DK146721B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 4'-epi-6'-hydroxyadriamycin - Google Patents

Description

i 146721

Den foreliggende opfindels angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt antitumorglycosid, 4'-epi-6'-hydroxyadriamycin, som har den i kravet anførte formel V.

Denne fremgangsmåde forudsætter fremstillingen og brugen af visse hidtil ukendte mellemprodukter.

Det omhandlede glycosid udviser antimitotisk aktivitet både "in vivo" og "in vitro" og er et nyttigt terapeutisk middel ved behandlingen af tumor- og virussygdomme hos mennesker. Udgangsmaterialet 4'-epi-6'-hydroxydaunomycin (I) 1 ° ? J 14 2 _C“3

A/YYY

s 0H

OGH o OH H ί 0 « 0 H0 Ϊ —./11 HO b 4 MHz (I) fremstillesved kondensation af daunomycinon (II)

0 OH

COCHi Λ TX J™ OCH« O OH !

OH

med 1,2,3-trideoxy-4,6-di-0-(p-nitrobenzoyl)-3-trifluor-acetamido-L-arabino-hex-l-enpyranose (ill) 2 146721 °lN _<\=y>~ ‘"°

0ζΗ^ζ Λ—C-o--- M-H

c=o cf3 (nr) til dannelse af glycosidbindingen. Ved at fjerne de beskyttende grupper på sukkerdelen fremkommer forbindelse (I), der isoleres som hydrochlorid.

Det er et meget vigtigt faktum at praktisk taget kun tX-glyeosidet dannes ved denne fremgangsmåde, idet -anomeren kun forefindes i en meget lille mængde i reaktionsblandingen.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte, behandles forbindelsen (I) med en opløsning af brom i chloroform og giver l4-brom-4'-epi-6' -hydroxy-daunomyein (IV),

O OH

COCHiBr och3 o (il) 3 146721 som ved styret hydrolyse, giver den omhandlede 4'-epi-6'-hydroxyadriamycin (V),

O OH

ςόχτ™ OCH3 o oh j NH, (2) der til slut isoleres som hydrochlorid.

Den reaktive, beskyttede forbindelse (III), som kondenseres med daunomycinon (il) er et nyt mellemprodukt som udledes af 3-amino-2,3-dideoxy-L-arabino-hexose (Vi), ΝΗλ m

Denne aminosukker var tidligere ukendt i L-serien eg er for første gang blevet fremstillet af os efte# følgende fremgangsmåde. L-gluoose er blevet omdannet til methyl-3-azido-4,6-0-benzyliden-2,3-dideoxy- OC-L-arabino-bexopyranosid (VII) 4 146721 OCHj N3 (3) ifølge de fremgangsmåder der er kendt i litteraturen for D-isomeren, ( G.U.Bollenbaek : "Methods in carbohydrate chemistry" II, 326, 1963, Acad.

Press. L.F.Wiggins, ibid, II, 188, 1963. A,C.Richardson : Carbohydrate Research, 422, (1967)).

Penne forbindelse omdannes ved katalytisk hydrogenering til 3-amino derivatet (VIII), OCHj NHi (Μ)

Efter at benzylidensubstituenten er fjernet, ved hjælp af hydrogenchlorid i methanol, fremkommer en methyl—3—amino—2,3—dideory—oc—L-arabino—hexøpyranosid (ix), 00¾ /— (S) tidligere ukendt også i P-serien, som omdannes ved behandling med syre til den ønskede forbindelse (VI) der isoleres som hydrochlorid.

Forbindelsen (Vi) behandles med trifluoreddikesyreanhydrid, og derefter med en lavere aliphatisk alkohol, hvorved R-trifluoracetylderivatet (x) fremkommer, 5 146721 ho -y

NH

l

CO

‘Fj (I) som til slut omsættes med p-nitrobenzoylchlorid i pyridin, efterfulgt af behandling med en svag base, hvorved der fremkommer l,2,3,-trideoxy-4,6-di-0-(p-nitrobenzoyl)-3-trifluoracetamido-L-arabino-hex-l-enpyranose (III) i godt udbytte.

I det følgende belyses fremstilllingen af forbindelserne III og I og fremgangsmåden ifølge opfindelsen nærmere.

Fremstilling af mellemproduktet 1,2,3-trideoxy-4.6-di-0-(n-nitrobenzoyl)-3— trifluoraoetamido-L-arabino-hex-l-enpyranose (III) 2,85 g methyl-3-azido-4,6-0-benzyliden-2,3—dideoxy— ct—L—arabino—hexopyrano— sid (VII) opløses i 40 ml vandfrit methanol og hydrogeneres ved 4,2 kp/cm^ ved stuetemperatur i tilstedeværelse af Raney-nikkel i 3 timer. Katalysatoren filtreres fra og filtratet inddampes til tørhed in vacuo.

Remanensen omkrystalliseres fra ethylacetat, hvorved der fremkommer 2,17 g methyl-3-amino-4,6-0-benzyliden-2,3-dideoxy-oC-L-arabino-hexopyranosid (VIII). Smp. 95-96°C ·, [ot]2° = -=-86° ( c = 0,5 CIC13). Udbytte 84 £ ; p.m.r. (CDC13) s 1,3-2,3 & ( m, 2H, C(2)E2), 1,4 6 ( bred s, 2H, BHg), 3.2- 4,4 6 ( flere m, 5H, C(3)H, C(4)H, C(5)H, 0(6)¾ ), 3,37 Å ( s, 3H, CH30 ), 4,76 6 ( dd, J = 3,5 Hz og J<1 Hz, IH, C(l)H ), 5,57 é ( s, IH ), o-<- 7.2- 7,7 S ( m, 5H, a6H5 ) ; 6 146721 massespekter : m/e 265 ( M+), m/e 234 ( M-0CH3), m/e 162 ( ^ ?5°6 ° m/e 149 ( 06H5-CBkS-CH2-CHO ) m/e 105 ( C^-cS ) 2,15 g af forbindelsen (VIII) opløses i 40 ml 0,5 I hydrogenchlorid i methanol og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 1 time. Opløsningen inddampes til det halve volumen, vandfrit ether tilsættes og de resulterende krystaller opsamles ved vacuumfiltrering og vaskes med en lille mængde tør ether, hvorved der fremkommer 1,5 g methyl-3-amino-2,3-dideoxy- oc -L-arabino-hesopyranosid (IX), smp. 120°C dec. ; [oC]^° = +920 ( C = 0,4 HgO ). Udbytte 87 & p.m.r. ( D20) s 1,5-2,5 S(m, 2H, C(2)H2), 3,2-4,0 <i ( flere m, 5H, C(3)H, C(4)H, C(5)H, C(6)H2 ), 3,416( s, 3H, CH30- ), 4,98(( ( dd, J= 3 Hz og J = 1,5 Hz, IH, C(l)H )·, massespekter : m/e 178 ( M + l), m/e 146 ( M-31 ) m/e 86 ( H^ = fe-0CH3 ), m/e 72 ( HgS = CH-CH2-CH0 ), m/e 59 ( H2f = CH-CH-OH ), m/e 44 ( ^ )

Η"" V

1,5 g af aminoglycosidet (IX) koges med N saltsyre under tilbageløbskøling i 5 timer. Opløsningen omrystes ved stuetemperatur med Amberli te IR 45 (OH-) ionbytter indtil pH-værdien er 5· Ionbytteren filtreres fra og filtratet ind*r dampes in vacuo til det halve volumen og frysetørres derefter. Remanensen omkrystalliseres fra methanol-ethylacetat, hvorved der fremkommer 1,33 g 3-amino-2,3-dideoxy-L-arabino-hexose (Vi) som hydrochlorid, smp. 155-157°C de®. Mp° = -55° ( c. = 0,5 H20 ). Udbytte 95 1° } 7 146721 Ρ·®*r. (3)gO) s 1,7-2,7 é ( ®, 2H, ¢(2^2), 3,3-4,16( flere m, 5H, C(3)H, C(4)l, C(5)H, 0(6)^),, 5,06 6( dd, J = 10 Hz og J = 2 Hz, 0,4 H, C(l)H ), 5,46 6( bred s, H = 7 Hz, 0,6 H, C(l)He^

Til en suspension af 1,25 g af forbindelsen (Vi) i tør ether sættess 7,6 ml trifluoreddikesyreanhydrid \mder afkøling og omrøring. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 20 timer og den resulterende klare opløsning inddampes in vaouo. Den faste remanens opløses i 20 ml vandfri methanol og henstilles ved stuetemperatur i 20 timer. Efter at opløsningsmidlet er fjernet omkrystallise— res remanensen fra acetone-chloroform, hvorved der fremkommer 1,72 g 2,3-di— de 02y- 3-1 r i fluo racet amido-L-arabinohexo s e (X), smp. 177°C, = 4-58° (c s 0,5 dioxan). Udbytte 90 massespekter : m/e 242 ( M-OH), m/e 169 ( Γ Aj 1+ ), *- 3 il 3 0 m/e 155 ( H0-CH-CH=NH-C0CF3 )/} m/e 140 ( CP3-C0—|<j ),

H

m/e 114 ( CP3-CO-fe3 ).

1,1 g af forbindelsen (x) sættes, i små portioner i løbet af 30 minuter under omrøring og ved stuetemperatur, til en opløsning af 3,17 g p-nitrobenzoyl-chlorid i 30 ml tør pyridin og omrøringen fortsættes ved stuetemperatur i 20 timer. Til opløsningen, afkølet til 0°C, sættes en isafkølet opløsning af · 1,44 g natriumhydrogencarbonat i 20 ml vand og blandingen hældes derefter i 35Ο ml isvand.

Bundfaldet fjernes ved filtrering, vaskes med vand og tørres over phoaphor-pentaoxid. Det tørre produkt omkrystalliseres fra dichlormethan-ether, hvorved der fremkommer 2,3 g af det ønskede produkt : l,2,3-trideoxy-4,6-di-0- (p-nitrobenzoyl)-3-trifluoracetamido-L-arabino-hex—1-enpyranose (IH), smp. 214-215°C, = -5-117°- ( <* = 0,5 CHC13). Udbytte 95 & 8 146721 Ρϊβι.γ. ( CDC13 - JMSO - ά&3ιΐ) : 4,3—5*6 ίί( flere m, 4H, C(3)H, C(4)H, C(5)h, C(2)H ), 4,52 6( bred s, Η, 2H, C(6)H2 ), 6,57 é( bred s, H = 5 Hz, IH, C(l)H ), 8,21 (i ( s, 4H aromatisk ), 8,35 é ( s, 4H aromatisk ), 9,27 6 ( s, IH, HH ).

Fremstilling af 4*-epi-61 -hydroxydaunomycin (i) 200 mg daunomycinon (H) opløses i 100 ml Tandfrit "benzen, til denne opløsning; sættes 540 mg 1,2,3-trideoxy-4.6-di-0-(p-nitrobenaoyl)-3-trifluoracetamido-L-arabino-hex-l-enpyranose (ill) og 20 mg p-toluensulfonsyre. Eeaktions-blandingen omrøres ved 55°C i 20 timer og efter afkøling til stuetemperatur filtreres det dannede bundfald fra og omkrystalliseres fra ethanol, hvorved man får 340 mg af den beskyttede 7-0-[4,,6,-cLi-0-(p-nitrobenzoyl)-3,-tri-fluoracetamido-OC-L-arabino] -daunomycinon ; Smp. 282°C. = +260° + 5° ( c = 0,05 chci3).

Det beskyttede glycosid opløses i 20 ml dioxan og behandles, efter afkøling til 0°C, med 0,2 H vandig natriumhydroxidopløsning. Efter 1 time ved 0°0 indstilles opløsningens pH til 4,5 med 1 H saltsyre og dioxan fjernes ved inddampning in vaouo. Den resulterende vandige opløsning indstilles, efter vask med chloroform, til pH 8,5 med 0,2 H vandig natriumhydroxid og ekstra-heres med chloroform. Ekstraktet tørres over vandfrit natriumsulfat og koncentreres til et lille volumen.

En ækvivalent saltsyre i methanol tilsættes, hvorved men får 160 mg 41-epi-6*-hydroxy-daunomycin som hydrochlorid, smp. 199“201°C, +388°-5° ( c = 0,05 CH3GH ) udbytte 56 <fo.

Fremgangsmåde ifølge opfindelsen, fremstilling af 4'-epi-6'-hydroxyadriamycin (V) (IMI 31)_______ 0,25 g 4’-epi-6'-hydroxydaunomycin (I) opløses i en blanding af 3>5 ml methanol og 10 ml vandfrit dioxan og omsættes, under omrøring, med 0,9 ml 166721 9 af en opløsning af 0,88 g brom i 10 ml chloroform. Raktionsblandingen hældes, efter 1 time ved stuetemperatur, i 75 ml ethylether under omrøring.

Den rå l^-brom-il'-epi-å'-hydroxydaunomycin filtreres fra og opløses i en blanding af 5 ml acetone og 5 ml 0,25 N hydrogenbromid. Efter 12 timer ved stuetemperatur ekstraheres den sure opløsning først med chloroform, for at eliminere aglyconerne, og dernæst med n-butanol. Adskillige ekstraktioner gennemføres indtil alle farvede stoffer er i det organiske lag. Efter koncentration af n-butanol i vacuum, får man 0,27 g af 14-brom derivatet. Dette produkt opløses i 10 ml vand og behandles med 0,5 g natriumformiat.

Efter 48 timer ved stuetemperatur inddampes reaktionsblandingen til tørhed i vacuum og remanensen opløses i 30 ml af en chloroform-methanol blanding (vol. forhold 2:1) og vaskes med 10 ml 1% vandig NaHCO^ opløsning. Den vandige fase ekstraheres flere gange med chloroform indtil alle farvede stoffer er i det organiske opløsningsmiddel. De samled chloroformekstrakter tørres over vandfrit natriumsulfat og koncentreres under reduceret tryk til et lille volumen, hvorefter det behandles med en ækvivalent 1 N saltsyre i methanol. Ved tilsætning af 10 volumen ethylether får man 0,125 g 4'-epi-6'-hydroxyadriamycin (V) som hydrochlorid. Smp. l80°C dec., [°t] = +216° (c = 0,01 CH^OH), kromatografisk RF på kiselgel HF plader (Merck) er 0,5, idet solventsystemet chloroform-methanol-vand (vol. forhold 130:60:10) anvendes .

Biologisk aktivitet Materialer og metoder In vitro forsøg

HeLa celler blev udsat for de forbindelser, der skulle afprøves, i 2-8-24 timer, derefter blev forbindelserne fjernet og cellerne blev udsået på 5 mm Falcon plastik skåle (200 celler/skål) i vækstmedium. Koloniantal blev bestemt mikroskopisk 5 døgn senere. Museembryofibroblaster (MEF) blev udsået på 35 mm Falcon plastik skåle, inficeret 24 timer senere med Moloney Sarcoma virus (MSV), og behandlet i 3 døgn med forskellige koncentrationer af forbindelserne. Antal foci af transformerede celler blev mikroskopisk bestemt 5 døgn efter infektionen. Uinficerede MEF blev behandlet på lignende ίο 146721 måde; i slutningen af eksperimentet blev cellerne talt i et hæmocytometer.

I alle forsøgenen blev cellerne incuberet i en 5% CO,, incoubator ved 37°C. Forbindelserne blev opløst i destilleret vand og derefter fortyndet i kulturmedium.

Resultaterne er opgivet som ID^q (Inhibitordosis 50%), beregnet efter do-sis/effekt kurver.

In vivo forsøg

Antitumoraktiviteten for undersøgte forbindelser blev undersøgt på ascites

Sarcoma 180. 3 måneder gamle CD 1 mus blev anvendt. Sarcoma 180 ascites cel- 6 ler blev intraperitonealt inoculeret (10 celler/mus).

Forbindelserne blev opløst i destilleret vand og derefter fortyndet i Ringer opløsning, og anvendt intraperitonealt 1 døgn efter tumorimplantationen (10 ml/kg legemsvægt). Den toksiske virkning blev bestemt ved makrosko-piskautopsiske resultater, hovedsageligt som reduktion af miltstørrelsen, sammenligning af forbindelsernes effektivitet blev baseret på maksimal forøgelse af middeloverlevelsestid, sammenlignet med ubehandlede kontroller, over det anvendte dosisområde. Antallet af langtidsoverlevende (LTS) henviser til tumorfri mus ved slutningen af forsøget (60 dage).

Resultater

Aktiviteten af den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelse 4' -epi-6 Miydroxyadriamycin, sammenlignet med de nært beslægtede forbindelser, daunomycin og adriamycin, på de undersøgte "in vitro" systemer er angivet i Tabel 1.

Forbindelsen viste en lavere aktivitet end stamforbindelsen på HeLa celler, på MSV foci og på MEF proliferation.

Tabel 2 angiver den observerede effekt på ascites Sarcoma 180. Den optimale antitumordosis (det er den dosis, hvor maksimal antitumoreffekt blev fundet) var på 10 mg/kg .

Ved den optimale dosis var antitumoraktiviteten, bedømt ud fra forøgelsen af levetiden af behandlede mus sammenlignet med kontrollerne, lavere end den der blev observeret efter adriamycinbehandling.

Med hensyn til den toksiske virkning, en betydningsfuld og ofte afgørende faktor, som må tages i betragtning efter en forlænget behandling med store 11 146721 kumulative doser af antitumorantibiotika, kan det iagttages, at det nye afprøvede derivat er afgørende mindre toksisk end stamforbindeisen.

Tabel 1 "In vitro" aktivitet af Ji'-epi-b'-hydroxyadriamycin. IDj_q (ng/ml).

Forbindelse HeLa celler MSV foci- MEF pro- T , kloneffektivitet dannelse liferation

Labora- ____ kode"' Exponeringstid for 2 „ 24 72 72 lægemiddel (timer)

Daunomycin 0 300 13 3 5,5 9

Adriamycin 0 280 110 18 2,5 7 IMI 31 4'-epi-6'-hydroxy- adriaraycin 900 1000 1000 25 50 o = gennesmsnitsværdi for flere eksperimenter 12

Tabel 2 146721

o X

Aktivitet af 4’-epi-6'-hydroxy-adriamycin.på ascites Sarcoma 180 __J__

Laborato- Forbindelse Dosis T/C 0 LTS + Toks. ΐ riekode (mg/kg) % 0,5 142 1/10 O 1 \ 183 25/159

Adriamycin 2 210 30/125 5 243 27/125 7/125 10 212 18/139 18/139 IMI 31 4'-epi-6'- hydro- 7,5 143 1/10 xyadriamycin 1(3 162 1/10 15 134 2/10 ikke tok sisk ved dosis 15 mg/kg x = 1 behandling i.p. på 1. dag o = Middeloverlevelsestid i % over kontrollerne + = Langtidsoverlevende ved 60 døgn + = Mus som døde af toksiske virkninger sammenlignet med det totale antal o = Gennemsnitsdata for et antal forsøg

Optimale doser er understreget.

Claims (3)

146721 Analogifremgangsraåde til fremstilling af 4'-epi-6'-hydroxy-adriamycin med formlen V

0 OH C0-CH20H och^ o oh :x=:^ NH „ 2 kendetegnet ved, at ^ ’-epi-6'-hydroxydauno-mycin med formlen I 0 1 8 ?H ,J 1^ JJ 1 i:iC — CH rvvr¥

3 IMi / 0H OCH 0 OH 3 0 Ji. HO—V 4 nh2