DK147528B - Vaskemiddelkomposition og fremgangsmaade til dens fremstilling - Google Patents

Description

i 1Λ7528

Opfindelsen angår en vaskemiddelkomposition, der indeholder et proteolytisk enzymprodukt med høj virkning i det alkaliske område, samt fremgangsmåde til dens fremstilling.

5 Proteolytiske enzymer, der har høj proteolytisk virkning i det alkaliske område, er velkendt. Vedder beskriver i Antonie van Leeuwenhoek, 1 (1934) 141-147 en ny mikroorganisme, som han kalder Bacillus alcalophilus, der er i stand til at nedbryde gelatine og 10 hæmoglobin i et stærkt alkalisk medium. Denne egenskab hos mikroorganismen kan tilskrives et enzym, som senere undersøgelser har vist (jvf. engelsk patentbeskrivelse nr. 1.205.403). Enzymer med stor virkning i alkaliske midler er også beskrevet . adskillige andre steder i 15 1 ittératur en, bl .a. i engelsk patentbeskrivel s e nr. 1.243.

784 og hollandsk patentansøgning nr. 72.07050, der omhandler adskillige proteolytiske enzymer produceret af medlemmer af slægten Bacillus, der er virksomme i vaskemiddelkompositioner, som normalt er alkaliske, når 20 de opløses i vaskevæsker.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en vaskemiddelkomposition med et enzymprodukt, der har høj proteolytisk virkning i alkaliske medier, som gør det overordentlig velegnet til at in-25 korporeres i vaskemiddelkompositioner.

Vaskemiddelkompositionen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den indeholder en virksom mængde af et enzymprodukt, der er karakteristisk ved a) at det har optimal proteolytisk aktivitet ved en 30 pH-værdi over 12, idet aktiviteten måles overfor denatureret hæmoglobin i overensstemmelse med Anson-metoden, b) at det består af mindst to proteolytisk aktive komponenter, der viser et karakteristisk zymogram ved 35 pladeelektroforese som vist på tegningen, 2 147528 c) at de to hovedkomponenter har følgende amino-syresammensætning:

Komponent A Komponent B

Lysin 6 6 5 Histidin 7 6

Arginin 9 8

Asparaginsyre · 27 28

Threonin 16 16

Serin 30 30 10 Glutaminsyre 15 15

Prolin 12 13

Glycin 31 33

Alanin 36 36

Cystin 0 0 15 Valin 22 22

Methionin 3 3

Isoleucin 8 9

Leucin 18 18

Tyrosin 7 6 20 Phenylalanin 2 2

Tryptophan 3 3 d) at de to hovedkomponenter har følgende fysiske egenskaber: 25 isoelektrisk punkt 10,5 10,5 molekylvægt 25.500 25.500 e) og at der er identisk med det proteolytiske enzymprodukt, der kan isoleres fra et dyrkningssubstrat fremkommet ved dyrkning af Bacillus nov.spec. PB 92, 30 hvoraf en kultur er deponeret i Laboratoriet for Mikrobiologi ved Det Tekniske Universitet i Delft, Holland, under aerobe betingelser i et substrat, indeholdende sædvanlige carbon- og energikilder, en nitrogenkilde, calcium- og magnesiumsalte og sporelementer.

35 Det nævnte enzymprodukt kan fremstilles med forbløffende højt udbytte af den omtalte Bacillus-stamme. Udbytterne er større end de, der opnås med eksempelvis en Bacillus firmus stamme, jvf. beskrivelsen til hollandsk patentansøgning 72.07050.

3 U7528

En anden uventet fordel ved den foreliggende opfindelse er, at enzymproduktet viser en forbløffende god vaskeevne i perboratholdige vaskemiddelkompositioner.

Vaskemiddelkompositionen ifølge opfindelsen 5 indeholder fortrinsvis det nævnte enzymprodukt sammen med et tensid, et vandblødgøringsmiddel, et alkali-metalsilicat, et alkalimetalbicarbonat og eventuelt et alkalimetalperborat.

Opfindelsen angår som før nævnt også en frem-10 gangsmåde til fremstilling af den omhandlede vaskemiddelkomposition, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at det ovenfor definerede enzymprodukt blandes med de i kompositionen indgående vaskemiddelkomponenter.

15 Undersøgelser af enzymproduktets egenskaber omtales mere detaljeret i det følgende:

Egenskaber ved enzymproduktet: a) Forholdet mellem pH/virkning.

Til bestemmelse af pH/virkningsforholdet an-20 vendes Anson hæmoglobinmetoden (jvf. J. Gen.

Physiology, 22 (1939), 79-89) så nært som muligt. Specifikationer, der ikke er givet i Anson litteraturen, anføres nedenfor:

Substrat-fremstilling: Oksehæmoglobin, protease-25 substrat ifølge Anson, lyofiliseret, rent, opnået fra SERVA, Heidelberg, Tyskland.

Substrat-opløsning: SERVA hæmoglobin blandedes med vand ved omrøring til opnåelse af en 22%'s opløsning (vægt/volumen). Ud fra denne frisk fremstillede 30 koncentrerede opløsning fremstilledes en fortyndet opløsning indeholdende 8 ml 1 N natriumhydroxid, 72 ml vand, 36 g urinstof og 10 ml af den koncentrerede opløsning. Denne alkaliske opløsning holdtes ved 25°C i 60 minutter for at denaturere hæmoglobinet, 35 Bufferopløsninger (se nedenfor), urinstof og merthiolat tilsattes, og pH indstilledes, idet man anvendte en Ingold HA elektrode. Volumenet indstilledes til en hæmoglobinkoncentration på 2,2%.

147528 4 pH-Referenceopløsningerne opnået hos Merck,

Darmstadt, Tyskland (Buffer-Titrisol 8,00, 9,00, 10,00, 11,00 og 12,00) .

Man anvendte et Philips digital pH-meter (PW

5 9408).

Til buffersammensætningen af substratopløsningen med pH 8 fulgtes beskrivelsen for trypsinbestemmelse. Sammensætningen af de andre bufferopløsninger blev taget fra Dawson et al jvf. "Data for Biochemical 10 Research", 2. udgave (1969) Oxford, siderne 475 og følgende

Komponenterne sattes til substratopløsningen, indtil man fik de slutkoncentrationer, der er angivet nedenfor:

15 pH-område 8,3 - 10,3: glycin - NaOH 0,05 M

pH-område 10,8 - 11,3: Na2HP04 - NaOH 0,025 M

pH-område 11,7 - 12,5: KC1 - NaOH 0,05 M

Enzymopløsning: Opløsningerne frisk-fremstilledes i vand. Man fremstillede fortyndinger heraf, idet 20 koncentrationen var 200 DU/ml. Betegnelsen DU betyder Delft-enheder, idet man refererer til en metode til bestemmelse af enzymaktivitet, der er beskrevet i engelsk patentbeskrivelse nr. 1,353.317.

Inkubering: Hver analyse bestod af to be-25 stemmelser og en kontrol. Substrat- og enzymopløsninger anbragtes i vandbad ved 25°C. Substratopløsningernes pH bestemtes ved hjælp af en Ingold HA elektrode og også ved hjælp af en Ingold LOT elektrode til bestemmelse af pH-værdier under 11,00. Man anvendte 30 titrisol pH-referenceopløsninger hele vejen igennem.

Til 2,5 ml af substratopløsningen anbragt i et centrifugeglas sattes 0,5 ml af en enzymopløsning. Man sikrede sig tilstrækkelig blanding ved at omrøre lige efter med en glasspatel. Kontrollen, uden enzym, blev også 35 inkuberet.

Inkuberingen afsluttedes efter 10 minutter ved tilsætning af 5 ml 0,3 N trichloreddikesyre. Kontrollen fik tilsat 5 ml trichloreddikesyreopløsning og 0,5 ml 147528 5 enzymopløsning. Trichloreddikesyreopløsningen blev tilsat ved hjælp af en ZIPPETTE (Jencons, Hemel Hemp-stead, Hertfordshire). Blandingen omrørtes kraftigt ved hjælp af glasspatelen, idet den stadig var i 5 centrifugeglasset. Glasset anbragtes i et vandbad ved 2°c.

pH-Ændringen under inkuberingen fulgtes ved at måle pH ved begyndelsen og afslutningen af inkuberingen, idet man anvendte en LOT-elektrode til inkuberings-10 værdier under 11,0 og en HA-elektrode til pH-værdier . over 11,0. pH-Ændringen var på mindre end 0,1 pH-enhed for inkubering af enzymopløsninger, der indeholdt 50 eller mindre DU/ml og mindre end 0,15 pH-enheder for inkuberinger af enzymopløsninger, der indeholdt 200 15 eller 500 DU/ml. Middelværdierne måltes med Ingold HA-værdier som basis.

Centrifugering: Rørene centrifugeredes med en acceleration på 6000 g, efter at de var blevet holdt mindst 30 minutter ved 2°C.

20 Farveudvikling: Farveudvikling udførtes i et vandbad ved 25°C.

5 ml af supernatanten blev sat til 10 ml 0,5 N NaOH, og blandingen omrørtes straks, idet man anvendte en VORTEX-GENIE (Scient. Industr., U.S.A.). Efter nøjagtig 25 2 minutters forløb sattes 3 ml phenolreagens til blandingen ved hjælp af en Zippette under kontinuerlig omrøring. Phenolreagenset var Merck's Folin-Ciocalteus Phenolreagens, fortyndet med 2 rumfang vand.

Farven måltes ved hjælp af et ZEISS M4 QIII 30 spektrofotometer med spalteautomatisering ved 750 nm præcis 6 minutter efter Folintilsætningen. Som reference for farveudviklingen anvendtes en tyro- -7 sinopløsning, der indeholdt 8 x 10 ækvivalenter tyrosin i 5 ml 0.2 N HC1 med 0.5 vægtvolumen-% for-35 maldehyd. Referencefarveudviklingen undersøgtes med regelmæssige mellemrum, men afvigelser fra middelværdien overskred aldrig 1% for en prøve af fortyndet Folin-reagens.

147528 6

Enzymproduktet udviser proteolytisk virkning som følger: pH_8,3 8,8 9,4 9,8 10,3 10,8 11,3 11/7 12,5 5 relativ virkning 85 87 91 88 87 94 91 99 100 b) Elektroforesemønster.

10 Enzvmproduktets karakter kan yderligere be stemmes ved zvmogrammetoden, der er baseret på en kombination af pladeelektroforese i polyacrylamidgel og visuel observering af virkningen. Metoden er blevet beskrevet af Zuidweg et al., i Biotech. og Bioeng. 14 (1972), 685-714, 15 og tillader en direkte sammenligning af præparater. Der er foretaget en sammenligning af det omhandlede enzymprodukt a), en protease opnået fra en Bacillus-stamme deponeret hos the National Collection of Type Cultures i London, som NCTC 4553, jvf. engelsk patentbeskri-20 velse nr. 1.205.403, (b), et kommercielt tilgængeligt proteolytisk enzym MAXATASE (Gist-Brocades N.V.,

Delft, Holland) (c), og et kommercielt tilgængeligt enzym ESPEBASE (d), jvf. medfølgende tegning Kun hovedkomponenterne er angivet. Det anvendte buffersystem 25 i elektroforeseadskillelsen var system E, der indeholdt Tris (dvs, 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol) og borsyre, og den visuelle observering af virkningen udførtes ved immersionskontaktteknik, således som beskrevet i Zuidweg et al. artiklen.

30 Tegningen viser, at enzymproduktet, som an vendes i vaskemiddelkompositionen ifølge opfindelsen, består af flere forbindelser, hvis sammensætning er forskellig fra sammensætningen af de andre enzympræparater.

c) Aminosyresammensætning.

35 Aminosyresammensætning af de to hovedkomponenter A og B (jvf. den medfølgende tegning) bestemtes.

Sammensætningen er vist i tabellen sammenlignet med amiosyresammensætningen af adskillige kendte enzymer: 147528 7 (1) substilisin Carlsberg, jvf. Delange og Smith, J.

Biol. Chem. 243 (1968) 2134; (2) enzymet fra Bacillus subtilis var. amylosacchariticus, anvendt som referenceenzym i U.S.A. patentbeskrivelsen nr. 3.622.458; (3) 5 enzymet fra Bacillus firmus, jvf. hollandsk patentansøgning nr. 72.07050, og (4) enzymet fra B 221, jvf.

K. Horikoshi, Agr. Biol. Chem. B5 (1971) 1407.

Bestemmelserne skal anses for at ligge inden for de sædvanlige fejl +10% af de angivne værdier.

10 Tabellen viser yderligere molekylvægtene af enzymerne, såvel som de isoelektriske punkter.

147528 8

Enzynoproduktet anvendt i midlet

Amino- ifølge opfindelsen_

syre (1) (2) (3) (4) Forbindelse a Forbindelse B

LYS 9 6 4 6 6 6 HIS 5 5 6 8 7. 6 5 ARG 4 3 6 8 9 8 ASP 28 20 23 29 27 28 THR 19 14 14 18 16 16 SER 32 37 22 23 30 30 10 GLU 12 12 14 16 15 15 PRO 9 10 12 16 12 13 GLY 36 25 30 39 31 33 ALA 42 27 32 45 36 36 15 CYS 0 0 0 0 0 0 VAL 31 20 21 27 22 22 MET 5 3 2 4 3 3 ILEU 10 12 7 9 8 9 LEU 16 12 16 22 18 18 20 TYR 13 9 6 7 7 6 PHE 4 2 2 2 2 2 TRY 13-5 3 3 25 Mol». 27.300 22.700 26.000 30.000 25.500 25.500 kyl- vægt

Isoelek- trisk 9,3 7,5-8,0 11,0 9,4 10,5 10,5 punkt 30

Substrat-specificitet. Sammenligning med de kendte proteolytiske enzymer "Nagarse" og "Maxatase”.

Substrat Relativ reaktionshastighed (%)

Enzynprodjukt "Nagarse” "Maxatase" , anvendt ifølge qpfindlesen 35 Casein ifølge Hammersten 100 100 100 Æggehvidealbumin 10 10 8

Gelatine ' 202 110 149

Hastoglobin 179 132 144 9 147528

Enzymkoncentrationen var 4,2 DU/ml. Resultaterne viser en bred substratspecificitet for enzymproduktet anvendt i midlet ifølge opfindelsen og en vis grad af ulighed mellem de tre enzymprodukters specificiteter, 5 særlig med gelatine som substrat.

Temperaturens indflydelse på den relative aktivitet af enzymproduktet anvendt i midlet ifølge opfindelsen ved pH 8,5.

10 Temp. (°C) 40 50 60 70

Relativ aktivitet ved pH 8,5 41 74 100 9

Temperaturens indflydelse på den relative aktivitet af enzymproduktet anvendt i midlet ifølge opfindelsen ved 15 pH 10,0.

Temp. (°C) 40 50 52,5 55 57,5 60 70

Relativ aktivitet ved pH 10,0 i % af aktiviteten ved 55°C 42 82 95 100 77 41 8 20 Betydning af pH, temperatur og andre faktorer for deaktivering.

Stabiliteten i opløsning af enzymproduktet anvendt i midlet ifølge opfindelsen overfor temperaturen undersøgtes. På grund af enzymproduktets anvendelse som 25 tilsætning til husholdningsvaskemidler, bestemtes varmestabiliteten under normale vaskebetingelser. I overensstemmelse hermed udførtes varmestabilitetsforsøgene i syntetisk postevand (STW) med eller uden tripolyphosphat (TPF, 0,15% vægt/volumen). Enzym-30 koncentrationen under opvarmningen var 400 DU/mg.

Indflydelse af pH på stabilitet ved 40°C pH under opvarmning 23456789 10 11

Restaktivitet (%) ved 35 Opvarmning i STW med TPF 79 98 90 93 89 91 85 11

Opvarmning i S0W uden TPF 16 8100 97100 97 95 98 88 79 147528 10

I et andet forsøg bestemtes stabiliteten ved pH

8,5 i syntetisk postevand indeholdende tripolyphosphat (0,15% vægt/volumen) ved to temperaturer.

Temperaturens indflydelse på stabiliteten ved pH 8,5.

5 Restaktivitet (%) efter opvarmning

Varighed af opvarmning (timer) 0 0,5 1,0 2,0

Opvarmningstenperatur 40°C 100 95 93 87

Gpvaronningstenperatur 50°C 100 82 77 69 10 Hæmning, aktivering og stabilisering.

Der udførtes forsøg med følgende enzym-hæmmere: Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)

Mercuri- eller parachlormercuri-benzoesyre (PCMB) Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) 15 Monoiodeddikesyre (MIA)

Indflydelse af hæmmere på enzymaktiviteten.

-3

Hammer (kone. 1x10 M) Ingen PMSF PCMB EDTA MIA Relativ aktivitet 100 5 117 91 106

Inkubationerne udførtes i syntetisk postevand 20 indeholdende tripolyphosphat (0,15% vægt/volumen) ved pH 8,5 i 30 minutter og ved 4 0°C.

Den ovenfor omtalte Bacillus nov.spec. PB 92, ved hjælp af hvilken det i midlet ifølge opfindelsen 25 anvendte enzymprodukt kan fremstilles, beskrives nærmere i det følgende:

Taxonomi.

Til den taxonomiske bestemmelse er anvendt Smith,

Gordon og Clark, "Aerobic Sporeforming Bacteria", U.S.

30 Dept. of Agr., Monograph No. 16 (1952). Sporulering af Bacillus PB 92 kan fremkaldes ved dyrkning af lyophi-liserede kulturer af gamle TSB (Trypton Soja bouillon fra Oxoid) agar kulturer (65 dage) på TSB agar.

Morphologi.

35 (a) Vegetative celler: (mobile) stave, rundede ender, i reglen enkelte, men også i korte kæder af 2-8 stave.

Sommetider findes meget lange kæder, der har en længde på 1000 -μ eller mere.

147528 11 (b) Sporangier: Sommetider lidt svulmede.

(c) Sporer : 0,6-0,8 til 1,0-1,3 y; ellipsoide; tykvæggede; subterminale til paracentrale.

(d) Skyggeformer: Temmelig mange; også i midten af en 5 kæde af normale celler.

Vækstforhold_Bemærkninger:_

Agarkoloni:

Form Uregelmæssig

Overflade Ujævn, hindeagtig spredning 10 Kant Udragende dele Væksthøjde Flad

Optisk karakter Uklar

Agar-stregkultur:

Vagest Moderat 15 Vækstform Spredning

Glans Mat Nærings-bouillon:

Overfladevækst Hinde

Uklarhed Forbigående 20 Sediment Flaget

Sedimentmængde Meget sparsem

Gelatine-stik:

Vadest Bedst for oven

Stiklinie Sparsem vækst 25 Smeltning Positiv, substrat uændret

Smeltningsgrad Ringe, de dog nedenfor

Lakmusmælk:

Reaktion Syrning

Syre-kasein Negativ 30 Enzym-kasein Negativ

Peptonisering Positiv

Fysiologiske forhold:_Bemærkninger: _

Reduktion af nitrat Positiv, se nedenfor 35 Denitrifikation af nitrat Negativ

Methylrødt Negativ

Voges-Proskauer Positiv

Indol Negativ 12 1Λ 7 5 2 8

Fysiologiske forhold:_Bemærkninger:_

Dannelse af hydrogensulfid Negativ

Hydrolyse af stivelse Positiv, se nedenfor

Citratudnyttelse Positiv 5 Udnyttelse af uorg. nitrogen:

Nitrat Negativ

Araroniurasalt Positiv

Farvedannelse:

Agar-bouillon Ingen 10 King A Ingen

Urease Positiv

Oxidase Positiv

Katalase Positiv Vækstområde Ikke vækst under pH 4,0 15 Forhold til fri oxygen Aerob O-F test (Hugh Leifson) Oxiderende

Fermentering: Dannelse af syre og gas: Syre Gas

Monosaccharider: : 20 L-Arabinose D-Xylose + D-Glucose + D-Mannose + D-Fructose + - 25 D-Galactose + L-Phamnose

Disaccharider:

Sucrose +

Maltose + 30 Lactose

Tréhalose +

Polysaccharider:

Dextrin +

Stivelse + 35 Alkoholer: D-Sorbitol + D-Mannitol +

Inositol + 147528 13

Fysiologiske forhold;_Bemærkninger;_

Syre Gas

Glycerol +

Adonitol Ikke udnyttet 5 Dulcitol Ikke udnyttet

Gluoosid:

Salicin Ikke udnyttet

Andre forhold:

Lysin-decarboxylering Negativ 10 Cytochrom Positiv

Indol-phenylpyrodruesyre Negativ

Natriurtchlorid-tolerance 7%

Yderligere kan følgende forhold nævnes:

Maksimum vaeksttemperatur: 50°C 15 Grarfr-positiv; obligat aerob.

Vækst på næringsagar pH 7,2; starter scmmetider noget lang-soranere end ved pH 9,4. Kanterne af kolonierne ved pH 7,2 fuldstændige, men ved pH 9,4 krøllede til filamentøse.

Ingen dannelse af pigment på tyrosinagar ved pH 9/5 20 Svag stivelseshydrolyse på kartoffelstivelse/- næringsagar ved pH 9,5.

Stærk smeltning af gelatine på gelatine/næringsagar ved pH 9,5.

Klar kaseinfordøjelse på mælkeagar ved pH 8,4, 25 Ingen eller ringe vækst på glucose- eller mannitolagar med nitrat som eneste nitrogenkilde.

Nitratreduktion positiv i nitrat/næringsbouillon pH 9,5.

Nærmest beslægtede kendte mikroorganisme af Bacillus-30 slægten anses at være en Bacillus cereus-stamme, betegnet som Bacillus cereus No. 8-1 (beskrevet bl.a. i den offentliggjorte japanske patentansøgning nr. 13708/78).

Denne sidstnævnte mikroorganisme er af en uafhængig japansk institution blevet sammenlignet med Bacillus 35 nov.spec. PB 92 ved undersøgelse af de forskellige, ovenfor omtalte forhold. Forskellene mellem de to organismer er blevet opsummeret som følger: U7528 14

Egenskaber Bacillus cereus PB 92 _No. 8-1__

Morfologi:

Polymorfi - + 5 Motilitet + Vækst på substrat: pH Næsten ingen vækst Videst ved ved pH 7,0 pH 7,2

Overfladevakst 10 på nærings-bouillon Ingen hinde Hinde

Biologiske egenskaber:

Reduktion af

Nitrat - + V P test - + 15 Citratudnyttelse + +

Udnyttelse af ammoniumsalt - +

Urease - + Vækst-temperatur mindre end 45°C Vækst ved

50°C

20 Fermentering:

Fructose - +

Galactose - +

Sorbitol - +

Mannitol - + 25 Natriumchloridtolerance 12% 7%

Bacillus nov.spec, PB 92 må formentlig anses som repræsenterende en ny art, selv om dette endnu ikke har kunnet fastslås helt sikkert.

30 Isolering:

Mikroorganismerne, der producerer enzymproduktet anvendt i midlet ifølge opfindelsen isoleredes fra en jordprøve fra Zambia ved hjælp af en særlig isolationsteknik ved et pH inden for området 8,0 til 9,5.

35 Forqærinq.

For at opnå høje udbytter af enzymproduktet Ved dyrkning af Bacillus PB 92 er substrater, der inde- 15 147528 holder let assimilerbart carbon og energikilder nødvendige, såsom glucose, sucrose, dextriner og stivelse og en nitrogenkilde af organisk oprindelse såsom casein, gær og sojamel. Yderligere tilsættes fortrinsvis visse 5 mængder af calcium-og magniumsalte og adskillige sporelementer.

En god gennemluftning er nødvendig under forgæringen. Substrates pH holdes passende mellem 6,5 og 10, fortrinsvis mellem 7 og 9. Forgæringstemperaturen 10 er passende 37°C.

Når der iagttages alle sikkerhedsforanstaltninger, kan man opnå meget høje udbytter (proteaseaktivitet pr. g af omsat glucose). Udbytte er tilstrækkeligt højt til en økonomisk produktion af enzymproduktet.

15 Udvinding af enzymproduktet.

Enzymproduktet udvindes af forgsringsbouillonen på sædvanlig måde. Bouillonen filtreres for at fjerne mikroorganismerne og uop3øseligt materiale. Til tørre vaskemiddelkompositioner udfældes enzymproduktet sæd-20. vanligvis ved at tilsætte vandblandbart organisk opløsningsmiddel eller uorganiske salte såsom Na2SC>4 eller (NH^^SO^ til filtratet. For at opnå en økonomisk produktion reduceres rumfanget af filtratet ved ind-dampning først, inden man tilsætter opløsningsmidlerne 25 eller saltene. Til flydende vaskemiddelkompositioner kan anvendes den filtrerede bouillon eller det genopløste enzymprodukt.

Efter udfældning fraskilles enzymproduktet ved filtrering eller centrifugering, og den resulterende 30 kage tørres.

Anvendelse i vaskemiddelkompositioner:

Enzymproduktet kan indføres i vaskemiddelkompositioner på sædvanlig måde. Mængden af enzymproduktet, der skal indføres, svarer sædvanligvis til, at man i 35 den endelige vaskemiddelkomposition får en proteolytisk aktivitet på ca. 100-5000 DU/g,fortrinsvis 500-1000 DU/g, Bestemmelsen af den proteolytiske aktivitet er beskrevet i engelsk patentbeskrivelse nr. 1.353.317.

147528 16

Vaskemiddelkompositioner ifølge opfindelsen indeholdende det omhandlede enzymprodukt indeholder normalt yderligere mindst ét tentid. Tensiderne, der er nyttige i vaskemiddelkompositionerne, er de i 5 vaskemiddelkompositioner med enzymatisk virkning sædvanligt anvendte. Sædvanligvis kan ikke-ioniske eller anioniske overfladeaktive forbindelser anvendes, såsom vandopløselige sæber, anioniske, ikke-anioniske, amfolytiske og zwitterioniske tensider. Et eksempel 10 på en almindeligvis anvendt tensid er dodecylbenzen-sulfonat. Sædvanligvis anvendes tensiderne , der kan anvendes alene eller i blandinger, i en mængde af ca.

4-20% af vaskemiddelkompositionen.

Vaskemiddelkompositionerne kan indeholde andre 15 forbindelser, der sædvanligvis anvendes i andre vaskemiddelkompositioner med proteolytisk aktivitet.

"De indeholder sædvanligvis komplekse phosphater, f.eks. et alkalimetaltripolyphosphat eller et alkalimetal-pyrophosphat, fortrinsvis i mængder på ca. 40-50 vægt% 20 af vaskemiddelkompositionen. Yderligere eller alternativt kan de indeholde sådanne forbindelser, som alkalimetal-nitrilotriacetat og alkalimetalcitrat. Deres virkning i vaskemiddelkompositionerne er kompleks, men deres mest vigtige virkning er, at de virker som vandblødgørings-25 midler. Andre forbindelser er f.eks. et alkalimetal-silikat, sædvanligvis i mængder på 1-10 vægt%, svagt alkaliske forbindelser, såsom alkalimetalbicarbonat, sædvanligvis i mængder indtil 20 vægt%, fyldstoffer, f.eks. et alkalimetalsulfat, og andre forbindelser, 30 såsom carboxymethylcellulose, parfumer og optiske blegemidler, Andre forbindelser, der sædvanligvis er inkorporeret, er alkalimetalperborater, specielt natriumperborat, og i forbindelse med perboraterne bør det bemærkes, at enzymproduktet har en uventet høj 35 stabilitet i nærværelse af disse.

Vaskemiddelkompositionerne kan fremstilles på sædvanlig måde, f, eks. ved at sammenblande komponenterne eller ved først at lave en pre'-mix. Denne blandes 17 147528 herefter med de andre forbindelser. Fortrinsvis blandes enzymproduktet med en eller flere af de andre forbindelser, f.eks. med fyldstoffet, for at fremstille et koncentrat af en forud bestemt enzymatisk aktivitet, 5 hvilket koncentrat kan blandes med de andre ønskede komponenter.

Fremstillingen af det omhandlede enzymprodukt og anvendelsen af dette i vaskemiddelkompositionen ifølge opfindelsen forklares nærmere i efterfølgende 10 eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af enzymprodukt.

Forgæring af Bacillus PB 92.

15 Det følgende substrat anvendtes: Gær (beregnet som tørstof) 22 g/liter K2HP04.3H20 5

MgS04.7H20 0,05

CaCl2 0,05 20 FeS04-7H20 0,005

MnS04.4H20 0,005

Substratkomponenterne opløstes i 90% af det endelige volumen, og steriliseredes herefter ved pH 7,0 25 ved en temperatur på 120°C i 1 time.

Man opnåede podningskulturen ved fra en skråagar med Bacillus PB 92 at pode 100 ml trypticasesojabouillon (Oxoid), til hvilken der efter sterilisering ved 120°C i 20 minutter var sat 4 ml 1 M natrium-30 carbonat. Podningskulturen dyrkedes ved 30°C i 24 timer på et GALLENKAMP rysteapparat.

Substratet dyrkedes ved 37°C og pH 8,0 med et rumfang af podningskulturen pr, 100 rumfang substrat. Hovedforgæringen udførtes ved 37°C i en omrøringsforgæ-35 ringsbeholder udstyret med en pH-kontrolanordning, en temperaturkontrolanordning, en antiskumningsanordning og en anordning til kontinuerlig måling af den opløste oxygenkoncentration og oxygenoptagelseshastighed.

147528 18 17 timer efter podningen tilsattes en 30%'s glucose-opløsning steriliseret ved 120°C i 1 time, til opnåelse af en slutkoncentration af 30 g glucose per liter substrat.

5 De opnåede resultater tydede på et udbytte af det proteolytiske enzymprodukt på ca. 8x105 DU/g glucose forgæret.

I hollandsk patentansøgning 72.07050, eksempel 1, beskrives et forgæringsforsøg, i hvilket det endelige 10 udbytte på 11x10^ DU/liter bouillon opnås (50 Anson-enheder svarer omtrent til 11x10 DU). Mængden af anvendt kulhydrat er ækvivalent med ca. 75 g glucose pr. liter bouillon. Udbyttet af protease pr. g omsat glucose i eksemplet i ansøgning 72.07050 andrager 5 15 1,5 x 10 DU. Udbyttet af det i vaskemiddelkompositionen ifølge opfindelsen anvendte enzymprodukt er således 5 gange større.

Eksempel 2 20 Vaskeevne.

Vaskeprøver udførtes på følgende måde: 1) Forsøgsstykker af klæde: EMPA-116 (plettet med blod, mælk og tush) opnået fra Eidgenossische Material Prufungs- und Versuchsanstalt fur Industrie, Bauwesen 25 und Gewerbe i Skt. Gallen, Svejts. Forsøgsstykkerne opbevares i mørke og lufttæt.

Til vaskeforsøg skæres de nødvendige stykker på 5 x 5 cm ud fra en visuelt homogen del af klædet.

2) Vaskerisæbevand: 4 g/1 af et perboratholdigt 30 kommercielt tilgængeligt vaskemiddel uden enzym pr.

liter "syntetisk postevand" (STW), der havde en hårdhed på 15°dH, fremstillet på følgende måde: 10 ml 2% CaCl2 (pro analysi) opløsning i destilleret vand sættes til 10 ml af en opløsning af 0,656% 35 MgCl^ i destilleret vand i en 1000 ml målekolbe.

Indholdet blandes grundigt. Herefter tilsættes 10 ml af en 2,1%'s NaHCO^ (pro analysi) opløsning og indholdet blandes igen, og der fyldes op med destilleret 147528 19 vand, således at der bliver 1000 ml.

3) Prøve: Til hver af et tilstrækkeligt antal 300 ml Erlenmeyer-kolber sættes 250 ml af vaskerisæbevandet.

Der tilsættes mængder af enzymproduktet svarende til 5 0, 25¾ 500 og 1000 DU/g af vaskemiddelkompositionen (dobbeltforsøg). Erlenmeyer-kolberne anbringes i en rystetermostat ved 45°C, i hvilken de varmes op under omrystning. Herefter tilsættes et stykke stof til hver af Erlenmeyer-kolberne, og der rystes i nøjagtig 1 time 10 ved 45°C.

Efter vask dekanteres vaskerisæbevandet, og der tilsættes 250 ml STW. Kolberne lukkes med gummipropper, og rystes kraftigt i nøjagtig 1 minut.

Tøj stykkerne lægges i et bæger, i hvilket de 15 skylles i langsomt rindende postevand. Efter at det sidste stykke tøj er sat til, fortsættes skylningen i ca. 10 minutter. Tøjstykkerne får lov aftørre i luften i mørke, anbragt i et hvidt rent håndklæde.

Efter tørring bestemmes remissionen i et ZEISS 20 ELREPHO remissionsmeter med filter nr. 1 på begge sider, idet man anvender MgO som reference. Middelværdierne udregnes med reference til et fuldstændig rent stykke tøj, der har en remission på 65,8% over for MgO.

Sammenligning mellem det omhandlede enzym-25 produkt og "MAXATASE" og "ESPERASE".

Vaskeprøverne udførtes på den ovenfor nævnte måde ved pH 9,7. Resultaterne var følgende: 30 % remission

DU/g enzympr., ifla. eks. 1'_ MAXATASE__ESPERASE

___4__Δ__Δ_ 0 20 - - ! ~ - ~ 250 41 21 30 10 31 11 500 46 26 33 13 36 16 251000 52_32 36 1 16 1 39 19 20 147528 Således viser tabellen, at under forsøgsbetingelserne har det her omhandlede enzymprodukt en bedre vaskeevne, end de kommercielt tilgængelige "MAXATASE" og "ESPERASE".

/

Claims (6)

147528

1. Vaskemiddelkomposition med proteolytisk virkning, kendetegnet ved, at den indeholder en virksom mængde af et enzymprodukt, der er 5 karakteristisk ved, a) at ‘det har optimal proteolytisk aktivitet ved en pH-værdi over 12, idet aktiviteten måles overfor denatureret hæmoglobin i overensstemmelse med Anson-metoden, 10 b) at det består af mindst to proteolytisk aktive komponenter, der viser et karakteristisk zymogram ved pladeelektroforese som vist på tegningen, c) at de to hovedkomponenter har følgende amino-syresammensætning: 15 Komponent A Komponent B Ly sin 6 6 Histidin 7 6

20 Arginin 9 8 Asparaginsyre 27 28 Threonin 16 16 Serin 30 30 Glutaminsyre 15 15

25 Prolin 12 13 Glycin 31 33 Alanin 36 36 Cystin 0 0 Valin 22 22

30 Methionin 3 3 Isoleucin 8 9 Leucin 18 18 Tyrosin 7 6 Phenylalanin 2 2

35 Tryptophan 3 3