseret aminoacylase-præparat, som udviser en aminoacylase-aktivitet på 37,5 enheder/g.

Eksempel 13 (1) 100 mg aminoacylase (20 enheder/mg) hidrørende fra Aspergillus oryzae opløses i 50 ml vand. 1 g (tør form) diethylaminoethyl tvær-bundet dextran ("DEAE-Sephadex A-25") sættes til opløsningen, og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 1 time. Den således opnåede til "DEAE-Sephadex" bundne aminoacylase opsamles ved filtrering. Den til "DEAE-Sephadex" bundne aminoacylase suspenderes i 5 ml vand. 20 ml af en vandig 4,4% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, som på forhånd er opvarmet til 40°C, sættes til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 0,1 M kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering.

22 14S745

Der opnås 29,8 g (våd form) af et immobiliseret aminoacylase-præparat, som udviser en aminoacylase-aktivitet på 32,9 enheder/g.

(2) 14,9 g af det under (1) opnåede immobiliserede aminoacylase- præparat pakkes i en søjle (1,6 cm i diameter og med en højde på 14 cm). En vandig 0,6 M N-acetyl-DL-methionin-opløsning (indstillet -4 til en pH-værdi på 7,0 med kaliumhydroxid) indeholdende 5 x 10 M koboltochlorid ledes gennem søjlen ved 37°C og med en strømningshastighed på 10 ml/time. Den enzymatiske aktivitet af det immobilisere-de aminoacylase-præparat analyseres med mellemrum. Resultaterne vises 'i Tabel II. Halveringstiden for den enzymatiske aktivitet af det immobiliserede aminoacylase-præparat er ca. 120 dage. Som det fremgår af disse data, udviser det immobiliserede aminoacylase-præparat høj enzymatisk aktivitet i et langt tidsrum, når det anvendes til den kontinuerlige enzymatiske reaktion.

TABEL II

Driftsperiode Aminoacylase- Relativ enzymatisk (dage) aktivitet aktivitet * (%) (enheder) 0 25 100 5 26 100 10 24 96 15 25 100 20 25 100 * Den relative enzymatiske aktivitet beregnes ved hjælp af formlen, som er vist i fodnoten til Tabel I.

Eksempel 14 20 mg aminoacylase (20 enheder/mg) hidrørende fra Aspergillus oryzae opløses i 1 ml vand, og 4 ml af en vandig 4% garvesyre-opløsning (indstillet til en pH-værdi på 7,0 med natriumhydroxid) sættes dertil. 20 ml af en vandig 4,4% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, som på forhånd er opvarmet til 45°C, sættes til amino-acylase-garvesyre-opløsningen. Blandingen sættes dernæst dråbevis til en vandig 0,1 M kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes med en vandig 23 U5745 0/1 M kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 24,0 g (våd form) af et immobiliseret aminoacylase-præparat, som udviser en aminoacylase-aktivitet på 0,6 enheder/g.

Eksempel 15 200 mg aminoacylase (20 enheder/mg) hidrørende fra Aspergillus oryzae opløses i 4 ml vand. 16 ml af en vandig 4,4% carragenan-("GENU GEL Type WG") opløsning indeholdende 5% gelatine (carragenan-opløsningen er på forhånd blevet opvarmet til 45°C) sættes til amino-acylase-opløsningen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 1 M ammoniumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. De således opnåede gelpartikler sættes til en blanding af 20 ml af en vandig 1 M ammoniumchlorid-opløsning og 1,6 ml af en vandig 25% glutaraldehyd-opløsning, og blandingen omrøres ved 4°C i 30 minutter. Så opsamles gelpartiklerne ved filtrering og vaskes med en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 18,6 g (våd form) af et immobiliseret aminoacylase-præparat, som udviser en aminoacylase-aktivitet på 21,5 enheder/g.

Eksempel 16 10 mg glucoseisomerase (223 enheder/mg) hidrørende fra Strepto-myces phaeochromogenus opløses i 1 ml vand, og 4 ml af en vandig garvesyreopløsning (indstillet til en pH-værdi på 7,0 med natriumhydroxid) sættes dertil. Glucoseisomerase-opløsningen tillades at henstå ved 45°C i 5 minutter, hvorefter 20 ml af en vandig 4,4% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, som på forhånd er opvarmet til 45°C, tilsættes. Blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes med en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 25,4 g (våd form) af et immobiliseret glucoseisomerase-præparat, som udviser en glucoseisomerase-aktivitet på 1,5 enheder/g.

Eksempel 17 10 mg glucoseisomerase (223 enheder/mg) hidrørende fra Strepto-myces phaeochromogenus opløses i 1 ml vand. Til glucoseisomerase-opløsningen sættes 4 ml af en vandig daddelblomme-tanninopløsning (tannin-indhold: 2,5 mg/ml). Glucoseisomerase-daddelblomme-tannin-opløsningen tillades dernæst at henstå ved 45°C i 5 minutter, og en 24 145745 vandig 4,4% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, som på forhånd er opvarmet til 45°C, tilsættes. Blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes med en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 23,2 g (våd form) af et immobili-seret glucoseisomerase-præparat, som udviser en glucoseisomerase-aktivitet på 5,2 enheder/g.

Eksempel 18 10 mg vegetabilsk proteolytisk enzym "papain" (3,1 ymol/minut/mg protein) opløses i 6 ml af en 0,02 M citrat-phosphat-puffer-opløsning (pH 6,2) indeholdende 0,005 M cystein og 0,01 M ethylendiamintetra-eddikesyre. 25 ml af en vandig 4% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, der på forhånd er opvarmet til 40°C sættes til papain-opløsningen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. De dannede gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. Der opnås 30 g (våd form) af et immobiliseret papainpræparat. Aktivitetsudbytte: 57%.

[En enhed papain-aktivitet defineres som den enzymatiske aktivitet, som dekomponerer et ymol α-benzoyl-arginin-ethylester ved omsætning med argininesteren ved pH 6,2 i et minut. Omsætningen med a-benzoyl-arginin-ethylester udføres ved tilsætning af 5 g af det immobilisere-de præparat til 10 ml af en 0,02 M citrat-phosphat-puffer-opløsning (pH 6,2) indeholdende 0,1 M benzoyl-arginin-ethylester og rystning af blandingen ved 37°C i 10 minutter. Den tilbageblevne mængde af benzyl-argininesteren måles i overensstemmelse med J.R. Kimmel et al's metode, der er beskrevet i J. Biol. Chem., 207, 515 (1954)].

Eksempel 19

Escherichia coli ATCC 9637 inokuleres i 1000 ml af et vandigt medium (pH 7,0) indeholdende 0,2% phenoxyeddikesyre, 2% pepton, 0,5% gærekstrakt, 0,5% natrium L-glutamat, 0,3% monokaliumphosphat, 0,7% dikaliumphosphat, 0,02% magnesiumsulfat-heptahydrat og 0,02% ferri-chlorid-hexahydrat. De således opnåede mikroorganismeceller suspenderes i 13 ml vandig fysiologisk saltvandsopløsning. 52 ml af en vandig 3,2% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, som på forhånd er opvarmet til 40°C sættes til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca.

3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. Der opnås 60,7 g (våd form) immobiliseret Escherichia coli præparat. Det udviser en penicillin- 25 H5745 amidaseaktivitet på 1114 ymol/time/g. Aktivitetsudbytte: 90%. [Penicillinamidase-aktivitet analyseres ifølge J.Bomstein's metode, der er beskrevet i "Analytical Chemistry", Bind 37, side 576 - 578 (1965)].

Eksempel 20 1) Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 inokuleres i 100 ml vandigt medium (pH 7,0) indeholdende de samme ingredienser som beskrevet i Eksempel 4. Mediet dyrkes ved 30°C i 24 timer under omrystning. Mikroorganismecellerne opsamles dernæst ved centrifugering. De således opnåede mikroorganismeceller suspenderes i 4 ml vandig fysiologisk saltvandsopløsning. 16 ml vandig 2,5% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, der på forhånd er opvarmet til 37°C sættes til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kalium-chlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. Der opnås 20 g (våd form) immobiliseret Brevibacterium ammoniagenes præparat.

10 g af det ovenfor opnåede immobiliserede Brevibacterium ammoniagenes præparat sættes til 30 ml vandig 1 M kaliumfumarat-opløsning (pH 7,0) indeholdende 0,3% oksegaldeekstrakt. Blandingen tillades at henstå ved 37°C i 20 timer. Efter denne behandling vaskes det immobiliserede Brevibacterium ammoniagenes præparat med en vandig 1% kaliumchlorid-opløsning. Det således opnåede immobiliserede præparat udviser en fumaraseaktivitet på 5790 ymol/time/g mikroorganismeceller. Aktivitetsudbytte 60%.

2) 20 g af det immobiliserede Brevibacterium ammoniagenes præparat opnået under 1) pakkes i en søjle (1,6 cm i diameter og 12 cm høj). En vandig 1 M kaliumfumarat-opløsning (pH 7,0) sendes gennem søjlen ved 37°C med en strømningshastighed som specificeret i Tabel III. Mængden af L-æblesyre i afgangsstrømmen analyseres på samme måde som beskrevet i Eksempel 4, og den procentvise omdannelse af kalium-fumarat til L-æblesyre beregnes derudfra. Resultaterne vises i Tabel III.

26 145745

TABEL III

Strømningshastighed Omdannelse (%) (ml/time) til L-æblesyre 3,5 82 6 80 9 70 12 62 20 40

_45 _23 I

Eksempel 21 1) Pseudomonas putidum ATCC 4359 inokuleres i 100 ml vandigt medium (pH 6,2) indeholdende 1% glucose, 1% gærekstrakt, 0,5% poly-pepton, 0,5% L-arginin,hydrochlorid, 0,1% ammoniumchlorid, 0,1% dikali-umphosphat, 0,05% magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,01% mangansulfat-tetra-hydrat, 0,0005% ferrosulfat-heptahydrat og 0,02% natrivunchlorid.

Mediet dyrkes ved 30°C i 24 timer under omrystning. Mikroorganismecellerne opsamles ved centrifugering De således opnåede Mikroorganisme-celler behandles på samme måde som beskrevet i Eksempel 20. Der opnås 20 g (våd form) immobiliseret Pseudomonas putidum præparat. Det udviser en L-arginin-deiminase-aktivitet på 1700 ymol/time/g mikroorganismeceller. Aktivitetsudbytte 64%.

[L-arginin-deiminase angives i mikromol L-citrullin, som fremstilles ved omsætning med L-arginin. Omsætningen med L-arginin udføres ved tilsætning af 10 g af det immobiliserede præparat til en vandig 0,5 M L-arginin,hydrochlorid-opløsning (pH 6,0) indeholdende 0,01% triethanolaminlaurylsulfat og dernæst omrystning af blandingen ved 37°C i en time. Mængden af fremstillet L-citrullin analyseres kolori-metrisk ved anvendelse af diacetylmonooxim som farvereagens.] 2) 20 g af det immobiliserede Pseudomonas putidum præparat opnået under punkt 1) pakkes i en søjle (1,6 cm i diameter og 12 cm høj).

En vandig 0,5 M L-arginin,hydrochlorid-opløsning (pH 6,0) sendes gennem søjlen ved 37°C med en strømningshastighed på 4,5 eller 12 ml/time.

27 145745 Mængden af L-citrullin i afgangsstrømmen analyseres på samme måde som beskrevet under punkt 1), og den procentvise omdannelse af L-arginin til L-citrullin beregnes derudfra. Resultaterne er vist i Tabel IV.

TABEL IV

Driftsperiode Omdannelse (%) af L-arginin til (dage) _L-citrullin_ 4,5 ml/time 12 ml/time 1 100 55 3 100 55 6 100 54 8 100 55 10 100 54 13 100 54 15 100 53 17 100 51 20 100 50 22 100 50 24 100 47 27 100 48 29 100 48 31 100 46

Halveringstiden for den enzymatiske aktivitet af det immobili-serede Pseudomonas putidum præparat er ca. 160 dage.

Eksempel 22

Mikroorganismeceller af Escherichia coli ATCC 11303 opnået på samme måde som beskrevet i Eksempel 5 lyofiliseres. 1,1 g af de lyofili-serede mikroorganismeceller suspenderes i 8 ml vandig fysiologisk saltvandsopløsning. 32 ml vandig 3,2% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, der på forhånd er opvarmet til 40°C, sættes til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. Derved opnås 32 g (våd form) immobiliseret Escherichia coli præparat. Det udviser en aspartase-aktivitet på 13.800 ymol/tirne.

28 145745

Aktivitetsudbytte: 13%.

Eksempel 23

Mikroorganisraeceller af Escherichia coli ATCC 11303 opnået som beskrevet i Eksempel 5 behandles med acetone til dannelse af acetonepulver. 576 g af dette acetonepulver suspenderes i 6 ml vandig fysiologisk saltvandsopløsning. 24 ml vandig 3,2% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, der på forhånd er opvarmet til 40°C, sættes til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kalium-chlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. Der opnås 26,8 g (våd fora) immobiliseret Escherichia coli præparat. Det udviser en aspartase-aktivitet på 1118 ymol/time/g. Aktivitetsudbytte: 39%.

Eksempel 24

Achromobacter liquidum IAM 1667 inokuleres i 100 ml vandigt medium (7,0) indeholdende 1% glucose, 0,2% dikaliumphosphat, 0,05% monokaliumphosphat, 0,1% ammoniumchlorid, 0,02% magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,1% gærekstrakt og 0,02% L-histidin,hydrochlorid.

Mediet dyrkes ved 30°C i 24 timer under omrystning. Mikroorganismecellerne opsamles derefter ved centrifugeringJ)e således opnåede mikroorganismeceller suspenderes i 4ml vandig fysiologisk saltvandsopløsning. Suspensionen varmes ved 70°C i 30 minutter, og derefter tilsættes 16 ml vandig 2,5% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, der på forhånd er opvarmet til 37°C. Blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca.

3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. Der opnås 20 g (våd fora) immobiliseret Achromobacter liquidum præparat. Det udviser en L-histidin-ammoniaklyase-aktivitet på 434 ymol/time/g mikroorganismeceller. Aktivitetsudbytte 62%.

[L-histidin-ammoniaklyase-aktivitet angives i mikromol urocansyre fremstillet ved omsætning med L-histidin. Omsætningen med L-histidin udføres ved tilsætning af 10 g af det immobiliserede præparat til 30 ml vandig 0,25 M L-histidin-opløsning (pH 9,0) og derefter omrystning af blandingen ved 37°C i en time. Mængden af fremstillet urocansyre analyseres kolorimetrisk ved 277 nm (molekylær ekstinktionskoefficients 1,88 X 10 ^ (pH 7,4))].

29 145745

Eksempel 25

Micrococcus ureae IAM 1010 inokuleres i 400 ml vandigt medium (pH 7,0) indeholdende de samme ingredienser som beskrevet i Eksempel 24. Mediet dyrkes ved 30°C i 24 timer under omrystning. Dernæst opsamles mikroorganismecellerne ved centrifugering. Disse celler behandles på samme måde som beskrevet i Eksempel 20. Derved opnås 20 g (våd form) immobiliseret Micrococcus ureae præparat som gelpartikler (ca. 3 mm i diameter). Det udviser en L-histidin-ammoniak-lyase-aktivitet på 299 μιηοΐ/time/g mikroorganismeceller. Aktivitetsudbytte 59%.

Eksempel 26

Streptomyces griseus IFO (Institute for Fermentation, Osaka,

Japan) 3430 inokuleres i 200 ml vandigt medium (pH 7,0) indehpldende 1% pepton, 0,25% gærekstrakt, 0,5% kødekstrakt, 1% D-xylose, 0,05% magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,024% koboltochlorid-hexahydrat og 0,5% natriumchlorid. Mediet dyrkes ved 30°C i 48 timer under omrystning. Dernæst opsamles mikroorganismecellerne ved centrifugering. De således opnåede mikroorganismeceller suspenderes i 20 ml vandig fysiologisk saltvandsopløsning, og der tilsættes 80 ml vandig 3,2% carragenan-("GENU GEL Type WG") opløsning, der på forhånd er opvarmet til 40°C, til suspensionen under opvarmning (i vandbad, badtemperatur 40°C). Blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning.

De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. Der opnås 83 g (våd form) immobiliseret Streptomyces griseus præparat. Det udviser en glucose-isomerase-aktivitet på 9,2 pmol/ time/g. Aktivitetsudbytte 31%.

Eksempel 27 2,5 g varmebehandlede mikroorganismeceller (glucose-isomerase-aktivitet: 7740 enheder/g) af Streptomyces phaeochromogenus suspenderes i 5 ml vand. Der sættes 20 ml vandig 3,1% carragenan-("GENU GEL Type WG") opløsning, der på forhånd er opvarmet til 40°C, til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 1% kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig 1% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 22,7 g (våd form) immobiliseret Streptomyces phaeochromogenus præparat. Det udviser en glucose-isomerase-aktivitet på 443 enheder/g.

Eksempel 28 30 145745 1) Serratia marcescens ATCC 21740 (isoleucinhydroxamat- og α-aminosmørsyre-resistent mutant) inokuleres i 100 ml vandigt medium (pH 7,0) indeholdende 0,5% glucose, 1,25% gærekstrakt, 1,0% pepton, 0,5% kødekstrakt og 0,5% natriumchlorid. Mediet dyrkes ved 30°C i 24 timer under omrystning. Dernæst opsamles mikroorganismecellerne ved centrifugering. De således opnåede mikroorganismeceller suspenderes i en vandig fysiologisk saltvandsopløsning. 16 ml vandig 3,2% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, der på forhånd er opvarmet til 37°C, sættes til 4 ml af suspensionen (indhold af mikroorganismeceller: 2 g/4 ml), og blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. Der opnås 20 g (våd form) immobilise-ret Serratia marcescens præparat. Det udviser en L-isoleucin-produkti-vitet på 8,6 ymol/time/g mikroorganismeceller.

[L-isoleucin-produktiviteten beregnes ved tilsætning af 5 g af det immobiliserede præparat til 20 ml vandig opløsning (pH 7,5) indeholdende 5% glucose, 1% urinstof, 2% DL-threonin, 2% dikaliumphosphat og 0,05% magnesiumsulfat-heptahydrat og dereftér omrystning af blandingen ved 30°C i 6 timer. Mængden af fremstillet L-isoleucin bio-analyseres under anvendelse af Leuconostoc mesenterioides P-60(ATCC 9135).] 2) 10 g af det under punkt 1) opnåede immobiliserede Serratia marcescens præparat pakkes i en søjle. 50 ml vandig opløsning (pH 7,5) indeholdende 5% glucose, 1% urinstof, 2% DL-threonin, 2% dikaliumphosphat og 0,05% magnesiumsulfat-heptahydrat ledes gennem søjlen med en strømningshastighed på 250 ml/time. Afgangsstrømmen ledes igen gennem søjlen ved samme strømningshastighed, og dette gentages i 5 timer. Der akkumuleres 43 ymol L-isoleucin i reaktionsblandingen.

Eksempel 29 2 g Mikroorganismeceller af Serratia marcescens Hd-Mhr ATCC 31026 (FERM P. 2120) (L-histidin-ammoniak-lyase-fri og 2-methylhisti-din-resistent mutant) behandles på samme måde som beskrevet i Eksempel 28-(1). Der opnås 20 g (våd form) immobiliseret Serratia marcescens præparat. Det udviser en L-histidin-produktivitet på 7,2 ymol/ time/g mikroorganismeceller.

[L-histidin-produktiviteten beregnes ved tilsætning af 5 g af det immobiliserede præparat til 20 ml vandig opløsning (pH 8,0) inde- 31 145745 holdende 5% glucose, 2% urinstof, 2% dikaliumphosphat og 0,2% magne-siumsulfat-heptahydrat og derefter omrystning af blandingen ved 30°C i 6 timer. Mængden af fremstillet L-histidin bioanalyseres under anvendelse af Leuconostoc mesenterioides P-60 (ATCC 9135).]

Eksempel 30 2 g mikroorganismeceller af Bacillus subtilis AHr Aur-9 ATCC 31002 (FERM P. 1998) (argininhydroxamat- og 6-azauracil-resistent mutant) behandles på samme måde som beskrevet i Eksempel 28-(1). Der opnås 20 g (våd form) immobiliseret Bacillus subtilis præparat. Det udviser en L-arginin-produktivitet på 21 pmol/time/g mikroorganismeceller.

[L-arginin-produktiviteten beregnes ved tilsætning af 5 g immobiliseret præparat til 20 ml af en vandig opløsning (pH 7,5) indeholdende 5% glucose, 2,5% ammoniumchlorid,2% natrium-L-aspartat, 2% dikaliumphosphat og 0,0002% magnesium-heptahydrat,og derefter omrystning af blandingen ved 30°C i 6 timer. Mængden af fremstillet L-arginin bioanalyseres under anvendelse af Leuconostoc mesenterioides P-60 (ATCC 9135).]

Eksempel 31 1 g mikroorganismeceller af Escherichia coli ATCC 11303 og 2 g mikroorganismeceller af Pseudomonas dacunhae IAM 1152, som opnås på samme måde som beskrevet i Eksemplerne 5 og 8, suspenderes i 3 ml vandig fysiologisk saltvandsopløsning. 600 mg carragenan ("GENU GEL Type WG") opløses i 14,5 ml vand under opvarmning, og opløsningen blandes med den ovenfor opnåede mikroorganismecelle-suspension. Blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning.

De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. Der opnås 20 g (våd form) immobiliseret mikroorganismecelle-præparat. Det udviser en L-alanin-produktivitet på 340 pmol/time/g mikroorganismeceller. [L-alanin-produktiviteten beregnes ved tilsætning af 5 g af det immobiliserede præparat til 30 ml vandig 1 M ammoniumfumarat-opløsning (pH 7,0) indeholdende 10~4 M pyridoxal-phosphat og derefter omrystning af blandingen ved 30°C i 1 time. Mængden af fremstillet L-alanin analyseres på samme måde som beskrevet i Eksempel 8].

32 U5745

Eksempel 32 1) Escherichia coli ATCC 11303 inokuleres i 500 ml vandigt medium (pH 7/0) indeholdende de samme ingredienser som beskrevet i Eksempel 5. Mediet dyrkes ved 37°C i 24 timer. Dernæst opsamles mikroorganismecellerne ved centrifugering.Disse mikroorganismeceller suspenderes i 16 ml vandig fysiologisk saltvandsopløsning/ og der sættes 64 ml vandig 3,2¾ carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, der på forhånd er opvarmet til 40°C, til suspensionen under opvarmning (i vandbad, badtemperatur 40°C). Blandingen sættes dråbevis til en vandig 1 M ammoniumf umarat-opløsning (pH 8,5) indeholdende 1 mM magnesiumchlorid.

De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering . Der opnås 60,4 g (våd form) immobiliseret Escherichia coli præparat. Det udviser en aspartase-aktivitet på 143,4 ymol/time/g. Aktivitetsudbytte 84% 2) 60,4 g af det immobiliserede Escherichia coli præparat opnået under punkt 1) pakkes i en søjle (4 cm i diameter og 8 cm høj) og inkuberes ved 37°C i 48 timer. Efter inkubationen udviser præparatet en aspartase-aktivitet på 278.422 ymol/time. Dernæst ledes 1000 ml vandig 1 M ammoniumfumarat-opløsning (pH 8,5) indeholdende 1 mM magnesiumchlorid gennem søjlen ved 37°C med en strømningshastighed på 50 ml/time. Afgangsstrømmen indstilles til pH 2,8, og det krystallinske bundfald opsamles ved filtrering. Der opnås 122 g L-asparaginsyre.

Eksempel 33

Serratia marcescens OUT (Faculty of Technology, Osaka University,

Japan) 8259 behandles på samme måde som beskrevet i Eksempel 32-(1).

Der opnås 50,8 g (våd form) immobiliseret Serratia marcescens præparat i form af gelpartikler (ca. 3 mm i diameter). Det udviser en aspartase-aktivitet på 36,9 ymol/time/g. Aktivitetsudbytte 87%.

Eksempel 34

Proteus vulgaris OUT 8226 behandles på samme måde som beskrevet i Eksempel 32-(1). Der opnås 44,0 g (våd form) immobiliseret Proteus vulgaris præparat i form af gelpartikler (ca. 3 mm i diameter). Det udviser en aspartase-aktivitet på 586,9 ymol/time/g. Aktivitetsudbytte 100%.

33 145745

Eksempel 35

Bacterium succinium I AM 1017 behandles på samme måde som beskrevet i Eksempel 32-(1). Der opnås 54,8 g (våd form) immobiliseret Bacterium succinium præparat i form af gelpartikler (ca. 3 mm i diameter).

Det udviser en aspartase-aktivitet på 295,5 ymol/time/g. Aktivitetsudbytte 100%.

Eksempel 36

Pseudomonas aeruginosa OUT 8252 behandles på samme måde som beskrevet i Eksempel 32-(1). Der opnås 39,8 g (våd form) immobiliseret Pseudomonas aeruginosa præparat i form af gelpartikler (ca. 3 mm i diameter). Det udviser en aspartase-aktivitet på 30,1 ymol/time/g. Aktivitetsudbytte 871.

Eksempel 37 5 g varmebehandlede mikroorganismeceller (glucose-isomerase-aktivitet: 7.740 enheder/g) af Streptomyces phaeochromogenus suspenderes i 10 ml vand. 40 ml vandig 3,1% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, der på forhånd er opvarmet til 40°C sættes til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 4% ammoniuir-chlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig 4% ammonium-chlorid-opløsning. Der opnås 57,8 g (våd form) immobiliseret Streptomyces phaeochromogenus præparat. Det udviser en glucose-isomerase-aktivitet på 214 enheder/g.

Eksempel 38 2 g varmebehandlede mikroorganismeceller (glucose-isomerase-aktivitet: 7.740 enheder/g) af Streptomyces phaeochromogenus suspenderes i 4 ml vand. 16 ml vandig 1,5% carragenan- ("GENU VISCO J") opløsning, der på forhånd er opvarmet til 40°C, sættes til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 0,1 M magnesium-chlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering. Gelpartiklerne sættes til en blanding af 10 ml vandig 1 M ammoniumchlorid-opløsning og 4 ml vandig 25% glutar-aldehyd-opløsning, og blandingen omrystes ved 30°C i 60 minutter. Dernæst opsamles gelpartiklerne ved filtrering. Der opnås 18,7 g (våd form) immobiliseret Streptomyces phaeochromogenus præparat. Det udviser en glucose-isomerase-aktivitet på 141 enheder/g.

Eksempel 39 34 145745 2 g varmebehandlede mikroorganismeceller (glucose-isomerase-aktivitet: 7.740 enheder/g) af Streptomyces phaeochromogenus suspenderes i 4 ml vand. 16 ml vandig 1,16 % furcellaran-opløsning, der på forhånd er opvarmet til 40°C sættes til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning.

De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 15,3 g (våd form) immobiliseret Streptomyces phaeochromogenus præparat. Det udviser en glucose-isomerase-aktivitet på 759 enheder/g.

Eksempel 40 2 g varmebehandlede mikroorganismeceller (glucose-isomerase-aktivitet: 7.740 enheder/g) af Streptomyces phaeochromogenus suspenderes i 4 ml vand. 16 ml vandig 1,16 g furcellaran-opløsning, der på forhånd er opvarmet til 40°C sættes til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 4% ammoniumchlorid-opløsning.

De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig 4% ammoniumchlorid-opløsning. Der opnås 16,4 g (våd form) immobiliseret Streptomyces phaeochromogenus præparat. Det udviser en glucose-isomerase-aktivitet på 444 enheder/g.

Eksempel 41 2 g varmebehandlede mikroorganismeceller (glucose-isomerase-aktivitet: 7.740 enheder/g) af Streptomyces phaeochromogenus suspenderes i 4 ml vand. 16 ml vandig 1% furcellaran-opløsning indeholdende 1,25% gelatine (furcellaran-opløsningen opvarmes på forhånd til 40°C) sættes til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 16,6 g (våd form) immobiliseret Streptomyces phaeochromogenus præparat. Det udviser en glucose-isomerase-aktivitet på 317 enheder/g.

Eksempel 42 2 g varmebehandlede mikororganismeceller (glucose-isomerase-aktivitet: 7.740 enheder/g) af Streptomyces phaeochromogenus suspenderes i 4 ml vand. 16 ml vandig 1% furcellaran-opløsning indeholdende 1,25% gelatine (furcellaran-opløsningen opvarmes på forhånd 35 145745 til 40°C) sættes til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 4% ammoniumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig 4% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 16,9 g (våd form) immo-biliseret Streptomyces phaeochromogenus præparat. Det udviser en glucose-isomerase-aktivitet på 421 enheder/g.

Eksempel 43 1,8 g gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opnået på samme måde som beskrevet i Eksempel 40 sættes til 20 ml vandig 1 M ammoniumchlorid-opløsning og 0,8 ml vandig 25% glutaraldehyd-opløsning. Blandingen omrystes ved 30°C i 60 minutter. Gelpartiklerne opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med is-vand. Der opnås 1,7 g (våd form) immobilise-ret Streptomyces phaeochromogenus præparat. Det udviser en glucose-isomerase-aktivitet på 66 enheder/g.

Eksempel 44 1) 1,66 g gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opnået på samme måde som beskrevet i Eksempel 41 sættes til en blanding af 0,8 ml vandig 25% glutaraldehyd-opløsning og 20 ml vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. Blandingen omrystes ved 30°C i 30 minutter. Gelpartiklerne opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med is-vand. Der opnås 1,7 g (våd form) immobiliseret Streptomyces phaeochromogenus præparat. Det udviser en glucose-isomerase-aktivitet på 318 enheder/g.

2) 10 g af det immobiliserede Streptomyces phaeochromogenus præparat opnået under punkt 1) pakkes i en søjle (1,6 cm i diameter og 14 cm høj). En vandig 50% glucose-opløsning (pH 7,0) indeholdende 0,01 M magnesiumsulfat, 1 mM koboltochlorid og 0,1 natriumsulfit ledes gennem søjlen ved 60°C. Glucose-isomerase-aktiviteten af det immobiliserede Streptomyces phaeochromogenus præparat analyseres med mellemrum. Resultaterne er vist i Tabel V. Halveringstiden for enzymaktiviteten af det immobiliserede Streptomyces phaeochromogenus -præparat er ca. 180 dage. Som det fremgår af disse data, udviser det immobiliserede Streptomyces phaeochromogenus præparat en høj enzymatisk aktivitet i et langt tidsrum, når det anvendes til den kontinuerlige enzymatiske omsætning.

36 145745

TABEL V

Driftsperiode Glucose-isomerase- Relativ enzymatisk (dage) aktivitet (enheder) aktivitet * (%) 0 3180· 100 10 3020 95 21 2961 93 30 2832 89 50 2618 82 71 2422 76 91 2164 68 jfe Den relative enzymatiske aktivitet beregnes véd hjælp af formlen, som er vist i fodnoten til Tabel I.

Eksempel 45 1,69 g gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opnået på samme måde som beskrevet i Eksempel 42 sættes til en blanding af 2 ml vandig 1 M ammoniumchlorid-opløsning, 0,8 ml vandig 25% glutaraldehyd-opløs-ning og 17,2 ml vand. Blandingen omrystes ved 30°C i 30 minutter. Gelpartiklerne opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med is-vand.

Der opnås 1,7 g (våd form) immobiliseret Streptomyces phaeochromogenus præparat. Det udviser en glucose-isomerase-aktivitet på 192 enheder/g.

Eksempel 46

Mikroorganismeceller af Escherichia coli ATCC 11303 opnået på samme måde som beskrevet i Eksempel 5 suspenderes i 8 ml vand. 64 ml vandig 3,2% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning, der på forhånd er opvarmet til 40°C, sættes til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til acetone (afkølet til -1° til 0°C). Efter dråbevis tilsætning omrøres blandingen i 10 minutter. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig 4% ammoniumchlorid-opløsning. Der opnås 54,0 g (våd form) immobiliseret Escherichia coli præparat. Det udviser en aspartase-aktivitet på 3.441 ymol/time/g. Aktivitetsudbytte 345%.

Eksempel 47 5 g varmebehandlede mikroorganismeceller (glucose-isomerase-aktivitet: 7.740 enheder/g) af Streptomyces phaeochromogenus sus- 37 145745 penderes i 10 ml vand. 40 ml vandigt 3% natriumsalt af cellulosesulfat- ("KELCO SCS") opløsning, der på forhånd er opvarmet til 37°C, sættes til suspensionen, og blandingen sættes dråbevis til en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. De resulterende gelpartikler (ca. 3 mm i diameter) opsamles ved filtrering og vaskes dernæst med en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 48 g (våd form) immobiliseret Streptomyces phaeochromogenus præparat. Det udviser en glucose-isomerase-aktivitet på 443 enheder/g.

Eksempel 48 1) 8 g mikroorganismeceller af Escherichia eoli ATCC 11303 opnået på samme måde som beskrevet i Eksempel 5 suspenderes i 5 ml fysiologisk saltvandsopløsning. 80 ml vandig 2,2% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløsning indeholdende 1% johannesbrødgummi (carragenan-opløs-ningen er på forhånd opvarmet til 40°C) blandes med suspensionen.

250 ml vandig kaliumchlorid-opløsning sættes gradvis til blandingen, og blandingen tillades at henstå ved 4°C i 30 minutter. Den resulterende gel skæres i terninger, som er 3 mm på hver led, og vaskes dernæst med en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. 89,3 g af de således opnåede gelterninger nedsænkes i 100 ml iskold ethanol, og der tilsættes glutaraldehyd til en slutkoncentration deraf på 0,49%. Blandingen tillades at henstå i 15 minutter under is-afkøling. Dernæst opsamles gelterningerne ved filtrering og vakes derefter med en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 86,2 g (våd form) immobiliseret Escherichia coli præparat. Det udviser en aspartase-aktivitet på 32.183 pmol/time/g mikroorganismeceller.

2) 11,1 g af det immobiliserede Escherichia coli præparat opnået under punkt 1) pakkes i en søjle (1,6 cm i diameter of 12 cm høj).

En vandig 1 M ammoniumfumarat-opløsning (pH 8,5) indeholdende 1 mM magnesiumchlorid ledes gennem søjlen ved 37°C med en strømningshastig--· hed på 6 ml/time. Den enzymatiske aktivitet af det immobiliserede Escherichia coli præparat analyseres med mellemrum. Resultaterne er vist i Tabel VI. Halveringstiden for den enzymatiske aktivitet af det immobiliserede Escherichia coli præparat er ca. 113 dage. Som det fremgår af disse data, udviser det immobiliserede præparat høj enzymatisk aktivitet i en lang periode, når det anvendes til den kontinuerlige enzymatiske omsætning.

38 145745

TABEL VI

Driftsperiode Aspartase-aktivitet Relativ enzymatisk (dage) (y mol/time/g celler) aktivitet * (%) 0 32.183 100 6 31.413 98 8 31.625 98 12 31.600 98 19 31.906 99 22 31.036 96 29 30.574 95 40 . 29.932 93 jfc Den relative enzymatiske aktivitet beregnes ved hjælp af formlen, som er vist i fodnoten til Tabel I.

Eksempel 49 1) Pseudomonas dacunhae IAM 1152 inokuleres i 120 ml af et vandigt medium (pH 7,0) indeholdende 1,4% natriumglutamat, 0,2% casamino-syre, 0,9% pepton, 0,05% monokaliumphosphat og 0,01% magnesiumsulfat-heptahydrat. Mediet dyrkes ved 30°C i 24 timer under omrystning. Mikroorganismecellerne opsamles dernæst ved centrifugering. 2 g af mikroorganismecellerne suspenderes i 5 ml fysiologisk saltvandsopløsning.

600 mg carragenan ("GENU GEL Type WG") opløses i 15 ml vand. Carragenan-opløsningen blandes med suspensionen ved 37°C, og 1 ml af en vandig 1 M hexamethylendiamin-opløsning (pH 7,0) sættes dertil. Blandingen tillades at henstå ved 4°C i 30 minutter. Den resulterende gel udskæres i terninger på 4 mm på hver led. Gelterningerne sættes til 50 ml af en vandig 2% ammoniumchlorid-opløsning indeholdende 1% glutaraldehyd, og blandingen tillades at henstå ved 0°C i 15 minutter. Så opsamles gelterningerne ved filtrering og vaskes med en vandig 1% ammoniumchlorid-opløsning. Der opnås 22 g (våd form) immobiliseret Pseudomonas dacunhae præparat. Det udviser en aspartase β-decarboxylase-aktivitet på 3.567 μ mol/time/g mikroorganismeceller.

39 145745 2) 22 g af det under punkt 1) opnåede immobiliserede Pseudomonas dacunhae pakkes i en søjle (1,6 cm i diameter og 10,5cmi højden).

En vandig 1 M ammoniumasparaginat-opløsning (pH 5,5) indeholdende 10 ^ M. pyridoxalphosphat ledes gennem søjlen fra bunden og opefter ved 37°C med en strømningshastighed på 13,8 ml/time. Mængden af L-alanin i afgangsopløsningen bioanalyseres under anvendelse af Leuco-nostoc citrovorum ATCC 8081. Resultaterne vises i Tabel VII. Halveringstiden for den enzymatiske aktivitet af det immobiliserede Pseudomonas dacunhae præparat er ca. 159 dage. Som det fremgår af disse data, udviser det immobiliserede præparat høj enzymatisk aktivitet i en lang periode, når det anvendes til den kontinuerlige enzymatiske reaktion.

TABEL VII

Driftsperiode Aspartat- Relativ enzymatisk (dage) β-decarboxylase- aktivitet * (%) aktivitet (jjmol/ml) 1 517 100 3 556 108 4 528 102 5 576 111 7 538 104 12 528 102 14 528 102 20 528 102 24 521 101 26 489 95 45 450 87 s Den relative enzymatiske aktivitet beregnes ved hjælp af formlen, som er vist i fodnoten til Tabel I.

Eksempel 50 1) Brevibacterium flavum ATCC 14067 inokuleres i 500 ml af et vandigt medium (pH 7,0) indeholdende 2,0% majsstøbevæske, 2,0% malon-syre, 0,2% diammoniumcitrat, 0,2% monokaliumphosphat og 0,05% magnesium-sulfat-heptahydrat. Mediet dyrkes ved 30°C i 48 timer under omrøring.

Så opsamles mikroorganismecellerne ved centrifugering. 8,0 g af mikroorganismecellerne suspenderes i 8 ml af en fysiologisk saltvandsopløsning. 34 ml af en vandig 5,0% carragenan- ("GENU GEL Type WG") opløs- 40 145745 ning, som på forhånd er opvarmet til 50°C, blandes med suspensionen.

250 ml af en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning sættes gradvis til blandingen, og blandingen tillades at henstå ved 4°C i 5 timer. Den resulterende gel skæres i terninger på 3 mm på hver led. Gelterningerne vaskes med en vandig 2% kaliumchlorid-opløsning. Der opnås 49,9 g (våd form) af et immobiliseret Brevibacterium flavum præparat. Det udviser en fumarase-aktivitet på 503 μιηοΐ/time/g mikroorganismeceller.

2) 6,3 g af det under punkt 1) opnåede immobiliserede Brevibacterium flavum præparat pakkes i en søjle (1,6 cm i diameter og 12 cm i højden). En vandig 1 M kaliumfumarat-opløsning (pH 7,0) ledes gennem søjlen ved 37°C og en strømningshastighed på 6 ml/time. Den enzymatiske aktivitet af det immobiliserede Brevibacterium flavum præparat analyseres med mellemrum. Resultaterne vises i Tabel VIII. Halveringstiden for det immobiliserede Brevibacterium flavum præparat er ca. 69 dage.

Som det fremgår af disse data, udviser det immobiliserede praqparat en høj enzymatisk aktivitet i et langt tidsrum, når det anvendes til den kontinuerlige enzymatiske reaktion.

TABEL VIII

Driftsperiode Fumarase-aktivitet Relativ enzymatisk (dage) (pmol/ml) aktivitet £ (%) 1 1768 100 2 - 1767 100 4 1472 83 9 1422 80 13 1401 79 18 1374 78 20 1355 77 25 1307 74 30 1308 74 s Den relative enzymatiske aktivitet beregnes ved hjælp af formlen, som er vist i fodnoten til Tabel I.

Claims

41 145745

1, KENDETEGNET ved, at gelmatrixen af det sulfaterede polysaccharid indeholder ammoniumion, kaliumion, magnesiumion eller en alkylen-diamin med 1-20 carbonatomer.

1, KENDETEGNET ved, at gelmatrixen af det sulfaterede polysaccha-. . -1 δ rid indeholder 10 til 10 millimol (pr. gram af det sulfaterede polysaccharid) af ionen, aminen eller opløsningsmidlet.

1. Immobiliseret katalytisk aktivt materiale, KENDETEGNET ved, at det omfatter et katalytisk aktivt enzym eller en katalytisk aktiv mikroorganisme eller et vand-uopløseligt, hydrofilt, katalytisk aktivt til bærer bundet enzym eller en vand-uopløselig, hydrofil, katalytisk aktiv til bærer bundet mikroorganisme, som er indesluttet i gelmatrixen af et sulfateret polysaccharid med et sulfatrest-indhold i molekylet på mere end 10 vægt%, og indeholdende ammoniumion, en metalion med en atomvægt, som er højere end 24, en vand-opløselig organisk amin eller et vandblandbart organisk opløsningsmiddel.

2. Immobiliseret katalytisk aktivt materiale ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det sulfaterede polysaccharid indeholder 12 - 62 vægt% sulfatrest i molekylet.

3, KENDETEGNET ved, at det sulfaterede polysaccharid er kappa-car-ragenan, iota-carregenan eller furcellaran.

3. Immobiliseret katalytisk aktivt materiale ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at det sulfaterede polysaccharid er carragenan, furcel-laran eller et cellulosesulfat med et sulfatrest-indhold på 12 - 62 vægt%.

4. Immobiliseret katalytisk aktivt materiale ifølge krav

5. Immobiliseret katalytisk aktivt materiale ifølge krav

6. Immobiliseret katalytisk aktivt materiale ifølge krav

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret katalytisk aktivt materiale ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at den omfatter trin til blanding af et katalytisk aktivt enzym, en katalytisk aktiv mikroorganisme, et vand-uopløseligt, hydrofilt, katalytisk aktivt til bærer bundet enzym eller en vand-uopløselig, hydrofil, katalytisk aktiv til bærer bundet mikroorganisme med en vandig opløsning af et sulfateret polysaccharid, der indeholder mere end 10 vægt% sulfatrest i molekylet, hvorefter den vandige blanding bringes i kontakt med ammoniumion, en metalion med en atomvægt, 145745 42 som er højere end 24, en vand-opløselig organisk amin eller et vandhiandbart organisk opløsningsmiddel.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at det sulfaterede polysaccharid indeholder 12 - 62 vægt% sulfatrest i molekylet.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at det sulfaterede polysaccharid er carregenan, furcellaran eller et cellulosesulfat med et sulfatrest-indhold på 12 - 62 vægt%.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, KENDETEGNET ved, at det sulfaterede polysaccharid er kappa-carragenan, iota-carragenan eller furcellaran.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at enzymet, mikroorganismen, det til bærer bundne enzym eller den til bærer bundne mikroorganisme blandes med en vandig opløsning indeholdende 0,05 - 20 vægt% af det sulfaterede polysaccharid, og at den vandige blanding bringes i kontakt med opløsningsmidlet eller en vandig opløsning indeholdende i det mindste 0,1 mM af ionen eller aminen.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at blandingstrinet udføres ved en temperatur på 30 - 70°C og ved en pH værdi på 1 - 13, og at det efterfølgende kontakttrin finder sted ved en temperatur på -5 - 70°C.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, KENDETEGNET ved, at pH-værdien i blandingstrinet er på 4 til 10.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at enzymet, mikroorganismen, det til bærer bundne enzym eller den til bærer bundne mikroorganisme blandes med en vandig opløsning indeholdende 0,05 til 20 vægt% af det sulfaterede polysaccharid, og at den vandige blanding bringes i kontakt med en vandig opløsning indeholdende i det mindste 0,1 mM af ammoniumion, kaliumion, magnesiumion eller en alkylendiamin med 1-20 carbonatomer.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 7, KENDETEGNET ved, at den desuden indbefatter et trin, ved hvilket gelmatrixen bringes i kontakt med et gelhærdningsmiddel.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, KENDETEGNET ved, at gelhærdningsmidlet anvendes i en koncentration på 0,01 - 1 gram pr. ml.