JPS61268178A - フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ - Google Patents
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼInfo
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- JPS61268178A JPS61268178A JP10842285A JP10842285A JPS61268178A JP S61268178 A JPS61268178 A JP S61268178A JP 10842285 A JP10842285 A JP 10842285A JP 10842285 A JP10842285 A JP 10842285A JP S61268178 A JPS61268178 A JP S61268178A
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- acid oxidase
- amino acid
- fructosyl amino
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規な酵素フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
及びその製造法に関する。
及びその製造法に関する。
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、イミノ２酢酸及
びその誘導体を酸化してグリオキシル酸又はα−ケトア
ルデヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成する反応
を触媒する酵素である。食品や生体内では還元性の糖、
特にアルドースと呼ばれるアルデヒド基を有する糖と蛋
白質、ペプチド、アミノ酸等のようにアミン基を有する
物質が共存する場合、両者が不可逆的に結合してケトア
ミン化合物が生成してくる。
びその誘導体を酸化してグリオキシル酸又はα−ケトア
ルデヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成する反応
を触媒する酵素である。食品や生体内では還元性の糖、
特にアルドースと呼ばれるアルデヒド基を有する糖と蛋
白質、ペプチド、アミノ酸等のようにアミン基を有する
物質が共存する場合、両者が不可逆的に結合してケトア
ミン化合物が生成してくる。
この化合物はアルデヒド基とアミン基の結合物がアマト
リ転移を起こした結果生成されることからアマトリ化合
物と呼ばれている。例えばグルコースとアラニンからは
次式Ａのフルクトシルアラニンが生成する。またグリセ
ルアルデヒドとグリシンからは次式Ｂのハイドロキシア
セトニールグリシンが生成する。
リ転移を起こした結果生成されることからアマトリ化合
物と呼ばれている。例えばグルコースとアラニンからは
次式Ａのフルクトシルアラニンが生成する。またグリセ
ルアルデヒドとグリシンからは次式Ｂのハイドロキシア
セトニールグリシンが生成する。
〒Ｈ３
ＣＲ２−Ｃ−ＣＨ２−ＮＥ（−ＣＨ，−Ｃ０ＯＨ（Ｂ）
ＯＨＯ このようにアルドースとα−アミノ酸が結合してアマト
リ転移を起こした化合物は、その分子内に共通にイミノ
２酢酸の基本骨格を含有しており、フルクトシルアミノ
酸オキシダーゼによって酸化分解され、α−ケトアルデ
ヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成する。また一
方アマトリ化合物はアルデヒド基を有する物質とアミノ
基を有する物質が接触した瞬間から化学的にかつ不可逆
的に生成蓄積されて（る。その生成速度は原料物質の濃
度、接触時間、温度などの関数で表わされる。それ故、
その蓄積量を測定することによって、過去の糖及びアミ
ン化合物の濃度、接触時間、保持温度などを推定するこ
とができる。しかしその定量は比較的困難であり、処理
中の分解に起因する精度の低下を免れ得なかった。
ＯＨＯ このようにアルドースとα−アミノ酸が結合してアマト
リ転移を起こした化合物は、その分子内に共通にイミノ
２酢酸の基本骨格を含有しており、フルクトシルアミノ
酸オキシダーゼによって酸化分解され、α−ケトアルデ
ヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成する。また一
方アマトリ化合物はアルデヒド基を有する物質とアミノ
基を有する物質が接触した瞬間から化学的にかつ不可逆
的に生成蓄積されて（る。その生成速度は原料物質の濃
度、接触時間、温度などの関数で表わされる。それ故、
その蓄積量を測定することによって、過去の糖及びアミ
ン化合物の濃度、接触時間、保持温度などを推定するこ
とができる。しかしその定量は比較的困難であり、処理
中の分解に起因する精度の低下を免れ得なかった。
従来の定量法としては例えば下記の方法が知られている
。アミノ酸分析計を用いる方法（ジャーナル・アグリカ
ルチュアル・フード・ケミストリー、２４巻１号（１９
７６）７０頁参照）、アマトリ化合物を水素化ホウ素ナ
トリウムで還元したのち塩酸分解してカラムクロマトグ
ラフィーで分離する方法（アチーブス・オプ・バイオケ
ミストリー−アンド・バイオフイジンクス（１９７７）
１８１．５４２〜５４９頁参照）、アマトリ化合物を弱
酸と加熱して生成する５−ハイドロキシメチル−２−フ
ルフラルデヒドをチオバルビッール酸によって比色定量
する方法（ＦＥＢＳレター（１９７６）７ｆ、３５６〜
３６０頁参照）など。しかしこれらの方法は操作の容易
性及び精度の点で満足できるものではなかった。
。アミノ酸分析計を用いる方法（ジャーナル・アグリカ
ルチュアル・フード・ケミストリー、２４巻１号（１９
７６）７０頁参照）、アマトリ化合物を水素化ホウ素ナ
トリウムで還元したのち塩酸分解してカラムクロマトグ
ラフィーで分離する方法（アチーブス・オプ・バイオケ
ミストリー−アンド・バイオフイジンクス（１９７７）
１８１．５４２〜５４９頁参照）、アマトリ化合物を弱
酸と加熱して生成する５−ハイドロキシメチル−２−フ
ルフラルデヒドをチオバルビッール酸によって比色定量
する方法（ＦＥＢＳレター（１９７６）７ｆ、３５６〜
３６０頁参照）など。しかしこれらの方法は操作の容易
性及び精度の点で満足できるものではなかった。
本発明者らはアマトリ化合物のうちフルクトシルクリシ
ンを分解する微生物を広く自然界より検索した結果、新
たに土壌より分離したコリネバクテリウム属に属する細
菌の培養物中に、フルクトシルクリシンを酸化分解して
グルコソン、グリシン及び過酸化水素を生成する酵素を
見出して本発明を完成した。
ンを分解する微生物を広く自然界より検索した結果、新
たに土壌より分離したコリネバクテリウム属に属する細
菌の培養物中に、フルクトシルクリシンを酸化分解して
グルコソン、グリシン及び過酸化水素を生成する酵素を
見出して本発明を完成した。
本発明は、下記の理化学的性質を有するフルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼである。また本発明は、このフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼを生産するコリネバクテリ
ウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物よりフル
クトシルアミノ酸オキシダーゼを採取することを特徴と
するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造法である
。
ミノ酸オキシダーゼである。また本発明は、このフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼを生産するコリネバクテリ
ウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物よりフル
クトシルアミノ酸オキシダーゼを採取することを特徴と
するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造法である
。
本発明の酵素（フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ）の
理化学的性質は下記のとおりである。
理化学的性質は下記のとおりである。
（１）作用及び基質特異性：
酸素の存在下で、イミノ２酢酸又はその誘導体を酸化し
て、グリオキシル酸又はα−ケトアルデヒド、α−アミ
ノ酸及び過酸化水素を生成する下記の酵素反応を触媒す
る酵素である。
て、グリオキシル酸又はα−ケトアルデヒド、α−アミ
ノ酸及び過酸化水素を生成する下記の酵素反応を触媒す
る酵素である。
Ｒ２
ｊ
この式中、Ｒ１は基−ＯＨ，−［ｃＨ（ｏＨ））Ｉｌ−
ｃＨ２ｏａ又なお、本酵素はβ−アミノ酸例えばβ−ア
ラニン等、イミノ酸例えばプロリン等、メチルアミン、
エタノールアミン等のアマトリ化合物に対しては作用し
ない。またケトンを還元したもの例えばグルジトリルグ
リシン等にも作用しない。
ｃＨ２ｏａ又なお、本酵素はβ−アミノ酸例えばβ−ア
ラニン等、イミノ酸例えばプロリン等、メチルアミン、
エタノールアミン等のアマトリ化合物に対しては作用し
ない。またケトンを還元したもの例えばグルジトリルグ
リシン等にも作用しない。
（２）至適ｐＨ：
本酵素の至適ｐＨは、フルクトシルクリシンを基質とし
た場合、第１図に示すとと＜ ｐＨ８゜０〜８．５であ
る。測定は酸素の吸収速度をオキシゲンモニターで計測
することにより行った。
た場合、第１図に示すとと＜ ｐＨ８゜０〜８．５であ
る。測定は酸素の吸収速度をオキシゲンモニターで計測
することにより行った。
なお図中の使用緩衝液は下記のとおりである。
０−Ｑ：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｘ−ｘ：０．１
Ｍベロナール−塩酸緩衝液Δ−Δ： ０．１ Ｍグリシ
ン−ＮａＯＨ緩衝液（３） ｐＨ安定性： 本酵素０．１単位を含有する各種緩衝液０．２ ｍｌを
４０℃、１０分間加熱し、残存した酵素活性を調べた。
Ｍベロナール−塩酸緩衝液Δ−Δ： ０．１ Ｍグリシ
ン−ＮａＯＨ緩衝液（３） ｐＨ安定性： 本酵素０．１単位を含有する各種緩衝液０．２ ｍｌを
４０℃、１０分間加熱し、残存した酵素活性を調べた。
その結果は第４図に示すとおりである。なお図中の使用
緩衝液は下記のとおりである。
緩衝液は下記のとおりである。
○−０：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液Δ−△： ０．
１ Ｍリン酸ナトリウム−０，１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝
液 Ｘ−Ｘ：０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（４）力価
の測定法： 第１法：生成される過酸化水素を発色定量する方法 ０．０５％４−アミノアンチピリン及ヒ０．０１５％２
．４−ジクロロフェノールサルホネートヲ含有する０、
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０） ２．８ｍｌを試験管
にとり、４［］ＯＵ／ｍｌのパーオキシダーゼ溶液１０
μ２を加える。温度平衡を３７℃に達せしめたのち、適
当な活性を有する酵素溶液Ｑ、 １ｒｎｌを加え、さら
に０．５Ｍフルクトシルクリシン−０，１ｍｌを加えて
１０分間反応させ、生じた色素な光電比色計を用いて５
１０ ｎｍにおける吸光度を測定する。別にあらかじめ
過酸化水素の標準溶液を用いて、その生成色素量との関
係を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、６
７℃、１分間当りに生成される過酸化水素のマイクロモ
ルを計算し、この数字な使用酵素液中の活性単位とする
。
１ Ｍリン酸ナトリウム−０，１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝
液 Ｘ−Ｘ：０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（４）力価
の測定法： 第１法：生成される過酸化水素を発色定量する方法 ０．０５％４−アミノアンチピリン及ヒ０．０１５％２
．４−ジクロロフェノールサルホネートヲ含有する０、
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０） ２．８ｍｌを試験管
にとり、４［］ＯＵ／ｍｌのパーオキシダーゼ溶液１０
μ２を加える。温度平衡を３７℃に達せしめたのち、適
当な活性を有する酵素溶液Ｑ、 １ｒｎｌを加え、さら
に０．５Ｍフルクトシルクリシン−０，１ｍｌを加えて
１０分間反応させ、生じた色素な光電比色計を用いて５
１０ ｎｍにおける吸光度を測定する。別にあらかじめ
過酸化水素の標準溶液を用いて、その生成色素量との関
係を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、６
７℃、１分間当りに生成される過酸化水素のマイクロモ
ルを計算し、この数字な使用酵素液中の活性単位とする
。
第２法：酵素反応にともなって吸収される酸素量を測定
する方法 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０） ２．９ｍｌをＹ
ＳＩ社製社製オキシセンモニタ一定容器にとり、０゜５
Ｍフルクトシルクリシン０．１ ｒｎｌを加え、６７℃
で１０分間攪拌し、溶存酸素と温度を平衡に達せしめる
。これに酸素電極を差し込み、密閉したのち、酵素溶液
５０μｌを注入し、生じる酸素吸収をモニターに接続し
た記録計で連続的に計測し、その最初の速度を測定する
。あらかじめ同様にして容器内の酸素濃度と記録値の間
で標準曲線を作成し、これを用いて測定値から酸素濃度
を求める。６７℃、１分間当たり１マイクロモルの酸素
吸収を起こす酵素の活性を１単位とする。
する方法 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０） ２．９ｍｌをＹ
ＳＩ社製社製オキシセンモニタ一定容器にとり、０゜５
Ｍフルクトシルクリシン０．１ ｒｎｌを加え、６７℃
で１０分間攪拌し、溶存酸素と温度を平衡に達せしめる
。これに酸素電極を差し込み、密閉したのち、酵素溶液
５０μｌを注入し、生じる酸素吸収をモニターに接続し
た記録計で連続的に計測し、その最初の速度を測定する
。あらかじめ同様にして容器内の酸素濃度と記録値の間
で標準曲線を作成し、これを用いて測定値から酸素濃度
を求める。６７℃、１分間当たり１マイクロモルの酸素
吸収を起こす酵素の活性を１単位とする。
（５）作用適温の範囲：
フルクトシルクリシンを基質にして、０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ８，０）中で、酵素反応により生成するグリ
シンを液体クロマトグラフィで分離定量する方法によっ
て測定した。その結果は第２図に示すとおりで、本酵素
の作用適温の範囲は３５〜４５℃である。
衝液（ｐＨ８，０）中で、酵素反応により生成するグリ
シンを液体クロマトグラフィで分離定量する方法によっ
て測定した。その結果は第２図に示すとおりで、本酵素
の作用適温の範囲は３５〜４５℃である。
（６）熱安定性：
精製酵素０．１単位を含有する酵素液Ｑ、５ ｍｌ （
０，１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８，０）を各温度で１０分
間放置したのち、残存した酵素活性を調べた。
０，１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８，０）を各温度で１０分
間放置したのち、残存した酵素活性を調べた。
その結果は第６図に示すとおりで、３５℃以下では安定
であるが、４５°Ｃで９０％が失活する。
であるが、４５°Ｃで９０％が失活する。
（ハ阻害活性化及び安定化：
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）中で、酸素
吸収を測定することによって調べた。濃度２ ｍＭの各
物質の本酵素に対する影響は、下記のとおりである。）
（ｇ 、 Ｐｂ 、 ＳＤＳは強く阻害し、Ｎ１、
Ｚｎ は中程度に阻害する。各種キレータ−及びＳＨ
試薬は微弱な阻害しか与えなかった。また本酵素に対す
る活性化剤及び安定化剤については未知である。
吸収を測定することによって調べた。濃度２ ｍＭの各
物質の本酵素に対する影響は、下記のとおりである。）
（ｇ 、 Ｐｂ 、 ＳＤＳは強く阻害し、Ｎ１、
Ｚｎ は中程度に阻害する。各種キレータ−及びＳＨ
試薬は微弱な阻害しか与えなかった。また本酵素に対す
る活性化剤及び安定化剤については未知である。
（８）精製方法：
本酵素は後記の精製方法によって精製するこ〉がで般る
へ （９）分子量： 本酵素の分子量は、セファデックスＧ−２００を用いた
カラムゲル濾過法で測定した結果、０．１Ｍ食塩含有０
．０５ Ｍ リン酸緩衝液中では６５０００であった。
へ （９）分子量： 本酵素の分子量は、セファデックスＧ−２００を用いた
カラムゲル濾過法で測定した結果、０．１Ｍ食塩含有０
．０５ Ｍ リン酸緩衝液中では６５０００であった。
（１０）等電点：
ディスク焦点電気泳動法により測定した結果、ＰＩ ＝
４．６であった。
４．６であった。
（１１）ディスク電気泳動：
デービスのｐＨ９，４のゲルを用いて５ ｍＡ／ゲルで
５℃、８０分泳動を行い、酵素蛋白をクマジーブリリア
ントブルーＧ−２５０で染色した。
５℃、８０分泳動を行い、酵素蛋白をクマジーブリリア
ントブルーＧ−２５０で染色した。
その結果、ゲルのアクリルアミド濃度１５％の時は陽極
側に４．１ ｃｒｒｔ（ブロムフェノールブルーは４．
５ ｃｍ ）、１５％の時には同じく陽極側に１゜７α
の所に酵素活性を持つ単一なバンドを認めた。
側に４．１ ｃｒｒｔ（ブロムフェノールブルーは４．
５ ｃｍ ）、１５％の時には同じく陽極側に１゜７α
の所に酵素活性を持つ単一なバンドを認めた。
前記のように本酵素は、その作用及び基質特異性におい
て、従来全く知られていない新規な酵素である。
て、従来全く知られていない新規な酵素である。
次に本発明によるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの
製造法について説明する。本発明において使用される微
生物はコリネバクテリウム属に属し、フルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼ生産能を有するものであればいずれで
もよいが、具体例としてはコリネバクテリウム９エスピ
ー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ、 ） Ａ
２−５−１が挙げられ、該菌の変種もしくは変異株も
用いられる。
製造法について説明する。本発明において使用される微
生物はコリネバクテリウム属に属し、フルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼ生産能を有するものであればいずれで
もよいが、具体例としてはコリネバクテリウム９エスピ
ー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ、 ） Ａ
２−５−１が挙げられ、該菌の変種もしくは変異株も
用いられる。
コリネバクテリウム−エスピーＡ２−３−１は、本発明
者らが土壌中より新たに分離した菌株であり、その菌学
的性質は下記のとおりである。
者らが土壌中より新たに分離した菌株であり、その菌学
的性質は下記のとおりである。
（ａ）形態：顕微鏡的観察（肉汁寒天培地３０℃、１〜
３日間の観察） （１）細胞の大きさ： ０．３ Ｘ Ｏ，９〜０．３Ｘ
１．０ミクロンの桿菌 （２）細胞の多形性：わずかにわん曲した形態を持つ、
菌糸状の生育、分校は認められない。
３日間の観察） （１）細胞の大きさ： ０．３ Ｘ Ｏ，９〜０．３Ｘ
１．０ミクロンの桿菌 （２）細胞の多形性：わずかにわん曲した形態を持つ、
菌糸状の生育、分校は認められない。
（３）運動性：認められない。
（４）胞子の有無：認められない。
（５）ダラム朱色性：陽性
（６）抗酸性：陰性
（ｂ）各培地における生育状態
（１）肉汁寒天平板培養＝３０℃、４８時間の培養で直
径１．５ ミ’）メートルの円形で表面平滑で光沢のあ
るコロニーを作り、半透明で淡黄色を帯びる。培養時間
の経過とともに不透明になっていく、拡散性の色素は作
らない。
径１．５ ミ’）メートルの円形で表面平滑で光沢のあ
るコロニーを作り、半透明で淡黄色を帯びる。培養時間
の経過とともに不透明になっていく、拡散性の色素は作
らない。
（２）肉汁寒天斜面培養−生育は良好で（１）に同じ。
（３）肉汁液体培地：静置培養では、生育悪くわずかな
混濁と菌の沈殿を認めるだけであるが振盪すると均一に
良く生育する。
混濁と菌の沈殿を認めるだけであるが振盪すると均一に
良く生育する。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：２５℃、３日程では菌へ
の生育はわずかに認められるが、溶解は認められない。
の生育はわずかに認められるが、溶解は認められない。
６日目程度になると菌の周囲だけわずかに液化する。
（５）リドマスミルク：紫色になり長時間の培養を行う
と凝固せずペプトン化する。
と凝固せずペプトン化する。
（Ｃ）生理的性質
（１）硝酸塩の還元：陰性
（２）脱窒反応：陰性
（３）ＭＲテスト：陰性
（４）ＶＰテスト：陰性
（５）インドールの生成：陰性
（６）硫化水素の生成二弱い陽性
（７）殿粉の加水分解：陰性
（８）クエン酸の利用：コーザー及びクリステン七ンの
両方で陽性 （９）無機窒素、源： ＮＨ，及びＮＯ３−の両方とも
利用する。
両方で陽性 （９）無機窒素、源： ＮＨ，及びＮＯ３−の両方とも
利用する。
（１０）色素の生成：淡黄色色素を作る。
（１１）ウレアーゼ：陽性
（１２）オキシダーゼ：陰性
（ｅ）カタラーゼ：陽性
（１４）生育の範囲蚕執温度：１０・〜６９℃ｔｔ
ｐＨ：４．２〜１０．０（１５）酸素に対する態
度：好気的 （１６）Ｏ−Ｆテスト：極めて弱い酸化的（１７）糖か
ら酸及びガスの生成 酸 ガス （１）Ｌ−アラビノース −−（２）Ｄ−キシ
ロース −− （６）Ｄ−グルコース −− （４）Ｄ−マンノース −− （５）Ｄ−フラクトース −− （６）Ｄ−ガラクトース − −（７筬芽糖
−− （８）シよ糖 −− （９）乳 糖 −− （１０） ）レバロース −− （１１） Ｄ−ンルビット −− （ｆ２） Ｄ−マンニット −− （１６）イノジット −− （１４）グリセリン −− （旧殿 粉 −− その他セルロースの分解能は認められな０゜ 前記の菌学的性質を有するコリネバクテリウム・エスピ
ーＡ２−３−１の分類学上の位置につイテ、「パージエ
イズ・マニュアル・オプφデタミネイティブ・バクテリ
オロジイ」第８版（１９７４年）の分類と対比検討した
結果、本菌株はグラム陽性の好気的無胞子桿菌であり、
カタラーゼ陽性、運動性がない、ゼラチン、カゼインを
わずかながら分解する、糖から酸の生成を行わない、生
活環にともなって極端な細胞の多形性を示さない、セル
ロースを分解しないことからコリネバクテリウム属に属
するものと判定される。さらに本菌株の分離源が動物質
に由来しないこと、ゼラチンを溶解すること、ウレアー
ゼを生産すること、３７°Ｃで生育することから、コリ
ネバクテリウム・ファシアンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
、ｅｒｉｕｍ ｆａｓｃｉａｎｓ ）に近縁な菌株と認
められるが１本菌株が土壌から分離したものであり、植
物病原菌でなく、グロスファクターを必要とせず１通常
培地で良く生育する点で異っており、コリネバクテリウ
ム属に属する新菌種の菌と判定され、本菌株をコリネバ
クテリウム・エスピーＡ４ Ｓ １と命名した。な
お、コリネバクテリウム・エスピーＡ２−３１は、通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄
第８２４５号（ＦＥＲＭ Ｐ−ａ ２４５ ）として寄
託されている。
ｐＨ：４．２〜１０．０（１５）酸素に対する態
度：好気的 （１６）Ｏ−Ｆテスト：極めて弱い酸化的（１７）糖か
ら酸及びガスの生成 酸 ガス （１）Ｌ−アラビノース −−（２）Ｄ−キシ
ロース −− （６）Ｄ−グルコース −− （４）Ｄ−マンノース −− （５）Ｄ−フラクトース −− （６）Ｄ−ガラクトース − −（７筬芽糖
−− （８）シよ糖 −− （９）乳 糖 −− （１０） ）レバロース −− （１１） Ｄ−ンルビット −− （ｆ２） Ｄ−マンニット −− （１６）イノジット −− （１４）グリセリン −− （旧殿 粉 −− その他セルロースの分解能は認められな０゜ 前記の菌学的性質を有するコリネバクテリウム・エスピ
ーＡ２−３−１の分類学上の位置につイテ、「パージエ
イズ・マニュアル・オプφデタミネイティブ・バクテリ
オロジイ」第８版（１９７４年）の分類と対比検討した
結果、本菌株はグラム陽性の好気的無胞子桿菌であり、
カタラーゼ陽性、運動性がない、ゼラチン、カゼインを
わずかながら分解する、糖から酸の生成を行わない、生
活環にともなって極端な細胞の多形性を示さない、セル
ロースを分解しないことからコリネバクテリウム属に属
するものと判定される。さらに本菌株の分離源が動物質
に由来しないこと、ゼラチンを溶解すること、ウレアー
ゼを生産すること、３７°Ｃで生育することから、コリ
ネバクテリウム・ファシアンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
、ｅｒｉｕｍ ｆａｓｃｉａｎｓ ）に近縁な菌株と認
められるが１本菌株が土壌から分離したものであり、植
物病原菌でなく、グロスファクターを必要とせず１通常
培地で良く生育する点で異っており、コリネバクテリウ
ム属に属する新菌種の菌と判定され、本菌株をコリネバ
クテリウム・エスピーＡ４ Ｓ １と命名した。な
お、コリネバクテリウム・エスピーＡ２−３１は、通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄
第８２４５号（ＦＥＲＭ Ｐ−ａ ２４５ ）として寄
託されている。
次に本発明で使用する培地としては、炭素源。
窒素源、無機塩、その他栄養素を適宜含有していれば合
成培地、天然培地いずれでも使用可能である。炭素源と
しては１例えばグルコース、フルクトース、キシロース
、グリセリンｅｌｌいることができる。窒素源としては
、ペプトン、カゼイン消化物、大豆粉等の蛋白質又はそ
の消化物、あるいは酵母エキス等の窒素性有機物が好適
に利用できる。無機物としては、ナトリウム、カリウム
、カルシウム、マンガン、マグネシウム、鉄、コバルト
等の塩類が使用できる。
成培地、天然培地いずれでも使用可能である。炭素源と
しては１例えばグルコース、フルクトース、キシロース
、グリセリンｅｌｌいることができる。窒素源としては
、ペプトン、カゼイン消化物、大豆粉等の蛋白質又はそ
の消化物、あるいは酵母エキス等の窒素性有機物が好適
に利用できる。無機物としては、ナトリウム、カリウム
、カルシウム、マンガン、マグネシウム、鉄、コバルト
等の塩類が使用できる。
本発明においては、フルクトシ・ルアミノ酸を含有する
培地で培養したときには、フルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼが最も収量よく得られる。
培地で培養したときには、フルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼが最も収量よく得られる。
該培地の好適な例としては、例えばグルコース０．６％
、フルクトシルクリシン賑５％、酵母エキス０．２％、
ポリペプトン０．２％、燐酸水素１カリウム０．２％、
硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カルシウム０．０１
％、硫酸第１鉄０．０１％（ｐＨ６，５）の培地が挙げ
られる。培養は通常２５〜６７°Ｃの範囲で、好適には
′５０°Ｃ付近で行われる。培養開始のｐＨは６〜８の
範囲であるが。
、フルクトシルクリシン賑５％、酵母エキス０．２％、
ポリペプトン０．２％、燐酸水素１カリウム０．２％、
硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カルシウム０．０１
％、硫酸第１鉄０．０１％（ｐＨ６，５）の培地が挙げ
られる。培養は通常２５〜６７°Ｃの範囲で、好適には
′５０°Ｃ付近で行われる。培養開始のｐＨは６〜８の
範囲であるが。
好適には６゜５付近である。このような条件下で、１６
〜２４時間振盪又は、深部攪拌培養すれば、培養物中に
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが効率良く生産され
、蓄積する。
〜２４時間振盪又は、深部攪拌培養すれば、培養物中に
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが効率良く生産され
、蓄積する。
本酵素は、培養時間を長くすると菌が溶解して菌体外に
も存在するようになるが、通常は菌体中に存在するので
、培養物を遠心分離又は濾過して菌体を集め、適量の緩
衝液に懸濁して菌体を破壊することによって酵素を可溶
化することが必要である。こうして得られた酵素含有液
から、核酸、細胞壁断片等を取り除くことによってフル
クトシルアミノ酸オキシダーゼを得ることができる。さ
らに本酵素は必要により酵素の単離精製の常法に従って
、例えば（１）ＤＥＡＥ −セルロースカラムクロマト
グラフィー、（２）硫安分画、 （３）フェニルセファ
ロースカラムクロマトグラフィー、（４）セファデック
スＧ−２００カラムクロマトグラフイー等の方法、又は
その他の方法を必要に応じて組み合わせて用いることに
より精製酵素を得ることができる。本酵素の精製の具体
例を示すと下記のとおりである。
も存在するようになるが、通常は菌体中に存在するので
、培養物を遠心分離又は濾過して菌体を集め、適量の緩
衝液に懸濁して菌体を破壊することによって酵素を可溶
化することが必要である。こうして得られた酵素含有液
から、核酸、細胞壁断片等を取り除くことによってフル
クトシルアミノ酸オキシダーゼを得ることができる。さ
らに本酵素は必要により酵素の単離精製の常法に従って
、例えば（１）ＤＥＡＥ −セルロースカラムクロマト
グラフィー、（２）硫安分画、 （３）フェニルセファ
ロースカラムクロマトグラフィー、（４）セファデック
スＧ−２００カラムクロマトグラフイー等の方法、又は
その他の方法を必要に応じて組み合わせて用いることに
より精製酵素を得ることができる。本酵素の精製の具体
例を示すと下記のとおりである。
培養物中から菌体を集めたのち、０．０２ Ｍリン酸緩
衝液ｐＥ（７，５に懸濁し、１０％量のグリセリンと１
％量のトリトンＸ−１００を加え溶解したのち、ダイノ
ミル（シンマルエンタープライズ社（スウェーデン）製
）を使用して菌体を破砕する。遠心分離して上清を集め
、ＤＥＡＥ−セルロースカラム（０，０２Ｍ リンｒｌ
ｌ 緩衝Ｗ ｐＨ１５に平衡化しである）にかげて酵素
を吸着させる。食塩０．２５Ｍを含んだ０．０２ Ｍ
リン酸緩衝液ｐＨ７，５で洗浄したのち、０．５Ｍ食塩
濃度にして酵素を溶出させる。活性画分を集め、１６％
になるように硫安粉末を加える。これを１６％硫安を含
有した０、 １ Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ７゜５に平衡化
したフェニルセファロースカラムに通過させて酵素を吸
着させる。この酵素を硫安た０、 Ｉ Ｍ リン酸緩衝
液で浴出し、その活性部について、０．１Ｍ食塩を含有
したリン酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡化したセファデック
スＧ−２０００カラムクロマトグラフイーを行い精製酵
素を得ることができる。
衝液ｐＥ（７，５に懸濁し、１０％量のグリセリンと１
％量のトリトンＸ−１００を加え溶解したのち、ダイノ
ミル（シンマルエンタープライズ社（スウェーデン）製
）を使用して菌体を破砕する。遠心分離して上清を集め
、ＤＥＡＥ−セルロースカラム（０，０２Ｍ リンｒｌ
ｌ 緩衝Ｗ ｐＨ１５に平衡化しである）にかげて酵素
を吸着させる。食塩０．２５Ｍを含んだ０．０２ Ｍ
リン酸緩衝液ｐＨ７，５で洗浄したのち、０．５Ｍ食塩
濃度にして酵素を溶出させる。活性画分を集め、１６％
になるように硫安粉末を加える。これを１６％硫安を含
有した０、 １ Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ７゜５に平衡化
したフェニルセファロースカラムに通過させて酵素を吸
着させる。この酵素を硫安た０、 Ｉ Ｍ リン酸緩衝
液で浴出し、その活性部について、０．１Ｍ食塩を含有
したリン酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡化したセファデック
スＧ−２０００カラムクロマトグラフイーを行い精製酵
素を得ることができる。
本発明によれば、従来定量の困難であったアマトリ化合
物を定量する上で、酵素法という新しい特異性の高いか
つ簡便な定量法が可能になる。
物を定量する上で、酵素法という新しい特異性の高いか
つ簡便な定量法が可能になる。
実施例
コリネバクテリウム・エスピーＡＡ２−５−１（ＦＩＲ
Ｐ−８２４５）をフルクトシルクリシン０．５％、イー
ストエキス０．２％、ポリペプトン［１，２％、リン酸
２水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５％
、塩化カルシウム０．０１％、硫酸第１鉄０．０１％及
びグルコース０．３％を含有した培地（ｐＨ６，５）
Ｉ Ｄ Ｏｍｌを入れた坂ロフラスコ（５［１０ｍ１容
量）に植菌し、３０℃１８時間振盪培養した。この種培
養物を３０１のジャーファーメンタ−中の同一培地２０
１に植え、通気量２０１、攪拌速度３５０ ｒｐｍの条
件で６０℃、２０時間培養した。培養物を１２００ Ｏ
ｒｐｍで遠心分離し菌体な集めた。その培養菌体の一部
（１００９）に０．０２ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（１
０％グリセリンと１％トリトンＸ−１００を含有する）
ｐＨ７，５，，８０ｍ１を加え、菌をよく分散させ、氷
で４℃まで冷却した。この液について、ダイノミルによ
る菌体の破砕処！ （３０００ｒｐｍ７分）を行った。
Ｐ−８２４５）をフルクトシルクリシン０．５％、イー
ストエキス０．２％、ポリペプトン［１，２％、リン酸
２水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５％
、塩化カルシウム０．０１％、硫酸第１鉄０．０１％及
びグルコース０．３％を含有した培地（ｐＨ６，５）
Ｉ Ｄ Ｏｍｌを入れた坂ロフラスコ（５［１０ｍ１容
量）に植菌し、３０℃１８時間振盪培養した。この種培
養物を３０１のジャーファーメンタ−中の同一培地２０
１に植え、通気量２０１、攪拌速度３５０ ｒｐｍの条
件で６０℃、２０時間培養した。培養物を１２００ Ｏ
ｒｐｍで遠心分離し菌体な集めた。その培養菌体の一部
（１００９）に０．０２ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（１
０％グリセリンと１％トリトンＸ−１００を含有する）
ｐＨ７，５，，８０ｍ１を加え、菌をよく分散させ、氷
で４℃まで冷却した。この液について、ダイノミルによ
る菌体の破砕処！ （３０００ｒｐｍ７分）を行った。
破砕容器は氷冷水によって充分冷却した。破砕液を１２
００Ｏｒｐｍで１５分遠心分離して上澄部分を集め、１
３０ゴの液を得た。この液を０．０１ Ｍ ） りスー
塩酸緩衝液ｐＨ７，５に平衡化したＤＥＡＥセルロース
を充填したカラム（直径２．５ｃｒｎ×長さ３０ｍ）に
かけて酵素を吸着させた。０→０．５Ｍ食塩濃度勾配に
よる溶出を行って活性部を集めた。次いでこの酵素液に
１６＋９／１００ｍ１の割合に硫安を溶解させたのち、
あらかじめ１６％硫安含有０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）で平衡化したフェニルセファロースを
充填したカラム（直径１−×長さ９ｃｒｎ、）を通過さ
せて酵素を吸着させた。
００Ｏｒｐｍで１５分遠心分離して上澄部分を集め、１
３０ゴの液を得た。この液を０．０１ Ｍ ） りスー
塩酸緩衝液ｐＨ７，５に平衡化したＤＥＡＥセルロース
を充填したカラム（直径２．５ｃｒｎ×長さ３０ｍ）に
かけて酵素を吸着させた。０→０．５Ｍ食塩濃度勾配に
よる溶出を行って活性部を集めた。次いでこの酵素液に
１６＋９／１００ｍ１の割合に硫安を溶解させたのち、
あらかじめ１６％硫安含有０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）で平衡化したフェニルセファロースを
充填したカラム（直径１−×長さ９ｃｒｎ、）を通過さ
せて酵素を吸着させた。
これを硫安濃度の１６％量０％の逆濃度勾配とエチレン
グリコール濃度の０％→２５％の濃度勾配をあわせもっ
た０、 ０１ Ｍ ） ！Ｊスス−酸緩衝液で溶出した
。活性部をアミコン社製限外濾過装置（分画膜１０００
０）にて濃縮したのち、セファデックスＧ−２００を充
填したカラム（１、２Ｘ １００ ａｎ ） （あらか
じめ０．１Ｍ食塩含有の０．０５ Ｍ ） ！Ｊスス−
酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡化しておく）にかけゲル濾過
した。活性部を集めた結果、２．２８単位／蛋白■の酵
素が得られた。
グリコール濃度の０％→２５％の濃度勾配をあわせもっ
た０、 ０１ Ｍ ） ！Ｊスス−酸緩衝液で溶出した
。活性部をアミコン社製限外濾過装置（分画膜１０００
０）にて濃縮したのち、セファデックスＧ−２００を充
填したカラム（１、２Ｘ １００ ａｎ ） （あらか
じめ０．１Ｍ食塩含有の０．０５ Ｍ ） ！Ｊスス−
酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡化しておく）にかけゲル濾過
した。活性部を集めた結果、２．２８単位／蛋白■の酵
素が得られた。
収率は２３％であった。
第１図は本酵素の至適ｐＨを示すグラフ、第２図は本酵
素の作用適温の範囲を示すグラフ、第３図は本酵素の熱
安定性を示すグラフ、第４図はｐＨ安定性を示すグラフ
である。
素の作用適温の範囲を示すグラフ、第３図は本酵素の熱
安定性を示すグラフ、第４図はｐＨ安定性を示すグラフ
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質を有するフルクトシルアミノ酸
オキシダーゼ。 （ａ）作用及び基質特異性：酸素の存在下で、イミノ２
酢酸又はその誘導体を酸化して、グリオキシル酸又はα
−ケトアルデヒド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成
する酵素反応を触媒する。 （ｂ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは、フルク
トシルクリシンを基質とした場合にｐＨ８．０〜８．５
（リン酸緩衝液）、安定ｐＨ範囲は８．０〜１０．００ （ｃ）作用適温の範囲：３５〜４５℃。 （ｄ）熱安定性：３５℃、１０分間の加熱に対して安定
であるが、４５℃、１０分間の加熱により９０％以上失
活する。 （ｅ）分子量：カラムゲルろ過法で測定した値は約６５
０００である。 ２、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを生産するコリ
ネバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、培養
物よりフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを採取するこ
とを特徴とする、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10842285A JPH0665300B2 (ja) | 1985-05-22 | 1985-05-22 | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10842285A JPH0665300B2 (ja) | 1985-05-22 | 1985-05-22 | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61268178A true JPS61268178A (ja) | 1986-11-27 |
| JPH0665300B2 JPH0665300B2 (ja) | 1994-08-24 |
Family
ID=14484362
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10842285A Expired - Lifetime JPH0665300B2 (ja) | 1985-05-22 | 1985-05-22 | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0665300B2 (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05192193A (ja) * | 1991-07-29 | 1993-08-03 | Genzyme Ltd | 非酵素的グリコシル化タンパク質の検定法 |
| US5387109A (en) * | 1992-06-05 | 1995-02-07 | Nakano Vinegar Co., Ltd. | Fructosylamine deglycase and a method of producing it |
| WO1997020039A1 (en) * | 1995-11-30 | 1997-06-05 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosyl amino acid oxidase, process for producing the same, and method of assaying amadori compounds using the enzyme |
| US5639672A (en) * | 1995-10-16 | 1997-06-17 | Lxn Corporation | Electrochemical determination of fructosamine |
| WO1997021818A1 (en) * | 1995-12-14 | 1997-06-19 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Novel fructosyl amino acid oxidase originating in fungi of the genus penicillium |
| US5985591A (en) * | 1997-11-26 | 1999-11-16 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Method for the determination of glycosylated proteins |
| WO2002044387A1 (en) * | 2000-11-28 | 2002-06-06 | Kikkoman Corporation | Novel fructosyl amino acid oxidase |
| EP2096173A1 (en) | 2003-05-21 | 2009-09-02 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method of measuring glycolated hemoglobin A1C, enzyme to be used therefor and process for producing the same |
| WO2011015326A2 (en) | 2009-08-03 | 2011-02-10 | Roche Diagnostics Gmbh | Fructosyl amino acid oxidase |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5712138A (en) | 1994-10-05 | 1998-01-27 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosyl amino acid oxidase |
| JP2008125368A (ja) | 2006-11-16 | 2008-06-05 | Amano Enzyme Inc | 新規なジペプチド分解酵素及びその製造方法並びにジペプチド分解酵素を用いる糖化蛋白質等の測定方法及びそれに用いる試薬組成物 |
-
1985
- 1985-05-22 JP JP10842285A patent/JPH0665300B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05192193A (ja) * | 1991-07-29 | 1993-08-03 | Genzyme Ltd | 非酵素的グリコシル化タンパク質の検定法 |
| US5387109A (en) * | 1992-06-05 | 1995-02-07 | Nakano Vinegar Co., Ltd. | Fructosylamine deglycase and a method of producing it |
| US5639672A (en) * | 1995-10-16 | 1997-06-17 | Lxn Corporation | Electrochemical determination of fructosamine |
| WO1997020039A1 (en) * | 1995-11-30 | 1997-06-05 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosyl amino acid oxidase, process for producing the same, and method of assaying amadori compounds using the enzyme |
| WO1997021818A1 (en) * | 1995-12-14 | 1997-06-19 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Novel fructosyl amino acid oxidase originating in fungi of the genus penicillium |
| US5985591A (en) * | 1997-11-26 | 1999-11-16 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Method for the determination of glycosylated proteins |
| WO2002044387A1 (en) * | 2000-11-28 | 2002-06-06 | Kikkoman Corporation | Novel fructosyl amino acid oxidase |
| US7091017B2 (en) | 2000-11-28 | 2006-08-15 | Kikkoman Corporation | Fructosyl amino acid oxidase |
| EP2096173A1 (en) | 2003-05-21 | 2009-09-02 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method of measuring glycolated hemoglobin A1C, enzyme to be used therefor and process for producing the same |
| WO2011015326A2 (en) | 2009-08-03 | 2011-02-10 | Roche Diagnostics Gmbh | Fructosyl amino acid oxidase |
| EP2287295A1 (en) | 2009-08-03 | 2011-02-23 | Roche Diagnostics GmbH | Mutant Fructosyl amino acid oxidase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0665300B2 (ja) | 1994-08-24 |
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|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |