JPH0678768A - アルカリプロテアーゼ、それらを産生するバクテリア、これらのアルカリプロテアーゼの生産法、これらのアルカリプロテアーゼの使用及びそれらを含む洗剤組成物 - Google Patents
アルカリプロテアーゼ、それらを産生するバクテリア、これらのアルカリプロテアーゼの生産法、これらのアルカリプロテアーゼの使用及びそれらを含む洗剤組成物Info
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- JPH0678768A JPH0678768A JP5116028A JP11602893A JPH0678768A JP H0678768 A JPH0678768 A JP H0678768A JP 5116028 A JP5116028 A JP 5116028A JP 11602893 A JP11602893 A JP 11602893A JP H0678768 A JPH0678768 A JP H0678768A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 高度にアルカリ性の条件下で優れた安定性を
有し、かつ洗剤中にブレンドされた場合に改良された洗
浄能力を示す新規なアルカリプロテアーゼを提供するこ
とにある。 【構成】 バチルス・プロテオリチクスから誘導された
アルカリプロテアーゼ。
有し、かつ洗剤中にブレンドされた場合に改良された洗
浄能力を示す新規なアルカリプロテアーゼを提供するこ
とにある。 【構成】 バチルス・プロテオリチクスから誘導された
アルカリプロテアーゼ。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はバチルス属の新規な種及
びそれらの誘導種から産生された新規なアルカリプロテ
アーゼに関する。また、本発明はこのアルカリプロテア
ーゼを産生する新規なバクテリア及びこのバクテリアの
誘導種に関する。また、本発明はその新規なバクテリア
を培養することを含むこのアルカリプロテアーゼの生産
方法に関する。本発明は、このアルカリプロテアーゼの
使用、前記のアルカリプロテアーゼを含む洗剤組成物及
び衣服からタンパク質の汚れを除去する方法に関する。
びそれらの誘導種から産生された新規なアルカリプロテ
アーゼに関する。また、本発明はこのアルカリプロテア
ーゼを産生する新規なバクテリア及びこのバクテリアの
誘導種に関する。また、本発明はその新規なバクテリア
を培養することを含むこのアルカリプロテアーゼの生産
方法に関する。本発明は、このアルカリプロテアーゼの
使用、前記のアルカリプロテアーゼを含む洗剤組成物及
び衣服からタンパク質の汚れを除去する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】９より
高いpHレベルでタンパク質を分解する能力を有するバク
テリアプロテアーゼが、かなり長い間にわたって知られ
ている。これらのプロテアーゼは、洗剤洗浄操作に典型
的に使用される比較的高いpHレベルでその活性を維持す
るそれらのタンパク質分解作用のために洗剤配合物中の
混入に適している。既知の高アルカリプロテアーゼの中
に、公開された欧州特許出願第0204342 号明細書にタカ
ハシにより開示されたアルカリプロテアーゼがあり、そ
の特許はバチルス属に属する微生物（その生物は或る種
の特性を示し、それによりアルカリプロテアーゼが産生
される）により産生されたアルカリプロテアーゼを特許
請求している。
高いpHレベルでタンパク質を分解する能力を有するバク
テリアプロテアーゼが、かなり長い間にわたって知られ
ている。これらのプロテアーゼは、洗剤洗浄操作に典型
的に使用される比較的高いpHレベルでその活性を維持す
るそれらのタンパク質分解作用のために洗剤配合物中の
混入に適している。既知の高アルカリプロテアーゼの中
に、公開された欧州特許出願第0204342 号明細書にタカ
ハシにより開示されたアルカリプロテアーゼがあり、そ
の特許はバチルス属に属する微生物（その生物は或る種
の特性を示し、それによりアルカリプロテアーゼが産生
される）により産生されたアルカリプロテアーゼを特許
請求している。
【０００３】文献The Journal of Biological Chemistr
y,1968,243,9号,2184 頁には、サブチリシン・カールス
ベルグ(Subtilisin Carlsberg)の完全アミノ酸配列が記
載されている。ホリコシらの米国特許第4,052,262 号
は、適当な栄養増殖培地中のバチルス種No.221(ATCC215
22) として同定されたバクテリアの培養を伴うアルカリ
プロテアーゼの調製法を特許請求している。イチシマら
は、米国特許第4,480,037 号においてAPI-21として同定
され、或る物理化学的性質により特性決定されたアルカ
リプロテアーゼを特許請求している。このプロテアーゼ
は、特許権者がバチルス種No.NKS-21 を特徴とする培養
により得られる。
y,1968,243,9号,2184 頁には、サブチリシン・カールス
ベルグ(Subtilisin Carlsberg)の完全アミノ酸配列が記
載されている。ホリコシらの米国特許第4,052,262 号
は、適当な栄養増殖培地中のバチルス種No.221(ATCC215
22) として同定されたバクテリアの培養を伴うアルカリ
プロテアーゼの調製法を特許請求している。イチシマら
は、米国特許第4,480,037 号においてAPI-21として同定
され、或る物理化学的性質により特性決定されたアルカ
リプロテアーゼを特許請求している。このプロテアーゼ
は、特許権者がバチルス種No.NKS-21 を特徴とする培養
により得られる。
【０００４】米国特許第3,723,250 号において、アウン
ストラップ(Aunstrup)らはバチルス属からの或る種のバ
クテリアの培養による高アルカリプロテアーゼ、特に、
約９より高いpH値で最適のタンパク質分解活性を有し、
かつpH12でそれらの最高のタンパク質分解値の少なくと
も80％を保持するアルカリプロテアーゼの調製法を開示
している。米国特許第4,002,572 号において、ニジェン
フイス(Nijenhuis) はバチルス株“PB 92"を開示し、そ
してアルカリ培地中で高いタンパク質分解活性を有する
酵素の生産におけるこの株の使用を特許請求している。
アウンストラップらは、米国特許第3,827,938 号におい
てバチルス・フィルムス(B.firmus)、株NRS 783 と称す
る微生物の液内培養を伴うアルカリタンパク質分解酵素
の生産法を特許請求している。アウンストラップらの米
国特許第3,674,643 号は適当な栄養培地中で7.5 〜11の
pHでバチルス・アルカロフィルス・ベッダー(B.alcalop
hilus Vedder) を培養することによるタンパク質分解酵
素の調製法を特許請求している。
ストラップ(Aunstrup)らはバチルス属からの或る種のバ
クテリアの培養による高アルカリプロテアーゼ、特に、
約９より高いpH値で最適のタンパク質分解活性を有し、
かつpH12でそれらの最高のタンパク質分解値の少なくと
も80％を保持するアルカリプロテアーゼの調製法を開示
している。米国特許第4,002,572 号において、ニジェン
フイス(Nijenhuis) はバチルス株“PB 92"を開示し、そ
してアルカリ培地中で高いタンパク質分解活性を有する
酵素の生産におけるこの株の使用を特許請求している。
アウンストラップらは、米国特許第3,827,938 号におい
てバチルス・フィルムス(B.firmus)、株NRS 783 と称す
る微生物の液内培養を伴うアルカリタンパク質分解酵素
の生産法を特許請求している。アウンストラップらの米
国特許第3,674,643 号は適当な栄養培地中で7.5 〜11の
pHでバチルス・アルカロフィルス・ベッダー(B.alcalop
hilus Vedder) を培養することによるタンパク質分解酵
素の調製法を特許請求している。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、増大された安
定性を有し、かつ一般の洗剤中にブレンドされた場合に
改良された洗浄能力を示す新規なアルカリプロテアーゼ
に関する。本発明は、高度にアルカリ性の条件で洗剤の
存在下で優れた安定性を有する酵素を提供する。本発明
は、8.5 より高いpHで既知のアルカリプロテアーゼより
大きい酵素活性を有する酵素を提供するものであり、こ
の差は高度にアルカリ性の条件で最も著しい。本発明
は、バチルス・プロテオリチクス(Bacillus proteolyti
cus)のバクテリアから誘導されたアルカリプロテアーゼ
に関する。本発明は、28キロダルトンの分子量及び10〜
11.5の等電点を有するバチルスから誘導されたアルカリ
プロテアーゼに関する。
定性を有し、かつ一般の洗剤中にブレンドされた場合に
改良された洗浄能力を示す新規なアルカリプロテアーゼ
に関する。本発明は、高度にアルカリ性の条件で洗剤の
存在下で優れた安定性を有する酵素を提供する。本発明
は、8.5 より高いpHで既知のアルカリプロテアーゼより
大きい酵素活性を有する酵素を提供するものであり、こ
の差は高度にアルカリ性の条件で最も著しい。本発明
は、バチルス・プロテオリチクス(Bacillus proteolyti
cus)のバクテリアから誘導されたアルカリプロテアーゼ
に関する。本発明は、28キロダルトンの分子量及び10〜
11.5の等電点を有するバチルスから誘導されたアルカリ
プロテアーゼに関する。
【０００６】本発明のアルカリプロテアーゼは、約11.1
の等電点（そこで、その活性は最高である）を有する。
本発明の酵素は細胞外の高アルカリプロテアーゼであ
る。本発明のアルカリプロテアーゼは8.5 〜11.5の範
囲、通常10以上のpHでタンパク質分解活性に最適のpHを
有する。本発明のアルカリプロテアーゼのアミノ末端か
ら最初の20のアミノ酸の配列（配列番号：１）は下記の
とおりである。 Ala-Gln-Ser-Val-Pro-Trp-Gly-Ile-Ser-Arg- Val-Gln-Ala-Pro-Ala-Ala-His-Asn-Arg-Gly-
の等電点（そこで、その活性は最高である）を有する。
本発明の酵素は細胞外の高アルカリプロテアーゼであ
る。本発明のアルカリプロテアーゼは8.5 〜11.5の範
囲、通常10以上のpHでタンパク質分解活性に最適のpHを
有する。本発明のアルカリプロテアーゼのアミノ末端か
ら最初の20のアミノ酸の配列（配列番号：１）は下記の
とおりである。 Ala-Gln-Ser-Val-Pro-Trp-Gly-Ile-Ser-Arg- Val-Gln-Ala-Pro-Ala-Ala-His-Asn-Arg-Gly-
【０００７】本発明のアルカリプロテアーゼは、市販の
重質液体洗剤中で11日の期間にわたって8.0 のpHで43℃
の温度に保たれた後にそれらの最初の活性の少なくとも
70％を保持する。アルカリプロテアーゼは、11日の期間
にわたって8.0 のpHまたは9.6 のpHで43℃に保たれた後
にそれらの最初の活性の少なくとも50％を保持する。本
発明のアルカリプロテアーゼはバチルスから誘導され
る。それらは好アルカリ性バチルスから誘導されること
が好ましい。それらはバチルス・プロテオリチクスのバ
クテリアまたは自然修飾または遺伝子修飾によるそれら
の誘導種から誘導されることが更に好ましい。
重質液体洗剤中で11日の期間にわたって8.0 のpHで43℃
の温度に保たれた後にそれらの最初の活性の少なくとも
70％を保持する。アルカリプロテアーゼは、11日の期間
にわたって8.0 のpHまたは9.6 のpHで43℃に保たれた後
にそれらの最初の活性の少なくとも50％を保持する。本
発明のアルカリプロテアーゼはバチルスから誘導され
る。それらは好アルカリ性バチルスから誘導されること
が好ましい。それらはバチルス・プロテオリチクスのバ
クテリアまたは自然修飾または遺伝子修飾によるそれら
の誘導種から誘導されることが更に好ましい。
【０００８】また、本発明はバチルス・プロテオリチク
スの新規なバクテリアに関する。また、本発明は、本発
明のアルカリプロテアーゼを産生するバチルス・プロテ
オリチクスの新規なバクテリアに関する。それは、ブダ
ペスト条約のもとにアグリカルチュラル・リサーチ・カ
ルチャー・コレクション(Agricultural Research Cultu
re Collection)（米国、イリノイ州、ペオリア）に寄託
されたバチルス・プロテオリチクスのバクテリアに関す
ることが好ましい。その寄託番号は下記のとおりであ
る。バチルス・プロテオリチクス株11-12 ：NRRL B-189
64、バチルス・プロテオリチクス株11-13 ：NRRL B-189
63、バチルス・プロテオリチクス株21-23 ：NRRL B-189
65。
スの新規なバクテリアに関する。また、本発明は、本発
明のアルカリプロテアーゼを産生するバチルス・プロテ
オリチクスの新規なバクテリアに関する。それは、ブダ
ペスト条約のもとにアグリカルチュラル・リサーチ・カ
ルチャー・コレクション(Agricultural Research Cultu
re Collection)（米国、イリノイ州、ペオリア）に寄託
されたバチルス・プロテオリチクスのバクテリアに関す
ることが好ましい。その寄託番号は下記のとおりであ
る。バチルス・プロテオリチクス株11-12 ：NRRL B-189
64、バチルス・プロテオリチクス株11-13 ：NRRL B-189
63、バチルス・プロテオリチクス株21-23 ：NRRL B-189
65。
【０００９】また、本発明はバチルス・プロテオリチク
スのバクテリアの天然または人工の突然変異体及び誘導
種に関する。本発明のバクテリアはバチルス属の新規な
種に属し、そして高度にアルカリ性の条件で優れた安定
性を有するプロテアーゼ（このプロテアーゼは、洗剤成
分の存在下で改良された洗浄活性に寄与する）を分泌す
る。本発明者らがバチルス・プロテオリチクスとして特
性決定したバクテリアの微生物学的性質は、ゴードン
(R.E.Gordon)、ハイネス(W.C.Haynes)及びパング(C.H.
N.Pang)(1973)(The genus Bacillus.Handbook 427号.U.
S.dept of Agriculture, ワシントンD.C.) 及びBergey'
s Manual of Systematic Bacteriology２巻(1986)に従
って測定した。pH9.7 の培地を、0.9 ％の二塩基性リン
酸ナトリウム及び1.0 ％の重炭酸ナトリウムを添加する
ことにより調製した（pHを水酸化ナトリウムで調節す
る）。
スのバクテリアの天然または人工の突然変異体及び誘導
種に関する。本発明のバクテリアはバチルス属の新規な
種に属し、そして高度にアルカリ性の条件で優れた安定
性を有するプロテアーゼ（このプロテアーゼは、洗剤成
分の存在下で改良された洗浄活性に寄与する）を分泌す
る。本発明者らがバチルス・プロテオリチクスとして特
性決定したバクテリアの微生物学的性質は、ゴードン
(R.E.Gordon)、ハイネス(W.C.Haynes)及びパング(C.H.
N.Pang)(1973)(The genus Bacillus.Handbook 427号.U.
S.dept of Agriculture, ワシントンD.C.) 及びBergey'
s Manual of Systematic Bacteriology２巻(1986)に従
って測定した。pH9.7 の培地を、0.9 ％の二塩基性リン
酸ナトリウム及び1.0 ％の重炭酸ナトリウムを添加する
ことにより調製した（pHを水酸化ナトリウムで調節す
る）。
【００１０】下記の形態学的性質を、0.5 ％のトリプト
ン(TRYPTONE)（ジフコ社(Difco))、0.5 ％の酵母エキス
（ジフコ社）、1.0 ％のグルコース及び上記の緩衝塩を
含む寒天培地で34℃で２日間培養した後に観察する。こ
うして、新規なバチルス・プロテオリチクスを含む株の
全ての細胞が棒状の形状を有することが測定される。株
21-23 は約0.94μm/2.35μm のサイズを有する。加え
て、全ての株が運動性を示す絨毛性のべん毛を有し、そ
してそれらの全てが膨潤胞子嚢中で楕円（株21-23 に関
して約0.59μm/1.18μm ）であり、末端近くに配置され
る胞子を形成した。全ての株はグラム陽性であることが
わかった。表１に要約されるような下記の生理学的性質
が、バチルス・プロテオリチクスの種々の株に当てはま
る。
ン(TRYPTONE)（ジフコ社(Difco))、0.5 ％の酵母エキス
（ジフコ社）、1.0 ％のグルコース及び上記の緩衝塩を
含む寒天培地で34℃で２日間培養した後に観察する。こ
うして、新規なバチルス・プロテオリチクスを含む株の
全ての細胞が棒状の形状を有することが測定される。株
21-23 は約0.94μm/2.35μm のサイズを有する。加え
て、全ての株が運動性を示す絨毛性のべん毛を有し、そ
してそれらの全てが膨潤胞子嚢中で楕円（株21-23 に関
して約0.59μm/1.18μm ）であり、末端近くに配置され
る胞子を形成した。全ての株はグラム陽性であることが
わかった。表１に要約されるような下記の生理学的性質
が、バチルス・プロテオリチクスの種々の株に当てはま
る。
【００１１】
【表１】 表１ 生理学的性質 ＶＰ試験 陰性 インドールの産生 陰性 澱粉の加水分解 陽性 クエン酸の利用 コサー(Koser) 培地中でわずかに利用 色素の産生 細胞外の色素は形成されない カタラーゼ 陽性 増殖の温度範囲 20〜57℃、特に33〜35℃の温度が良好 である 増殖のpH範囲 pH7.0 〜12.0、特にpH10.0付近が良好 である 酸素に対する挙動 好気性 下記の表に示されたサッカリド から酸の産生（＋，産生した；−，産生しなかった）
【００１２】
【表２】
【００１３】
【表３】 （続き）
【００１４】これらのバクテリアの更に別の性質は、塩
化ナトリウムに対するそれらの抵抗性（全ての株は５％
のNaCl中で増殖するが、７％または10％のNaCl中で増殖
しない）；アルカリプロテアーゼ（これらは９以上の最
適pHを有し、また洗剤成分と合わせた場合にアルカリ条
件で優れた安定性を示し、それ故、改良された洗浄能力
に寄与する）の産生のそれらの能力である。以上の性質
を要約すると、本発明のバクテリアはグラム陽性の棒状
物であり、これらはカタラーゼ陽性であり、好気性であ
り、そして耐熱性の内生胞子を生産する。こうして、そ
れらはバチルス属に属する。また、これらの株は絨毛性
べん毛を有する棒状物であり、20℃〜57℃の温度範囲で
増殖し、かつ33〜35℃の最適増殖温度を有することがわ
かる。これらの株はpH10で増殖できる好アルカリ性菌で
ある。
化ナトリウムに対するそれらの抵抗性（全ての株は５％
のNaCl中で増殖するが、７％または10％のNaCl中で増殖
しない）；アルカリプロテアーゼ（これらは９以上の最
適pHを有し、また洗剤成分と合わせた場合にアルカリ条
件で優れた安定性を示し、それ故、改良された洗浄能力
に寄与する）の産生のそれらの能力である。以上の性質
を要約すると、本発明のバクテリアはグラム陽性の棒状
物であり、これらはカタラーゼ陽性であり、好気性であ
り、そして耐熱性の内生胞子を生産する。こうして、そ
れらはバチルス属に属する。また、これらの株は絨毛性
べん毛を有する棒状物であり、20℃〜57℃の温度範囲で
増殖し、かつ33〜35℃の最適増殖温度を有することがわ
かる。これらの株はpH10で増殖できる好アルカリ性菌で
ある。
【００１５】これらの株と同様の性質を有するバチルス
の既知の種はバチルス・パステウリイ(B.pasteurii) 及
びバチルス・アルカロフィルス(B.alcalophilus)であ
る。本発明の株は、本発明の株が澱粉を加水分解し、一
方、バチルス・パステウリイが澱粉を加水分解せず、そ
して本発明の株がアルカリ培地中の増殖にアンモニウム
塩を必要とせず、一方、バチルス・パステウリイがそれ
を必要とする点でバチルス・パステウリイと異なる。加
えて、本発明の株は10％のNaClの存在下で増殖せず、一
方、バチルス・パステウリイがその存在下で増殖する。
その他の区別は、上記のバチルス・プロテオリチクスの
株が55〜57℃までの温度で増殖できるが、一方、バチル
ス・パステウリイが50℃以上で増殖しないことである。
更に、本発明の株は好アルカリ性バチルスであるので、
それらがバチルス・アルカロフィルス(ATCC 27647)と比
較される。本発明の株は、本発明の株がＬ−アラビノー
スまたはＤ−キシロースから酸を産生しないが、一方、
バチルス・アルカロフィルスがそれらから酸を産生する
点でATCC 27647株と異なる。株ATCC 27647は５％のNaCl
の存在下または50℃以上の温度で増殖しないが、これら
の条件下で本発明の株は増殖する。アルカリ条件で増殖
できる２種のバチルス種のみがその名称を記載された
が、本発明の株は入手可能な名称のつけられていない好
アルカリ性バチルス種No.221(ATCC 21522)、No.Y-76(AT
CC 21537- 米国特許第4,052,262 号) 、No.0-4(ATCC 21
536-米国特許第4,052,262 号) 、No.A-40(ATCC 21592)
、PB-92(ATCC 31408- 米国特許第4,002,572 号) 並び
に株Ｙ、Ｐ、Ｋ及びＸ（欧州特許出願第0,204,342 号)
と比較される。
の既知の種はバチルス・パステウリイ(B.pasteurii) 及
びバチルス・アルカロフィルス(B.alcalophilus)であ
る。本発明の株は、本発明の株が澱粉を加水分解し、一
方、バチルス・パステウリイが澱粉を加水分解せず、そ
して本発明の株がアルカリ培地中の増殖にアンモニウム
塩を必要とせず、一方、バチルス・パステウリイがそれ
を必要とする点でバチルス・パステウリイと異なる。加
えて、本発明の株は10％のNaClの存在下で増殖せず、一
方、バチルス・パステウリイがその存在下で増殖する。
その他の区別は、上記のバチルス・プロテオリチクスの
株が55〜57℃までの温度で増殖できるが、一方、バチル
ス・パステウリイが50℃以上で増殖しないことである。
更に、本発明の株は好アルカリ性バチルスであるので、
それらがバチルス・アルカロフィルス(ATCC 27647)と比
較される。本発明の株は、本発明の株がＬ−アラビノー
スまたはＤ−キシロースから酸を産生しないが、一方、
バチルス・アルカロフィルスがそれらから酸を産生する
点でATCC 27647株と異なる。株ATCC 27647は５％のNaCl
の存在下または50℃以上の温度で増殖しないが、これら
の条件下で本発明の株は増殖する。アルカリ条件で増殖
できる２種のバチルス種のみがその名称を記載された
が、本発明の株は入手可能な名称のつけられていない好
アルカリ性バチルス種No.221(ATCC 21522)、No.Y-76(AT
CC 21537- 米国特許第4,052,262 号) 、No.0-4(ATCC 21
536-米国特許第4,052,262 号) 、No.A-40(ATCC 21592)
、PB-92(ATCC 31408- 米国特許第4,002,572 号) 並び
に株Ｙ、Ｐ、Ｋ及びＸ（欧州特許出願第0,204,342 号)
と比較される。
【００１６】上記の株の全てが好アルカリ性バクテリア
であり、アルカリ培地（pH10) 中の増殖の性質を共有し
ている。本発明の株とは対照的に、バチルス分離株Ｙ、
Ｐ、Ｋ及びＸは10％のNaClの存在下で増殖し、47℃以上
で増殖せず、ガラクトースから酸を産生せず、そしてレ
モンの形状の内生胞子を生産する。本発明の株とは対照
的に、バチルス株PB-92(ATCC 31408) はリボースのみか
ら酸を産生し、そして試験したその他の基質（表２を参
照のこと）から酸が生成されない。バチルス株PB-92 は
50℃の最高増殖温度を有していた。記載されたその他の
ATCC株の全ての他にバチルスNo.0-4、A-40及び221 との
バチルス・プロテオリチクスからの本発明の株の充分な
比較が、下記の表２に示されている。
であり、アルカリ培地（pH10) 中の増殖の性質を共有し
ている。本発明の株とは対照的に、バチルス分離株Ｙ、
Ｐ、Ｋ及びＸは10％のNaClの存在下で増殖し、47℃以上
で増殖せず、ガラクトースから酸を産生せず、そしてレ
モンの形状の内生胞子を生産する。本発明の株とは対照
的に、バチルス株PB-92(ATCC 31408) はリボースのみか
ら酸を産生し、そして試験したその他の基質（表２を参
照のこと）から酸が生成されない。バチルス株PB-92 は
50℃の最高増殖温度を有していた。記載されたその他の
ATCC株の全ての他にバチルスNo.0-4、A-40及び221 との
バチルス・プロテオリチクスからの本発明の株の充分な
比較が、下記の表２に示されている。
【００１７】
【表４】 表２ その他の好アルカリ性バチルスからバチルス・プロテオリチクスを区別する特徴 下記の物質から B.プロテオ B.アルカロ B.アルカロ No 0-4 産生される酸 リチクス フィルス フィルス亜種 (ATCC- （３種の株全部）(ATCC-27647) ハロジュランス 21536) (ATCC-27557) リボース ＋ − − ＋ ガラクトース ＋ − − − Ｄ−グルコース ＋ ＋ ＋ ＋ Ｄ−フラクトース ＋ ＋ ＋ ＋ Ｌ−ラムノース − − − − Ｄ−マンニトール ＋ − − − Ｄ−ソルビトール − − − − α−メチルＤ−グルコシド＋ − − − Ｎ−アセチルグルコサミン＋ ＋ ＋ ＋ アミグダリン ＋ − − ＋ エスクリン − ＋ − − Ｏ−セロビオース ＋ − − ＋ Ｄ−マルトース ＋ ＋ ＋ − サッカロース ＋ ＋ ＋ ＋ トレハロース ＋ ＋ ＋ ＋ 澱粉 ＋ ＋ ＋ − グリコーゲン ＋ ＋ ＋ − β−ゲンチオビオース ＋ − − − 最高増殖温度（℃） 55-57 46 54 56 ５％のNaCl中の増殖 ＋ − ＋ ＋10％のNaCl中の増殖 − − ＋ ND
【００１８】
【表５】 表２（続き） その他の好アルカリ性バチルスからバチルス・プロテオリチクスを区別する特徴 下記の物質から No Y-76 No 221 No A-40 PB-92 産生される酸 (ATCC- (ATCC- (ATCC- (ATCC- 21537) 21527) 21592) 31408) リボース − − ＋ ＋ ガラクトース − − − − Ｄ−グルコース ＋ ＋ ＋ − Ｄ−フラクトース ＋ ＋ ＋ − Ｌ−ラムノース ＋ − − − Ｄ−マンニトール ＋ ＋ ＋ − Ｄ−ソルビトール ＋ ＋ − − α−メチルＤ−グルコシド＋ − ＋ − Ｎ−アセチルグルコサミン＋ ＋ ＋ − アミグダリン ＋ ＋ − − エスクリン − − ＋ − Ｏ−セロビオース ＋ ＋ − − Ｄ−マルトース ＋ ＋ ＋ − サッカロース ＋ ＋ ＋ − トレハロース ＋ ＋ ＋ − 澱粉 − − ＋ − グリコーゲン − − ＋ − β−ゲンチオビオース − − − − 最高増殖温度（℃） 56 55 47 47 ５％のNaCl中の増殖 ＋ ＋ ＋ ND10％のNaCl中の増殖 ND ND ND ND 注 ND= 測定せず、＋＝産生する、−＝産生しない。
【００１９】本発明のバチルス株は既知の好アルカリ性
バチルスであるバチルス・パステウリイ、バチルス・ア
ルカロフィルス、バチルス・アルカロフィルス亜種ハロ
ジュランス及び好アルカリ性バチルスの名称の付けられ
ていない構成員から明らかに区別できるので、考慮中の
微生物について新規な種を確立することが適切である。
それ故、本発明者らは、この新規なバクテリア種をバチ
ルス・プロテオリチクスと称する。本発明のアルカリプ
ロテアーゼは、本明細書に記載されたバチルス・プロテ
オリチクスの分離株により産生し得るだけでなく、これ
らの天然もしくは人工の突然変異体及び／またはその他
の誘導種により産生し得る。また、本発明は、新規な微
生物またはその誘導種を通気条件下で適当な栄養培地中
で培養し、次いでそれからアルカリプロテアーゼを回収
することを含む本発明のアルカリプロテアーゼの生産法
に関する。本発明により生産されるアルカリプロテアー
ゼは、バチルス・プロテオリチクスまたはその誘導種の
バクテリア培養菌を培養し、得られた物質をアルカリプ
ロテアーゼの生産について知られている方法で単離、精
製することにより調製し得る。
バチルスであるバチルス・パステウリイ、バチルス・ア
ルカロフィルス、バチルス・アルカロフィルス亜種ハロ
ジュランス及び好アルカリ性バチルスの名称の付けられ
ていない構成員から明らかに区別できるので、考慮中の
微生物について新規な種を確立することが適切である。
それ故、本発明者らは、この新規なバクテリア種をバチ
ルス・プロテオリチクスと称する。本発明のアルカリプ
ロテアーゼは、本明細書に記載されたバチルス・プロテ
オリチクスの分離株により産生し得るだけでなく、これ
らの天然もしくは人工の突然変異体及び／またはその他
の誘導種により産生し得る。また、本発明は、新規な微
生物またはその誘導種を通気条件下で適当な栄養培地中
で培養し、次いでそれからアルカリプロテアーゼを回収
することを含む本発明のアルカリプロテアーゼの生産法
に関する。本発明により生産されるアルカリプロテアー
ゼは、バチルス・プロテオリチクスまたはその誘導種の
バクテリア培養菌を培養し、得られた物質をアルカリプ
ロテアーゼの生産について知られている方法で単離、精
製することにより調製し得る。
【００２０】本発明の株の培養に関して、固体または液
体の培地を使用することが可能であり、このような培地
はアルカリ緩衝剤を含むだけでなく、バクテリアの増殖
に必要な成分、即ち、炭素源、窒素源及び無機塩を含む
必要がある。緩衝剤は培地のpHを７〜12、好ましくは８
〜11のレベルに保つべきである。適当な炭素源として、
グルコース、マンノース、フラクトース、マンニトー
ル、マルトース、セロビオース、蔗糖、デキストリン、
澱粉、加水分解された澱粉、糖蜜、それらの混合物また
はこれらの炭素源の２種以上のブレンドが挙げられる。
使用される炭素源はグルコース及び／または加水分解さ
れた澱粉であることが好ましい。最良の結果が、加水分
解された澱粉で得られる。
体の培地を使用することが可能であり、このような培地
はアルカリ緩衝剤を含むだけでなく、バクテリアの増殖
に必要な成分、即ち、炭素源、窒素源及び無機塩を含む
必要がある。緩衝剤は培地のpHを７〜12、好ましくは８
〜11のレベルに保つべきである。適当な炭素源として、
グルコース、マンノース、フラクトース、マンニトー
ル、マルトース、セロビオース、蔗糖、デキストリン、
澱粉、加水分解された澱粉、糖蜜、それらの混合物また
はこれらの炭素源の２種以上のブレンドが挙げられる。
使用される炭素源はグルコース及び／または加水分解さ
れた澱粉であることが好ましい。最良の結果が、加水分
解された澱粉で得られる。
【００２１】使用し得る窒素源として、大豆粉、加水分
解された大豆粉、カゼイン、コーンスティープリカー、
綿実粉、ジャガイモ粉、大麦粉、入手できるタンパク質
の酵素による加水分解産物、非脂肪乾燥ミルク固形物、
乾燥酵母、酵母エキス、それらの混合物またはこれらの
窒素源の２種以上のブレンドが挙げられる。使用される
窒素源は、大豆粉、加水分解された大豆粉、綿実粉、タ
ンパク質の酵素による加水分解産物、非脂肪乾燥ミルク
固形物、酵母エキス及びこれらの化合物の２種以上のブ
レンドであることが好ましい。窒素源は、大豆粉、加水
分解された大豆粉、綿実粉、酵母エキス及びこれらの化
合物の２種以上のブレンドであることが更に好ましい。
最良の結果が、加水分解された大豆粉で得られる。
解された大豆粉、カゼイン、コーンスティープリカー、
綿実粉、ジャガイモ粉、大麦粉、入手できるタンパク質
の酵素による加水分解産物、非脂肪乾燥ミルク固形物、
乾燥酵母、酵母エキス、それらの混合物またはこれらの
窒素源の２種以上のブレンドが挙げられる。使用される
窒素源は、大豆粉、加水分解された大豆粉、綿実粉、タ
ンパク質の酵素による加水分解産物、非脂肪乾燥ミルク
固形物、酵母エキス及びこれらの化合物の２種以上のブ
レンドであることが好ましい。窒素源は、大豆粉、加水
分解された大豆粉、綿実粉、酵母エキス及びこれらの化
合物の２種以上のブレンドであることが更に好ましい。
最良の結果が、加水分解された大豆粉で得られる。
【００２２】リン酸カリウム、塩化カルシウム、塩化カ
ルシウム二水和物、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム二水和物、硫酸マグネシウム及びそれらの混合物が好
適な無機塩を代表する。好適なアルカリ緩衝剤の例とし
て、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、
炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、リ
ン酸ナトリウム、テトラホウ酸ナトリウム及びこれらの
緩衝剤の２種以上のブレンドが挙げられる。使用される
アルカリ緩衝剤は、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水
素二カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リ
ン酸ナトリウムまたはこれらの緩衝剤の２種以上のブレ
ンドであることが好ましい。また、自動pH調節機構が種
々の塩基性反応物質の添加により使用されてもよい。所
望により、バクテリア株の増殖または酵素の産生に必要
なその他の有機または無機の物質が添加し得る。上記の
成分を含む培地が常法で滅菌され、本発明の株の一種で
接種される。培養は振とうしながら通気して、または通
気攪拌して好ましくは30〜40℃で30〜120 時間行われて
培養液を得ることができる。
ルシウム二水和物、硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウ
ム二水和物、硫酸マグネシウム及びそれらの混合物が好
適な無機塩を代表する。好適なアルカリ緩衝剤の例とし
て、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、
炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、リ
ン酸ナトリウム、テトラホウ酸ナトリウム及びこれらの
緩衝剤の２種以上のブレンドが挙げられる。使用される
アルカリ緩衝剤は、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水
素二カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リ
ン酸ナトリウムまたはこれらの緩衝剤の２種以上のブレ
ンドであることが好ましい。また、自動pH調節機構が種
々の塩基性反応物質の添加により使用されてもよい。所
望により、バクテリア株の増殖または酵素の産生に必要
なその他の有機または無機の物質が添加し得る。上記の
成分を含む培地が常法で滅菌され、本発明の株の一種で
接種される。培養は振とうしながら通気して、または通
気攪拌して好ましくは30〜40℃で30〜120 時間行われて
培養液を得ることができる。
【００２３】既知の方法、例えば、精密濾過、遠心分
離、限外濾過、凝集及び／または凝集とその後の限外濾
過または遠心分離によるバイオマスの除去後に、上澄み
が一つ以上のプロセス、例えば、通常の塩析、有機溶媒
の添加による沈殿、限外濾過、減圧下の凝縮、イオン交
換またはゲル濾過にかけられて、粉末または濃縮液の形
態の粗酵素または精製酵素を回収する。本明細書に記載
された株の全てが、10〜11.5の範囲の等電点（クロマト
フォーカシングにより測定される）を有する３種のアル
カリプロテアーゼのパターンを形成する。
離、限外濾過、凝集及び／または凝集とその後の限外濾
過または遠心分離によるバイオマスの除去後に、上澄み
が一つ以上のプロセス、例えば、通常の塩析、有機溶媒
の添加による沈殿、限外濾過、減圧下の凝縮、イオン交
換またはゲル濾過にかけられて、粉末または濃縮液の形
態の粗酵素または精製酵素を回収する。本明細書に記載
された株の全てが、10〜11.5の範囲の等電点（クロマト
フォーカシングにより測定される）を有する３種のアル
カリプロテアーゼのパターンを形成する。
【００２４】主要なプロテアーゼ酵素は以下のようにし
て精製し得る。バクテリアの培養後に、培養液が遠心分
離されて上澄みを得る。この上澄みに、凝集剤、例え
ば、商品名シンカル(CYNCAL)として販売される製品、水
及び濾過助剤、例えば、ケイ酸二カルシウム及びアルミ
ン酸二カルシウムを含む化合物または商品名セライト(C
ELITE)として販売される化合物が添加され、充分に混合
される。得られるスラリーが濾過される。プロテアーゼ
が従来の塩析（この場合、固体の硫酸ナトリウムが添加
され、攪拌される）により得られる透明な濾液から沈殿
される。次いでケイ酸二カルシウム及びアルミン酸二カ
ルシウムを含む化合物が添加され、プレコートされたフ
ィルターを使用して濾過される。次いで、保持された固
体が減圧で乾燥される。次いで乾燥粉末が緩衝液で抽出
される。未溶解の物質が遅い速度の遠心分離により除去
され、得られた上澄みが濾過により浄化される。次いで
限外濾過器を使用してその溶液が水に対して透析されて
(diafiltered) 、塩を除去する。次いで得られた溶液が
イオン交換カラム、例えば、DEAE-セルロース（ワット
マン社）（これは前もって緩衝液、例えば、0.01M のリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5)で平衡にされている）に
適用され、同緩衝液で溶離される。プロテアーゼは担体
により結合されておらず、その空隙率で溶離される。次
いでこれがアガロースを含むカラム（これに青色の色素
アフィニティーリガンドが結合されている）に適用され
る。プロテアーゼはアガロースカラムに結合され、溶離
される。このカラムからの溶出液が透析されて塩を除去
し、そしてレテンテート(retentate) が凍結乾燥されて
精製プロテアーゼ製剤を生じる。
て精製し得る。バクテリアの培養後に、培養液が遠心分
離されて上澄みを得る。この上澄みに、凝集剤、例え
ば、商品名シンカル(CYNCAL)として販売される製品、水
及び濾過助剤、例えば、ケイ酸二カルシウム及びアルミ
ン酸二カルシウムを含む化合物または商品名セライト(C
ELITE)として販売される化合物が添加され、充分に混合
される。得られるスラリーが濾過される。プロテアーゼ
が従来の塩析（この場合、固体の硫酸ナトリウムが添加
され、攪拌される）により得られる透明な濾液から沈殿
される。次いでケイ酸二カルシウム及びアルミン酸二カ
ルシウムを含む化合物が添加され、プレコートされたフ
ィルターを使用して濾過される。次いで、保持された固
体が減圧で乾燥される。次いで乾燥粉末が緩衝液で抽出
される。未溶解の物質が遅い速度の遠心分離により除去
され、得られた上澄みが濾過により浄化される。次いで
限外濾過器を使用してその溶液が水に対して透析されて
(diafiltered) 、塩を除去する。次いで得られた溶液が
イオン交換カラム、例えば、DEAE-セルロース（ワット
マン社）（これは前もって緩衝液、例えば、0.01M のリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5)で平衡にされている）に
適用され、同緩衝液で溶離される。プロテアーゼは担体
により結合されておらず、その空隙率で溶離される。次
いでこれがアガロースを含むカラム（これに青色の色素
アフィニティーリガンドが結合されている）に適用され
る。プロテアーゼはアガロースカラムに結合され、溶離
される。このカラムからの溶出液が透析されて塩を除去
し、そしてレテンテート(retentate) が凍結乾燥されて
精製プロテアーゼ製剤を生じる。
【００２５】また、本発明は、少なくとも本発明のアル
カリプロテアーゼを含む洗剤組成物に関する。また、本
発明は、有効量の本発明のアルカリプロテアーゼを含む
洗浄用組成物に関する。酵素は常法で洗浄用組成物に配
合でき、そして酵素を含む洗浄用組成物が本発明の別の
局面を形成する。本発明の酵素を含む洗浄用組成物は、
少なくとも洗剤を更に含む。洗浄用組成物に有益であ
り、かつ酵素添加と適合性である洗剤は一般にノニオン
系及びアニオン系の表面活性化合物、例えば、水溶性の
石鹸、アニオン系、ノニオン系、両性及び双性イオン系
の洗剤である。普通使用される洗剤の例は、ドデシルベ
ンゼンスルホン酸ナトリウム、または線状のアルキルベ
ンゼンスルホン酸ナトリウム及び一級アルキルスルフェ
ートである。それはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリ
ウムであることが好ましい。ノニオン系洗剤の例は、１
モル当たり７個のエトキシレート残基を有する約C1 3-C
15 一級アルコールのエトキシレートまたはこれと１モ
ル当たり３個の残基の延長までエトキシル化された相当
するアルコールの混合物である。
カリプロテアーゼを含む洗剤組成物に関する。また、本
発明は、有効量の本発明のアルカリプロテアーゼを含む
洗浄用組成物に関する。酵素は常法で洗浄用組成物に配
合でき、そして酵素を含む洗浄用組成物が本発明の別の
局面を形成する。本発明の酵素を含む洗浄用組成物は、
少なくとも洗剤を更に含む。洗浄用組成物に有益であ
り、かつ酵素添加と適合性である洗剤は一般にノニオン
系及びアニオン系の表面活性化合物、例えば、水溶性の
石鹸、アニオン系、ノニオン系、両性及び双性イオン系
の洗剤である。普通使用される洗剤の例は、ドデシルベ
ンゼンスルホン酸ナトリウム、または線状のアルキルベ
ンゼンスルホン酸ナトリウム及び一級アルキルスルフェ
ートである。それはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリ
ウムであることが好ましい。ノニオン系洗剤の例は、１
モル当たり７個のエトキシレート残基を有する約C1 3-C
15 一級アルコールのエトキシレートまたはこれと１モ
ル当たり３個の残基の延長までエトキシル化された相当
するアルコールの混合物である。
【００２６】上記の洗浄用組成物は、タンパク質分解活
性を含む洗剤配合物中に普通に使用される更に別の化合
物を含んでもよい。それらは、ナトリウムトリポリホス
フェートの如きアルカリ金属トリポリホスフェートまた
はアルカリ金属ピロホスフェートの如き複雑なリン酸塩
を含むことができる。更に、または別途、アルカリ金属
のシアノトリ酢酸塩及びアルカリ金属のクエン酸塩の如
き化合物が含まれていてもよい。洗浄用組成物中のそれ
らの作用は複雑であるが、それらの最も重要な作用は水
軟化剤の作用である。通常含まれるその他の化合物は、
ストラクチュラント(structurant) 、例えば、アルカリ
金属のケイ酸塩、好ましくはケイ酸ナトリウム、弱アル
カリ性化合物、例えば、アルカリ金属の重炭酸塩、増量
剤、例えば、アルカリ金属の硫酸塩、好ましくは硫酸ナ
トリウム、及びその他の化合物、例えば、カルボキシメ
チルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロー
ス、香料及び増白剤である。その他の通常含まれる化合
物は、過ホウ酸塩漂白前駆体、例えば、アルカリ金属の
過ホウ酸塩、好ましくは過ホウ酸ナトリウムである。
性を含む洗剤配合物中に普通に使用される更に別の化合
物を含んでもよい。それらは、ナトリウムトリポリホス
フェートの如きアルカリ金属トリポリホスフェートまた
はアルカリ金属ピロホスフェートの如き複雑なリン酸塩
を含むことができる。更に、または別途、アルカリ金属
のシアノトリ酢酸塩及びアルカリ金属のクエン酸塩の如
き化合物が含まれていてもよい。洗浄用組成物中のそれ
らの作用は複雑であるが、それらの最も重要な作用は水
軟化剤の作用である。通常含まれるその他の化合物は、
ストラクチュラント(structurant) 、例えば、アルカリ
金属のケイ酸塩、好ましくはケイ酸ナトリウム、弱アル
カリ性化合物、例えば、アルカリ金属の重炭酸塩、増量
剤、例えば、アルカリ金属の硫酸塩、好ましくは硫酸ナ
トリウム、及びその他の化合物、例えば、カルボキシメ
チルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロー
ス、香料及び増白剤である。その他の通常含まれる化合
物は、過ホウ酸塩漂白前駆体、例えば、アルカリ金属の
過ホウ酸塩、好ましくは過ホウ酸ナトリウムである。
【００２７】配合に際して、酵素は増量剤の如き成分の
一種と混合されて既知の酵素活性の濃厚物をつくり、次
いでその他の所望の成分と混合し得る。また、洗浄用組
成物は、所望のpHに調節するためのアルカリ及び硫酸ナ
トリウムの如き中性の無機塩を含んでもよい。また、洗
浄用組成物は、ポリアクリル酸の如きアクリルポリマ
ー、またはアクリル／マレイン酸コポリマーを含んでも
よい。また、洗浄用組成物は、テトラ−アセチル−エチ
レン−ジアミンの如きアミノを含む漂白活性剤を含んで
もよい。また、洗浄用組成物は、ビルダーとしてＡ型ゼ
オライトの如きゼオライトを含んでもよい。本発明の洗
浄用組成物は、本明細書で先に特定されたアルカリプロ
テアーゼ以外の酵素を含んでもよい。それは、中性のプ
ロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、バチルス・サブチ
リス(subtilis)、バチルス・レンタス(lentus)、バチル
ス・アミロリクエファシエンス(amyloliquefaciens) 、
バチルス・リチェニフォルミス(licheniformis) または
バチルス・アルカロフィルス(alcalophilus)、アミラー
ゼ、セルラーゼ、リパーゼまたはこれらのその他の酵素
の二種以上のブレンドを含んでもよい。
一種と混合されて既知の酵素活性の濃厚物をつくり、次
いでその他の所望の成分と混合し得る。また、洗浄用組
成物は、所望のpHに調節するためのアルカリ及び硫酸ナ
トリウムの如き中性の無機塩を含んでもよい。また、洗
浄用組成物は、ポリアクリル酸の如きアクリルポリマ
ー、またはアクリル／マレイン酸コポリマーを含んでも
よい。また、洗浄用組成物は、テトラ−アセチル−エチ
レン−ジアミンの如きアミノを含む漂白活性剤を含んで
もよい。また、洗浄用組成物は、ビルダーとしてＡ型ゼ
オライトの如きゼオライトを含んでもよい。本発明の洗
浄用組成物は、本明細書で先に特定されたアルカリプロ
テアーゼ以外の酵素を含んでもよい。それは、中性のプ
ロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、バチルス・サブチ
リス(subtilis)、バチルス・レンタス(lentus)、バチル
ス・アミロリクエファシエンス(amyloliquefaciens) 、
バチルス・リチェニフォルミス(licheniformis) または
バチルス・アルカロフィルス(alcalophilus)、アミラー
ゼ、セルラーゼ、リパーゼまたはこれらのその他の酵素
の二種以上のブレンドを含んでもよい。
【００２８】洗浄用組成物の例は、本発明の酵素並びに
洗剤、水軟化剤、アルカリ金属のケイ酸塩、弱アルカリ
性の重炭酸塩及び必要によりアルカリ金属のホウ酸塩を
含んでもよい。本発明の水性洗剤液の例は、ドデシルベ
ンゼンスルホン酸、７モル／モルのエチレンオキサイド
と縮合されたC12-C15 線状アルコール、モノエタノール
アミン、クエン酸、キシレンスルホン酸ナトリウム、水
酸化ナトリウム、本発明のプロテアーゼ及び水を含むよ
うに配合される。また、本発明は、洗剤活性組成物及び
有効量の本明細書で先に特定されたアルカリプロテアー
ゼを含む洗剤組成物に関する。また、本発明は、洗剤活
性組成物及び有効量の本明細書で先に特定されたアルカ
リプロテアーゼを含み、またビルダー、漂白剤または増
白剤の少なくとも一種を含む粒状洗剤組成物に関する。
多くのこのようなビルダー、漂白剤または増白剤が当業
界で知られている。また、本発明は、洗剤活性組成物及
び有効量の本明細書で先に特定されたアルカリプロテア
ーゼを含み、また漂白剤または増白剤の少なくとも一種
を含む液体洗剤組成物に関する。
洗剤、水軟化剤、アルカリ金属のケイ酸塩、弱アルカリ
性の重炭酸塩及び必要によりアルカリ金属のホウ酸塩を
含んでもよい。本発明の水性洗剤液の例は、ドデシルベ
ンゼンスルホン酸、７モル／モルのエチレンオキサイド
と縮合されたC12-C15 線状アルコール、モノエタノール
アミン、クエン酸、キシレンスルホン酸ナトリウム、水
酸化ナトリウム、本発明のプロテアーゼ及び水を含むよ
うに配合される。また、本発明は、洗剤活性組成物及び
有効量の本明細書で先に特定されたアルカリプロテアー
ゼを含む洗剤組成物に関する。また、本発明は、洗剤活
性組成物及び有効量の本明細書で先に特定されたアルカ
リプロテアーゼを含み、またビルダー、漂白剤または増
白剤の少なくとも一種を含む粒状洗剤組成物に関する。
多くのこのようなビルダー、漂白剤または増白剤が当業
界で知られている。また、本発明は、洗剤活性組成物及
び有効量の本明細書で先に特定されたアルカリプロテア
ーゼを含み、また漂白剤または増白剤の少なくとも一種
を含む液体洗剤組成物に関する。
【００２９】また、本発明は、本明細書で先に特定され
たアルカリプロテアーゼを含む液体洗剤組成物に関す
る。この液体洗剤組成物は水性または非水性であっても
よい。しばしば、この液体洗剤組成物は貯蔵安定性を改
良するための酵素安定剤を含む。多くのこのような酵素
安定剤、例えば、プロピレングリコールの如きポリオー
ルが当業界で知られている。本発明は特に均一な濃厚な
液体洗剤に関する。また、本発明は、本明細書で先に特
定されたアルカリプロテアーゼを含む粒状洗剤組成物に
関する。また、本発明は、衣類からタンパク質の汚れを
除去する方法に関するものであり、前記の方法は前記の
衣類を本明細書で先に特定された洗剤組成物で洗浄する
ことを含む。本発明を下記の実施例により更に詳しく説
明する。
たアルカリプロテアーゼを含む液体洗剤組成物に関す
る。この液体洗剤組成物は水性または非水性であっても
よい。しばしば、この液体洗剤組成物は貯蔵安定性を改
良するための酵素安定剤を含む。多くのこのような酵素
安定剤、例えば、プロピレングリコールの如きポリオー
ルが当業界で知られている。本発明は特に均一な濃厚な
液体洗剤に関する。また、本発明は、本明細書で先に特
定されたアルカリプロテアーゼを含む粒状洗剤組成物に
関する。また、本発明は、衣類からタンパク質の汚れを
除去する方法に関するものであり、前記の方法は前記の
衣類を本明細書で先に特定された洗剤組成物で洗浄する
ことを含む。本発明を下記の実施例により更に詳しく説
明する。
【００３０】
【実施例】実施例１ 自然界から本発明の株を単離するのに使用したスクリー
ニング操作は、以下のようにして行われる。 1)好アルカリ性バクテリアの単離：調査中の試料の場所
からの土壌約１g を塩溶液(0.8％のNaCl) ９mlに懸濁さ
せる。この懸濁液の所定の容積(0.1〜1.0 ml) を、下記
の培地を含む寒天プレートの表面に塗布する。商品名HY
ソイ(SOY)(シェフィールド・プロダクツ社) として販売
される加水分解された大豆粉0.8 ％(w/v) 、塩化カルシ
ウム0.044 ％(w/v)、商品名マルトリン(MALTRIN)100
（グレイン・プロセシング社）として販売される加水分
解された澱粉2.1 ％(w/v) 、非脂肪の乾燥ミルク固形物
２％(w/v) 、重炭酸ナトリウム0.84％(w/v) 及びリン酸
水素二ナトリウム0.1 ％。これを1.5 ％の寒天で固化す
る。プレートのインキュベーションを32℃で３日間行っ
て好アルカリ性バチルスを得る。
ニング操作は、以下のようにして行われる。 1)好アルカリ性バクテリアの単離：調査中の試料の場所
からの土壌約１g を塩溶液(0.8％のNaCl) ９mlに懸濁さ
せる。この懸濁液の所定の容積(0.1〜1.0 ml) を、下記
の培地を含む寒天プレートの表面に塗布する。商品名HY
ソイ(SOY)(シェフィールド・プロダクツ社) として販売
される加水分解された大豆粉0.8 ％(w/v) 、塩化カルシ
ウム0.044 ％(w/v)、商品名マルトリン(MALTRIN)100
（グレイン・プロセシング社）として販売される加水分
解された澱粉2.1 ％(w/v) 、非脂肪の乾燥ミルク固形物
２％(w/v) 、重炭酸ナトリウム0.84％(w/v) 及びリン酸
水素二ナトリウム0.1 ％。これを1.5 ％の寒天で固化す
る。プレートのインキュベーションを32℃で３日間行っ
て好アルカリ性バチルスを得る。
【００３１】2)アルカリプロテアーゼを産生するバクテ
リアの単離 上記の操作(1) で得られた好アルカリ性バクテリアを同
培地のプレートで更に精製し32℃で２日間インキュベー
トし、次いで透明な輪を形成したバクテリアをアルカリ
プロテアーゼを産生するバクテリアとして回収する。 3)高温スクリーン 上記の操作(2) で選択されたバクテリアの全てを同培地
に再度接種し(restreak)、48時間のインキュベーション
後に57℃における増殖について調べる。 4)安定なアルカリプロテアーゼ産生菌の選択 上記の操作(3) で選択されたバクテリアの全てを、商品
名トリプトン（ジフコ・ラブズ社）として販売されるタ
ンパク質の加水分解物0.5 ％、酵母エキス0.5％、グル
コース1.0 ％、重炭酸ナトリウム0.42％、炭酸ナトリウ
ム0.53％、リン酸水素二カリウム0.1 ％を含む液体培地
中で増殖させる。これらを一夜にわたって200rpmで振と
うしながら37℃でインキュベートする。次いでこれを５
％(v/v)の接種レベルで同培地の第二バッチに移し、37
℃で５時間にわたって振とうしながらインキュベートす
る。次いで５％の植菌物を、大豆粉2.4 ％、商品名マル
トリン100(グレイン・プロセシング社) として販売され
る加水分解された澱粉4.8％、リン酸水素二ナトリウム
0.9 ％及び重炭酸ナトリウム1.0 ％を含むプロテアーゼ
生産培地（pH9.5)に移し、激しく攪拌(300rpm)しながら
37℃で40時間インキュベートする。そのバイオマスを低
速の遠心分離により除去し、pH9.5 、55℃におけるプロ
テアーゼ安定性を以下のようにして調べる。アルカリプ
ロテアーゼを含む上澄み50μl を上記の操作(1) に記載
した組成物の寒天プレートの表面で12.7mmのブランク紙
抗菌性試験ディスクに適用する。プロテアーゼ活性の透
明な領域のサイズを、55℃でインキュベートしながら10
時間にわたって監視する。領域サイズの継続した膨張(c
ontinued expansion) は増大された安定性を意味すると
解される。
リアの単離 上記の操作(1) で得られた好アルカリ性バクテリアを同
培地のプレートで更に精製し32℃で２日間インキュベー
トし、次いで透明な輪を形成したバクテリアをアルカリ
プロテアーゼを産生するバクテリアとして回収する。 3)高温スクリーン 上記の操作(2) で選択されたバクテリアの全てを同培地
に再度接種し(restreak)、48時間のインキュベーション
後に57℃における増殖について調べる。 4)安定なアルカリプロテアーゼ産生菌の選択 上記の操作(3) で選択されたバクテリアの全てを、商品
名トリプトン（ジフコ・ラブズ社）として販売されるタ
ンパク質の加水分解物0.5 ％、酵母エキス0.5％、グル
コース1.0 ％、重炭酸ナトリウム0.42％、炭酸ナトリウ
ム0.53％、リン酸水素二カリウム0.1 ％を含む液体培地
中で増殖させる。これらを一夜にわたって200rpmで振と
うしながら37℃でインキュベートする。次いでこれを５
％(v/v)の接種レベルで同培地の第二バッチに移し、37
℃で５時間にわたって振とうしながらインキュベートす
る。次いで５％の植菌物を、大豆粉2.4 ％、商品名マル
トリン100(グレイン・プロセシング社) として販売され
る加水分解された澱粉4.8％、リン酸水素二ナトリウム
0.9 ％及び重炭酸ナトリウム1.0 ％を含むプロテアーゼ
生産培地（pH9.5)に移し、激しく攪拌(300rpm)しながら
37℃で40時間インキュベートする。そのバイオマスを低
速の遠心分離により除去し、pH9.5 、55℃におけるプロ
テアーゼ安定性を以下のようにして調べる。アルカリプ
ロテアーゼを含む上澄み50μl を上記の操作(1) に記載
した組成物の寒天プレートの表面で12.7mmのブランク紙
抗菌性試験ディスクに適用する。プロテアーゼ活性の透
明な領域のサイズを、55℃でインキュベートしながら10
時間にわたって監視する。領域サイズの継続した膨張(c
ontinued expansion) は増大された安定性を意味すると
解される。
【００３２】選択されたバクテリアの全てをゴードン
(R.E.Gordon)(1973)及びBergey's Manual of Systemati
c Bacteriology,2巻(1986)に従って試験し、特性決定
し、分類する。その他に、炭水化物からの酸の産生を、
小型試験系API 高速CH(DMSラボラトリィズ社、NJ) の改
良品を使用して調べる。このプロトコルにおいて、生物
をニュートリエント・アガー(NUTRIENT AGAR)(ジフコ
社) への重炭酸ナトリウム1.0 ％及びリン酸水素二ナト
リウム0.9 ％の添加によりつくられたアルカリ性栄養寒
天プレートに塗布し、35℃で48〜72時間インキュベート
する。生物当たり５個のプレートの増殖物を、10N のNa
OHでpH9.2 に調節されたチモールブルー溶液（トリプト
ン（ジフコ社）0.5 ％、酵母エキス0.5 ％、硫酸ナトリ
ウム0.5 ％及びチモールブルー（フィッシャー・サイエ
ンティフィック社、NJ)0.015％を含む)25 ml中に再度懸
濁させる。次いでこれをミクロアッセイキットのアンプ
ルに添加し、ブルーの出発点からの色の変化を48時間の
期間にわたって記録する。最も安定なアルカリプロテア
ーゼ産生菌の全てが炭水化物に関する酸産生の特徴的な
パターンを生じ、これはその他の好アルカリ性バチルス
から得られたパターンと異なり、バチルスの新種である
バチルス・プロテオリチクスの生成を保証する。天然源
から単離されたバクテリアのこのクラスターはバチルス
・プロテオリチクス株11-12 、11-13 及び21-23 を含
む。これらのバクテリア、バチルス・プロテオリチクス
をブタペスト条約のもとにアグリカルチュラル・リサー
チ・カルチャー・コレクション（米国、イリノイ州、ペ
オリア）に寄託する。寄託番号は下記のとおりである。
バチルス・プロテオリチクス株11-12 ：NRRL B-18964、
バチルス・プロテオリチクス株11-13 ：NRRL B-18963、
バチルス・プロテオリチクス株21-23 ：NRRL B-18965。
(R.E.Gordon)(1973)及びBergey's Manual of Systemati
c Bacteriology,2巻(1986)に従って試験し、特性決定
し、分類する。その他に、炭水化物からの酸の産生を、
小型試験系API 高速CH(DMSラボラトリィズ社、NJ) の改
良品を使用して調べる。このプロトコルにおいて、生物
をニュートリエント・アガー(NUTRIENT AGAR)(ジフコ
社) への重炭酸ナトリウム1.0 ％及びリン酸水素二ナト
リウム0.9 ％の添加によりつくられたアルカリ性栄養寒
天プレートに塗布し、35℃で48〜72時間インキュベート
する。生物当たり５個のプレートの増殖物を、10N のNa
OHでpH9.2 に調節されたチモールブルー溶液（トリプト
ン（ジフコ社）0.5 ％、酵母エキス0.5 ％、硫酸ナトリ
ウム0.5 ％及びチモールブルー（フィッシャー・サイエ
ンティフィック社、NJ)0.015％を含む)25 ml中に再度懸
濁させる。次いでこれをミクロアッセイキットのアンプ
ルに添加し、ブルーの出発点からの色の変化を48時間の
期間にわたって記録する。最も安定なアルカリプロテア
ーゼ産生菌の全てが炭水化物に関する酸産生の特徴的な
パターンを生じ、これはその他の好アルカリ性バチルス
から得られたパターンと異なり、バチルスの新種である
バチルス・プロテオリチクスの生成を保証する。天然源
から単離されたバクテリアのこのクラスターはバチルス
・プロテオリチクス株11-12 、11-13 及び21-23 を含
む。これらのバクテリア、バチルス・プロテオリチクス
をブタペスト条約のもとにアグリカルチュラル・リサー
チ・カルチャー・コレクション（米国、イリノイ州、ペ
オリア）に寄託する。寄託番号は下記のとおりである。
バチルス・プロテオリチクス株11-12 ：NRRL B-18964、
バチルス・プロテオリチクス株11-13 ：NRRL B-18963、
バチルス・プロテオリチクス株21-23 ：NRRL B-18965。
【００３３】実施例２−株の培養 バチルス・プロテオリチクス株21-23(NRRL B-18965) の
凍結した作用培養菌（10％のグリコール中で貯蔵）を使
用して種培地（これは脱イオン水中にトリプトン（ジフ
コ社）0.5 ％、酵母エキス（ジフコ社）0.5 ％及びグル
コース1.0 ％を含んでいた）に接種する。また、それは
リン酸水素二ナトリウム0.9 ％及び重炭酸ナトリウム1.
0 ％を含んでいた。この緩衝液を濃厚液として調製し、
NaOHでpH9.5 に調節し、別々に滅菌し、冷却時に種フラ
スコに添加する。その培養菌を、培養菌がケレット−サ
マーソン(Klett-Sommerson) 光度計（ケレット・マニュ
ファクチャリング社、NY、米国）で測定して400 単位の
ケレット値に等しい細胞密度に達するまで34℃で振とう
しながらインキュベートする。この培養菌を使用して10
リットルの醗酵槽中で同培地10リットルに接種し（５％
の接種レベル）、次いでこれを通気(0.5vvm)し、34℃で
攪拌(500rpm)して、培養菌が再度400 ケレット単位に等
しい細胞密度に達するまで培養する。これから、100 リ
ットルの生産醗酵槽に５％の接種レベルで接種する。こ
の醗酵槽はクエン酸ナトリウム二水和物0.33％、塩化カ
ルシウム二水和物0.26％、商品名HYソイ（シェフィール
ド社）として販売される加水分解された大豆粉1.87％、
商品名ファーマメディア(PHARMAMEDIA)(トレーダーズ・
プロテイン社) として販売される綿実粉2.93％、商品名
マルトリンM-50（グレイン・プロセシング社）として販
売される加水分解された澱粉10.93 ％、軟水を含む商品
名マズー(MAZUR)P-2000 消泡剤（マズー・ケミカル社）
0.2 ％を含む。緩衝液は脱イオン水（最終容積の7.0
％) 中にリン酸水素二ナトリウム0.9 ％及び重炭酸ナト
リウム1.0 ％を含む。それをNaOHでpH9.7 に調節し、別
々に滅菌する。完全培地の最終pHをNaOHでpH9.7 に調節
する。次いでこれを0.70kg/cm2(10psi) の背圧のもとに
通気(0.5vvm)し、攪拌(400rpm)して34℃で78時間培養す
る。78時間の培養後に、アルカリプロテアーゼの収量は
上澄み１ml当たり37APU である。
凍結した作用培養菌（10％のグリコール中で貯蔵）を使
用して種培地（これは脱イオン水中にトリプトン（ジフ
コ社）0.5 ％、酵母エキス（ジフコ社）0.5 ％及びグル
コース1.0 ％を含んでいた）に接種する。また、それは
リン酸水素二ナトリウム0.9 ％及び重炭酸ナトリウム1.
0 ％を含んでいた。この緩衝液を濃厚液として調製し、
NaOHでpH9.5 に調節し、別々に滅菌し、冷却時に種フラ
スコに添加する。その培養菌を、培養菌がケレット−サ
マーソン(Klett-Sommerson) 光度計（ケレット・マニュ
ファクチャリング社、NY、米国）で測定して400 単位の
ケレット値に等しい細胞密度に達するまで34℃で振とう
しながらインキュベートする。この培養菌を使用して10
リットルの醗酵槽中で同培地10リットルに接種し（５％
の接種レベル）、次いでこれを通気(0.5vvm)し、34℃で
攪拌(500rpm)して、培養菌が再度400 ケレット単位に等
しい細胞密度に達するまで培養する。これから、100 リ
ットルの生産醗酵槽に５％の接種レベルで接種する。こ
の醗酵槽はクエン酸ナトリウム二水和物0.33％、塩化カ
ルシウム二水和物0.26％、商品名HYソイ（シェフィール
ド社）として販売される加水分解された大豆粉1.87％、
商品名ファーマメディア(PHARMAMEDIA)(トレーダーズ・
プロテイン社) として販売される綿実粉2.93％、商品名
マルトリンM-50（グレイン・プロセシング社）として販
売される加水分解された澱粉10.93 ％、軟水を含む商品
名マズー(MAZUR)P-2000 消泡剤（マズー・ケミカル社）
0.2 ％を含む。緩衝液は脱イオン水（最終容積の7.0
％) 中にリン酸水素二ナトリウム0.9 ％及び重炭酸ナト
リウム1.0 ％を含む。それをNaOHでpH9.7 に調節し、別
々に滅菌する。完全培地の最終pHをNaOHでpH9.7 に調節
する。次いでこれを0.70kg/cm2(10psi) の背圧のもとに
通気(0.5vvm)し、攪拌(400rpm)して34℃で78時間培養す
る。78時間の培養後に、アルカリプロテアーゼの収量は
上澄み１ml当たり37APU である。
【００３４】実施例３−アルカリプロテアーゼの精製 主要プロテアーゼ酵素を以下のようにしてバチルス・プ
ロテオリチクス株21-23(NRRL B-18965) から精製する。
バクテリアの培養後に、培養液を1,300rpm(27,300 g)で
60分間にわたって遠心分離して上澄みを得る。上澄み４
リットルに、商品名シンカル(CYNCAL)(50 ％w/w)として
販売される凝集剤50g と、商品名セライト512 として販
売されるケイ酸二カルシウム及びアルミン酸二カルシウ
ムを含む化合物200gを添加し、充分に混合する。得られ
たスラリーを、商品名セライト512 として販売される製
品で前もって被覆されたフィルターを使用して濾過す
る。プロテアーゼを従来の塩析（この場合、固体の硫酸
ナトリウムが添加されて29％(w/v) の最終濃度を得る）
により得られた透明な濾液から沈殿させ、１時間攪拌す
る。次いで商品名セライト512 として販売される製品約
50g を添加し、セライト512 プレコートフィルターを使
用して濾過する。次いで保持された固体を減圧で０℃で
48時間乾燥させる。次いで乾燥粉末を0.1Mのリン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.5)で抽出する。未溶解の物質を遅い
速度の遠心分離により除去し、得られた上澄みを0.45ミ
クロンのフィルターによる濾過により浄化する。次いで
その溶液を、10,000分子量カットオフの限外濾過膜を使
用して水に対して透析して塩を除去する。次いで得られ
た溶液をDEAE- セルロース（ワットマン社）イオン交換
カラム（これは前もって0.01M のリン酸ナトリウム緩衝
液( pH6.5)で平衡にされている）に適用し、同緩衝液で
溶離する。プロテアーゼは担体により結合されず、その
空隙率で溶離される。次いでこれを、アガロース（これ
に、青色色素アフィニティーリガンドが結合されてい
る）を含むカラムに適用する。そのリガンドはシバクロ
ン・ブルー(CIBACRON BLUE)F3GA としてピアス・ケミカ
ルズ社から市販されている。プロテアーゼはシバクロン
・ブルーアガロースカラムに結合されており、これを0.
01M のリン酸ナトリウム緩衝液( pH6.5)中の0.5MのNaCl
の溶液で溶離する。このカラムからの溶出液を前記のよ
うに透析して塩を除去し、レテンテートを凍結乾燥して
精製プロテアーゼ製剤を得る。
ロテオリチクス株21-23(NRRL B-18965) から精製する。
バクテリアの培養後に、培養液を1,300rpm(27,300 g)で
60分間にわたって遠心分離して上澄みを得る。上澄み４
リットルに、商品名シンカル(CYNCAL)(50 ％w/w)として
販売される凝集剤50g と、商品名セライト512 として販
売されるケイ酸二カルシウム及びアルミン酸二カルシウ
ムを含む化合物200gを添加し、充分に混合する。得られ
たスラリーを、商品名セライト512 として販売される製
品で前もって被覆されたフィルターを使用して濾過す
る。プロテアーゼを従来の塩析（この場合、固体の硫酸
ナトリウムが添加されて29％(w/v) の最終濃度を得る）
により得られた透明な濾液から沈殿させ、１時間攪拌す
る。次いで商品名セライト512 として販売される製品約
50g を添加し、セライト512 プレコートフィルターを使
用して濾過する。次いで保持された固体を減圧で０℃で
48時間乾燥させる。次いで乾燥粉末を0.1Mのリン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.5)で抽出する。未溶解の物質を遅い
速度の遠心分離により除去し、得られた上澄みを0.45ミ
クロンのフィルターによる濾過により浄化する。次いで
その溶液を、10,000分子量カットオフの限外濾過膜を使
用して水に対して透析して塩を除去する。次いで得られ
た溶液をDEAE- セルロース（ワットマン社）イオン交換
カラム（これは前もって0.01M のリン酸ナトリウム緩衝
液( pH6.5)で平衡にされている）に適用し、同緩衝液で
溶離する。プロテアーゼは担体により結合されず、その
空隙率で溶離される。次いでこれを、アガロース（これ
に、青色色素アフィニティーリガンドが結合されてい
る）を含むカラムに適用する。そのリガンドはシバクロ
ン・ブルー(CIBACRON BLUE)F3GA としてピアス・ケミカ
ルズ社から市販されている。プロテアーゼはシバクロン
・ブルーアガロースカラムに結合されており、これを0.
01M のリン酸ナトリウム緩衝液( pH6.5)中の0.5MのNaCl
の溶液で溶離する。このカラムからの溶出液を前記のよ
うに透析して塩を除去し、レテンテートを凍結乾燥して
精製プロテアーゼ製剤を得る。
【００３５】実施例４−アルカリプロテアーゼの性質 こうして得られたバチルス・プロテオリチクス株21-23
により産生された主要な新規なアルカリプロテアーゼの
物理化学的性質は以下のとおりである。 i)比活性 株21-23 からの精製された新規なアルカリプロテアーゼ
の比活性を計算したところ、タンパク質1mg 当たり26.5
APU である。 分析プロトコル：アルカリプロテアーゼアッセイは、0.
06M のホウ酸塩緩衝液（pH8.5)でpH8.5 に緩衝されたカ
ゼイン基質（0.67％w/v の濃度）の40℃における加水分
解に基く。加水分解されていない基質をトリクロロ酢酸
18％(w/v) の添加により沈殿させ、遠心分離(1800gで15
分間) により除去する。可溶化されたカゼインペプチド
を275nm における吸光度により測定する。１アルカリプ
ロテアーゼ単位(APU) は、そのアッセイの条件下で毎分
４マイクロモルの当量のチロシンを遊離する活性であ
る。タンパク質濃度を、ブラッドフォード(BRADFORD)タ
ンパク質試薬（シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical C
o.,セントルイス,MO.) から入手した）を製造業者によ
り推奨された条件下で使用することにより測定する。
により産生された主要な新規なアルカリプロテアーゼの
物理化学的性質は以下のとおりである。 i)比活性 株21-23 からの精製された新規なアルカリプロテアーゼ
の比活性を計算したところ、タンパク質1mg 当たり26.5
APU である。 分析プロトコル：アルカリプロテアーゼアッセイは、0.
06M のホウ酸塩緩衝液（pH8.5)でpH8.5 に緩衝されたカ
ゼイン基質（0.67％w/v の濃度）の40℃における加水分
解に基く。加水分解されていない基質をトリクロロ酢酸
18％(w/v) の添加により沈殿させ、遠心分離(1800gで15
分間) により除去する。可溶化されたカゼインペプチド
を275nm における吸光度により測定する。１アルカリプ
ロテアーゼ単位(APU) は、そのアッセイの条件下で毎分
４マイクロモルの当量のチロシンを遊離する活性であ
る。タンパク質濃度を、ブラッドフォード(BRADFORD)タ
ンパク質試薬（シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical C
o.,セントルイス,MO.) から入手した）を製造業者によ
り推奨された条件下で使用することにより測定する。
【００３６】ii) 等電点 アルカリプロテアーゼの等電点は、クロマトフォーカシ
ングにより推定して11.1である。また、これを、ファー
マシア(PHARMACIA) 両性電解質系（ファーマシア社、ピ
スカットアウェイ、NJ.)を使用して等電点電気泳動によ
り確認する。 iii)分子量 精製アルカリプロテアーゼの分子量をドデシル硫酸ナト
リウムの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り測定する。その分子量は28キロダルトンであることが
わかる。
ングにより推定して11.1である。また、これを、ファー
マシア(PHARMACIA) 両性電解質系（ファーマシア社、ピ
スカットアウェイ、NJ.)を使用して等電点電気泳動によ
り確認する。 iii)分子量 精製アルカリプロテアーゼの分子量をドデシル硫酸ナト
リウムの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り測定する。その分子量は28キロダルトンであることが
わかる。
【００３７】iv) アミノ酸配列分析 凍結乾燥された精製アルカリプロテアーゼを、製造業者
の指示に従って操作されるアプライド・バイオシステム
ズ(APPLIED BIOSYSTEMS)（フォスター・シティ(Foster
City),CA.)477Aパルス液相タンパク質配列決定装置を使
用してアミノ末端から部分的に配列決定する。アミノ末
端からの最初の20のアミノ酸の配列（配列番号：１）は
通常の３文字アミノ酸コードで以下のように示される。 Ala-Gln-Ser-Val-Pro-Trp-Gly-Ile-Ser-Arg- Val-Gln-Ala-Pro-Ala-Ala-His-Asn-Arg-Gly-
の指示に従って操作されるアプライド・バイオシステム
ズ(APPLIED BIOSYSTEMS)（フォスター・シティ(Foster
City),CA.)477Aパルス液相タンパク質配列決定装置を使
用してアミノ末端から部分的に配列決定する。アミノ末
端からの最初の20のアミノ酸の配列（配列番号：１）は
通常の３文字アミノ酸コードで以下のように示される。 Ala-Gln-Ser-Val-Pro-Trp-Gly-Ile-Ser-Arg- Val-Gln-Ala-Pro-Ala-Ala-His-Asn-Arg-Gly-
【００３８】v)洗剤配合物中の安定性 市販の重質液体洗剤をpH８またはpH9.6 まで滴定し、新
規なプロテアーゼの試料を添加し、または比較のために
バチルス・リチェニフォルミス（酵素Ａ）により産生さ
れたアルカリプロテアーゼの試料を添加する（両方のプ
ロテアーゼを洗剤１g 当たり約2.0APUまで添加する）。
次いでこれらの試料を43℃でインキュベートし、示され
た日数で活性について分析し、残存活性を測定する。こ
れらの値を０日の時間の活性(100) を基準として相対活
性で表す。下記の表３の最初の数はpH8.0 処理による残
存活性を表し、括弧中の数はpH9.6 に保たれた時の残存
活性を表す。
規なプロテアーゼの試料を添加し、または比較のために
バチルス・リチェニフォルミス（酵素Ａ）により産生さ
れたアルカリプロテアーゼの試料を添加する（両方のプ
ロテアーゼを洗剤１g 当たり約2.0APUまで添加する）。
次いでこれらの試料を43℃でインキュベートし、示され
た日数で活性について分析し、残存活性を測定する。こ
れらの値を０日の時間の活性(100) を基準として相対活
性で表す。下記の表３の最初の数はpH8.0 処理による残
存活性を表し、括弧中の数はpH9.6 に保たれた時の残存
活性を表す。
【００３９】
【表６】 表３ 酵素 源 下記の日数における残存活性 ０ ４ ７ 11 新規な B.プロテオリチクス 100(100) 80(71) 68(54) 74(55) プロテアーゼ酵素Ａ B.リチェニフォルミス 100(100) 34(25) 24(18) 21(15)
【００４０】vi) 活性に最適なpH範囲 B.リチェニフォルミスからの酵素Ａと比較した新規なプ
ロテアーゼの相対活性を、6.5 〜11.5のpH範囲で種々の
緩衝液を使用して測定する。pH8.5 で得られた活性を任
意に100 と指定する。これらのデータを下記の表４に示
す。この表４は、B.プロテオリチクスからの新規なプロ
テアーゼがpH8.5 以上でB.リチェニフォルミスからのプ
ロテアーゼよりも大きな活性を有し、この差が高度にア
ルカリ性の条件下で最も顕著であることを示す。
ロテアーゼの相対活性を、6.5 〜11.5のpH範囲で種々の
緩衝液を使用して測定する。pH8.5 で得られた活性を任
意に100 と指定する。これらのデータを下記の表４に示
す。この表４は、B.プロテオリチクスからの新規なプロ
テアーゼがpH8.5 以上でB.リチェニフォルミスからのプ
ロテアーゼよりも大きな活性を有し、この差が高度にア
ルカリ性の条件下で最も顕著であることを示す。
【００４１】
【表７】 表４ 酵素 源 下記のpHにおける残存活性 6.5 7.5 8.5 9.5 10.5 11.5 新規な B.プロテオリチクス 50 82 100 107 105 110 プロテアーゼ酵素Ａ B.リチェニフォルミス 66 89 100 97 97 64
【００４２】B.プロテオリチクス株21-23 により産生さ
れたアルカリプロテアーゼの性質をその他の既知のアル
カリプロテアーゼと比較し、そして表５に見られるよう
に、株21-23 からのプロテアーゼは特有の分子量及び等
電点を有し、それ故、新規なアルカリプロテアーゼと認
められる。
れたアルカリプロテアーゼの性質をその他の既知のアル
カリプロテアーゼと比較し、そして表５に見られるよう
に、株21-23 からのプロテアーゼは特有の分子量及び等
電点を有し、それ故、新規なアルカリプロテアーゼと認
められる。
【００４３】
【表８】 表５ 生物 21-23 バチルス種Ｙ B.リチェニフォルミス B. 種221 NKS-21 引用文献 ａ ｂ ｃ ｄ 酵素 新規な 1/a 1/b カールズベルグ API-21 プロテ サブチリシン アーゼ 分子量 28,000 21,000 40,000 27,300 30,000 22,000 等電点 11.1 10.1 5.1 9.4 10.0 7.4 注： ａ：欧州特許出願第0,204,342 号 1/a:バチルス種Ｙから誘導されたアルカリプロテアーゼ
Ya 1/b:バチルス種Ｙから誘導されたアルカリプロテアーゼ
Yb ｂ：マークランド(Markland,Jr.F.S.)及びスミス(Smit
h,E.L.)(1971):primary structure,chemical and physi
cal properties,The Enzymes(第３編）３巻、561-608
頁、Academic Press、ニューヨーク及びロンドン。 ｃ：米国特許第4,052,262 号 ｄ：米国特許第4,480,037 号
Ya 1/b:バチルス種Ｙから誘導されたアルカリプロテアーゼ
Yb ｂ：マークランド(Markland,Jr.F.S.)及びスミス(Smit
h,E.L.)(1971):primary structure,chemical and physi
cal properties,The Enzymes(第３編）３巻、561-608
頁、Academic Press、ニューヨーク及びロンドン。 ｃ：米国特許第4,052,262 号 ｄ：米国特許第4,480,037 号
【００４４】実施例５−洗剤中の新規なアルカリプロテ
アーゼの使用 洗浄試験を衣類の試験片：血液、ミルク及び墨で汚した
EMPA-117もしくはEMPA-116またはココア、ミルク及び砂
糖で汚したEMPA-112（これらの衣類はスイスのSkt ガレ
ン(Gallen)にあるEidgenossiche Material Prufungs un
d Versuchanstalt fur Industrie,Bauwesen und Gewerb
e から得た）を用いて、洗浄水の初期pH10.7で市販の高
炭酸塩アニオン系洗剤を使用して、以下のようにして行
う。実施例３で得られたアルカリプロテアーゼを20 APU
/lの使用レベルで添加する。ターグ−オー−トメーター
(Terg-o-tometer)(US-テスティング社) を洗浄機として
使用する。４種の衣類を洗浄水1.0 リットルに添加し、
100rpmで38℃で10分間洗浄する。水10リットルを使用し
て５分間にわたってすすぎを行う。汚れの除去率を下記
の式を使用して計算する。 汚れの除去率＝(RW-RS)/(RO-RS) x 100 （式中、 RO= 汚されていない衣類の反射率 RS= 汚れた衣類の反射率 RW= 洗浄された衣類の反射率） 結果を表６に示す。
アーゼの使用 洗浄試験を衣類の試験片：血液、ミルク及び墨で汚した
EMPA-117もしくはEMPA-116またはココア、ミルク及び砂
糖で汚したEMPA-112（これらの衣類はスイスのSkt ガレ
ン(Gallen)にあるEidgenossiche Material Prufungs un
d Versuchanstalt fur Industrie,Bauwesen und Gewerb
e から得た）を用いて、洗浄水の初期pH10.7で市販の高
炭酸塩アニオン系洗剤を使用して、以下のようにして行
う。実施例３で得られたアルカリプロテアーゼを20 APU
/lの使用レベルで添加する。ターグ−オー−トメーター
(Terg-o-tometer)(US-テスティング社) を洗浄機として
使用する。４種の衣類を洗浄水1.0 リットルに添加し、
100rpmで38℃で10分間洗浄する。水10リットルを使用し
て５分間にわたってすすぎを行う。汚れの除去率を下記
の式を使用して計算する。 汚れの除去率＝(RW-RS)/(RO-RS) x 100 （式中、 RO= 汚されていない衣類の反射率 RS= 汚れた衣類の反射率 RW= 洗浄された衣類の反射率） 結果を表６に示す。
【００４５】
【表９】 表６ 試料 源 汚れ除去率（％） 汚れた衣類 EMPA116 EMPA117 EMPA112 洗剤単独 − 4 19 4 酵素Ａ B.リチェニフォルミス 22 56 17 新規な B.プロテオリチクス 28 60 22 プロテアーゼ 注：酵素Ａ＝表５（引用文献ｂ）に記載されたB.リチェ
ニフォルミスからのカールズベルグ・サブチリシン 表６は、試験条件下で、本発明の酵素がB.リチェニフォ
ルミスから誘導された市販の酵素よりも良好な洗浄作用
を有することを示す。
ニフォルミスからのカールズベルグ・サブチリシン 表６は、試験条件下で、本発明の酵素がB.リチェニフォ
ルミスから誘導された市販の酵素よりも良好な洗浄作用
を有することを示す。
【００４６】配列番号：１ (i) 配列の特徴 (A) 長さ：20のアミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (ii)分子の種類：タンパク質 (v) フラグメントの種類：Ｎ末端 (vi)起源： (A) 生物：バチルス (B) 株：バチルス・プロテオリチクス (C) 個々の分離株：株21-23 (xi)配列 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly 20
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (17)
- 【請求項１】 バチルス・プロテオリチクスのバクテリ
アから誘導されたアルカリプロテアーゼ。 - 【請求項２】 28キロダルトンの分子量及び10〜11.5の
等電点を有するバチルスから誘導されたアルカリプロテ
アーゼ。 - 【請求項３】 プロテアーゼが8.5 〜11.5の範囲のpHで
タンパク質分解活性に最適のpHを有することを特徴とす
る請求項１または２に記載のアルカリプロテアーゼ。 - 【請求項４】 アルカリプロテアーゼのアミノ末端から
最初の20のアミノ酸の配列（配列番号：１）が、 Ala-Gln-Ser-Val-Pro-Trp-Gly-Ile-Ser-Arg- Val-Gln-Ala-Pro-Ala-Ala-His-Asn-Arg-Gly- である請求項１または２に記載のアルカリプロテアー
ゼ。 - 【請求項５】 プロテアーゼがバチルス・プロテオリチ
クスから誘導されることを特徴とする請求項２に記載の
アルカリプロテアーゼ。 - 【請求項６】 プロテアーゼが11日の期間にわたって、
pH8.0 で43℃の温度に保たれた後にそれらの最初の活性
の少なくとも70％を保持することを特徴とする請求項
１、２、３または４に記載のアルカリプロテアーゼ。 - 【請求項７】 請求項２に記載のアルカリプロテアーゼ
を産生するバチルス・プロテオリチクス。 - 【請求項８】 バチルス・プロテオリチクスNRRL B-189
64、バチルス・プロテオリチクスNRRL B-18963及びバチ
ルス・プロテオリチクスNRRL B-18965からなる群から選
ばれたバチルス・プロテオリチクス。 - 【請求項９】 バチルス・プロテオリチクスまたはこの
バクテリアの誘導種を適当な栄養培地中で通気条件下で
培養し、次いでそれからアルカリプロテアーゼを回収す
ることを特徴とする請求項１または２に記載のアルカリ
プロテアーゼの生産法。 - 【請求項１０】 少なくとも請求項１または２に記載の
アルカリプロテアーゼを含むことを特徴とする洗剤組成
物。 - 【請求項１１】 有効量の請求項１または２に記載のア
ルカリプロテアーゼを含むことを特徴とする洗浄用組成
物。 - 【請求項１２】 洗剤活性組成物と有効量の請求項１ま
たは２に記載のアルカリプロテアーゼを含むことを特徴
とする洗剤組成物。 - 【請求項１３】 洗剤活性組成物と有効量の請求項１ま
たは２に記載のアルカリプロテアーゼを含む洗剤組成物
であって、前記の洗剤組成物が粒状であり、かつビルダ
ー、漂白剤または増白剤の少なくとも一種を含むことを
特徴とする洗剤組成物。 - 【請求項１４】 洗剤活性組成物と有効量の請求項１ま
たは２に記載のアルカリプロテアーゼを含む洗剤組成物
であって、前記の洗剤組成物が液体であり、かつ漂白剤
または増白剤の少なくとも一種を含むことを特徴とする
洗剤組成物。 - 【請求項１５】 請求項１または２に記載のアルカリプ
ロテアーゼを含むことを特徴とする液体洗剤組成物。 - 【請求項１６】 請求項１または２に記載のアルカリプ
ロテアーゼを含むことを特徴とする粒状洗剤組成物。 - 【請求項１７】 衣服からタンパク質の汚れを除去する
方法であって、前記の方法が前記の衣服を、洗剤活性組
成物と有効量の請求項１または２に記載のアルカリプロ
テアーゼを含む洗剤組成物で洗浄することを特徴とする
タンパク質の汚れの除去方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US88418492A | 1992-05-18 | 1992-05-18 | |
| US07/884184 | 1992-05-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0678768A true JPH0678768A (ja) | 1994-03-22 |
Family
ID=25384125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5116028A Pending JPH0678768A (ja) | 1992-05-18 | 1993-05-18 | アルカリプロテアーゼ、それらを産生するバクテリア、これらのアルカリプロテアーゼの生産法、これらのアルカリプロテアーゼの使用及びそれらを含む洗剤組成物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5518917A (ja) |
| EP (1) | EP0571014B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0678768A (ja) |
| DE (1) | DE69333463D1 (ja) |
| FI (1) | FI110612B (ja) |
| MX (1) | MX9302836A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4884080A (en) * | 1985-01-31 | 1989-11-28 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Color image printing apparatus |
| US4890121A (en) * | 1985-01-31 | 1989-12-26 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Halftone image printing device |
| WO1997016541A1 (en) * | 1995-11-02 | 1997-05-09 | Novo Nordisk A/S | Alkaline protease, process for the production thereof, use thereof, and microorganism producing the same |
| JP2018068120A (ja) * | 2016-10-24 | 2018-05-10 | 花王株式会社 | アルカリプロテアーゼの製造方法 |
| JP2022117758A (ja) * | 2021-02-01 | 2022-08-12 | 株式会社東芝 | 廃水処理装置および廃水処理方法 |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0571014B1 (en) * | 1992-05-18 | 2004-03-31 | Genencor International, Inc. | Bacteria producing alkaline proteases, and production of these alkaline proteases |
| DK91092D0 (ja) * | 1992-07-10 | 1992-07-10 | Novo Nordisk As | |
| DE4411223A1 (de) * | 1994-03-31 | 1995-10-05 | Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg | Verwendung alkalischer Proteasen in gewerblichen Textilwaschverfahren |
| US5976859A (en) * | 1996-11-15 | 1999-11-02 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Detergent-stable alkaline protease from bacillus pumilus |
| US20050191741A1 (en) * | 1998-09-25 | 2005-09-01 | Council Of Scientific And Industrial Research | Microbial composition and a process useful for the neutralization of alkaline waste- waters |
| US6846483B2 (en) | 1998-09-25 | 2005-01-25 | Council Of Scientific And Industrial Research | Microbial composition and a process useful for the neutralization of alkaline waste-waters |
| US6448060B1 (en) * | 2000-03-31 | 2002-09-10 | Council Of Scientific And Industrial Research | Alkalothermophilic bacillus that produces a protease inhibitor |
| US6995246B1 (en) * | 2000-10-19 | 2006-02-07 | Akzo Nobel N.V. | Methods for removing suspended particles from soluble protein solutions |
| ATE420161T1 (de) * | 2002-07-01 | 2009-01-15 | Novozymes As | Monopropylenglykol als fermentationszusatz |
| US7364901B2 (en) * | 2002-07-15 | 2008-04-29 | University Of Kentucky Research Foundation | Recombinant Stokesia epoxygenase gene |
| US20040106184A1 (en) * | 2002-08-28 | 2004-06-03 | Introgen Therapeutics Inc. | Chromatographic methods for adenovirus purification |
| DE10304066B4 (de) * | 2003-01-31 | 2007-01-18 | Henkel Kgaa | Verfahren zur Veredelung konzentrierter Enzymlösungen |
| DE10360841A1 (de) * | 2003-12-20 | 2005-07-14 | Henkel Kgaa | Helle, stabile, staub- und geruchsarme Enzymgranulate |
| CN109355222B (zh) * | 2018-11-06 | 2020-06-02 | 上海交通大学 | 对水稻白叶枯病菌具有拮抗作用的芽孢杆菌及分离与应用 |
| CN112899206B (zh) * | 2021-04-12 | 2022-07-26 | 西北农林科技大学 | 一株产几丁质酶、产吲哚乙酸的芽孢杆菌及其应用和方法 |
| CN117487724B (zh) | 2023-12-29 | 2024-03-22 | 东北林业大学 | 一株解蛋白芽孢杆菌cwj-2-gj及其应用 |
| KR102886908B1 (ko) * | 2024-11-22 | 2025-11-19 | 대한민국 | 신규 미생물 바실러스 프로티올리티커스 NIFoS Turf1 및 이를 포함하는 항진균 및 잔디 생육 개선용 조성물 |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1234445A (ja) * | 1967-10-03 | 1971-06-03 | ||
| GB1205403A (en) * | 1967-11-10 | 1970-09-16 | Novo Terapeutisk Labor As | Preparation of proteolytic enzyme preparations |
| US3622458A (en) * | 1968-10-02 | 1971-11-23 | Sanraku Ocean Co | Production of a new protease |
| US4052262A (en) * | 1969-05-31 | 1977-10-04 | Rikagaku Kenkyusho | Preparation of an alkaline protease |
| GB1395895A (en) * | 1971-05-28 | 1975-05-29 | Novo Terapeutisk Labor As | Enzyme products |
| GB1519148A (en) * | 1974-11-19 | 1978-07-26 | Gist Brocades Nv | Compositions of matter |
| US4323651A (en) * | 1974-12-04 | 1982-04-06 | R. J. Reynolds Tobacco Company | Thermostable lactase derived from bacillus |
| JPS54129186A (en) * | 1978-03-30 | 1979-10-06 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | Preparation of collagenase |
| JPS6055118B2 (ja) * | 1982-02-08 | 1985-12-03 | 昭和電工株式会社 | 新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法 |
| US5185258A (en) * | 1984-05-29 | 1993-02-09 | Genencor International, Inc. | Subtilisin mutants |
| US4797362A (en) * | 1985-06-06 | 1989-01-10 | Lion Corporation | Alkaline proteases and microorganisms producing same |
| WO1988006624A2 (en) * | 1987-02-27 | 1988-09-07 | Gist-Brocades N.V. | Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes |
| DK6488D0 (da) * | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
| CN1056187C (zh) * | 1988-02-11 | 2000-09-06 | 金克克国际有限公司 | 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用 |
| BR9006832A (pt) * | 1989-06-26 | 1991-08-06 | Unilever Nv | Composicao detergente enzimatica |
| BR9006827A (pt) * | 1989-06-26 | 1991-08-06 | Unilever Nv | Composicoes detergentes enzimaticas |
| DE3921918A1 (de) * | 1989-07-04 | 1991-01-17 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von 2,4,6-trifluor-1,3,5-triazin |
| DK0493398T3 (da) * | 1989-08-25 | 2000-05-22 | Henkel Research Corp | Alkalisk, proteolytisk enzym og fremgangsmåde til fremstilling deraf |
| DE4023458A1 (de) * | 1989-08-31 | 1991-03-07 | Kali Chemie Ag | Neue hochalkalische proteasen |
| ES2136604T3 (es) * | 1991-01-22 | 1999-12-01 | Kao Corp | Composicion detergente. |
| CA2066556A1 (en) * | 1991-04-26 | 1992-10-27 | Toyoji Sawayanagi | Alkaline protease, method for producing the same, use thereof and microorganism producing the same |
| EP0571014B1 (en) * | 1992-05-18 | 2004-03-31 | Genencor International, Inc. | Bacteria producing alkaline proteases, and production of these alkaline proteases |
-
1993
- 1993-05-06 EP EP93201288A patent/EP0571014B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-06 DE DE69333463T patent/DE69333463D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-05-14 MX MX9302836A patent/MX9302836A/es not_active IP Right Cessation
- 1993-05-18 JP JP5116028A patent/JPH0678768A/ja active Pending
- 1993-05-18 FI FI932255A patent/FI110612B/fi not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-01-12 US US08/180,336 patent/US5518917A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-13 US US08/181,872 patent/US5385837A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-02-17 US US08/390,570 patent/US5565348A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4884080A (en) * | 1985-01-31 | 1989-11-28 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Color image printing apparatus |
| US4890121A (en) * | 1985-01-31 | 1989-12-26 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Halftone image printing device |
| WO1997016541A1 (en) * | 1995-11-02 | 1997-05-09 | Novo Nordisk A/S | Alkaline protease, process for the production thereof, use thereof, and microorganism producing the same |
| US5981255A (en) * | 1995-11-02 | 1999-11-09 | Novo Nordisk A/S | Alkaline protease, process for the production thereof, use thereof, and microorganism producing the same |
| JP2018068120A (ja) * | 2016-10-24 | 2018-05-10 | 花王株式会社 | アルカリプロテアーゼの製造方法 |
| JP2022117758A (ja) * | 2021-02-01 | 2022-08-12 | 株式会社東芝 | 廃水処理装置および廃水処理方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5565348A (en) | 1996-10-15 |
| US5385837A (en) | 1995-01-31 |
| MX9302836A (es) | 1995-01-31 |
| FI932255A0 (fi) | 1993-05-18 |
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