DK147794B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af gastrin-analoge heptapeptidamidderivater - Google Patents

Description

o i 14779Λ

Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte gastrin-analoge heptapeptidamid-derivater med den almene formel I

5 HOOC-(CH2)3-C0—Ala-Tyr-Gly-Trp—X—Asp-Phe—NH2, I

i hvilken X står for leucin eller methionin, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at peptider med den almene formel II 10

H-Ala-Tyr(Bu1)-Gly-Trp-X-Asp(OBu1)-Phe-NH2, II

i hvilken Bu1 er en tert.-butyIrest, og X har den ovenfor angivne betydning, omsættes med glutarsyreanhydrid, og at 15 beskyttelsesgrupperne i reaktionsprodukterne med den almene formel III

HOOC-(CH2)3-C0-Ala-Tyr(Bu1)-Gly-Trp-X-Asp(OBu1)-Phe-NH2 III

fjernes ved behandling med trifluoreddikesyre.

20 Der er blevet beskrevet talrige syntetiske pepti

der fra det C-terminale område af gastrin, der på lignende måde som det naturlige hormon gastrin bevirker stimulation af maven med hensyn til syreproduktion og volumenudskillelse. Blandt disse syntetiske peptider udmærker sig 25 pentapeptidet med formlen IV

Boc-&-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2, IV

i hvilken Boc er en tert.-butyloxycarbonylrest (The lan-30 eet 1966, s. 993). Pentapeptidet udviser den stærkeste stimulerende virkning i sammenligning med andre syntetiske peptider.

Dette pentapeptid IV er også allerede sammenlignet med et heptapeptid med formlen V, der kun adskiller sig 35 fra den ifølge kravet fremstillede forbindelse med formlen I og med X = Leu ved, at glutaroylresten mangler.

O

14779Λ 2

H-Ala-Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe-N^ V

Det udviser en noget lavere biologisk virkning end pepti-det IV.

5 Derimod har det ifølge kravet fremstillede peptid med formlen I, i hvilken X står for methionin, en 1,3 gange så stor biologisk virkning som peptidet med formlen IV, det ifølge kravet fremstillede peptid med formlen I, i hvilken X = leucin, endda en 2,3 gange så stor virkning 10 som peptidet med formlen IV, beregnet på molærbasis.

Den biologiske virkning er bestemt på perfunderede rottemaver ifølge Brit. J. Pharmacol. 38 (1970), s.

206-213.

Til fremstilling af forbindelserne med den almene 15 formel I omsættes peptiderne med formlen II med glutarsyre-anhydrid i dimethylformamid, idet reaktionstider fra ca.

4 til ca. 20 timer ved 0-5°C er tilstrækkelige, opløsningsmidlet afdestilleres i vakuum, og remanensen udrives med ether. Beskyttelsesgrupperne spaltes fra med 90%'s tri-20 fluoreddikesyre ved stuetemperatur (reaktionstid ca. 1 time). Til rensning af peptiderne med den almene formel I er det tilstrækkeligt med for eksempel en omfældning fra alkohol/ether.

De ifølge kravet fremstillede hidtil ukendte pep-25 tider er lægemidler. De er fri for ikke-fysiologiske komponenter, tjener til stimulering af mavesaftproduktionen og kan anvendes som terapeutika ved formindsket sekretion af fordøjelsessafter i mavesæk, galdeblære og bugspytkirtel.

Den parenterale indgiveisesform er en 0,001 til 30 0,1%'s vandig opløsning, eventuelt med tilsætning af fysiologiske mængder natriumchlorid eller i en vandig pufferopløsning. Som puffere kan for eksempel anvendes: 1/15 Molære phosphat-puffere (primært kaliumphosphat og sekundært natriumphosphat ifølge Sørensen og Clark) og pH-35 -værdier på 5,0 til 7,5. Disse opløsninger tjener til subkutan og intramuskulær anvendelse.

O

3 U7794

Til nasal anvendelse anvendes ca. 0,1 %'s vandige opløsninger, 0,1 til 3 %'s olieholdige suspensioner eller et 0,1 til 3 %'s, tørt pulverpræparat med for eksempel lactose eller mannitol som bærer.

5

Bestemmelse af gastrin-virkning;

Bestemmelsen af den biologiske aktivitet gennemføres på rottemaver, der perfunderes in situ. Som forsøgsdyr anvendes Wistar-hanrotter med en vægt på mellem 210 og 270 10 g. Rotterne har fastet i 24 timer, men har dog fået drikkevand ad libitum, og de anæstetiseres derpå intramuskulært med urethan (1,5 g/kg). Arbejdsmåden og forsøgsproceduren svarer til metodologien beskrevet af Smith et al., J. Phar-macol. 38, 206-213 (1970).

15 Til bestemmelse af aktiviteten anvendes 4-punkts-prø- ven ifølge Schild, J. Physiol. 101, 115-130 (1942), hvorved hvert af dyrene modtager intravenøse injektioner af 2 doser af standardforbindelsen IV og af 2 doser af peptiderne og gastrin. De 4 injektioner, dvs. standardpræparatet og præ-20 paratet, der skal afprøves, indgives til 4 rotter hver, i en rækkefølge, der svarer til et romersk kvadratforsøg ("Latin square design"). Passende doser af peptiderne bestemmes ved 4 forudgående forsøg. Afhængigt af de respektive aktiviteter er disse mellem 0,2 og 4,0^ig/kg.

25 Ved forsøget anvendes følgende peptider: 1) Boc-£-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 (formel IV) 2) H-Ala-Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe-NH2 (formel V) 3) HOOC-(CH2)2“CO-Ala-Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe-NH2 (formel I, X = Leu) 30 På vægtbasis med anvendelse af pentagastrin med formlen IV som standard (= 1) fås der følgende relative aktiviteter: 1) 1,0 2) 0,6 35 3 ) 2,3 o 4 147794

Fremstillingseksempler

Til renhedsprøvning af de i det følgende fremstillede forbindelser anvendes tyndtlagschromatografi med følgende løbemiddelsysterner: 5 1) tert.-butanol/pyridin/petroleumsether, 1:1:8 2) methanol/vand 80:20 3) methylethylketon/pyridin/vand/iseddikesyre 70:15:15:2 4) butanol/eddikesyre/vand 2:1:1

Der anvendes de i peptidkemien sædvanlige forkor-10 teiser; dicyclohexylcarbodiimid = DCC; dimethylformamid = DMF. Z = Benzyloxycarbonyl.

Eksempel 1

Glutaroyl-Ala-Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe-NH^, 15 a) Z-Tyr (Bu*~) -Gly-OCH., 74 g (0,2 mol) Z-Tyr (OBu*")-OH og 54 g (0,4 mol) 1-hydroxybenzotriazol opløses i 300 ml tetrahydrofuran, der afkøles til 5°C, og en opløsning af 42 g (0,2 mol) DCC i 50 ml tetrahydrofuran sættes til. Derpå efteromrøres 20 il time ved 0°C og 1 time ved stuetemperatur. Så skilles det udskilte dicyclohexylurinstof fra ved sugning. Til den tilbageblivende opløsning sættes ved 0°C en opløsning af 25 g (0,2 mol) glycin-methylester-hydrochlorid og 27 ml (0,2 mol) N-ethylmorpholin i 150 ml tetrahydrofuran. Derpå 25 efteromrøres i endnu 2 timer ved stuetemperatur, så afdestilleres opløsningsmidlet i vakuum ved stuetemperatur, remanensen optages i ethylacetat og ethylacetatopløsningen rystes med 0,2 N svovlsyre, mættet natriumhydrogencarbonat-opløsning og vand. Efter tørring af ethylacetatopløsningen 30 over magnesiumsulfat fås slutproduktet ved afdampning af opløsningsmidlet i vakuum som en svagt gullig olie. Produktet kan ikke adskilles ved tyndtlagschromatografi i systemerne 1, 2, 3 og 4.

Udbytte: 54 g (73% af teoretisk).

35 14779Λ

O

5

b) Η-Tyr-(But)-Gly-OCH-, HCl + J

60 g Z-Tyr(Bu )-Gly-OMe i 1 liter methanol hydrogeneres katalytisk ved en pH-værdi på 3 ved hjælp af 10 g 10%'s Pd/BaSO^ under tilsætning af 1 N methanolisk HCl. Efter fra-5 skillelse af katalysatoren afdestilleres opløsningsmidlet.

Den tilbageblivende harpiks bliver fast ved udrivning med ether. Udbytte 45 g, smp. fra 97°C under opskumning.

[a]p® = + 27,0° (c = 1 i methanol).

10 c) Z-Ala-Tyr (But) -Gly-OCH-,

Til en opløsning af 29 g (0,13 mol) Z-Ala-OH og 35 g 1-hydroxybenzotriazol i 240 ml DMF sættes ved 5°C 29 g DCC. Der omrøres 1 time ved 0°C og 1 time ved stuetemperatur, det udfældede dicyclohexylurinstof filtreres fra, og 15 der tilsættes en opløsning af 44,8 g (0,13 mol) H-Tyr(Bu^)--Gly-OCH^, HCl og 16,5 ml N-ethylmorpholin i 300 ml DMF.

Efter en reaktionstid på 3 timer ved stuetemperatur afde-stilleres opløsningsmidlet i vakuum, remanensen optages i ethylacetat, og ethylacetatopløsningen mættes med 1 N HCl.

20 Der vaskes med natriumhydrogencarbonat og vand, tørres over natriumsulfat og inddampes i vakuum. Det halvfaste produkt bliver fast ved digerering med ether.

Udbytte: 46,5 g (70%). Smp. 107°C.

[ct]^° = - 34,9° (c = 1 i methanol) 25 C27H35N3°7 (513) kere9net C = 63,1%, H = 6,8%, N = 8,2%.

fundet C = 63,4%, H = 6,9%, N = 8,1%.

Kan ikke adskilles ved tyndtlagschromatografi i systemerne 1 og 2.

30 d) Z-Ala-Tyr(But)-Gly-OH

44,6 g methylester fra c) i 150 ml dioxan og 89 ml 1 N natriumhydroxydopløsning omrøres i 1 time ved stuetemperatur. Der neutraliseres med 1 N HCl, inddampes i vakuum til 1/3 af det oprindelige volumen og pH-værdien indstilles

QC

til 3 med 1 N HCl. Den udfældede olie optages i 700 ml ether.

Til den over MgSO^ tørrede opløsning sættes 250 ml petrole- o 6 147794 umsether. Bundfaldet udskrystalliserer ved 0°C i løbet af nogle dage.

Udbytte: 37,4 g (88%) smp. 89°C.

[a]p° = -42,7° (c = 1 i methanol) 5 Kan ikke adskilles ved tyndtlagschromatografi i systemerne 1 og 2.

e) Z-Trp-Leu-OH

83 g Z-Trp-Leu-OMe, fremstillet ifølge J. Org. Chem 10 (1966), s. 3400, omrøres i en blanding af 500 ml dioxan og 100 ml 2 N NaOH i 100 minutter. pH-værdien indstilles til 6 med 1 N HCl, der inddampes, tilsættes noget vand, og pH-værdien indstilles til 3 med 1 N HCl. Det udfældede produkt omkrystalliseres fra methanol/vand.

15 Udbytte: 72,5 g, smp. 70°C.

[a]p® = -27,5° (c = 1 i methanol).

f) Z-Trp-Leu-Asp(OBu^-Phe-NH2

Til en opløsning af 23,8 g (52 mmol) Z-Trp-Leu-OH, 20 19,5 g (52 mmol) Η-Asp (OBu^) -Phe-iH^HCl, fremstillet ifølge J. Chem. Soc. (C) 1966, s. 555, 12 g N-hydroxysuccinimid og 6,65 ml N-ethylmorpholin i 400 ml tetrahydrofuran sættes ved -5°C under omrøring en opløsning af 10,8 g DCC i 18 ml tetrahydrofuran. Under omrøring afkøles frivilligt til stuetem-25 peratur. Efter henstand natten over frafiltreres det udfældede dicyclohexylurinstof, og opløsningen inddampes til tørhed i vakuum. Den tilbageblivende olie mættes med 5%'s citronsyre. Den digereres med natriumhydrogencarbonat og vand, tørres i vakuum over ?2°5 udkoges med lidt ethanol.

30 Udbytte: 31,5 g, smp. 212°C, [a]p° = -36,7° (c = 1 i DMF)

Kan ikke adskilles ved tyndtlagschromatografi i systemerne 1, 2, 3 og 4.

35

O

7 147794 g) H-Trp-Leu-Asp(OBu^)-Phe-NHp,HC1 7,68 g Z-Tetrapeptid fra f) hydrogeneres katalytisk i 350 ml methanol analogt med eksempel lb). Efter sædvanlig oparbejdning fås 6,5 g af et amorft produkt.

5 [a]p0 = "22°C (c = 1 i methanol).

Kan ikke adskilles ved tyndtlagschromatografi i systemerne 1, 2, 3 og 4.

h) Z-Ala-Tyr- (But) -Gly-Trp-Leu-Asp (OBuh -Phe-NH2 10 0,5 g (1 mmol) Z-Ala-Tyr(Bu^j-Gly-OH, 0,64 g (1 mmol)

H-Trp-Leu-Asp(OBut)-Phe-NH2fHCl, fremstillet ifølge eksempel g), 0,27 g (2 mmol) 1-hydroxybenzotriazol og 0,13 ml N--ethylmorpholin opløses i 10 ml DMF, dertil sættes ved 0°C

0. 24 g DCC, og der omrøres i 15 timer ved stuetemperatur.

15 Det udfældede dicyclohexylurinstof filtreres fra, og opløsningen inddampes i vakuum. Remanensen optages i ethylacetat og ekstraheres ved under 5°C med 10%'s citronsyre, hvorefter der vaskes med mættet natriumhydrogencarbonat og vand. Efter tørring af ethylacetatopløsningen over MgS04 inddampes. Der-20 ved udfælder 450 mg af Z-heptapeptidet. Yderligere 193 mg lader sig udvinde af moderluden ved fældning med ether. Smp.

192°C.

[a]p° = -27,8°C (c = 1 i DMF)

Aminosyreanalyse: Asp 1,0, Gly 0,99, Ala 1,02 25 Leu 0,98, Tyr 0,90, Phe 0,99

Tyr/Trp = 1,03

Kan ikke adskilles ved tyndtlagschromatografi i systemerne 1, 3 og 4. 1 35 i) H-Ala-Tyr (Bu11) -Gly-Trp-Leu-Asp (OBut) -Phe-NH,, ,HC1 4 g Z-heptapeptid fra h) hydrogeneres katalytisk i 1,3 liter methanol analogt med eksempel lb). Efter afdestil- lering af opløsningsmidlet digereres remanensen med ether, og der opnås 2,8 g med et smp. på 199-200°C (dekomponering).

147794 ο δ

k) Glutaroyl-Ala-Tyr(Bu^)-Gly-Trp-Leu-Asp(OBu^)--Phe-NEU

Til en opløsning af 8,8 g (12 mmol) af H-heptapep-tid-hydrochloridet fra i) i 50 ml DMF sættes ved 0°C i lø-5 bet af 40 minutter portionsvis under omrøring 2,3 g (20 mmol) glutarsyreanhydrid og 2,56 ml N-ethylmorpholin. Der omrøres i 5 timer ved 0°C med påfølgende henstand i 16 timer ved 4°C, opløsningsmidlet afdestilleres i vakuum, og remanensen digereres med ether.

10 Udbytte: 8,8 g, smp. 230-232°C (dekomponering).

[a]p° = -31° (c = 1 i DMF) l) Glutaroyl-Ala-Tyr-Gly-Trp-Leu-Asp-Phe-NHp 1,27 g af det beskyttede glutaroyl-heptapeptid fra 15 k) omrøres i 90 minutter ved stuetemperatur i 5 ml 90%'s trifluoreddikesyre. Derefter afdestilleres trifluoreddike-syren i vakuum, remanensen digereres med ether og omfældes i ethanol/ether.

Udbytte: 620 mg. Smp. 213°C (dekomponering).

20 [a]^° = -33,8° (c = 1 i DMF)

Aminosyreanalyse: Asp 1,09, Gly 1,00, Ala 1,07,

Leu 1,08, Tyr 0,69, Phe 1,02

Tyr/Trp = 1,02

Kan ikke adskilles ved tyndtlagschromatografi i systemerne 25 2, 3 og 4.

Eksempel 2

Glutaroyl-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH^ a) Z-Ala-Tyr (Bu^) -Gly-Trp-Met-Asp (OBu^) -Phe-NH^, 30 17,7 g Z-Ala-Tyr(Bu^)-Gly-OH, fremstillet ifølge eksempel ld), 23 g H-Trp-Met-Asp (OBu^) -Phe-N^, fremstillet ifølge J. Chem. Soc. (C), 1967, s. 2410, og 9,6 g 1--hydroxybenzotriazol opløses i 120 ml DMF. Ved 0°C tilsættes 8 g DCC, og der omrøres natten over ved stuetempe- «c ratur. Efter frafiltrering af dicyclohexylurinstoffet inddampes opløsningen i vakuum, remanensen udrives med vand.

o 9 147794 0,2 N HC1, mættet natriumhydrogencarbonat og vand og tørres i højvakuum over

Udbytte: 37,3 g, snip. 228°C.

[a]p° = -27,9° (c = 1 i DMF) 5 C59H75Ng012S (1133) Beregnet: C = 62,51, H = 6,62%, N = 11,1%, S = 2,82%

Fundet: C = 62,6%, H = 6,7%, N = 11,1%, S = 2,9%.

10 b) H-Ala-Tyr (Bu*1) -Gly-Trp-Met-Asp (OBut) -Phe-NH^ 37 g af Z-heptapeptidet fra a) hydrogeneres katalytisk i 400 ml DMF under tilsætning af 15 ml cyclohexylamin og rigeligt Pd. Efter at fraspaltningen af Z-gruppen er sket, filtreres katalysatoren fra, opløsningen inddampes 15 til tørhed i vakuum, og remanensen udrives med ether. For at rense produktet yderligere fældes fra DMF/ether/petrole-umsether.

Udbytte: 24,3 g, smp. 209°C (dekomponering), [d]p° = -22,5° (C = 1 i DMF) 20 c) Glutaroyl-Ala-Tyr(Bu*')-Gly-Trp-Met-Asp(OBu^)--Phe-NHp

Til en opløsning af 12 g af H-heptapeptidet fra b) i 60 ml DMF sættes portionsvis under omrøring ved 0°C i lø-25 bet af 40 minutter 3 g glutarsyreanhydrid og 4,3 ml N- -ethylmorpholin. Der omrøres endnu 5 timer ved 0°C med påfølgende henstand i 16 timer ved 4°C. Så afdestilleres opløsningsmidlet i vakuum, og remanensen digereres med ether.

Udbytte: 10,3 g, smp. 231°C (dekomponering).

30 [a]p° = -31° (c = 1 i DMF).

d) Glutaroyl-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NHp 10,1 g af det beskyttede glutaroylheptapeptid fra c) opløses i 50 ml 90%'s trifluoreddikesyre. Efter 75 minut-35 ters henstand ved stuetemperatur afdestilleres trifluored-dikesyren i vakuum, remanensen digereres med 10 ml ethanol,