DK148748B - Fremgangsmaade til fremstilling af antibiotiske polypeptidforbindelser, eller syreadditionssalte deraf, og mikroorganisme til anvendelse ved udoevelse af fremgangsmaaden - Google Patents

Description

i 148748

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af antibiotistepolypeptidforbindelse? eller syreadditionssalte deraf, med baktericide og bakte-riolytiske aktiviteter over for grampositive bakterier.

5 Endvidere angår opfindelsen en hidtil ukendt mikroorganisme til anvendelse ved udøvelse af nævnte fremgangsmåde.

Staphylococci vides at producere mindst tre klasser af forbindelser med en hæmmende virkning på væksten af 10 bakterier, nemlig bakteriociner, bakteriolytiske enzymer og lavmolekylære antibiotica. Publikationer, der beskriver produktionen af lavmolekylære antibiotica ud fra staphylococci, er følgende: HSU, C-Y. og WISEMAN, G.M., Can. J. Microbiol, 17 (1971), 15 side 1223-1226.

LOEB, L.J., MOYER A. og MURRAY, R.G.E., Can. J. Res., 28E (1950), side 212-216.

PULVERER, G. og JELJASZEWICZ, J., Proceedings of III. International Symposium on staphylococci and staphylo-20 coccal infections, side 599-621. Udgivet af J. Jelja-szewicz. Stuttgart: Fischer-Verlag.

SELWIN, S., MARSH, P.D. og SETHNA, T.N., Chemotherapy. "Proceedings of the 9th International Congress of Chemotherapy", j> (1975), side 391-396. Udgivet af J.D. Willi-25 ams og A.M. Geddes. New York.

SU, T.L., Br. J. Exp. Pathol., 29 (1948), side 473-481.

HALBERT, S.P., SWICK, L.og SONN, C., J. Immunol., 70 (1953) side 400-410.

Ingen af de i ovennævnte publikationer beskrevne 30 lavmolekylære antibiotica har imidlertid vist sig at udvise en bactericid virkning resulterende i lysis af bakteriecellerne .

I J.Med.Microbiol., 12 (1979), side 71-82, er der beskrevet forsøg, hvori adskillige stammer af for menne-35 skehuden naturlige bakterier omfattende 93 isolater af Propionobacterium aenes og 148 isolater af Micrococcaceae blev undersøgt for deres evne til at hæmme vadesten af 148748 2 forskellige indikatorstammer af P.aenes og Staphylococcus epidermidis. 53 Stammer blandt de undersøgte viste nogen aktivitet over for mindst én indikatorstamme, og der fandtes både bred- og smal-spektret hæmning. De stammer, 5 der undersøgtes, kom fra 36 aene-patienter og 8 kontrolpersoner, og hovedformålet med undersøgelserne var at finde ud af, om forekomsten af hæmmende stammer og omvendt forekomsten af sensibile stammer hos patienter re-. suiterer i en prædisposition for aene. De særlige stammer 10 af P.aenes og Micrococcaceae, der blev undersøgt, er ikke identificeret undtagen gennem en intern reference. Endvidere findes ingen beskrivelse af noget forsøg på at udvinde de aktive forbindelser, der var ansvarlige for den observerede hæmning.

15 Den foreliggende opfindelse er baseret på den erken delse, at en særlig stamme af Staphylococcus epidermidis, dvs. Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 (der i henhold til Budapesttraktaten er deponeret i the National Collection of Industrial Bacteria, Torrey Research Station, 20 P.O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, 3.oktober 1979) kan dyrkes til produktion af hidtil ukendte lavmolekylære antibiotiske polypeptider, der udviser bredspektret aktivitet over for grampositive bakterier, og som afviger fra de af staphylococci hidtil producerede lav-25 molekylære antibiotica ved, at de har en baktericid virkning resulterende i lysis af bakteriecellerne.

Opfindelsen angår således som nævnt en fremgangsmåde til fremstilling af antibiotiske polypeptidforbin-delser, eller syreadditionssalte deraf, med baktericide 30 og bakteriolytiske aktiviteter over for grampositive bakterier, med en mokelylvægt på fra 950 til 10.000 og indeholdende i peptidkæden én prolinrest, to glycinrester og mindst én rest af hver af aminosyrerne isoleuein, phenyl-alanin, alanin, asparaginsyre, glutaminsyre og lysin, 35 hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 eller en mutant deraf med væsentligt samme egenskaber dyrkes aerobt i eller på et dyrkningsmedium for nævnte organisme, hvorefter nævnte antibiotiske polypeptidforbindelser udvindes.

3 1487/,8 Særligt egnet blandt de omhandlede antibiotiske polypeptidforbindelser er et antibioticum med en molekylvægt på ca. 950 og indeholdende i molekylstrukturen deraf én prolinrest, to glycinrester og én rest af hver af 5 de ovennævnte yderligere aminosyrer«

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan gennemføres ved anvendelse af et flydende eller fast dyrkningsmedium, der indeholder carbon- og nitrogen-kilder sammen med passende uorganiske salte og andre næringsmidler. Egnede XO dyrkningsmedier udgøres for eksempel af følgende: (i) Hjerne-Hjerte-Infusionsagar (BHIA):

Dette er et kommercielt medium markedsført af Difco Laboratories, Central Avenue, West Molesey, Surrey, England, og indeholder infusioner fra kalvehjerner og okse-X5 hjerter, proteosepepton (Difco), bacto-dextrose, natrium-chlorid og dinatriumphosphat.

(ii) Trypticase-Soja-Suppe:

Dette er et kommercielt medium markedsført af Bect-on Dickinson & Co. Limited, Empire Way, Wembley, Middle-20 sex, England, og indeholdende pancreatinfordøjet kasein, papainfordøjet sojabønnemel, natriumchlorid og dinatrium-phosphat.

(iii) Tryptone L42/Gærekstrakt L21-Medium:

Dette er et medium fremstillet, så det indeholder 25 2 vægt% Tryptone L 42 og 1 vægt% Gærekstrakt L 21, begge bestanddele markedsført af Oxoid Limited, Southwark Bridge Road, London SE1 9HF, England.

(iv) Syntetisk Medium:

Dette er et medium som beskrevet af Griffith, C.J.

30 og Melville, T.H., Arch.Oral.Biol., 19 (1974), side 87-90, med følgende sammensætning: 4 148748

Koncen- Koncen-

Komponent tration Komponent tration 5 mg pr.liter mg pr.liter K2HP04 1.750 Biotin 0,006 KH2P04 1.750 Nicotinsyre 2,3

Trinatriumcitrat 500 Thiamin 1,0 PIPES 5.000 Pyridoxin HCl 12,0 10 i (Piperazin-N-N -bis- Calciumpanto- (2-ethansulfonsyre)) thenat 1,2

Glucose 0,2% (vægt/ volumen) 15 L-alanin 100 Opløsning af salte; L-arginin 200 MgS04,7H20 200 ) L-asparagin 100 Fe-citrat 10 ] L-asparaginsyre 200 MnS04,4H20 10 ) L-cystein 100 NaCl 10 |Pr· * 1 *5 -4- pi· 20 L-glutaminsyre 500 CaCl2 10 )

Glycin 100 ZnCl2 5 j L-histidin 100 CuSO. 0,5) 4 ) L-hydroxyprolin 100 CoNO^ 5 L-isoleucin 100 25 L-leucin - 100 Agar 1,0% «0 %£L> L-methionin 100 L-phenylalanin 100 L-prolin 100 30 L-serin 200 L-threonin 200 L-tryptophan 100 L-tyrosin 100 L-valin 100 35 Adenin 10

Guanin 10

Uracil 10 148748 5

Dyrkningstrinnet gennemføres aerobt, hensigtsmæssigt ved en temperatur på 35° til 40°C, fortrinsvis ved ca. 37°C, i ca. 12 til 48 timer, fortrinsvis 24 til 36 timer. Dyrkningsmediets indledende pH-værdi ligger hen-5 sigtsmæssigt inden for området fra 4,5 til 7, idet pH-værdier fra 5 til 6,5 foretrækkes.

Efter endt dyrkningstrin udvindes de hidtil ukendte antibiotiske stoffer fra dyrkningsmediet. Fremgangsmåder, der har vist sig anvendelige til gennemførelse af udvin-10 dingstrinnet, er følgende: 1. Fryse-tø-ekstraktion:

Dette er en velkendt teknik, beskrevet for eksempel af McGeachie J., Zentralbl. Bakteriol. (Orig A) , 196 (1965), side 377-384. Den ekstraherede væske kan derefter 15 centrifugeres for at fjerne bakterierne. Den således vund-ne rå fryse-tø-ekstrakt kan, om ønsket til anvendelse ved prøvning af de antibiotiske stoffer,steriliseres ved filtrering gennem et celluluseacetat-membranfilter (porediameter 0,45 μπι, Oxoid Ltd.) og lagres ved 4°C indtil brug.

20 Ikke-steril ekstrakt kan lagres ved -20°C.

2. Inddampning: pH-Værdien af rå fryse-tø-ekstrakter gøres sur, fortrinsvis til ca. pH 5 og hensigtsmæssigt ved tilsætning af 10N HC1, forud for inddampning, fordi den hæmmen-25 de aktivitet af de hidtil ukendte antibiotiske stoffer kun er varmestabil under sure betingelser. Inddampning kan hensigtsmæssigt ske ved 90°C på en rotationsfordamper (Rotavapor-EL, Buehi, Schweiz) ved reduceret tryk.

3. Ultrafiltrering: Koncentrering eller dialyse kan opnås 30 ved positiv trykfiltrering under anvendelse af en passende filtreringsmembran, f.eks. i en Amicon-model 52 (kapacitet 65 ml), markedsført af Amicon Limited, High Wycombe^ Buckinghamshire, England. Fem dobbeltvolumen-udskiftnin-ger af destilleret vand anvendes hensigtsmæssigt til dia- 35 lyse.

4. Åmmoniumsulfatfæld'ning:

Ammoniumsulfat sættes til fryse-tø-ekstrakten til opnåelse af 25-30% mætning. Efter omrøring kan det derved 148748 6 udfældede protein fjernes, f.eks. ved centrifugering. Det overliggende materiale bringes derefter til 50-60% mætning ved tilsætning af yderligere (NH^jSO^ igen efterfulgt af omrøring og centrifugering. Bundfaldet, der in-5 deholder de antibiotiske stoffer^can derefter gensuspenderes i et minimalt volumen puffer, f.eks. 0,05M phosphat-puffer, pH 6,0. Ved gennemførelse af dette rensningstrin bliver (NH^^SO^ fortrinsvis først tilsat til opnåelse af ca. 30% mætning og derefter tilsat til opnåelse af ca.

10 50% mætning.

5. Ionbytter-chromatografi;

En prøve, der er delvis renset ved inddampning eller ammoniumsulfat-fældning, overføres til en Sephadex £25 — kat ionbytter søjle. Ikke-bundne stoffer elueres med 15 startpuffer, f.eks. 0,05M phosphatpuffer, pH 6,0. Bundne stoffer kan derefter elueres ved en strømningshastighed på 15 ml pr.time under anvendelse af lineært stigende ionstyrkegradient af 0-0,5M (400 ml) NaCl i 0,5M phosphatpuffer, pH 6,0, og der opsamles fraktioner på 5,5 ml.

20 6· Gelf iltrerings-chromatografi:

En prøve, der er delvis renset ved inddampning, am-moniumsulfatfældning og/eller ionbytter-chromatografi, overføres til en Sephadex G50-søjle og elueres, f.eks. med 0,05M phosphatpuffer, pH 6,0. Om ønsket kan Sephadex 25 G25 -, Sephadex G15- eller Biogel P2-søjler anvendes i stedet for Sephadex G50-søjlen.

Ved ionbytter- og gelfiltrerings-trinnene ovenfor har det vist sig, at de eluerede omhandlede antibiotiske polypeptider ofte har et betydeligt NaCl-indhold.

30 Dette skyldes den stærkt kationiske natur af og den aromatiske rest i polypeptideme,der bringer dem til at binde stærkt til gelfiltreringsmedier (hvadenten der er tale om polyacrylamid- eller dextran-geler), således at der til deres frigørelse kræves anvendelse af puffere med høj 35 ionstyrke.

I praksis er der derfor udviklet tre alternative kombinationer af ionbytter- og gelfiltrerings-chromato-grafitrin til anvendelse på prøver, der er partielt ren- 148748 7 set ved inddampning eller ammoniumsulfatfældning; (a) opnåelse af en høj titer indeholdende NaCl ved elue-ring gennem en Biogel P2- eller Sephadex G15-sØjle efterfulgt af eluering gennem en Sephadex C25-søjle.

5 (b) opnåelse af en lavere titer med lavt NaCl-indhold ved eluering gennem en Sephadex c25-søjle efterfulgt af eluering gennem en Sephadex GlO-søjle, og (c) kombineret fjernelse af højmolekylært materiale og fjernelse af NaCl ved eluering gennem en Sephadex G-10 15-søjle efterfulgt af eluering gennem en Sephadex C- 25-søjle efterfulgt af eluering gennem en Sephadex G- 10-søjle.

Det vil forstås, at de ovenfor beskrevne rensningstrin er eksempelvise, og at disse trin kan modificeres 15 eller erstattes med andre rensningstrin som ønsket. For eksempel er det muligt at erstatte ammoniumsulfatfældningstrinnet med et lignende trin, der gør brug af andre fældningsmidler, såsom ethanol eller acetone.

Udvindingstrinnet indebærer fortrinsvis fryse-tø-20 ekstraktion, ammoniumsulfatfældning, ionbytter-chromato-grafi og gelfiltrerings-chromatografi.

Som et alternativ til fryse-tø-ekstraktion indebærer endnu et foretrukket udvindingstrin centrifugering af det inkuberede medium ved ca. 3000 g i ca. 30 minutter 25 for at fjerne cellemateriale, hvorefter den overliggende væske underkastes ammoniumsulfatfældningen og påfølgende trin som beskrevet for fryse-tø-ekstrakten. Dette er særligt velegnet, når inkubation er foretaget i hjerne-hjer-te-infusionssuppe.

30 Det er påvist, at der ved ionbytter-chromatografi eller gelfiltrerings-chromatografi sker en separation fra et mere høj-molekylært antibiotisk stof. Således er der for eksempel efter ammoniumsulfatfældning efterfulgt af gelfiltrerings-chromatografi som ovenfor beskrevet fundet to spidser for 35 hæmningsaktivitet over for udvalgte indikatorstammer af S.epidermidis (kodenummer MF87) og S.cohnii (kodenummer MF121). En kvantitativ bestemmelse af hæmningsaktivitet er foretaget ved en modifikation af metoden ifølge Dajani 8 148748 og Wannamaker, J.Bacteriol.,' 97 (1969), side 985-991. To-fold-rækkefortyndinger af præparatet af antibiotiske stoffer blev lavet i enten hjerne-hjerte-infusion (rå præparater vundet ved fryse-tø-ekstraktion) eller 0,05M phos-5 phatpuffer, pH 6,0 (søjlefraktioner) under anvendelse af volumener på 0,5 ml. Et volumen på 0,02 ml af hver fortynding blev anbragt pletvis på overfladen af en tilsået plade af hver indikatororganisme og henstillet til tørring. Plader blev inkuberet aerobt i 6-7 timer ved 37*C.

10 Den fortynding, der frembragte en tydelig reduktion af indikatorstammens væksttæthed, blev betragtet som slutpunktet og blev betragtet som indeholdende 1 enhed hæmningsaktivitet pr.ml. Fig, 1 på tegningerne illustrerer de resultater, der er opnået på søjlefraktioner vundet 15 ved gelfiltrerings-chromatografi, og det fremgår, at der er en mindre spids, der eluerede i udtømningsvolumenet, og en større spids, der blev tilbageholdt af gelen. De i Fig. 1 illustrerede resultater er for ammoniumsulfatfældet inhibitor elueret gennem Sephadex G50 under anven-20 delse af en 0,05M phosphatpuffer ved pH 6,0. Den totale udvinding af aktivitet fra søjlen var 84,3%. Det er påvist, at den mindre spids tilvejebringes af stof med relativt høj molekylvægt (muligvis større end 30.000), og at den større spids tilvejebringes af stof med relativ 25 lav molekyl'vægt (mindre end 10.000). Der var en 20-fold forøgelse i den specifikke aktivitet af de lavmolekylære antibiotiske stoffer, de antibiotiske polypeptider,(fra 2,06 til 40 enheder pr.mg protein over for MF121), men ikke for . antibiotisk stof med højere molekylvægt, som 30 vist i nedenstående Tabel i.

U8748 9

• Tabel I

Fraktion Totale Totalt Sped- Totalt aktivi- protein fik ak- udbytte, tetsen- mg tivitet % heder enheder 5 over for pr. mg . MF 1.2.1 protein Rå fryse-tø-ekstrakt 5120 2480 2,06

Ammoniumsulfatfældning 1280 96 13,3 25,0

Relativt højmolekylært 10 antibiotisk stof (samlet) 45 46 0,98 0,88

Relativt lavmolekulært antibiotisk stof .(samlet). . . ..... 10.4.0. . . . 2.6.....4.0.......2.0,3 15

Virkningsmåden for de omhandlede lavmolekylære antibiotiske stoffer over for S.epidermidis (MF87) er undersøgt i vækstmedium (BHI) og ikke-vækst-medium (phos-phatpuffer) for at bestemme, om denne virkningsmåde er bakteriostatisk, baktericid eller bakteriolytisk. Til bestemmelse af virkningsmåden blev Staphylococcus epidermidis (MF87) dyrket natten over ved 37'C og anvendt som g substrat ved en indledende koncentration på 10 celler pr.ml BHI eller 0,5M phosphatpuffer, pH 6,0. Inaktiv in-2!_ hibitor anvendtes som kontrol og vandtes ved autoklavering ved 121*C i 0,25 time ved pH 9,0. pH-Værdien blev forud for anvendelse genindstillet på 6,0, Aktivt stof vandtes enten ved Sephadex 650-chromatografi af et inddampet koncentrat (til undersøgelser i vækstmedium) eller ved ion-bytter-chromatografi af lavmolekylært stof på Sephadex C-25 (til undersøgelser i ikke-vækst-medium). Ens volumener af celler og antibiotisk stof (eller autoklaveret antibiotisk stof) blev blandet ved TQ, og portioner af hver blanding blev inkuberet ved 37'C i kuvetter holdt i et 35 automateret dobbeltstråle-spektrofotometer (SP1800, Pye Unicam) indstillet på 600 nm-aflæsning ved intervaller på 0,08 time. Resten af hver blanding (også inkuberet ved 148748 ίο 37*C) anvendtes til registrering af levedygtighedstal. Bakteriernes udseende under mikroskop bestemtes hver time ved Gram-farvning.

Fig. 2 på tegningerne viser ændringerne i levedyg-5 tighedstal og optisk tæthed for en suspension af celler af S.epidermidis (MF87) i vækstmedium i nærværelse og fraværelse af de antibiotiske stoffer.Ved fravær af de antibiotiske stoffer voksede organismerne og nåede den stationære fase efter 5,25 timers inkubation. I nærværelse 10 af de antibiotiske stoffer begyndte levedygtigheds tal let imidlertid at falde straks og var reduceret til 10% af dets oprindelige niveau efter 0,17 time, uden nogen reduktion etf optisk tæthed. Kort tid senere begyndte den optiske tæthed at falde, og efter 6 timers inkubation 15 havde den nået næsten nul. På dette tidspunkt var levedygtighedstallet 10 organismer pr.ml. Gram-farvede film af kontrolkulturen viste til alle tider intakte grampositive cocci. Kulturen indeholdende de antibiotiske stoffer begyndte at undergå lysis efter 0,17 time (gramnegative 20 celler, morfologi utydelig, gramnegativt materiale uden for celler), og graden af lysis steg med forlænget inkubation. Efter 4 timers inkubation var der kun få intakte celler tilbage.

I ikke-vækst-medium blev der opnået lignende resul-25 tater, selvom effekten af inhibitoren var reduceret, således at levedygtighedstallet faldt til 10% af dets indledende niveau efter 0,5 time (sammenlignet med 0,17 time i vækstmedium).

Der er observeret de følgende egenskaber for de an-tibiotiske stoffer fremstillet ved dyrkningsprocessen ifølge opfindelsen og for de rå præparater, ud fra hvilke de udvindes: 11 148748 1. Protease-sensibilitet.

De ionbyttede lavmolekylære antibiotiske stoffer (indeholdende 1,75 mg pr.ml protein) var sen^Jbile over for trypsin (2,5 mg pr.ml), men resistente over for ther-5 molysin (160 yg pr.ml), subtilisin (650 yg pr.ml) og pro-nase (1,5 mg pr.ml). Aktivitet måltes ved pH 6,0 i 0,05M phosphatpuffer. Inkubation foregik ved 37°C i 3 timer.

2. Hæmnings-spektre for det rå præparat (dvs, fryse-tø-1Q ekstrakt) og for de separerede lavmolekylære antibiotiske stoffer.

Tabel II nedenfor viser hæmnings-spektrene for den rå fryse-tø-ekstrakt og for de lavmolekylære antibiotiske stoffer. Disse blev frasepareret ved gelfiltrering af et 15 ammoniumsulfatbundfald på Sephadex G50.

Tabel II

Aktivitetsspektre for forskellige inhibitorpræparater.

Følsomhed over for 20 Organisme For- Lavmole- Råt præ- søgs- kylæré parat medium antibi- (fryse-tø- otiske ekstrakt) . ........stoffer S.aureus (3 stammer) 6BHIA + + 25 S.epidermidis " + + S.cohnii (MF121) " + + M.luteus 6BHIA + + M.roseus " + + 30 P.aenes 6BHIA ± ± P.avidum " + + P. granulesum " + + S.pyogenes 6BHIA + + S.faecalis " S/zymogenes " + + S.virldans " + + (fortsættes) 35 12 148748 Følsomhed over for

Organisme For- Lavmole- Råt præ- søgs- kylære parat medium antibi- (fryse-tø- 5 otiske ekstrakt) stoffer A. viridans 6BHIA + +

B. cereus 6BHIA

B.megaterium " + + 10 B.laterosporus " - ± B. sphaericus " + + C. diphtheriae gravis 6BHIA + + C.xerosis " + + C.hofmannii " + + 15 L .monocytogenes 6BHIA + +

C.sporogenes FBA

C.bifermentans " + + C«perfringens " + +

Arthrobacter oxydans 6BHIA + + 20 Cellulomonas subalbus " + + P.ovale Pepton -

Oksegalde

Hf. mening i t idi s HBA

N. gonorrhoéae " - N.pharyngis " 25 H.Influenzae "

Cnranobacterium violaceum 6BHIA

E.coli (2) 6BHIA

P.vulgaris " P.morganii " - 30 S.typhimurium " K.aerogenes " K. pneumoniae ” A. faecalis " S.marcescens " 35 -i--- HBA = opvarmet blodagar FBA = frisk blodagar 6BHIA = Hjerne-Hjerte-Infusionsagar, pH 6,0 148748 13 + = zone med total hæmning i dråbeområde.

± = zone med partiel hæmning (reduceret vækst).

- = ingen hæmning.

5 Aktivitet var begrænset til hæmning af grampositive organismer. Spektret for dec lavmolekylære antibiotiske stoffer varidentisk med spektret for det rå præparat.

10 3. Andre egenskaber af det rå præparat.

(dvs. fryse-tø-ekstrakt).

Virkningerne af forskellige behandlinger på aktivi-: teten af rå fryse-tø-ekstrakter af det eller de antibiotiske stoffer er vist i nedenstående Tabel III.

Tabel III

Virkningerne af forskellige behandlinger på aktiviteten af rå fryse-tø-ekstrakt

Behandling Indledende2^ Endelig2^ %_ titer titer Resterende 1. Opvarmning: 37eC/16 timer 8 8 100 100*C/4 timer 8 8 100 121"C/15 min./pH 56 6 100 121*C/15 min./pH 9 6 0 0 2. pH (2 uger/4*C) pH 2 8 8 100 pH 7 8 6 75 pH 11 8 0 0 3. Inddampning 90°C, reduceret tryk 800 640 80 4. Amicon-dialyse (PM30)y^ 8 2 25 5. Adsorption: 1011 celler af S.epide'rmidis pr. ml inhibitor, 5. min./.3.7*.C............1.2............3 . 25 148748 14 x) Titer er udtrykt som enheder pr.ml over for MF87 (undtagen i tilfælde af inddampning, hvor titeren er totale enheder over for MF87).

y) Tilbageholder molekyler > 30.000 mol.vægt.

5 Det har vist sig, at aktiviteten er yderst termo- stabil ved sure pH-værdier, således at koncentrerede præparater kunne vindes ved inddampning af fryse-tø-ekstrak-terne ved pH 5,0. Hæmnings-aktiviteten var stabil ved 4"C, hvis pH var sur, og blev adsorberet på de sensibile 10 celler af S.epidermidis ved 37*C. Aktiviteten blev fældet med ammoniumsulfat (0-50% mætning). Under fremstilling på BHI-agar passerede hæmningsaktiviteten gennem en dialysemembran (tilbageholdelsesgrænse ved molekylvægt på 14.000) anbragt på overfladen af agaren mellem frembringerkultu-15 ren og vækstmediet for indikatorstammen. Aktiviteten af rå præparater kunne imidlertid ikke fjernes totalt ved dialyse mod destilleret vand. Ultrafiltrerings-membraner med molekylvægtgrænser ved 10.000 og 30.000 tilbageholdt fra 18,25 til 25% af hæmningsaktiviteten. Mindst 99% af 20 molekyler, der kan passere gennem membranen, skulle fjernes ved denne metode. Disse resultater viser tilstedeværelsen af lavmolekylære og højmolekylære stoffer.

4. Aktivitet af antibiotiske stoffer over for S.epidermir 25 dis NCIB 11536.

Der er ikke observeret nogen aktivitet for de lavmolekylære antibiotiske stoffer.

5. Aminosyre-analyse af lavmolekylære antibiotiske stoffer.

Aminosyre-analyse viser, at de lavmolekylære antibiotiske stoffer er polypeptider afledt af isoleucin,phe-nylalanin, alanin, asparaginsyre, glutaminsyre, lysin, glycin og prolin. Der er navnlig påvist en aminosyresam-mensætning af én enhed afledt af hver af isoleucin, phe-35 nylananin, alanin, asparaginsyre, glutaminsyre, lysin og prolin og to enheder afledt af glycin. I de allerede kendte polypeptid-antibiotica er der ikke påvist tilstedeværelse af isoleucin og phenylalanin. Hsu, C-Y og Wise- 148748 15 man, G.M. i Can. J.Microbiol. 18 (1972) 121-125, har i-midlertid rapporteret epidermidiner, hvori der foreligger alanin, asparaginsyre, glutaminsyre, glycin, lysin og prolin, men det skal bemærkes, at virkningsmåden for dis-5 se epidermidiner er bakteriostatisk snarere end bakteri-cid og bakteriolytisk.

6. Virkningsmåde for de antibiotiske stoffer.

Det rå præparat (dvs. fryse-tø-ekstrakten) udviser en baktericid virkning resulterende i lysis af cellerne.

10 Det er observeret, at den lysis, der skyldes, at S.epi-dermidis-celler udsættes for de lavmolekylære antibiotiske stoffer,ikke var en primær effekt af adsorption af de antibiotiske stoffer/3a over 90% af cellerne var blevet dræbt, førend lysis begyndte. Aktiviteten foreligger også 15 på ikke-vækst-medier.

På grund af deres baktericide virkning og deres hre-de aktivitetsspektrum over for grampositive bakterier er de omhandlede lavmolekylæte antibiotiske stoffer potentielt anvendelige ved forebyggelse og behandling af grampositive 20 bakterieinfektioner, navnlig sådanne infektioner af hu den. De lavmolekylære antibiotiske stoffer er af særlig in-· teresse derved, at de er potentielt anvendelige ved forebyggelse og behandling af sådanne hudinfektioner som inficeret eksan, impetigo, bylder, cellulitis og navnlig acne, idet stbffer-25 jnes aktivitet over for et stort antal indikatorstammer af P.aenes er påvist. Det menes, at de lavmolekylære antibiotiske stoffer, da de produceres af en på huden normalt foreliggende organisme, sandsynligvis vil have større stabilitet og aktivitet på huden end hidtil anvendte an-30 tibiotica.

De omhandlede antibiotiske polypeptidforbindelser kan indgå i farmaceutiske kompositioner sammen med et farmaceutisk bærestof eller excipiens,

De farmaceutiske kompositioner kan for eksempel 35 foreligge i en form egnet til oral, parenteral, enteral eller lokal anvendelse. Præparater til lokal anvendelse foretrækkes, og sådanne præparater kan for eksempel foreligge i form af opløsninger, emulsioner, geler, lotioner, 148748 16 salver, cremer eller pulvere. Sædvanlige farmaceutiske bærere og excipienser såvel som de sædvanlige fremstillingsmetoder kan anvendes ved fremstillingen af farmaceutiske præparater.

5 Opfindelsen angår som nævnt også en mikroorganisme til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen og ejendommelig ved, at mikroorganismen er Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 i biologisk ren form.

10 Stammen S.epidermidis NCIB 11536 er isoleret fra et voksent menneskes ansigtshud og blev identificeret efter skemaet ifølge Kloos, W.E. og Schleifer, K.H., J.Clin. Microbiol., 1 (1975), side 82-88. Karakteristika for denne stamme er følgende:.

15 Historie:

Oprindelig beskrivelse af farver; grå-h.vid, proteolytisk (på chokoladeagar).

Dato for isolering; Maj 1976.

Kilde: Overflade af ansigtshud, han-kaukasier, sund hud 20 (ingen acne vulgaris eller tegn på anden hudsygdom), alder 25 år.

Lagring: I 40 volumen% glycerol/phosphat-pufret saltopløsning (PBS).

Vækstbetingelser: Flydende kultur - Hjeme-Hjerte-Infu-25 sion, inkubation natten over, 37*C aerobt.

Inokulum: 0,1 ml fra glycerol/PBS-lagerkultur.

(Bem.: langtidslagring - frysetørrede kulturer og kulturer holdt i flydende nitrogen.) 1 148748 17

Karakteristika;

Prøve Reaktion

Coagulase

Phosphatase + 5

Nitratreduktion +

Novobiocin-sensibilitet sensibil over for 5pg- plade

Syre, aerobt fra: glucose + IQ mannitol trehalose ~ sucrose + lactose + xylose 15 arabinose maltose + fructose + ribose -

Protease + 2Q Lipase - triolein + (kun pladeprøve) tributyrin + ( " " )

Hyaluronidase

Haemolyse (heste- eller menneskeblod) + (kun pladeprøve)

Produktion af acetoin + 25 DNase +

Ernæring (aerob vækst): 1. Vitaminbehov: nicotinsyre thiamin 3Q biotin (kan erstattes med oliesyre).

2. Aminosyrebehov: ikke fuldt ud bestemt, men vil vokse på syntetisk medium indeholdende 7 aminosyrer.

3. Kræver ikke guanin, uracil eller adenin for vækst.

148748 18

Antibiotiske sensibiliteten Mængde af anti-bioticum/plade 5 Sensibil over for: ampicillin 10 ug penicillin G 1 enhed carbenicillin 100 ug tetracyclin 10 ug clindamycin 2 ug 10 gentamycin 10 ug erythromycin 5 ug chloramphenicol 25 ug furoxon 50 ug novobiocin 5 ug 15

Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksempel .

Mikroorganismer:

Indikatorstaramerne S.epidermidis MF87 og S.cohnii 20 MF121, ligesom den antibioticum-producerende stamme S. epidermidis NCIB 11536, blev isoleret fra ansigtshuden af et voksent menneske. Stammerne holdtes i 40 volumen% glycerol/PBS under anvendelse af en modifikation af metoden ifølge Gore L.F. og Walsh P., J.Med.Lab.Techno1., 21 25 (1964), side 244-246.

Kultur:

Et isolat af stammen S.epidermidis NCIB 11536 (taget fra en lagerkultur holdt i 40 volumen% glycerol/PBS som ovenfor beskrevet) blev inkuberet i Hjerne-Hjerte-30 Infusions(BHI)-suppe i en mængde på 0,1 ml isolat pr. 10 ml suppe, idet inkubationen foregik aerobt natten over ved 37*C under anvendelse af en baneryster.

Portioner på 0,1 ml af den således vundne suppekultur blev inokuleret over på plader af Hjerne-Hjerte-Infu-35 sionsagar (BHIA), idet dyrkningsmediet var som markedsført af Difco Laboratories og med følgende sammensætning pr.liter medium: 148743 19

Kalvehjerner, infusion derfra 200 g

Oksehjerte, infusion derfra 250 g

Proteose-pepton, Difco 10 g

Bacto-dextrose 2 g 5 Natriumchlorid 5 g

Dinatriumphosphat 2,5 g

Agar - sat til endeligt koncentrat i mængde på 1% (vægt/volumen)

Dyrkningsmediets pH var 6.

10

Pladerne blev derefter inkuberet i 24 timer under aerobe betingelser ved en temperatur på 37*C.

Udvinding af antibiotiske stoffer: 1. Fryse-tø-ekstraktion; 15 Dette trin udførtes ved en modifikation af metoden i-følge McGeachie J., Zentrabl.Bakteriol (Orig A), 196 (1965), side 377-384. Kulturen blev lagret natten over ved en temperatur på -20"C og blev derefter optøet ved stuetemperatur, og den derved udtrængte væske blev 20 indsamlet. Denne udtrængte væske blev derefter underkastet centrifugering ved 3.000 g i 1 time ved 4*C.

Det herved vundne overliggende materiale omtales her som rå fryse-tø-ekstrakt, la. Centrifugering.

25 I et alternativt tilfælde, hvor inkubation udførtes aerobt i 48 timer ved 37*C i Hjerne-Hjerte-Infusions-suppe under anvendelse af en baneryster, blev den inkuberede suppe centrifugeret ved 3000 g i 30 minutter for at fjerne cellemateriale. Det således vundne over-30 liggende materiale blev derefter behandlet på samme måde som beskrevet for rå fryse-tø-ekstrakt.

2. Åmmoniumsuifat-fældning.

Fast ammoniumsulfat (analar, B.D.H.) blev sat til den rå fryse-tø-ekstrakt til opnåelse af 30% mætning. Ef-35 ter omrøring ved 4°C i 3 timer blev det herved vundne bundfald (der indeholdt noget af det i ekstrakten tilstedeværende protein) fjernet ved centrifugering ved 3000 g i 1 time ved 4’C. Yderligere fast ammoniumsulfat blev derefter tilsat til opnåelse af 50% mætning.

148748 20

Efter omrøring natten over ved 4*C blev det vundne bundfald (der indeholdt de antibiotiske stoffer, der skulle udvindes) igen fraskilt ved centrifugering som ovenfor beskrevet. Dette andet bundfald blev opløst i 5 en minimal mængde 0,05M phosphatpuffer, pH 6,0, ved 4*C,og uopløst bundfald blev igen fjernet ved centrifugering til opnåelse af et overliggende materiale til yderligere rensning.

3. Ionbytter-chromatografi.

10 En prøve på 10 ml af det ved ammoniumsulfatfældning vundne overliggende materiale blev overført til en Sephadex C25-kationbyttersøjle (søjledimensioner 1,5 x 30 cm), der var for-ækvilibreret med 0,05M phosphat-puffer, pH 6,0. Ikke-bundne stoffer blev elueret med 15 startpuffer ved stuetemperatur. Bundne stoffer blev derefter elueret ved en strømningshastighed på 15 ml pr.time under anvendelse af en lineært stigende ionstyrkegradient af 0-0,5M (400 ml) NaCl i 0,05M phos-phatpuffer, pH 6,0, ved stuetemperatur. Det højmoleky-20 lære antibiotiske stof var ubundet og vandtes i elua-tet med startpuffer. Under eluering blev der indsamlet fraktioner på 5,5 ml, og dem, der indeholdt det lavmolekylære antibiotiske stof (identificeret ved deres hæmningsaktivitet over for MF121) blev tilbageholdt.

25 4. Gelfiltrerings-chromatografi.

Af spidsfraktioner fra ionbytter-chromatografi indeholdende de lavmolekylære antibiotiske stoffer blev 10 ml overført til en Sephadex G25-søjle (2,2 x 45 cm, v = 61,5 ml, V. = 141 ml), der var for-ækvilibreret o t 30 med 0,05M phosphatpuffer, pH 6,0. Søjlen blev elueret med 0,05M phosphatpuffer, pH 6,0, ved en strømningshastighed på 12 ml pr.time ved stuetemperatur, og fraktioner på 4 ml, hvoraf nogle indeholdt de lavmolekylære antibiotics (igen identificeret ved deres 35 hæmningsaktivitet over for MF121)^ blev indsamlet.

I nedenstående Tabel IV er samlet de opnåede resultater: 148748 21

Tabel IV

Fraktion Totale erihe- Totalt Specifik Udbytte der af ham- protein aktivitet % ningsaktivi- mg enheder pr.

5 tet over for mg protein S.cohnii z) Rå fryse-tø-ekstrakt 12.800 2.560 5 30-50% arrmonium- sulfat-bundfald 10.400 50,50 202,80 80 10 C25-ubundet højmole- kylært antibiotisk stof 185,80 1,45 v) C25-bundet lavmole-kylært antibiotisk 15 stof (alle fraktioner) 5.110,60 3,27 1.561,40 39,90 C25-bundet lavmolekylært antibiotisk stof (spids-fraktioner) 4.653,20 1,17 3.983,10 36,40 ^G25 (alle fraktioner) 1.194,80 0,076 15.720,40 9,33 20 y^G25 (spidsfraktioner) 1.056 0,027 39.111,10 8,25 x) Sephadex C25-kationbytter y) Sephadex G25-sØjle z) S.cohnii - MF121.

Proteinprøve.

25 I ovenstående Tabel og i hele beskrivelsen er pro tein bestemt ved metoden ifølge Lowry, O.H., Rosgbrough, N.J., Farr, A.L. og Randall, R.J., J.Biol. Chem., 193 (1951), side 265-275, under anvendelse af okseserumalbu-min som reference.

30 Undersøgelser af minimalernæring.

Til yderligere undersøgelse af fremstillingen af de' omhandlede antibiotiske stoffer blev der foretaget undersøgelser vedrørende minimalernæring. Ved disse undersøgelser blev isolater af stammen S.epidermidis NCIB 35 11536 (taget fra en lagerkultur holdt i 40 volumen% gly- cerol/PBS som ovenfor beskrevet) inkuberet aerobt i 24 timer ved 37*C under anvendelse af en baneryster. Inkubation fandt sted i et syntetisk medium som ovenfor beskrevet, men idet flere komponenter var udskiftet, udeladt el-40 ler forelå i andre koncentrationer. Idet der henvises til 148748 22 det ovenfor beskrevne syntetiske medium var, til undersøgelserne vedrørende minimalernæring, phosphatindholdet reduceret til 200 mg pr.liter Na^PO^, PIPES var erstattet med 10000 mg pr.liter MES (2-(morpholino)ethansulfon-5 syre), K2HP04 var erstattet med 500 mg pr.liter KC1, og glucoseindholdet var sat til 2000 mg pr.liter. Ved anvendelse af dette syntetiske medium som basis for minimal-ernærings-undersøgelserne blev aminosyreindholdene i de syntetiske medier varieret ved udeladelse fra medierne 10 af forskellige aminosyrer. Det viste sig, at aminosyre-indholdet i det syntetiske medium kunne reduceres til 800 mg pr.liter L-arginin, 400 mg pr.liter L-cystein, 2000 mg pr.liter L-glutaminsyre, 15 400 mg pr.liter glycin, 400 mg pr.liter L-prolin 400 mg pr.liter L-tryptophan og 400 mg pr.liter L-histidin uden at hindre vækst af S.epidermidis NCIB 11536 eller 20 fremstilling af de omhandlede antibiotiske stoffer.

Ved disse undersøgelser fandtes også, at hævning af den totale aminosyrekoncentration fra 2800 mg pr.liter til 11200 mg pr.liter resulterede i en 8 til 16 ganges 25 forøgelse i titer, mens bakterielt udbytte kun steg med 1%.

Disse resultater viser, at aminosyresammensætning har en tydelig indvirkning på antibioticumfremstilling. Ultraviolette absorptionsspektre.

30 Fig. 3, 4 og 5 på tegningerne illustrerer U.V.- spektre registreret inden for absorptionsområdet 200-300 nm med tre prøver af de lavmolekylære antibiotiske stoffer vundet ved aerob dyrkning af S.epidermidis NCIB 11536.

Prøverne viste hver en absorptionsspids centreret ved ca.

35 210 nm og en svagere absorptionsspids centreret ved ca.

270-280 nm. Fig. 3 og 4 illustrerer U.V.-spektre for prøver af de antibiotiske stofferefter jpnbytter-chromatogra-fi ved eluering gennem en Sephadex C25-kationbyttersøjle