DK146287B - Fremgangsmaade til deoxygenering af et blodproevemateriale og kapillarroer til anvendelse ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

(19) DANMARK Cj)

j|| (.2) FREMLÆGGELSESSKRIFT „»146287 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 4691/76 (51) Int.CI.3: G 01 N 33/48 (22) Indleveringsdag: 18 okt 1976 (41) Aim. tilgængelig: 19 apr 1978 (44) Fremlagt: 22 aug 1983 (86) International ansøgning nr.:-(30)Prioritet: - (71) Ansøger ‘RADIOMETER A/S; 2400 København NV, DK.

(72) Opfinder Ole ‘Siggaard-Andersen; DK.

(74) Fuldmægtig: Plougmann & Vlngtott Patentbureau_ (54) Fremgangsmåde til deoxygenering af et blodprøvemateriale og kapillarrør til anvendelse ved fremgangsmåden

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til deoxygenering af et blodprøvemateriale og et kapillarrør til anvendelse ved frsmgangsnåden.

Ved undersøgelse af patienter for indholdet af carbonmonoxidhæmoglobin (HbCO) i blodet udtages en blodprøve, og prøvens indhold af HbCO bestemmes med et spektrofotometer. Dette kan enten gøres direkte uden forbehandling af blodprøven eller nøjagtigere efter en fjernelse af blodets indhold af oxygen. Blodets indhold af oxygen kan fjernes ved

Q

evakuering, udluftning med ikke-oxygenholdige gasser eller ved brug O af et reduktionsmiddel. Som reduktionsmiddel kan benyttes en vandig u £ opløsning af natriumdithionit (^28204) og tris (hydroxymethyl)-amino- £ methan (C4HnN03/ 1 det følgende kaldet Tris) i en koncentration sva- ^ rende til ca. 5 gange den støkiometriske mængde, når opløsningen af 3 reduktionsmidlet tilsættes blodet i forholdet 1:1 (v/v).

2 146287

Den reaktion, der forløber ved reduktion af blodets indhold af oxygen med dithionit, kan vises ved følgende reaktionsskema: 2 Na2S204 + 3 Hb02 + 2 H20 4 S04”- + 3 Hb + 4 H+ + 4 Na+

Den spektrofotometriske bestemmelse kan foretages under anvendelse af et egnet fotometer, som måler ved bølgelængderne 506 nm og 600 nm. Ved 506 nm absorberer hæmoglobin, oxyhæmoglobin (Hb02) og carbonmonoxidhæmoglobin praktisk taget ens, medens der ved 600 nm er en væsentlig forskel mellem på den ene side hæmoglobins absorption og på den anden side absorptionen forårsaget af oxyhæmoglobin plus carbonmonoxidhæmoglobin, der ved denne bølgelængde absorberer praktisk taget ens.

Når blodprøven er fri for oxyhæmoglobin, kan man ud fra disse to målinger bestemme blodprøvens indhold af carbonmonoxidhæmoglobin.

Fælles for de ovennævnte metoder til forberedelse af blodprøven til de spektrofotometriske målinger er, at de er tidskrævende og besværlige at udføre. Dette kan illustreres ved følgende beskrivelse af fremgangsmåden til reduktion af en blodprøve ved brug af det ovennævnte reduktionsmiddel: a) Centrifuger 10 ml blod ved ca. 5000 omdrejninger pr. minut i 3 minutter.

b) Frasug plasmaet.

C)1 Afvej 31 mg natriumdithionit og 22 mg Tris og opløs i 5 ml vand. Dette er reduktionsmidlet.

d) Overfør straks 2,5 ml reduktionsmiddel til en glassprøjte.

e) Sug 2,5 ml blodkoncentrat op i sprøjten, tilprop sprøjten, bland indholdet omhyggeligt og henstil sprøjten under rotation i 5 - 8 minutter.

f) Mål HbCO-indholdet under anaerobe forhold.

3 146287

Det vil ses, at den ovenfor beskrevne procedure er tids- og arbejdskrævende, indebærer fejlmuligheder og usikkerhedsfaktorer og kræver en relativt stor blodmængde.

Fra Clin. Chim. Acta 42 (1972), pp 85-100 og pp 101-108 og et foredrag holdt i Selskabet for Klinisk Kemi i oktober 1975 er det kendt at foretage en reduktion af tætpakkede erythrocyter i et kapillarrør. Ved denne kendte reduktion anvendes stadig en reduktionsmiddelopløsning af den art, der er omtalt ovenfor under punkt c) og punkt d), og det fremgår tydeligt af artiklerne i Clin. Chim. Acta, at denne opløsning er så ustabil, at den skal fremstilles frisk hver dag. Ved den kendte fremgangsmåde skal der således manipuleres med væsker, der må fremstilles frisk hver dag og derefter opbevares anae-robt i glassprøjter. Endvidere sker der ved denne kendte fremgangsmåde, også når den udføres i kapillarrør, en centrifugering af blodet og en fjernelse af plasmaet, således som det er anført ovenfor under punkt a) og b).

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en nem og bekvem fremgangsmåde til deoxygenering af en blodprøve, hvilken fremgangsmåde åbner mulighed for en langt mere simpel procedure ved bestemmelse af blodets indhold af carbonmonoxidhæmoglobin og andre bestemmelser, hvor en deoxygeneret blodprøve skal anvendes, f.eks. ved nul-kalibreringen af et oxygenmætningsmeter. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen foretages reduktionen af oxygen uden fortynding af prøven. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at blodprøvematerialet er en helblodprøve, og at denne indføres i et kapillarrør, som indeholder et tørt reduktionsmiddel for blodets indhold af oxygen, i hvilket kapillarrør reduktionsmidlets indvirkning på blodprøven lades foregå.

Herved opnås en afgørende forenkling af blodprøvens klargørelse til den fotoætriske bestormelse, og en række usikkerhedsfaktorer elimineres. Da reduktionsmidlet foreligger i kapillarrøret i tør form, undgås en fortynding af prøven, og man kan derfor, i modsætning til ved den ovennævnte kendte metode, bestorme den oprindelige hæmoglobinkoncentration (altså summen af alle hæmoglobin-fraktioner) . Endvidere er det en udbredt prøvetagningsteknik at tage blodet fra patienten i kapillarrør, og denne simple og velindarbej- 4 146287 dede teknik kan således umiddelbart anvendes til indføring af blodet i kapillarrøret med reduktionsmiddel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Ved udførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det hensigtsmæssigt, at kapillarrøret fyldes helt op med blodprøven og derefter forsegles i begge ender, og at blodprøven og reduktionsmidlet gennemblandes i kapillarrøret ved hjælp af et i kapillarrøret anbragt ferromagnetisk legeme, f.eks. et lille stykke ståltråd, der bevæges ved hjælp af en uden for røret værende magnet. Efter reduktionen kan prøven anvendes til det ønskede formål, f.eks. til måling af carbonmonoxidhæmoglobin, idet den let og simpelt under anaerobe forhold direkte kan overføres til et fotometer.

I forhold til den teknik, der som ovenfor beskrevet er kendt fra Clin. Chim. Acta og fra foredraget holdt i selskabet for Klinisk Kemi i oktober 1975 opnås den afgørende forenkling for brugeren, at der ikke længere skal manipuleres med væsker, som er ustabile, og som skal fremstilles frisk hver dag og opbevares under anaerobe forhold, ligesom blodprøvematerialet ikke behøver undergå en forudgående centrifugering og fjernelse af plasma.

Udover.at frembyde de ovennævnte fordele ved deoxygeneringen af en blodprøve, hvori blodets indhold af carbonmonoxidhæmoglobin skal bestemmes, frembyder fremgangsmåden ifølge opfindelsen også meget væsentlige fordele ved O-kalibreringen af et oxygenmætningsmeter. Ved denne O-kalibrering er den blodprøve, der indføres i kapillarrøret og i øvrigt behandles på samme måde, en blodprøve fra en voksen, rask ikke-ryger.

Opfindelsen angår også et kapillarrør til anvendelse ved den ovennævnte fremgangsmåde, og dette kapillarrør er ejendommeligt ved, at det indeholder et tørt reduktionsmiddel for reduktion af blodets indhold af oxygen i en tilstrækkelig mængde til reduktion af oxygenindholdet i det rumfang blod, der kan indeholdes i kapillarrøret.

5 146287 Når kapillarrøret skal anvendes til reduktion af blodprøver, der udtages direkte fra patienten, bør det foruden reduktionsmidlet indeholde et antikoagulationsmiddel. I de tilfælde, hvor den blodprøve, der skal indføres i kapillarrøret, f.eks. fra en sprøjte, allerede er tilsat et antikoagulationsmiddel, kan antikoagulationsmidlet undværes i kapillarrøret. Kapillarrøret ifølge opfindelsen er hensigtsmæssigt fra producenten præpareret med reduktionsmidlet og det eventuelle antikoagulationsmiddel og lufttæt forseglet i begge ender, og i denne form kan det under bibeholdelse af sin virkning opbevares gennem længere tid. På denne måde undgås det, at brugeren behøver manipulere med kemikalier til deoxygeneringen.

En hensigtsmæssig størrelse for kapillarrøret er en længde på ca.

10 cm og et rumfang på ca. lOO^ul, og det foretrækkes, at reduktionsmidlet og de eventuelle øvrige reagenser er anbragt som et lag af tørt materiale på rørets indvendige væg, hvilket f.eks. kan opnås ved den nedenfor beskrevne fremgangsmåde.

Reduktionsmidlet i kapillarrøret ifølge opfindelsen er i praksis fortrinsvis natriumdithionit, der i praksis fortrinsvis er kombineret med en passende pH-puffer, f.eks. Tris. Mængden af natriumdithionit i et kapillarrør med rumfang lOO^ul er hensigtsmæssigt mindst 0,12 mg (den støkiometriske mængde), fortrinsvis ca. 0,6 mg. Mængden af Tris i kapillarrøret er fortrinsvis ca. 0,7 mg pr. mg natriumdithionit.

Når kapillarrøret skal indeholde et antikoagulationsmiddel, er dette hensigtsmæssigt anbragt i tilstrækkelig mængde sammen med reduktionsmidlet på kapillarrørets indvendige væg. Antikoagulationsmidler, der egner sig til dette formål,er f.eks. heparin eller calciumbindere såsom trinatriumcitrat, dinatriumsaltet af ethylendiamintetraeddikesyre, natriumfluorid eller alkalimetalsalte af oxalsyre.

Det præparerede kapillarrør ifølge opfindelsen fremstilles hensigtsmæssigt ved, at en opløsning eller suspension af et reduktionsmiddel i et flygtigt medium føres gennem et kapillarrør under en oxygenfri atmosfære, og at opløsningsmidlet fordampes, så at der efterlades et lag af reduktionsmidlet på kapillarrørets indre væg. Når reduktionsmidlet er natriumdithionit, kan denne fremgangsmåde hensigtsmæssigt udføres ved, at en suspension af natriumdithionit og Tris i et flyg- 6 146287 tigt ikke-opløsningsmiddel for natriumdithionit og Tris føres gennem et kapillarrør under en oxygen- og vanddampfri atmosfære, hensigtsmæssigt ved, at kapillarrørets nedre ende dyppes i suspensionen, hvorefter den herved ved kapillarkræfterne indtrukne væskestreng ved hjælp af et påført undertryk suges til kapillarrørets anden ende, idet det flygtige medium fordampes ved sugningen. Det således fremstillede ka-pillarrør bør holdes under inert atmosfære, indtil det er forseglet i begge ender. Forseglingen kan f.eks. være en prop af epoxyharpiks i hver af kapillarrørets ender. Alternativt kan man overføre det præparerede kapillarrør under inert atmosfære til en lufttæt emballage, f.eks. en lamineret plast/aluminiumpose.

Som ovenfor nævnt kan kapillarrøret foruden reduktionsmidlet og den eventuelt sammen med reduktionsmidlet anvendte puffer indeholde et an-tikoagulationsmiddel, der da hensigtsmæssigt kan påføres kapillarrørets indervæg sammen med reduktionsmidlet på den ovenfor beskrevne måde, eller reduktionsmidlet kan på den ovenfor beskrevne måde indføres i et kapillarrør, der allerede er behandlet med antikoagulations-middel. (Kapillarrør præpareret med heparin er kendte og de kan fremstilles som beskrevet nedenfor). Det kan imidlertid også tænkes, at kapillarrøret skal anvendes i forbindelse med blodprøver, som allerede er tilsat et antikoagulationsmiddel, i hvilket tilfælde kapillarrøret ikke behøver at være præpareret med et antikoagulationsmiddel. I et tilfælde, hvor et kapillarrør, der ikke er præpareret med antikoagulationsmiddel, skal anvendes til en umiddelbart udtagen blodprøve, kan man også forestille sig at tilsætte antikoagulationsmidlet umiddelbart efter det præparerede kapillarrørs åbning, eller man kan tænke sig indføring af antikoagulationsmidlet sammen med omrøreren og eventuelt i første omgang anbragt på omrøreren.

Det er kendt at præparere glaskapillarrør, der skal anvendes til blod-prøvetagning, med heparin for at hindre blodets koagulation i rørene.

I sådanne præparerede glaskapillarrør findes heparin som et tyndt lag på rørets inderside, og selve den procedure, ved hvilken dette lag påføres, minder om den ovenfor beskrevne fremgangsmåde til fremstilling af kapillarrøret ifølge opfindelsen, idet nemlig f.eks. en dråbe af en opløsning af 0,35 g natriumheparinat i l«5 mi methanol maenoiaenae 3,75 ml vand ved hjælp af en sprøjte med påsat kanyle indføres i den ene ende af et kapillarrør, hvorefter røret holdes i ca. 10 sekunder i et varmekammer ved ca. 70°C og derefter gennemblæses med kold luft i ca. 10 sekunder.

7 146287

Tegningen viser et kapillarrør ifølge opfindelsen. Et glaskapillar-rør 1 med længde ca. 100 mm og rumfang ca. lOO^ul er i begge ender lukket ved hjælp af en prop af epoxyharpiks 2. Det kan være hensigtsmæssigt, at der til lettelse af glassets åbning i hver ende af kapillarrøret findes en kærv, rille eller ridse 3. På glassets indvendige væg findes en belægning 4 af små krystaller eller amorfe partikler af reduktionsmidlet, f.eks. natriumdithionit, den eventuelle puffer og det eventuelle antikoagulationsmiddel.

Opfindelsen belyses nærmere ved følgende eksempler:

Eksempel 1.

Natriumdithionit og Tris formales anaerobt hver for sig i en kuglemølle i 8 - 12 timer. De formalede pulvere blandes i forholdet 31 vægtdele natriumdithionit til 22 vægtdele Tris, og det færdige pulver suspenderes i dichlormethan (CH2C12) i forholdet 1 g pulver til 6 ml dichlormethan. Den resulterende suspension holdes i stadig omrøring til forhindring af sedimentation. Denne operation og alle følgende operationer i fremstillingsproceduren foregår under inert atmosfære, da natriumdithionit ellers ved tilstedeværelse af oxygen eller vanddamp vil nedbrydes i løbet af få minutter. Et 100 mm langt kapillarrør med indvendigt rumfang ca. lOO^ul neddyppes ca. 1 cm i suspensionen og hæves derefter ud af denne, og den fremkomne væskestreng suges hen til rørets anden ende. Herved fordamper dichlorme-thanet, og der dannes en praktisk taget ensartet belægning på rørets indervæg. Røret lukkes derefter i begge ender med et oxygen- og vanduigennemtrængeligt materiale, f.eks. epoxyharpiks, og er derefter klar til forsendelse.

Eksempel 2.

Der gås frem på samme måde som beskrevet i eksempel 1, idet der dog yderligere tilsættes 11,13 mg heparin pr. 6 ml CH2C12· Ved anvendelse af lO^ul suspension pr. kapillarrør vil de færdige rør hver indeholde ca. 19^,ug heparin, hvilket er ca. 20 gange den nødvendige mængde.

0 146287

O

I stedet for heparin kan også anvendes andre antikoagulanter, f.eks. trinatriumcitrat, ethylendiamintetraeddikesyre eller især dinatriumsaltet deraf, natriumfluorid eller ravsyremonolithium-, mononatrium-eller monokaliumsalt. De anvendte mængder af disse antikoagulerings- midler er: Pr. 6 ml i det færdige CH2CI2 kapillarrør

Trinatriumcitrat: 286 mg ca. 500^ug ethylendiamintetra- eddikesyre-dinatriumsalt: 48 mg ca. 80^ug natriumfluorid: 600 mg ca. lOOO^ug oxalsyremonolithium-, mononatrium- eller monokaliumsalt: 120 mg. ca. 200yug.

Eksempel 3.

En bestemmelse af carbonmonoxidhæmoglobin under anvendelse af det ifølge eksempel 2 fremstillede kapillarrør udføres på følgende måde: 1) Røret afskæres i begge ender, så lukkematerialet fjernes.

2) Blodprøven overføres til røret, der fyldes helt op. Hensigtsmæssigt kan blodprøven simpelt hen fra patienten direkte tages i kapillarrøret ved den velkendte metode.

3) Et lille stykke ståltråd, der virker som magnetomrører, anbringes i kapillarrøret, som derefter tilstoppes med modellervoks eller et lignende materiale.

4) Med en magnet bevæges ståltrådsstykket i kapillarrøret, så at prøven gennemblandes omhyggeligt, hvorefter den henstilles i 5 - 8 minutter.

5) Røret afskæres i begge ender, og prøven overføres anaerobt til et egnet fotometer, hvor den udmåles.

Claims (7)

146287 y Patentkrav.

1. Fremgangsmåde til deoxygenering af et blodprøveraateriale ved behandling af blodprøvematerialet med et reduktionsmiddel i et kapillarrør , kendetegnet ved, at blodprøvematerialet er en helblodprøve, og at denne indføres i et kapillarrør, som indeholder et tørt reduktionsmiddel for blodets indhold af oxygen, i hvilket kapillarrør reduktionsmidlets indvirkning på blodprøven lades foregå.

2· Kapillarrør til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder et tørt reduktionsmiddel for reduktion af blodets indhold af oxygen i en tilstrækkelig mængde til reduktion af oxygenindholdet i det rumfang blod, der kan indeholdes i kapillarrøret.

3. Kapillarrør ifølge krav 2> kendetegnet ved, at det foruden reduktionsmidlet indeholder et antikoagulationsmiddel.

4. Kapillarrør ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at det er lufttæt forseglet i begge ender.

5. Kapillarrør ifølge et hvilket som helst af kravene 2-4, kendetegnet ved, at reduktionsmidlet er natriumdithionit.

6· Kapillarrør ifølge krav 5/ kendetegnet ved, at det yderligere indeholder en pH-puf-fer.

7. Kapillarrør ifølge krav 3, kendetegnet ved, at antikoagulationsmidlet er heparin, tri-natriumcitrat, dinatriumsaltet af ethylendiamintetraeddikesyre, natriumfluorid eller et alkalimetaloxalat.