DK147202B - Fremgangsmaade til udvinding af maltosephosphorylase og beta-phosphoglucosemutase som raaekstrakt eller i beriget form og anvendelse af den fremstillede ekstrakt - Google Patents

Description

147202

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til udvinding af maltosephosphorylase og,3-phosphoglucosemutase som.råekstrakt eller i beriget form af mikroorganismer og anvendelsen af de således fremstillede ekstrakter.

Det er kendt, at maltosephosphorylase forekommer i Neisseria meningiti-dis (J. Biol. Chem. 199, 153 (1952)), i ikke identificerede øllactoba-ciller (Biochem. J. 78, 204 (1961)) og i Lactobacillus brevis IFO 3345 = ATCC 8287 (Agr. Biol. Chem. 37, 2813 (1973)) og kan udvindes heraf.

2 147202

Forekomst af β-phosphoglucosemutase er kendt i kaninmuskler, i gær og Neisseria meningitidis (J. Biol. Chem. 236, 2186 (1961)), samt Lacto-bacillus brevis ATCC 8287.

De to nævnte enzymer er teknisk af interesse, da de sammen kan anvendes til bestemmelse af α-amylase, et diagnostisk meget vigtigt enzym. Denne bestemmelse er baseret på hydrolyse af stivelse med α-amylasen under dannelse af maltose. Den således dannede maltose bliver af maltosephos-phorylase (MP) i nærværelse af phosphat spaltet i glucose og β-glucose-1-phosphat, og sidstnævnte omdannes af β-phosphoglucosemutasen (3PGM) til a-glucose-6-phosphat, som så på kendt måde i nærværelse af glucose- 6-phosphat-dehydrogenase (G6PGH) reducerer NAD til NADH og derved selv overgår til 6-phosphogluconat. Det således dannede NADH er dermed et mål for α-amylaseaktiviteten.

Til kliniske prøver med kombinerede enzymatiske reaktioner, hvori der således skal anvendes flere enzymer, spiller det en afgørende rolle, om de nødvendige enzymer er let tilgængelige og uden stort besvær kan bringes i en til analysen egnet form. For prisen for sådanne enzymatiske bestemmelser afgøres i det væsentlige af prisen på de hertil anvendte enzymer. Det er særlig gunstigt, hvis der af et enkelt udgangsmateriale kan opnås flere til en bestemt prøve anvendte enzymer samtidig.

Blandt de hidtil kendte udgangsmaterialer forekommer de to ovennævnte enzymer ganske vist i Neisseria meningitidis sammen i en form, som muliggør deres anvendelse til en a-amylaseprøve uden forudgående adskillelse. Det er dog en betydelig ulempe, at det drejer sig om en yderst farlig og virulent mikroorganisme, som kun under største forsigtigheds-foranstaltninger kan anvendes som kilde til industrielt anvendte enzymer. Desuden er de fundne aktiviteter af de nævnte enzymer utilfredsstillende i denne mikroorganisme. Lactobacillus brevis ATCC 8287 indeholder desuden α-glucosidase, et ved anvendelsen forstyrrende enzym, således at en oprensning her er uomgængelig.

Det er derfor den foreliggende opfindelses opgave at skaffe en fremgangsmåde til samtidig udvinding af MP og β-PMG, som undgår anvendelse af den farlige Neisseria meningitidis, og som muliggør en simpel udvinding af enzymerne ud fra let tilgængelige, uskadelige udgangsmaterialer.

3 147202

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til udvinding af maltosephosphory-lase og β-phos'phoglucomutase som råekstakt eller i beriget form uden adskillelse af mikroorganismer, ér· Uoverensstemmelse hermed ejendommelig ved, at.ekstrakten udvindesdf Lactobacillasbrsvis NCIB 8836, 8561, 8562, DSM 20054, Lactobacillus plantarum DSM 20174 og dsm 43, Lactobacillus reuteri DSM 20016, Lactobacillus fermentum DSM 20052, Streptococcus spec. DSM 1118, DSM 1119, BSM 1120 og/eller DSM 1121.

Overraskende har det vist sig, at de to nævnte enzymer er indeholdt sammen i de ovenfor anførte mikroorganismer i høj aktivitet og let kan udvindes deraf.

Til anvendelsen til α-amylasebestemmelsen kan råekstrakten af de nævnte mikroorganismer anvendes direkte. Til dette formål bliver mikroorganismerne oplukket ved sædvanlige fysiske metoder, f.eks. med ultralyd, ved højtryksdispersion, udrivning eller lignende, uopløselige fragmenter fraskilles, og den klare overliggende væske anvendes som sådan eller i frysetørret form til bestemmelsen af α-amylase. Eventuelt kan disse råekstrakter også underkastes en yderligere rensning. Da en adskillelse af de to enzymer skal undgås til anvendelsen til a-amylasebestemmelsen, sker den videre rensning fortrinsvis under anvendelse af en prøve, ved hvilken den samlede aktivitet af de to enzymer bestemmes efter hvert rensningstrin, idet man tilsætter en egnet stødpude såsom maltose, NADP

og G6PDH og måler dannelsen af NADPH. Fortrinsvis aktiveres herved en- 2+ zymerne MP og β-PMG ved tilsætning af a-glukose-l,6-diphosphat og Mn -ioner, f.eks. i form af mangansulfat eller et andet organisk eller uorganisk mangansalt.

Opfindelsen angår endvidere anvendelsen af maltosephosphorylase og β-phosphoglucosemutase, som fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som råekstraktrakt eller i beriget form til bestemmelse af α-amylase, eventuelt under tilsætning af a-glucose-1,6-diphosphat 2+ og/eller Mn -ioner.

Opfindelsen gør det muligt at udvinde de to nævnte enzymer på væsentligt simplere og billigere måde og i en form, hvori de kan anvendes direkte uden forudgående adskillelse til bestemmelse af α-amylase. Udførelsen af en sådan bestemmelse forenkles og lettes derved væsentligt.

Opfindelsen belyses nærmere af følgende eksempler.

Eksempel 1 4 147202

De i følgende tabel anførte mikroorganismer dyrkes på et medium indeholdende 1% maltose ifølge Kamogawa (Agr. Biol. Chem. 37, 2813 (1973)) og oplukkes derefter ved højtryksdispersion. Efter fracentrifugering af de uopløselige dele blev den fremkomne råekstrakt undersøgt direkte for sin egnethed til a-amylasebestemmelse efter følgende skema: . „ a-amylase

Stivelse + H20 ---^ maltose 3-

Maltose + PO^ MP^ glucose + β-glucose-l-phosphat β-glucose-l-phosphat —^^^^glucose-6-phosphat

Glucose-6-phosphat + NAD+ 6-phosphogluconat + NADH +H+

Til konstatering af egnetheden af råekstrakten blev anvendt følgende forsøgssats: 3,4 ml 0,1 M phosphatstødpude + a-glucose-l/6-diphosphat (c =0,05), pH 6,5 0,1 ml MnS04 1% .

1,0 ml 0,2 M Maltose(Merck, til biokemiske formål) 0,5 ml råekstrakt

Inkubation: 1 time ved 37°C

Stop: 1 ml prøve - 3 minutter/100°C, derefter centrifugering og anvendelse af 0,25 ml overstående væske til følgende bestemmelse: modificeret a-glucose-6-phosphatprøve: 2,54 ml 0,3 M TRA-stødpude, pH 7,6 0,1 ml 0,1 M MgCl2 0,1 ml NADP (c = 10) 0,25 ml overstående væske.

Start: 0,01 ml G6PDH (c = 1) T = 25°, måling af ΔΕ0,,.

366 Følgende tabel viser de opnåede resultater: 5 147202

Stamme ΔΕ (NADPH)^

Lactob. brevis NCIB 8836 0,850

Lactob. plantarum DSM 20174 0,675

Lactob. reuteri DSM 20016 0,252

Lactob. brevis NCIB 8561 0,150

Lactob. brevis NCIB 8562 0,100

Lactob. plantarum DSM 43 0,090

Streptococcus spec. DSM 1118 0,115

Streptococcus spec. DSM 1119 0,125

Streptococcus spec. DSM 1120 0,210

Streptococcus spec. DSM 1121 0,110 ^ΔΕ korrelerer direkte med ΜΡ/β-PGM-aktiviteten Eksempel 2

Der blev anvendt et reagens, som havde følgende sammensætning:

Phosphatstødpude 20 mM; pH 6,5

NAD 2 mM

Maltotetraose 10 mM

Opløselig stivelse

Glucose-l,6-diphosphat spor Råekstrakt af lactob. plantarum DSM 20174 indeholdende maltosephosphorylase 3 U/ml og gr-phosphoglucomutase 1 U/ml G6PDH (Leuconostoc mesent.) 9 U/ml opløst i vand

Den fremkomne opløsning blev inkuberet ved 30°C, og prøveopløsningen blev tilsat, og efter 5 minutters forinkubering blev i et fotometer målt extinktionsdifferencen ved Hg 334 nm i 5 minutter. For 2,0 ml reagens og 0,10 ml prøve fås følgende beregningsformel for aktiviteten af α-amylase i prøven: U/l = ΔΕ/min x |^U^50__=AE/min x i699