DK145912B - Fremgangsmaade til udvinding af zwitterioner af cephalosporinforbindelser fra cephalosporinkomplekser - Google Patents

Description

(19) DANMARK

é (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT mi 145912 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. ^680/79 (51) IntCI.3 C 07 D 501/22 (22) Indleveringsdag 5· s ep. 1979 C 07 D 501/12 (24) Løbedag 19· <Ian· 1972 (41) Aim. tilgængelig 3· S ep. 1979 (44) Fremlagt 11 · aPr · 1985 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. 267/72

(30) Prioritet 20. jan. 1971, 108218, US

(71) Ansøger ELI LILLY AND COMPANY, Indianapolis, US.

(72) Opfinder William Lee Garbrecht, US.

(74) Fuldmægtig Pat ent bureauet Hofman-Bang & Bout ard.

(54) Fremgangsmåde til udvinding af zwitterioner af cephalosporin= forbindelser fra cephalosporin= komplekser.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til udvinding af zwitterioner af cephalosporinforbindelser fra cephalosporin-komplekser, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

^ Til fremstilling af visse cephalosporansyrederivater har man udvik- -sj let procesveje til acylering af 7-aminogruppen i en cephalosporin- ^ kemeester med en acyleret form af den ønskede syre. Når acyle- S) ringstrinnet er tilendebragt, må enhver beskyttende gruppe og estergruppen fjernes fra cephalosporinderivatet for at opnå det ønskede cephalosporinantibiotikum. Ofte udføres acyleringen og ^ deesterificeringen i et enkelt opløsningsmiddelsystem. Af bekvem- 2 145912 mellghedsgrunde og for at få et forbedret udbytte foretrækkes det i nogle tilfælde at anvende p-nitrobenzyl som estergruppe på ce-phalosporinkemen i denne proces. I en sådan proces fremstilles for eksempel en p-nitrobenzylester af 7-aminodesacetoxycephalb-sporansyre (7-ADCA) eller et p-toluensulfonatsalt deraf, og dette anvendes som kemeforbindelse til fremstilling af cephalexin, hvilket antibiotikum er beskrevet i U.S. patent nr. 3 507 861.

En metode, der på nuværende tidspunkt anvendes til fremstilling af cephalexin, består i at acylere p-nitrobenzylesteren af 7-aminodesacetoxycephalosporansyre (7-ADCA-ester) i acetonitril med et C^-C^-alkyl-phenylglycinanhydrid, hvori aminonitrogenet er beskyttet med enaminen fra methylacetoacetat. Man.fjerner nu estergruppen fra carboxylsyregruppen ved at behandle acetonitril-blandingen af cephalexinesteren med et reducerende middel, f.eks. metallisk zinkstøv og syre. Dette syrereduktionstrin, der også fjerner enaminen, efterfølges af en basebehandling for at øge pH i blandingen til ca. 4,5 - 5,0, ved hvilken pH-værdi man får en udfældning af den rå cephalexin som en zwitterion.

Selv om denne syrereduktion er meget effektiv til at spalte p-nitrobenzylestergruppen, produceres der samtidigt visse urenheder, der er svære at fjerne fra cephalexin-zwitterionen. Blandt sådanne urenheder mener man, at der er små mængder af 7-ADCA, phenylglycin og, når man anvender p-nitrobenzylester, en urenhed, hvis struktur man endnu ikke kender med sikkerhed. Uanset den kemiske struktur indeholder den sidstnævnte urenhed diazoter-bart nitrogen som målt med Bratton-Marshall-metoden beskrevet nedenfor. Fagmanden vil foretrække at eliminere eller i det mindste at reducere mængden af diazoterbart nitrogen til et ubetydeligt niveau i cephalexinproduktet.

De omhandlede forbindelser er derivater af 7-aminodesacetoxycepha-losporansyre (7-ADCA) med formlen /S\ H0N— CH — CH CH?

2 I I I

&--N X — CH, X* \ X 3 o

C00H

3 145912 7-aminodesacetoxycephalosporansyre kan også kaldes 7-amino-3-methyl-A^-cephem-4-carboxylsyre. På lignende måde kan cephalexin kaldes 7-[D-a-amino-a-phenylacetamido ]-3~methyl-^^-cephem-4-carboxylsyre.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man opløser et kompleks af en cephalosporinsyre med den i kravet angivne almene formel og Ν,Ν-dimethylformamid eller N,N-dime-thylacetamid i surt vand og opvarmer opløsningen til en temperatur på 40-70°C. Derefter blander man den opvarmede kompleksopløsning med en basisk forbindelse, indtil pH når op på en værdi, ved hvilken cephalosporinforbindelsen udfælder som en zwit-terion.

Cephalosporinsyrekomplekset kan fremstilles ud fra en cephalosporin-ester, der opløses i Ν,Ν-dimethylformamid (IMF) eller N,N-dimethyl-acetamid (DMAC), om nødvendigt ved hjælp af en syre. Opløsningen behandles med et reduktionsmiddel og derefter med en syre for at fjerne estergruppen. Efter filtrering behandles blandingen med en base for at øge pH til en værdi, hvor cephalosporinsyrekomplekset med DMF eller DMAC udfælder.

Det rå cephalosporinsyrekompleks med DMF eller DMAC kan yderligere oprenses ved at opløse komplekset i et N,N-dialkylacylamid indeholdende op til ca. 40 volumenprocent polært, væskeformigt fortyndingsmiddel, gøre blandingen sur, omrøre og dernæst tilsætte base til genudfældning af det oprensede cephalosporinsyrekom-pleks. Dette omdannes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til den frie cephalosporinforbindelse ved at opløse komplekset i surt vand, opvarme opløsningen til 40 - 70°C og dernæst indstille pH i blandingen til et sådant område, hvor cephalosporinforbindelsen udfælder fra opløsningen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres med cephalosporinsyrer med den almene formel /s\ R'-NH-CH-CH CHp II I 2 C -Nv .C -CH, s n*'

C00H

4 U5912 hyori R’ betegner hydrogen, H^, som del af et salt eller en aminogruppe indeholdende en acylgruppe med formlen 0

II

¥-CH—C

i .

hvori B er -NH^ eller -NH^, når cephalosporinesteren er på salt-form; og ¥ er phenyl, 3-hydroxyphenyl, 4-hydroxyphenyl, 4-chlor-phenyl, 3,5-dichlor~4-hydroxyphenyl eller 3-chlor-4-hydroxyphenyl.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan som nævnt anvendes som en del af den totale proces til fremstilling af cephalosporinforbindelser. I denne proces går man frem på følgende måde: (1) Cephalosporinesteren, dvs. p-nitrobenzyl- eller 2,2,2-tri-chlorethylesteren af 7-aminodesacetoxycephalosporansyre, acyléres i acetonitril med et blandet anhydrid af phenylglycin, en substitueret pihenylglycin, 2-thienylglycin eller lignende, hvori aminonitro-genet i glycindelen er beskyttet med en amin fra methylacetoacetat eller en anden beskyttende gruppe, såsom tertiær-butoxycarbonyl; (2) Produktet fra trin (1) behandles med en egnet syre til udfældning af saltet af cephalosporinesteren. En aromatisk carbonhydrid-sulfonsyre med 6-12 carbonatomer, såsom p-toluensulfonsyre, foretrækkes til dette formål. Ved en sådan syrebehandling fjernes methylacetoacetatenaminen fra aminonitrogenet.

(3) Cephalosporinesteren eller saltet deraf fra trin (2) separeres fra acetonitrilmediet, f.eks. ved filtrering eller centrifugering.

(4) Den N-enamin-blokerede cephalosporinester eller cephalosporin-estersaltet deraf opløses i Ν,Ν-dimethylformamid (DMF) eller N,N-dimethylacetamid (DMA.C) eller et opløsningsmiddelsystem indeholdende mindst én af disse komponenter som en hovedkomponent.

(5) Opløsningen fra trin (4) behandles med et reduktionsmiddel, f.eks. metallisk zink, der af bekvemmelighedsgrunde er findelt. Alternativt kan reduktionsmidlet være hydrogen under kendte hydrogeneringsbetingelser i nærværelse af en hydrogeneringskatalysator, 5 145912 såsom palladium eller rhodium på en carbon- eller bariumsulfat-bærer eller en palladium- eller rhodiumforbindelse suspenderet i det medium, der skal hydrogeneres. Enhver ikke-oxiderende syre kan anvendes til tilvejebringelse af syremediet, men saltsyre foretrækkes. En sådan behandling fjerner også visse aminonitro-genbeskyttende grupper, hvis disse ikke er fjernet på et tidligere trin i processen. Reaktionen færdiggøres i det væsentlige på kort tid, men i praksis omrøres blandingen lidt eller henstår i nogle få timer for at fuldstændiggøre reaktionen og for at tillade enhver remanens og ureageret zink at sætte sig. Reaktionsblandingen kan dernæst separeres fra remanensen ved filtrering, dekantering, centrifugering eller på lignende måde.

(6) Reaktionsblandingen fra trin (5) behandles dernæst med tilstrækkelig base til at øge pH til et niveau, ved hvilket cephalo-sporinsyren udfælder som et kompleks med IMF eller DMAC. Når man anvender det foretrukne opløsningsmiddel, IMF, som eneste opløsningsmiddel, udfælder cephalexin-bis(lMF) komplekset ved en pH-værdi på 6,9. Med DMF-blandinger kan cephalosporinkomplekset udfælde ved en pH-værdi fra ca. 6,5 til 7,5. Enhver almindelig base kan anvendes til at behandle reaktionsblandingen. Valget afhænger normalt af omkostningerne og tilgængeligheden, og af hver farligt stoffet er at arbejde med. Det foretrækkes at anvende ammoniak, ammoniumhydroxid eller en N,N,N-tris(C-j-C^-alkyl)-amin, såsom triethylamin. Imidlertid kan man også anvende de mere økonomiske alkalimetalhydroxider, f.eks. natriumhydroxid eller kaliumhydroxid.

Cephalosporinkomplekserne med DMF eller DMAC kan yderligere renses ved at opløse dem i en sur blanding af et udvalgt N,N-dialkylacylamid og op til 40 volumenprocent af et polært opløsningsmiddel. Med det foretrukne opløsningsmiddel IMF er en foretrukken blanding 90 % DMF og ca. 10 % vand. Andre polære . væskeformige fortyndingsmidler, der kan anvendes, omfatter alka-noler med 1-3 carbonatomer, såsom methanol, ethanol eller iso-propanol, og andre forbindelser, såsom acetone, acetonitril, nitromethan, methylethylketon og lignende. Alternativt kan cephalosporin- DMF-komplekset renses ved at opløse det i den polære væske med syre, og den fremkomne opløsning kan dernæst behandles med DMF eller DMAC. Generelt tilsættes en ikke oxiderende syre, såsom saltsyre, for at forøge opløsningshastigheden. Der tilsæt- 6 145912 tes en egnet base, såsom ammoniumhydroxid eller triethylamin for at øge pH til det niveau, hvor cephalosporinkomplekset udfælder effektivt. Med cephalexin-bis(DMF) foretrækkes en pH-værdi på 6,5 - 7,5. Denne oprensningsmetode kan gentages en eller flere gange, indtil cephalosporinkomplekset viser et ønsket lavt indhold af diazoterbart nitrogen og andre uønskede urenheder, såsom 7-aminodesacetoxy-cephalosporansyre (7-ADCA). Fortrinsvis gentages denne procedure, indtil mængden af diazoterbart nitrogen er mindre end 0,1%.

Det fremstillede kompleks af cephalosporinsyren og N,N-dimethyl-formamid eller Ν,Ν-dimethylacetamid opløses derefter i surt vand, og opløsningen opvarmes til 40-70°C. Derpå blandes en basisk forbindelse med opløsningen, indtil cephalosporinforbin-delsen udfælder som en zwltterion.

Den omhandlede fremgangsmåde kan for eksempel anvendes til fremstilling af cephalexin, som er et kendt antibiotikum. Til disse formål opløses cephalexin~bis(N,N-dialkylacylamid) i vand. Der tilsættes syre for at mindske pH til 1-2, blandingen opvarmes til 40 - 70°C, .fortrinsvis 50 - 60°C, til dannelse af monohydratet, og dernæst tilsættes en base, såsom ammoniumhydroxid eller triethylamin, for at øge pH til det punkt, hvor cephalexin-zwitterion-monohydratet udfælder. Normalt sker udfældningen ved pH 4,5 - 5,0, men det afhænger af det anvendte opløsningsmiddelsystem. Hvis man ønsker at opnå ikke-opløst cephalexin, kan komplekset opløses i og udvindes fra en vandig acetonitrilblanding. Cephalexin-zwitterionen fjernes fra reaktionsblandingen på konventionel måde, vaskes med acetonitril, tørres og fremstilles dernæst i en farmaceutisk blanding til anvendelse i den antibiotiske terapi til bekæmpelse af forskellige infektionssygdomme.

Følgende eksempler illustrerer nærmere den foreliggende opfindelse:

Eksempel_l

Spaltning af p-nitrobenzylester

En blanding af 26,0 g p-toluensulfonatsalt af cephalexinesteren p-nitrobenzyl-3-methyl-7-(D-a-amino-cc-phenylacetamido)-4^-cephem- 4-carboxylat, 200 ml DMF og 20,0 ml koncentreret saltsyre omrørte® og holdtes på 5° C med extern afkøling, medens der portionsvis tilsattes 10,4 g pulverformig zink i løbet af en halv 7 145912 time. Blandingen omrørtes dernæst i 1 time uden yderligere køling og Blev holdt på stuetemperatur i adskillelse timer. Efter filtrering blev cephalexinråstoffet i filtratet udfældet ved gradvis justering af pH i blandingen til 6,5 med triethylamin. Det farveløse, krystallinske produkt, et bis-(dimethylformamid)-kompleks af cephalexin, opsamledes, vaskedes med MF og dernæst med ethyl-acetat og tørredes. Produktet vejede 16,5 g og udviste følgende analyser:

Cephalexin (base) indhold, UV (264 nyu ............. 72,2 %

Diazoterbart nitrogen (optisk densitetsmetode)...... ca. 2000 ppm

Zink............................................... 30 ppm

Phenylglycin....................................... 0,01 % 7-ADCA............................................. 0,13 %

Rensning af cephalexin-bis(IMF)-kompleks i DMF

16,0 g cephalexin-2(DMF)-kompleks fremstillet som ovenfor opløstes i 160 ml af en blanding af 95 % DMF og 3 % vand ved at indstille pH til ca. 2 med koncentreret saltsyre. Den lysegule opløsning filtreredes, og filtratet behandledes med triethylamin til et pH på 6,5 for at udfælde cephalexin-bis(DMF)-komplekset som et produkt. Dette produkt opsamledes, vaskedes med DMF og ethylacetat og tørredes. Det farveløse, krystallinske produkt havde et smeltepunkt på 183 - 186°C, vejede 15>7 g og havde et karakteristisk røntgendiffraktionsmønster og udviste endvidere følgende analyser:

Cephalexin (base), UV (264 nyu) metode ............. 72,0 %

Diazoterbart aminonitrogen ......................... ca. 150 ppm

Zink............................................... ikke detekterbar

Phenylglycin ....................................... " " 7-ADCA............................................. " "

En anden DMF-opløsning med syre efterfulgt af udfældning af cepha-lexinkomplekset med triethylamin formindskede det diazoterbare nitrogen i produktet til mindre end 50 ppm.

8 145912

Eksem]oel_2 I en 285 liter reaktionsbeholder anbragtes 108 liter N,N-dimethyl-formamid (IMF) afkølet til -10°C. Dernæst tilsattes halvdelen af en portion på 7,7 liter saltsyre p.a., og 10 kg p-toluensulfonatsalt af p-nitrobenzylesteren af cephalexin. Dernæst tilsattes anden halvdel af portionen på 7,7 liter saltsyre. Til denne blanding sattes 4,08 kg zinkstøv i løbet af 40 minutter, medens blandingen afkøledes til mindre end 12°C. Dernæst tilsattes i løbet af 30 minutter 10,8 liter saltsyre, og blandingen omrørtes natten over ved +20 °0. Blandingen filtr er edés·, og ca. 800 g remanens og afsat zinkstøv opsamledes på en filterhjælp (Hyflo pad) i en Buchner-tragt. Det opsamlede materiale var fortrinsvis en gul remanens og mindre end 20 g zinkstøv. Det filtrerede materiale på Buchner-tragten vaskedes med 4 liter IMF. Filtratet, der indeholdt produktet, behandledes med triethylamin til et pH på 6,9 til udfældelse. af cephalexin-bis(N,N-dimethylformamid). Det udfældede produkt filtreredes på en Buchner-tragt, vaskedes med tre gange 15 liter IMF, efterfulgt af to gange 15 liter ethyl-acetat-udvaskninger. Det vaskede produkt tørredes ved 32°C. Dr opnåedes 5,05 kg af cephalexinkomplekset. Den teoretiske vægt for det rene cephalexin baseret på vægten af udgangsmateriale var 4,695 kg. Udbyttet var 77,5 %. En UV-analyse ved 264 nyu viste, at. cephalexinindholdet var 72 %. Indholdet af diazoterbart nitrogen var ca. 2.000 ppm. 7-ADCA-indholdet var 0,07 vægtprocent. Produktet havde en grå farve..

Eksempel_3

Fremgangsmåden i eksempel 2 blev gentaget med 14,6 kg p-toluensulf onatsalt af p-nitrobenzylester af cephalexin, dog afkøledes blandingen til -5°C, og zinkstøvet dryssedes i reaktionsblandingen i løbet af 35 minutter. Temperaturen blev holdt under 12°C. Der anvendtes 5,34 kg zink. Efter tilsætning af 14,13 liter saltsyre opvarmedes til 22°C, og blandingen omrørtes natten over.

Den næste dag filtreredes blandingen. Remanensen opsamledes og vaskedes med DMF (4 liter), pH i filtratet indstilledes til 5,2, og der tilsattes 2 g af cephalexinkomplekset som podet krystal. Blandingen omrørtes 30 minutter. Når de udfældede cephalexin-krystaller var af god, filtrerbar størrelse, indstilledes pH af 9 145912 opslæmningen til 6,0, og blandingen omrørtes i 15 minutter. pH indstilledes til 6,9, og blandingen omrørtes i 15 minutter og filtreredes dernæst. Piltreringstiden var 45 minutter. Den vedhængende væske udludedes med tre gange 15 liter DMF og to gange 15 liter ethylacetat vaskevand. Det krystallinske cephalexin-produkt tørredes og vejede 7,568 kg. Produktet havde en hvid farve. Cephalexinindholdet var 71,7 % (UV-analyse). Den teoretiske vægt af cephalexin i dette kompleks var 6,3 kg. Det aktuelle udbytte var 86,1 %. Indholdet af diazoterbart nitrogen var ca. 1.000 ppm, og 7-ADCA-indholdet var 0,14 %.

Et andet forsøg udført på i det væsentlige den samme måde resulterede i et udbytte på 7,87 kg (80,6 %) af det hvide, krystallinske cephalexinprodukt, hvilket indeholdt 70 % cephalexin, ca. 2.000 ppm diazoterbart nitrogen og 0,09 % 7-ADCA.

Endnu et forsøg gav 7,38 kg (85 % udbytte) af det krystallinske cephalexin-bis-(DMF)-produkt, hvilket indeholdt 71,4 % cephalexin, ca. 1.500 ppm diazoterbart nitrogen og 0,09 % 7-ADCA.

Eksempel_4

En blanding af det rå cephalexinkompleks fra fire forsøg som beskrevet ovenfor, ialt 19,4 kg, opløstes i en blanding af 247 liter DMF og 28 liter destilleret vand. pH indstilledes til 2,0 med saltsyre, hvorefter pH indstilledes til 6,9 med ammoniumhydroxid. Blandingen filtreredes over to Buchner-tragte og vaskedes med to portioner (18 liter pr. portion) 100 % DMF. Efter prøveudtagning (0,901 kg) opløstes det tiloversblevne af det filtrerede, semi-rensede cephalexinkompleks i en blanding af 247 liter IMF og 28 liter vand ved hjælp af saltsyre, hvorefter pH indstilledes til 6,9 med ammoniumhydroxid. Blandingen filtreredes dernæst til opsamling af produktet, cephalexin-bis(DMF)-komplekset, på en Buchner-tragt. Produktet vaskedes to gange med 15 liter DMF og to gange med ethylacetat (15 liter og 12 liter). Det oprensede cephalexinkompleks tørredes dernæst. Den totale vægt var 24,0 kg plus 115 gram for prøverne. Cephalexinindholdet var 70,0 % målt ved UV-analyse. Indholdet af diazoterbart nitrogen var 300 ppm, og det aktuelle udbytte var 90 %.

10 145912

Eksem£el_5

Til en 285 liter reaktor med en omrører sattes 92 liter destilleret vand, 6 kg saltsyre p.a. og 23 kg cephalexin-bis-(DMF)-kompleks. Denne blanding vaskedes med 11,5 liter ionbyttet vand og dernæst 0,640 kg natriumethylendiamintetraacetat i 5»5 liter destilleret vand. Der tilsattes 1,67 kg aktivt kul, og der om-rørtes i 1 time. Opløsningen filtreredes dernæst gennem et glasfilter på et rammefilter og vaskedes med 15»3 liter destilleret vand. Filtratet og vaskevandet overførtes til et 285 liter destil-lationsapparat og opvarmedes til 55°C. pH indstilledes til 4,5 med triethylamin. Overskud af triethylamin opsamledes rundt om omrøreren. Den opsamlede overskydende amin neutraliseredes med 3,0 liter saltsyre. Den maksimale pH-værdi var 5,6 i mindre end 5 minutter. Blandingen filtreredes på en Buchner-tragt og vaskedes med 5 liter vand og to gange 15 liter ionbyttet vand.

Filtratet (180 liter) afkøledes og overførtes til en 285 liter destillationsbeholder. Der tilsattes 90 liter acetonitril for at udfælde restindholdet. Begge produkter tørredes i luft ved 32°C til en konstant -vægt. Der opnåedes 12,5 kg cephalexinmono-hydrat (93 % cephalexin) målt ved ultraviolet analyse (264 nyu meter). Indholdet af diazoterbart nitrogen var mindre end 50 ppm, og indholdet af DMF var 0,0602 %. Vandindholdet blev bestemt ved hjælp af Karl Fischers analytiske metode og blev bestemt til 6,25 %

Eksemgel^S

p-Nitrobenzylesteren af 7-ADCA acyleres med et blandet anhydrid af methyl og D-2-amino-2-(2,-thienyl)-eddikesyre, hvori amino-gruppen er beskyttet eller blokeret med enaminen af methylaceto-acetat. Den fremkomne blanding behandles med p-toluensulfonsyre for at fjerne enaminen og for at udfælde cephalosporinesteren p-nitrobenzyl-3-methyl-7-[D-2-amino-2-(2'-thienyl)acetamido]-Δ^-cephem-4-carboxylat.

Denne cephalosporinester opløses i DMF ved hjælp af saltsyre og behandles med metallisk zink i et surt medium for at fjerne estergruppen. Ammoniumhydroxid tilsættes for at øge pH til ud-fældelse af 3-methyl-7-[D-2-amino-2-(2'-thienyl)-acetamido]-Λ^-cephem-4-carboxylsyre-bis(DMF)-komplekset.

145912 11

Dette kompleks opløses i surt vand (pH 1-2), opvarmes til 50-60°C og behandles dernæst med base for at øge pH til udfældning af zwitterionen af 3-methy1-7-[D-2-amino-2-(2*-thienyl)-acetamido]-A^-cephem-4-carboxylsyre. Denne forbindelse separeres fra reaktionsblandingen, vaskedes, hvis det er ønsket, og tørres. Dette er et kendt antibiotikum omtalt i US patent nr. 3 352 858.

Eksempel_7

Til en opløsning af D-a-(4’-hydroxyphenyl)-a-(tert.-butoxy-carbonylamino)-eddikesyre, 2,6-lutidin i tetrahydrofuran sættes ethylchlorformiat til dannelse af et blandet anhydrid som beskrevet i eksempel 2 i US patent nr. 3 489 752. Til denne opløsning sættes p-nitrobenzylesteren af 7-ADCA til dannelse af p-nitrobenzyl-3-methy1-7-[D-cc-(4’-hydroxyphenyl)-a-(tert.-butoxycarbonylamino)-acetamido]-4 ^-cephem-4-carboxylsyre og behandles med base, indtil forbindelsen udfælder som dens DMF-kompleks. Komplekset behandles som i eksempel 5 til dannelse af 3-methy1-7-[D-α-(4'-hydroxyphenyl-a-amino)-acetamido]-Δ^-cephem-4-carboxylsyre.

På lignende måde kan man fremstille 3-methyl-7-[D-a-amino-a-(3',5’-dichlor-4'-hydroxyphenyl)acetamido]-A^-cephem-4-carboxyl-syre ved at acylere p-nitrobenzylesteren af 7-ADCA med det tilsvarende blandede 2-(3’,5?-dichlor-4’-hydroxyphenyl)-2-amino-eddikesyre-anhydrid, hvori aminonitrogenet er blokeret som beskrevet i US patent nr. 3 489 750, efterfulgt af en fjernelse af estergruppen. På lignende måde kan man fremstille 3-methyl- 7-[D-a-amino-a-(3'-chlor-4'-hydroxyphenyl)-acetamido]- Δ^-cephem- 4-carboxylsyre (US patent nr. 3 489 751) ved at acylere p-nitro-benzyl-7-ADCA-ester og dernæst at fjerne de amino-beskyttende grupper som beskrevet ovenfor.

Den analytiske procedure til bestemmelse af diazoterbart amin i cephalexinprodukter er angivet nedenfor:

Diazoterbart amin i cephalexinhvdrat

Kemisk betegnelse: 7-(D-oc-amino~a-phenylacetamido)-3-methyl- 3-cephem-4-carboxylsyre.

Alment navn: Cephalexin.

Analysemetode: Kolorimetrisk.

Anvendelse: Bestemmelse af diazoterbar amin.

12 145912 I. Apparatur:

Beckman Model Du spektrofotometer eller andet egnet spektrofotometer.

II. Reagenser:

1. saltsyre, 0,5 N

2. Natriumnitrat, 0,1 % i H20 3. Ammonium-sulfamat, 0,5 % i H20 4. N-(1-naphthyl) -ethylen-diamin-dihydrochlorid, 0,1 % i H20 III. Procedure:

Afvej nøjagtigt ca. 100 mg cephalexin i en 50 ml Erlen-meyer-kolbe. Tilsæt 3,0 ml vand efterfulgt af 10,0 ml 0,5 normal HC1. Tilsæt 2,0 ml 0,1 % natriumnitrit, bland og lad det henstå i 3 minutter. Tilsæt dernæst 2,0 ml 0,5 % ammoniumsulfamat, omryst og lad det henstå i 3 minutter. Tilsæt 2,0 ml 0,1 % N-(1-naphthyl)-ethylen-diamin-dihydrochlorid. Bland godt og lad det henstå i 20 minutter. Bestem absorptionen af denne opløsning ved 550 nyu på et egnet spektrofotometer ved anvendelse af 1,0 cm kuvetter og vand i referencekuvetten.

Fodnote: Denne metode er en modifikation af den, der er beskrevet af A.C. Bratton og E.K. Marshall, Jr. i J. Biol. Chem., 128, (1939), PP. 537 - 550.

IV. Resultater: : loo

Abs. x —-s—s- = Abs. pr. 100 mg cephalexin.

550 nyu vægt af prøve V. Bemærkninger:

Detektionsgrænsen er 50 ppm.