JPH0226640B2 - - Google Patents
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- JPH0226640B2 JPH0226640B2 JP55502299A JP50229980A JPH0226640B2 JP H0226640 B2 JPH0226640 B2 JP H0226640B2 JP 55502299 A JP55502299 A JP 55502299A JP 50229980 A JP50229980 A JP 50229980A JP H0226640 B2 JPH0226640 B2 JP H0226640B2
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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Description
請求の範囲
１ スタフイロコツカス・エピデルミデイス（S.
epidermidis）NCIB11536から生産することがで
きかつ分子量が950〜10000であるポリペプチド抗
生物質化合物又はその酸付加塩であつて、該化合
物はその分子構造内に式―NH―R1―CO―，―
NH―R2―CO―，―NH―R3―CO―，―NH―
R4―CO―，―NH―R5―CO―，―NH―R6―
CO―，―NH―R7―CO―および
【式】 （式中、NH2―R1―COOH，NH2―R2―
COOH，NH2―R3―COOH，NH2―R4―
COOH，NH2―R5―COOH，NH2―R6―COOH
およびNH2―R7―COOHはそれぞれイソロイシ
ン、フエニルアラニン、アラニン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リジンおよびグリシンを示
し、【式】はプロリンを示す）を 有するアミノ酸誘導体ユニツトから成る、上記抗
生物質化合物。 ２ 分子量が950〜10000であるポリペプチド抗生
物質化合物又はその酸付加塩であつて、その分子
構造内に式―NH―R1―CO―，―NH―R2―CO
―，―NH―R3―CO―，―NH―R4―CO―，―
NH―R5―CO―，―NH―R6―CO―，―NH―
R7―CO―および （式中、NH2―R1―COOH，NH2―R2―
COOH，NH2―R3―COOH，NH2―R4―
COOH，NH2―R5―COOH，NH2―R6―COOH
およびNH2―R7―COOHはそれぞれイソロイシ
ン、フエニルアラニン、アラニン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リジンおよびグリシンを示
し、【式】はプロリンを示す）を 有するアミノ酸誘導体ユニツトから成る、上記抗
生物質化合物の製造法において、スタフイロコツ
カス・エピデルミデイス（Staphylococcus
epidermidis）NCIB11536又はその変異株をその
培地中又は培地面で好気培養し、その後その抗生
物質化合物を採り出すことを特徴とする、上記化
合物の製造法。 ３ 培地にはＬ―アルギニン、Ｌ―システイン、
Ｌ―グルタミン酸、グリシン、Ｌ―プロリン、Ｌ
―トリプトフアンおよびＬ―ヒスチジンを含有す
る、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 抗生物質化合物を回収する場合、菌細胞物質
から分離に続いて、この化合物を硫酸アンモニウ
ムの作用により沈澱させる、特許請求の範囲第２
項又は第３項記載の方法。 ５ 菌細胞物質からの分離を凍結―解凍抽出によ
り行う、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 硫酸アンモニウムの作用による沈澱に続い
て、抗生物質化合物をイオン交換クロマトグラフ
イにより分別する、特許請求の範囲第４項又は第
６項記載の方法。 ７ スタフイロコツカス・エピデルミデイス（S.
epidermidis）NCIB11536から生産することがで
きかつ分子量が950〜10000であるポリペプチド抗
生物質化合物又はその酸付加塩であつて、該化合
物はその分子構造内に式―NH―R1―CO―，―
NH―R2―CO―，―NH―R3―CO―，―NH―
R4―CO―，―NH―R5―CO―，―NH―R6―
CO―，―NH―R7―CO―および
【式】 （式中、NH2―R1―COOH，NH2―R2―
COOH，NH2―R3―COOH，NH2―R4―
COOH，NH2―R5―COOH，NH2―R6―COOH
およびNH2―R7―COOHはそれぞれイソロイシ
ン、フエニルアラニン、アラニン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リジンおよびグリシンを示
し、【式】はプロリンを示す）を 有するアミノ酸誘導体ユニツトから成る抗生物質
化合物を活性成分として含有し、および担体から
成る、殺菌組成物。 明細書 本発明はポリペプチド系抗生物質、同製造法お
よび殺菌組成物に関する更に本発明は抗生物質を
生産するスタフイロコツカス エピデルミデイス
（Staphylococcus epidermidis）新菌株、この菌
株を含有する組成物およびこの種の組成物により
人間の皮膚を香粧的にあるいは予防的に処理する
方法に関する。この抗生物質はグラム陽性菌に対
して殺菌作用を有する。 スタフイロコツカス菌はは細菌の生育に対し阻
止作用を有する少なくとも３種の物質、すなわち
バクテリオシン、細菌分解性酵素および低分子量
抗生物質を生産することは知られている。スタフ
イロコツカス菌から低分子量抗生物質を生産する
ことが記述されている文献には次のようなものが
ある。 スー，シー―ワイ（HSU，Ｃ―Ｙ）およびワ
イズマン，ジー．エム．（Wiseman，G.M.）、カ
ナダ．ジヤーナル．マイクロバイオロジー
（Can.J.Microbiol），17（1971）、第1223―1226
頁。 ローブ．エル．ジエー．，モイア エイ．
（Loeb，L.J.Moyer A.）およびマレー，アール．
ジー．イー．（Murray，R.G.E.），カナダ．ジヤ
ーナル．リサーチ．（Can.J.Res.），28E（1950），
第212―216頁。 パルバーラー，ジー．（Pulverer，G.）および
ジエルヤセビツク，ジエー．（Jeljaszewicz，
J.），スタフイロコツカスおよびスタフイロコツ
カス感染に関する第３回国際シンポジウム会議議
事録 （Proceedings of International
Symosium on staphylococci and staphyloccal
infections），第599―621頁。ジエー．ジエルヤ
セビツク．スチマツトガルト：フイツシヤー―ベ
ルテツグ（J.Jeljaszewicz.Stuttgart：Fischer―
Verlas）著。 セルウイン，エス．，マーシユ，ピー．デイー． （Selwin，S.，Marsh，P.D.）およびセスナ，
テイー．エヌ（Sethna，T.N.），「化学療法、第
９回化学療法国際会議議事録」
“（Chemotherapy，Proceedings of the 9th
International Congfess of Chemotherapy）“，
５（1975）、第391―396頁。ジエー．デイー．ウ
イリアムス（J.D.Williams）およびエイ．エム．
ゲツデイス（A.M.Geddes），ニユーヨーク著。 スー，テイ．エル．（Su，T.L.）ブリテイシ
ユ．ジヤーナル．エクスペリメンタル．パソオロ
ジイー．（Br.J.Exp.Pathol.），29（1948），第473
―481頁。 ハルバート，エス．ピー．（Halbert，S.P.），
スイツク，エル．（Swick，L.）およびソン，シ
ー（Sonn，C.），ジヤーナル．イムノロジイー．
（J.Immunol.），70（1953）第400―410頁。 上記文献に記載される低分子量抗生物質はどれ
も菌細胞の分解による殺菌作用を示すこれは実証
されなかつた。 ジヤーナル．メデイカル．マイクロバイオロジ
イー．（J.Med.Microbiol.），12（1979）、第71―
82頁には、プロピオノバクテリウム・アクネス
（Propionobacterium acnes）の単離菌93種およ
びマイクロコツカセス（Micrococcaceae）の単
離菌148種種から成る人間の皮膚に常在する多く
の菌株について、各種指示株であるピー．アクネ
ス（P.acnes）およびスタフイロコツカス・エピ
デルミデイス（Staphylococcus epidermidis）
のその生育阻止能をスクリーンした実験が記載さ
れている。試験したこれらのうち53株が少なくと
も１つの指示株に対し若干の活性を示し、広いス
ペクトルと狭いスペクトル阻止が検出された。実
験した菌株は36人の〓瘡患者と８人の対照者から
とり、研究の主目的は、阻止菌の所持逆に言えば
患者の感受性菌の所持は〓瘡になり易いかどうか
を見出すことであつた。スクリーンされたピー．
アクネス（P.acnes）とマイクロコツカセス
（Micrococcaceae）の特定菌は内部基準による以
外は同定されない。更に、観察された阻止活性物
質の回収について試みられていない。 本発明は、スタフイロコツカス・エピデルミデ
イス（Staphylococcus epidermidis）の特定菌
株すなわちスタフイロコツカス・エピデルミデイ
ス （Staphylococcus epidermidis）NCIB11536
（本菌はナシヨナル・コレクシヨン・オブ・イン
ダストリアル・バクテリア，トレー・リサーチ・
ステーシヨン（National Collection of
Industrial Bacteria，Torrey Research
Station），ピー．オー．ボツクス（P.O.Box）
31，135アベー通り、アバデイーンAB9 8DGに
1979年10月３日寄託されかつ微生物工業技術研究
所の受託番号は第5972号である）を培養して、グ
ラム陰性菌に対し広い抗菌スペクトルを示しかつ
菌細胞の分解による殺菌作用を有する点で、スタ
フイロコツカイ（Staphylococci）により従来生
産される低分子量抗生物質とは区別される新規低
分子量ポリペプチド系抗生物質を生産し得るとい
う知見に基づくものである。 本発明の一側面によれば、10000より多くない
分子量を有しかつグラム陽性菌に対し殺菌・制菌
活性を有するポリペプチド系抗生物質化合物又は
その付加塩を供し、この化合物は分子構造内に次
式のアミノ酸誘導体単位を有する。 ―NH―R1―CO―，―NH―R2―CO―，―
NH―R3―CO―，―NH―R4―CO―，―NH―
R5―CO―，NH―R6―CO―，―NH―R7―CO
―および （式中、NH2―R1―COOH，NH2―R2―
COOH，NH2―R3―COOH，NH2―R4―
COOH，NH2―R5―COOH，NH2―R6―COOH
およびNH2―R7―COOHはそれぞれイソロイシ
ン、フエコルアラニン、アラニン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リジンおよびグリシンを示
し、【式】はプロリンを示す。 本発明のの抗生物質ポリペプチドの内特に適当
なものは、約950の分子量を有し、かつその分子
構造内に次式のアミノ酸誘導体単位を有する抗生
物質である。 ―NH―R1―CO―，―NH―R2―CO―，―
NH―R3―CO―，―NH―R4―CO―，―NH―
R5―CO―，―NH―R6―CO―，―NH―R7―
CO―および【式】およびさらに― NH―R7―CO― （式中、NH2―R1―COOH，NH2―R2―
COOH，NH2―R3―COOH，NH2―R4―
COOH，NH2―R5―COOH，NH2―R7―COOH
および【式】上記の定義の通りで ある）をアミノ酸誘導体単位。 このポリペプチドのアミノ酸配列又は含量を変
えた場合は、ポリペプチドはその抗生物質性を保
持し得ることは勿論認識すべきである。したがつ
て、上記ポリペプチド系抗生物質およびその付加
塩は、式 ―NH―R1―CO―および―NH―R2―CO―
（式中、NH2―R1―COOHおよびNH2―R2―
COOHは上記定義の通りである）のアミノ酸単
位のものを除いて、１つ又はその以上、適当には
１〜３つの上記アミノ酸誘導体式単位がない場合
又は異なつたアミノ酸から誘導された式単位によ
り置換されている場合、本発明の範囲内に入ると
みなされる。 本発明の別の側面によれば、スタフイロコツカ
ス・エピデルミデイス（Staphylococcus）
epidermidis）NCIB 11536又はその変異株をそ
の培地内で又は培地上で好気的に培養させその後
その抗生物質化合物を回収する工程を包含する、
グラム陽性菌に対し殺菌・制菌活性を有する抗生
物質化合物の製造方法を供する。 本発明の製造法の別法として、個々のペプチド
縮合を継続して、ポリペプチド鎖を段階的に構成
していく非微生物的方法により、本発明のポリペ
プチド抗生物質を製造することが可能である。 本発明方法は適当な無機塩その他の栄養源と共
に炭素源および窒素源をを含有する流動又は固形
培地を使つて行なうことができる。適当な培地は
例えば次のものがある： (i) ブレーンハートインフユージヨン寒天
（BHIA） これはデイフコ・ラボラトリーズ（英国サレ
ー、ウエストモレシイーセントラル通り）より
市販されている培地であり、小牛の脳と牛の心
臓からの浸出物、プロテオースペプトン（デイ
フコ）、バクト―デキストロース、塩化ナトリ
ウムおよびリン酸二ナトリウムを含有する。 (ii) トリプチカーゼソイブロス これはベクトン・デイキンスン・アンド・カ
ンパニイ・リミテツド（Becton Dickinson
＆ Co.Limited）（英国ミドルセツクス、ウエ
ンブリー、エンパイア通り）より市販されてい
る培地であり、カゼインのパンクレアチン消化
物、大豆粉のパパイン消化物、塩化ナトリウム
およびリン酸二ナトリウムを含有する。 (iii) トリプトンンL42／酵母エキスL21培地 これは２重量％のトリプトンL42および１重
量％の酵母エキスL21を含有し、両成分はオキ
ソイドリミテツド（Oxoid Limited）（英国、
ロンドンSE19HF、サウスウオークブリツジ通
り）より市販されている。 (iv) 合成培地 これはグリフイス，シー．ジエー．
（Griffith，C.J.）およびメルビル，テイー．エ
イチ（Melville，T.H.）、アーク．オーラル．
バイオロジイー．（Arch.Oral.Biol.），19
（1974）、p.87―90に記述されている培地であ
り、次の組成を有する： 【表】 【表】 培養工程は好気的に、望ましくはは35〜40℃
で、更には約37℃で約12〜48時間、望ましくは24
〜36時間で行なう。培地の最初のPHは4.5〜７の
範囲でよく、５〜6.5のPHが望ましい。 培養工程の完了後、新しい抗生物質を培地から
回収する。回収工程を行なうのに有用であると判
つた方法は次の通りである。 １ 凍結―解凍抽出 この方法は公知の技術で、例えばマクギーチ
イ，ジエー．（McGeachie J.），ゼントラブル・
バクテリオロジイー（Zentrabl Bakteriol）
（Orig Ａ）、196（1965）、p.377―384に記述され
ている。抽出液を遠心分離して、細菌を除く。得
られた粗凍結―解凍抽出物（必要なら抗生物質の
試験に使用する）を、酢酸セルロース膜フイルタ
ー（孔直径0.45μｍ、オキソイド・リミテツド）
で過して殺菌し、必要なまで４℃で貯蔵するこ
とができる。非殺菌抽出物は−20℃で貯蔵するこ
とができる。 ２ 蒸発 粗凍結―解凍抽出物のPHを蒸発前に酸性にし、
望ましくは10NHClを加えて約PH５にする。新し
い抗生物質の阻止活性は酸性条件下でのみ熱安定
性であるからである。蒸発は減圧下回転エバポレ
ータ（ロタベーパー―イー．エル．Rotavapor―
EL，ブチ，スイス）により90℃で都合よく行な
うことができる。 ３ 限外過 適当な過膜、例えばアミコン・リミテツド，
ハイ・ワイコム，バツキンガムシヤー（Amicon
Limited，High Wycombe，
Buckinghamshire）、英国から市販されているア
ミコンモデル52（能力65ml）を使つて、濃縮又は
透析を陽圧過により行なうことができる。倍容
量の蒸留水で５回透析を行なうのがよい。 ４ 硫酸アンモニウム沈澱 硫酸アンモニウムを25〜30％飽和度を得るため
に、凍結―解凍抽出物に加える。撹拌後、沈澱タ
ン白質を例えば遠沈により除くことができる。上
清液に更に（NH4）2SO4を加えて50〜60％飽和度
にし、続いて撹拌と遠沈を行なう。抗生物質を含
む沈澱物は最小量のバツフアー、例えば0.05Mリ
ン酸塩バツフアー、PH6.0に再懸濁させることが
できる。この精製工程を行なう場合、
（NH4）2SO4を最初に添加し、約30％飽和度を得、
続いて約50％飽和度を得るように添加するのがよ
い。 ５ イオン交換クロマトグラフイ 蒸発又は硫安沈澱により部分的に精製した試料
をセフアデツクスＣ―25カチオン―交換カラムに
充填する。未結合物質は最初のバツフアー、例え
ば0.05Mリン酸塩バツフアー、PH6.0で溶離する。
ついで0.5Mリン酸塩バツフアー、PH6.0中直線的
に増大するイオン強度交配の０〜0.5M（400ml）
NaClを使つて、15mlh-1の流速で溶離することが
でき、5.5mlフラクシヨンを集める。 ６ ゲル過クロマトグラフイ 蒸発、硫安および／又はイオン交換クロマトグ
ラフイにより部分的に精製した試料をセフアデツ
クスＧ―50カラムに充填し、例えば0.05Mリン酸
塩バツフアー、PH6.0で溶離する。必要なら、セ
フアデツクスＧ―25、セフアデツクスＧ―15又は
バイオゲル（Biogel）P2カラムをセフアデツク
スＧ―50カラムの代りに使用することができる。 上記イオン交換工程およびゲル過工程におい
て、本発明の溶離したポリペプチド抗生物質はし
ばしばかなりのNaCl含量をを有することが判つ
た。このことはゲル過媒体（ポリアクリルアミ
ド又はデキストランゲル）に強力に結合させかつ
その解離のために高イオン強度バツフアーの使用
を必要とするポリペプチド内の芳香族残基の高度
カチオン性によりおきる。 したがつて実際上、イオン交換やゲル過クロ
マトグラフイ工程の３つの相互のコンビネーシヨ
ンが、蒸発又は硫酸アンモニウム沈澱により部分
的に精製される試料について操作するために開発
された。 (a) バイオゲルP2又はセフアデツクスG15カラム
による溶離続いてセフアデツクスC25カラムに
よる溶離で食塩含有の高力価を得ること、 (b) セフアデツクスC25カラムによる溶離続いて
セフアデツクスG10カラムによる溶離で低食塩
含量の低力価を得ること、および (c) セフアデツクスG15カラムによる溶離、続い
てセフアデツクスC25カラムによる溶離、セフ
アデツクスG10カラムによる溶離で、高分子量
物質の除去とNaClの除去とを組み合わせるこ
と。 上記精製工程は一例であり、またこれらの工程
は望みのその他の精製工程により置き換えること
もあるいは改良することもできる。例えば、硫酸
アンモニウム沈澱工程をエタノールやアセトンの
如き他の沈澱剤を使う類似の工程により置き換え
ることも可能である。 回収工程は凍結―解凍抽出、硫酸アンモニウム
沈澱、イオン交換クロマトグラフイおよびゲル
過クロマトグラフイを包含することがよい。 凍結―解凍抽出の別法として、更に望ましい回
収工程は、培地を約30分間約3000ｇで遠心分離し
細胞材料を除去し、ついで上澄液を硫酸アンモニ
ウム沈澱させそして凍結―解凍抽出物に対し上記
工程から成る。培養をブレーンハートインフユー
ジヨンブロスで行なう場合にこの方法は特に適し
ている。 イオン交換クロマトグラフイ又はゲル過工程
によつて、２種の抗生物質の分離があることが分
つた。すなわち例えば、硫酸アンモニウム沈澱続
いて上記ゲル過クロマトグラフイにより、選択
された指示株ケータ、エス．エピデルミデイス
（S.epidermidis）（コード番号MF87）およびエ
ス．コーニイー（S.cohnii）（コード番号MF121）
に対する阻止活性の２つのピークが検出された。
阻止活性の定量測定はダヤニとワナメーカー
（DajaniとWannamaker）の方法、ジヤーナル・
バクテリオロジイー（J.Bacteriol.），97（1969），
p.985―991の変法により行なう。抗生物質標品の
連続した２倍稀釈はブレーンンハートインフユー
ジヨン液（凍結―凍抽出法により得た粗標品）か
又は0.05Mリン酸塩バツフアー、PH6.0（カラムフ
ラクシヨン）において0.5ml容量を使つて行なつ
た。各稀釈の0.02ml容量を各指示株の接種板の表
面にスポツトし、乾燥させた。接種板は37℃で６
―７時間好気的に培養させた。指示株の生長密度
の一定の減少をおこす稀釈は終点とみなし、かつ
阻止活性の−ユニツトml-1を含むと考えられた。
添付図面の第１図はゲル過クロマトグラフイに
より得たカラムフラクシヨンについて得た結果を
示し、空容量（void volume）で溶離した最小ピ
ークとゲルにより得た最大ピークがある。第１図
に示した結果は、PH６で0.05Mリン酸塩バツフア
ーと使つてセフアデツクスG50により溶離した硫
酸アンモニウム沈澱インヒビターのものである。
カラムからの全体の活性回収率は84.3％であつ
た。最小ピークは比較的高分子量（多分30000以
上）の物質により得られ、また最大ピークは比較
的低分子量（10000未満）の物質により得られる
ことが分つた。低分子量抗生物質、ポリペプチド
抗生物質の比活性では20倍の増大があつた。
（MF121に対し2.06〜40単位mg-1タン白）が、高
分子量抗生物質では次の表１に示すようにそうで
はなかつた。 【表】 高分子量抗生物質のフラクシヨンは、限外過
により再濃縮するまで、指示株エス・エピデルミ
デイス（S.epidermidis）（MF87）を阻止しなか
つた。カラムから回収した活性の4.0％を示した
に過ぎなかつた。本発明において主な関心のある
抗生物質は、図１の最大ピークによる比較的低分
子量の抗生物質である。 エス．エピデルミデイス（S.epidermidis）
（MF87）に対する本発明に係る低分子量抗生物
質の作用形態は生育培地（BHI）および非生育
培地（リン酸塩バツフアー）において研究され、
この作用形態が制菌性、殺菌性又は溶菌性である
かどうかを決定した。この作用形態の測定のため
に、エス．エピデルミデス（Sepidermidis）
（MF87）を37℃で一晩生育させ、108細胞ml
-1BHI又は0.5Mリン酸塩バツフアー、PH6.0の初
期濃度で基質として使用した。不活性インヒビタ
ーは対照として使用し、121℃／0.25h、PH9.0の
オートクレーブにより得た。PHは使用前6.0に調
整した。蒸発濃縮物のセフアデツクススG50クロ
マトグラフイ（生育培地での研究のため）か又は
セフアデツクスＣ―25に対する低分子量物質のイ
オン交換クロマトグラフイ（非生育培地での研究
のため）により活性物質を得た。等容量の細胞と
抗生物質（又はオートクレーブ処理した抗生物
質）をT0で混合し、各混合物の部分を、0.08時間
間隔で600nmにセツトした自動化ダブルビームス
ペクトロフオトメータ（SP1800、パイ・ユニカ
ム）に保持したキユーベツト中37℃で培養した。
各混合物の残り（37℃で同じく培養）を使つて生
菌数を算えた。バクテリアの顕微鏡による外観を
グラム染色により測定した。 図２は、抗生物質の存在および不存在下、栄養
培地におけるエス．エピデルミデイス（S.
epidermidis）（MF87）の細胞サスペンジヨンの
生菌数および光学密度の変化を示す。抗生物質が
存在しない場合、微生物は生育し、5.25時間培養
後に定常相に達した。しかし、抗生物質が存在す
る場合、生菌数は直ぐに落ち始め、0.17時間後に
初のレベルの10％に減少し、光学密度の減少はな
かつた。その後間もなく、光学密度は落ち始め、
６時間の培養後殆んど零になつた。この点で生菌
数は10微生物ml-1であつた。いつでも対照培養物
のグラム染色フイルムは完全にグラム陽性球菌を
示した。抗生物質含有の培養物は0.17時間後に分
解を始め（グラム陰性細胞、生態不明瞭、細胞外
にグラム陰性物質）、分解度は長期の培養につれ
増大した。４時間培養後、完全な細胞は殆んど残
存しなかつた。 非生育培地では、類似の結果が得られたけれど
も、インヒビターの効果は減少し、0.5時間後に
生菌数は最初のレベルの10％に落ちた（生育倍地
の0.17時間と比較して）。 本発明による培養方法において生産した抗生物
質（低分子量と高分子量の両方）および抗生物質
を回収した粗標品の次のような性質を観察した。 １ プロテアーゼ感受性（低分子量抗生物質の） イオン交換した低分子量抗生物質（1.75mgml-1
タン白含有）はトリプシン（2.5mgml-1）に対し
感受性であるが、サーモリシン（160μｇml-1）、
サブチリシン（650μｇml-1）およびプロナーゼ
（1.5mgml-1）に対し耐性であつた。活性は0.05M
リン酸塩バツフアー中PH6.0で測定した。培養は
37℃／３時間であつた。 ２ 粗製剤（すなわち凍結―解凍抽出物）および
分離した低分子量と高分子量抗生物質の阻止ス
ペクトル 下記の表２は、粗製凍結―解凍抽出物、低分子
量抗生物質および高分子量抗生物質の阻止スペク
トルを示す。これらはセフアデツクスG50につい
て硫酸アンモニウム沈澱物をゲル過により分離
した。 【表】 【表】 活性はグラム陽性菌の阻止に限定した。低分子
量抗生物質のスペクトルは粗製剤の場合と同一で
あつた。高分子量抗生物質は殆んど阻止されなか
つたが、このことは実際のスペクトルの差よりむ
しろその低力価を反映すると考えられる。なぜな
ら阻止されないそれらの微生物は粗製剤に対し最
大の耐性を示したものであつたからであつた。 ３ 粗製剤（すなわち凍結―解凍抽出物）の他の
性質 抗生物質の粗凍結―解凍抽出物の活性に及ぼす
各種処理の影響は次の表３に示す。 【表】 【表】 活性は酸性PHで非常に熱安定性であるから、濃
縮製剤はPH5.0で凍結―解凍抽出物を蒸発させて
得ることができることが判つた。PHが酸性の場
合、阻止活性は４℃で安定であり、37℃でエス．
エピデルミデイス（S.epidermidis）の活性細胞
に吸着された。活性は硫酸ナトリウム（０―50％
飽和）により沈澱した。BHI寒天で生産中、阻
止活性は指示株の製造培養物と生育培地間の寒天
の表面において透析膜（保持制限分子量14000）
を通した。しかし、粗製剤の活性は蒸留水に対す
る透析により合体的に除かれなかつた。分画分子
量10000と30000の限外過膜は18.75―25％の阻
止活性を保持した。膜を通過しうる少なくとも99
％の分子はこの操作により除去されるべきであ
る。これらの結果は、低分子量と高分子量抗生物
質の存在を示している。 ４ エス．エピデルミデイス（S.epidermidis）
NCIB11536に関する抗生物質の活性 高分子量抗生物質はエス．エピデルミデイス
（S.epidermidis）NCIB11536に関し強力な制菌活
性を示し、他方そのような活性は低分子量抗生物
質について観察されないことが判つた。 ５ 低分子量抗生物質のアミノ酸分析 アミノ酸分析の結果、低分子量抗生物質はイソ
ロイシン、フエニルアラニン、アラニン、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸、リジン、グリシンおよ
びプロリンから誘導されるポリペプチドであるこ
とを示している。特に、イソロイシン、フエニル
アラニン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミ
ン酸、リジンおよびプロリンの各々から誘導され
る１ユニツトおよびグリシンから誘導される２ユ
ニツトのアミノ酸組成を示している。当業界で既
知のポリペプチド系抗生物質では、イソロイシン
とフエニルアラニンの存在は実証されなかつた。
しかし、（スー．シー―ワイ）（Hsu，Ｃ―Ｙ）と
ワイズマン，ジイー．エム．（Wiseman，G.M.）
（カナダ．ジヤーナル．マイクロバイオロジイー．
（Can.J.Microbiol.）18（1972）121―５）はアラ
ニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシ
ン、リジンおよびプロリンが存在するエピデルミ
デインス（epidermidins）を報告したが、これら
のエピデルミデインスの作用様式は殺菌性・溶菌
性というより制菌性であることが留意されるべき
である。 ６ 抗生物質の作用様式 粗製剤（すなわち凍結―解凍抽出物）は細胞の
溶解を伴なう殺菌作用を示す。エス．エピデルミ
デイス（S.epidermidis）細胞を低分子量抗生物
質の吸着の主たる効果ではなく、その理由は細胞
の90％以上が溶解が始まる前に死滅したからであ
ることが観察された。活性は非生育培地について
も実証した。 グラム陽性菌に対するその殺菌作用およびその
広スペクトルからみて、本発明に係る低分子量抗
生物質はグラム陽性菌感染、特に皮膚感染の処理
に有用である。この低分子量抗生物質は、感染し
た湿疹、膿湿疹、ねぶと、結合織炎および特に坐
瘡の如き皮膚感染の処理に有用である点に特に興
味ある。多くのピー．アクネス（P.acnes）の指
示株に対する該抗生物質の活性は実証された。皮
膚に常在する微生物により生成される低分子量抗
生物質は通常使用する抗生物質より皮膚に対し一
層安定性が高くかつ活性を有する様である。 本発明の別の側面によれば、グラム陽性菌の感
染、特に〓瘡膿痂疹又は感染湿疹の如き人間のグ
ラム陽性菌皮膚感染を克服するための人体又は動
物の体を処理する方法に使用するために、上記の
ポリペプチド抗生物質又はその酸付加塩を供す
る。 更に別の側面によれば、本発明に係る抗生物質
化合物を活性成分として医薬上の担体又は賦形剤
を含む医薬組成物を供する。 本発明に係る組成物は例えば経口、非経口、腸
内又は局所適用に適した剤型にすることができ
る。局所適用の製剤が望ましく、そのような製剤
は例えば溶液、エマルジヨン、ゲル、ローシヨ
ン、軟膏、クリーム又はパウダーの形でよい。常
法の医薬担体や賦形剤、ならびに通常の製造法を
本発明に係る医薬製剤の製造に使用できる。 本発明の別の側面によれば、本発明に係る抗生
物質化合物を人体又は動物体に適用して、グラム
陽性菌感染を克服する方法を供する。 人体又は動物体の処理法に係る望ましい態様
は、局所用に適した剤型で本発明の医薬組成物を
人間の皮膚に局所適用して、人間の〓瘡、膿痂疹
又は感染湿疹を処理するものである。 エス．エピデルミデイス（S.epidermidis）
NCIB11536株は成人の人体の顔面皮膚から単離
し、クリース，ダブリユー．イー．（Kloos，W.
E.）とシユライフアー．ケー．エイチ．
（Schleifer，K.H.），ジヤーナル．クリニカル．
マイクロバイオロジイー（J.Clin.Microbiol.）、
１（1975）p.82―88の手法により同定した。この
菌株の公知の特徴は次の通りである。 沿 革 最初の着色に関する記述：灰白色、タン白分解性
（チヨコレート寒天）。 単離の日：1976年５月。 源：コーカサス人の男性の顔面の皮膚面、健康な
皮膚（〓瘡ブルガリスなし又は他の皮膚病の
徴候なし）25才令。 貯蔵：40％（ｖ／ｖ）グリセロール／リン酸塩緩
衝塩（PBS）中。 生育条件：流動培養―ブレーンハートインフユー
ジヨン、１晩培養、37℃、好気性。 接種：グリセロール／PBSストツク培養物から
0.1ml（注：長期間貯蔵―凍結乾燥培養物お
よび液体窒素に保持した培養物）。 特性： 【表】 栄養（好気的生育） １ ビタミン要求：ニコチン酸 チアミン ピオチン
（オレイン酸と置換可能） ２ アミノ酸要求：十分に測定しなかつたが、７
アミノ酸含有合成培地に生育する。 ３ 生育に対しグアニン、ウラシル又はアデニン
を要求しない。 抗生物質の感染性 抗生物質の量／デイスク 感染性：アンピシリン 10μg ペニシリンＧ 1unit カルベニシリン 100μg テトラサイクリン 10μg クリンダマイシン 2μg ゲンタマイシン 10μg エリスロマイシン 5μg クロラムフエニコール 25μg フロキソン 50μg ノボピオチン 5μg 本発明の別の側面によれば、望ましくは殺菌培
地中スタフイロコツカス・エピデルミデイス
（Staphylococcus epidermidis）NCIB 11536又
はその変異株を供する。 セルウイン，エス．マーチ，ピー．デイー．
（Selwyn，S.March，P.D.）、およびセスナ，テ
イー，エヌ．（Sethna，T.N.）チモセラピイー
（Chemotherapy）５（1975）391―６の第９回国
際会議により報告された実験によれば、スタフイ
ロコツカス菌はそれらが生育し得る健康な皮膚に
移すことができる。 更に本発明の別の側面によれば、スタフイロコ
ツカス・エピデルミデイス（Staphylococcus
epidermidis）NCIB 11536又はその変異株と殺
菌担体又は賦形剤とを包含する香粧又は予防薬組
成物を供する。 本発明の香粧組成物又は予防薬組成物は皮膚に
局所適用するために適した剤型がよい。 本発明の別の側面によれば、〓瘡、膿痂疹又は
感染湿疹を避けるために人間の皮膚の香粧的又は
予防的処理方法において、本発明に係る香粧組成
物又は予防薬組成物、すなわち本発明に係る抗生
物質を含む香粧組成物又は予防薬組成物と担体又
は賦形剤とを含む香粧組成物又は予防薬組成物を
人間の皮膚に局所適用する方法である。 次の例により本発明を説明する。 微生物 当該抗生物質生産菌エス．エピデルミデイス
（S.epidermidis）NCIB 11536のような指示株エ
ス．エピデルミデイス（S.epidermidis）NF87と
エス．コーニイ（S.cohnii）MF121を成人の顔面
から単離した。この菌株をゴア，エル．エフ．
（Gore L.F.）とウオルシユ，ピー．（Walsh P.）、
ジヤーナル．メデイカル．ラボラトリイー．テク
ノロジイー（J.Med.Lab.Technol.），21（1964），
p.244―246の変法を使つて40％（ｖ／ｖ）グリセ
ロール／PBSに維持した。 培 養 エス．エピデルミデイス（S.epidermidis）
NCIB11536（上記の40％（ｖ／ｖ）グリセロー
ル／PBSに維持したストツク培養物から取つた）
の単離物をBHIブロス中、ブロス10ml当り単離
物0.1mlの量で、オービタル振盪器を使つて37℃
で１晩好気培養した。 こうして得たブロス培養物0.1mlをBHI寒天
（BHIA）プレートに接種した。この培地はデイ
フコラボラトリーズから市販され、培地１当り
次の組成を有する。 カーフブレーンフユージヨン 200ｇ ビーフブレーンフユージヨン 250ｇ プロテオースペプトン，Difco 10ｇ バクト―デキストロース ２ｇ 塩化ナトリウム ５ｇ リン酸二ナトリウム 2.5ｇ 寒天―最終濃度１％（ｖ／ｖ）に添加培地PH
は６である。 37℃の温度で24時間プレートを好気培養し
た。 抗生物質の回収 １ 凍結―解凍抽出 この工程はマクギーチー，ジエイ．
（McGeachie，J.）、ゼントラブル，バクテリオ
ロジイー（Zentrabl，Bakteriol）（Orig Ａ），
196（1965），p.377―384の変法により行なつ
た。培養物を−20℃の温度で１晩貯蔵し、その
後室温で解凍し、そして絞り出した流動液を集
めた。この流動液を４℃／１時間、3000ｇで遠
沈した。こうして得た上澄液を以後粗凍結―解
凍抽出液と呼ぶ。 1a 遠心分離 オービタル振盪器を使つてブレーンハートイ
ンフユージヨンブロス中37℃で48時間好気培養
を行なう別法では、培養したブロスを3000ｇで
30分遠沈し細胞材料を除いた。こうして得た上
澄液を続いて粗凍結―解凍抽出液について記述
した同じ方法で処理した。 ２ 硫酸アンモニウム沈澱 固形の硫酸アンモニウム（アナラー
（analar），（B.D.H.）を粗凍結―解凍抽出液に
加え、30％飽和液を得た。４℃／３時間撹拌し
た後、生成沈澱物（抽出液に存在するタン白質
を若干含有する）を４℃／１時間3000ｇで遠心
除去した。更に50％飽和になるまで固形硫酸ア
ンモニウムを加えた。４℃で１晩撹拌した後、
生成した沈澱物（回収すべき抗生物質を含む）
を上記の様に再度遠心分離した。この２番目の
沈澱物をPH6.0／４℃の0.05Mリン酸塩緩衝液
少量に溶解し、未溶解沈澱物を遠心分離により
除き、更に精製のために上澄液を得た。 ３ イオン交換クロマトグラフイ 硫酸アンモニウム沈澱法により得た上澄液の
試料10mlを、0.05Mリン酸塩緩衝液、PH6.0で
予備平衡させたセフアデツクスＣ―25カチオン
交換カラム（カラム寸法1.5×30cm）に装入し
た。未結合物質は室温で出発緩衝液で溶離し
た。結合物質はその後室温で0.05Mリン酸塩緩
衝液、PH6.0中０―0.5M（400ml）NaClの直線的
に増大するイオン強度勾配を使つて、15mlh-1
の流速で溶離した。高分子量抗生物質は未結合
であり、出発緩衝液で溶離液中で得られた。溶
離中、5.5mlフラクシヨンを集め、低分子量抗
生物質（その阻止活性より同定）を含有した。 ４ ゲル過クロマトグラフイ 低分子量抗生物質を含有するイオン交換クロ
マトグラフイからの極大フラクシヨン10mlを、
0.05Mリン酸塩緩衝液、PH６で予備平衡させた
セフアデツクスG25カラム（2.2×45cm、Vo＝
61.5ml、Vt＝141ml）に装入した。カラムは
0.05Mリン酸塩緩衝液、PH6.0を使い、12mlh-1
の流速で室温で溶離した。低分子量抗生物質
（MF121に対するその阻止活性により同定）を
含む４mlフラクシヨンを集めた。 次の表４は得られた結果を要約するものであ
る： 【表】 タン白試験 上記表および本明細書を通じて、対照として牛
の血清アルブミンを使つて、ローリイ，オー．エ
イチ．，ロスグブラウ，エヌ．ジエイ．，フアー，
エイ．エル．およびランドール，アール．ジエ
イ．（Lowry，O.H.，Rosgbrough，N.J.，Farr，
A.L.およびRondall，R.J.），ジヤーナル．バイオ
ロジイー，ケミストリイー．（J.Biol.Chem.），
193（1951），p.265―275の方法によりタン白質を
評価した。 最小栄養実験 更に本発明の抗生物質の生産を研究するため
に、最小栄養実験を行なつた。これらの実験で
は、菌株エス．エピデルミデイス（S.
epidermidis）NCIB 11536（上記した40％（ｖ／
ｖ）グリセロール／PBSに保持したストツク培
養物から取つた）の単離菌をオービタル振盪器を
使つて37℃／24時間好気培養した。上記の合成培
地（若干の成分を変更し、あるいは濃度を変え
た）中培養を行なつた。上記合成培地に言及し
て、最小栄養実験に対し、リン酸塩含量を200mg
-1NaH2PO4に減じ、PIPESを10000mg
-1MES（２（モルホリノ）エタンスルホン酸）と
置換し、K2HPO4は500mg-1KClと置換し、そ
してグルコース含量は2000mg-1に固定した。最
小栄養実験のベースとしてこの合成培地をとり、
合成培地のアミノ酸含量は培地から各種アミノ酸
を除いていろいろ変えた。合成培地のアミノ酸含
量はエス．エピデルミデイス（S.epidermidis）
NCIB 11536の生育を妨たげずにあるいは本発明
の抗生物質の生産を妨げずに下記の様に減じ得る
ことが判つた。 800mg-1L―アルギニン 400mg-1L―システイン 2000mg-1L―グルタミン酸 400mg-1グリシン 400mg-1L―プロリン 400mg-1L―トリプトフアンおよび 400mg-1L―ヒスチジン。 これらの実験では、全アミノ酸濃度を2800mg
-1から11200mg-1まで上げると、８〜16倍の力
価の増加となつたが、バクテリアの収率にわずか
１％しか上がらなかつた。 これらの結果は、アミノ酸組成が抗生物質の生
産に顕著な影響を有することを示す。 紫外線吸収スペクトル 添付図の第３，４および５図は、エス．エピデ
ルミデイス（S.epidermidis）NCIB 11536の好気
培養により得た低分子量抗生物質の３試料を使
い、200―300nmの吸収範囲で記録したU.V.スペ
クトルを表わす。試料は各々約270―280nmに中
心をもつ弱い吸収極大と約210nmに中心をもつ吸
収極大を示した。第３図と第４図はセフアデツク
スＣ―25カチオン交換カラムで溶離することにイ
オン交換クロマトグラフイに続く抗生物質の試料
のU.V.スペクトルを表わし、夫々256と512ユニ
ツトml-1の力価を示す。第５図はセフアデツクス
Ｇ―25カラムで溶離してゲル過クロマトグラフ
イに続く抗生物質試料のU.V.スペクトルを表わ
す。
epidermidis）NCIB11536から生産することがで
きかつ分子量が950〜10000であるポリペプチド抗
生物質化合物又はその酸付加塩であつて、該化合
物はその分子構造内に式―NH―R1―CO―，―
NH―R2―CO―，―NH―R3―CO―，―NH―
R4―CO―，―NH―R5―CO―，―NH―R6―
CO―，―NH―R7―CO―および
【式】 （式中、NH2―R1―COOH，NH2―R2―
COOH，NH2―R3―COOH，NH2―R4―
COOH，NH2―R5―COOH，NH2―R6―COOH
およびNH2―R7―COOHはそれぞれイソロイシ
ン、フエニルアラニン、アラニン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リジンおよびグリシンを示
し、【式】はプロリンを示す）を 有するアミノ酸誘導体ユニツトから成る、上記抗
生物質化合物。 ２ 分子量が950〜10000であるポリペプチド抗生
物質化合物又はその酸付加塩であつて、その分子
構造内に式―NH―R1―CO―，―NH―R2―CO
―，―NH―R3―CO―，―NH―R4―CO―，―
NH―R5―CO―，―NH―R6―CO―，―NH―
R7―CO―および （式中、NH2―R1―COOH，NH2―R2―
COOH，NH2―R3―COOH，NH2―R4―
COOH，NH2―R5―COOH，NH2―R6―COOH
およびNH2―R7―COOHはそれぞれイソロイシ
ン、フエニルアラニン、アラニン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リジンおよびグリシンを示
し、【式】はプロリンを示す）を 有するアミノ酸誘導体ユニツトから成る、上記抗
生物質化合物の製造法において、スタフイロコツ
カス・エピデルミデイス（Staphylococcus
epidermidis）NCIB11536又はその変異株をその
培地中又は培地面で好気培養し、その後その抗生
物質化合物を採り出すことを特徴とする、上記化
合物の製造法。 ３ 培地にはＬ―アルギニン、Ｌ―システイン、
Ｌ―グルタミン酸、グリシン、Ｌ―プロリン、Ｌ
―トリプトフアンおよびＬ―ヒスチジンを含有す
る、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 抗生物質化合物を回収する場合、菌細胞物質
から分離に続いて、この化合物を硫酸アンモニウ
ムの作用により沈澱させる、特許請求の範囲第２
項又は第３項記載の方法。 ５ 菌細胞物質からの分離を凍結―解凍抽出によ
り行う、特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 硫酸アンモニウムの作用による沈澱に続い
て、抗生物質化合物をイオン交換クロマトグラフ
イにより分別する、特許請求の範囲第４項又は第
６項記載の方法。 ７ スタフイロコツカス・エピデルミデイス（S.
epidermidis）NCIB11536から生産することがで
きかつ分子量が950〜10000であるポリペプチド抗
生物質化合物又はその酸付加塩であつて、該化合
物はその分子構造内に式―NH―R1―CO―，―
NH―R2―CO―，―NH―R3―CO―，―NH―
R4―CO―，―NH―R5―CO―，―NH―R6―
CO―，―NH―R7―CO―および
【式】 （式中、NH2―R1―COOH，NH2―R2―
COOH，NH2―R3―COOH，NH2―R4―
COOH，NH2―R5―COOH，NH2―R6―COOH
およびNH2―R7―COOHはそれぞれイソロイシ
ン、フエニルアラニン、アラニン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リジンおよびグリシンを示
し、【式】はプロリンを示す）を 有するアミノ酸誘導体ユニツトから成る抗生物質
化合物を活性成分として含有し、および担体から
成る、殺菌組成物。 明細書 本発明はポリペプチド系抗生物質、同製造法お
よび殺菌組成物に関する更に本発明は抗生物質を
生産するスタフイロコツカス エピデルミデイス
（Staphylococcus epidermidis）新菌株、この菌
株を含有する組成物およびこの種の組成物により
人間の皮膚を香粧的にあるいは予防的に処理する
方法に関する。この抗生物質はグラム陽性菌に対
して殺菌作用を有する。 スタフイロコツカス菌はは細菌の生育に対し阻
止作用を有する少なくとも３種の物質、すなわち
バクテリオシン、細菌分解性酵素および低分子量
抗生物質を生産することは知られている。スタフ
イロコツカス菌から低分子量抗生物質を生産する
ことが記述されている文献には次のようなものが
ある。 スー，シー―ワイ（HSU，Ｃ―Ｙ）およびワ
イズマン，ジー．エム．（Wiseman，G.M.）、カ
ナダ．ジヤーナル．マイクロバイオロジー
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ジエルヤセビツク，ジエー．（Jeljaszewicz，
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５（1975）、第391―396頁。ジエー．デイー．ウ
イリアムス（J.D.Williams）およびエイ．エム．
ゲツデイス（A.M.Geddes），ニユーヨーク著。 スー，テイ．エル．（Su，T.L.）ブリテイシ
ユ．ジヤーナル．エクスペリメンタル．パソオロ
ジイー．（Br.J.Exp.Pathol.），29（1948），第473
―481頁。 ハルバート，エス．ピー．（Halbert，S.P.），
スイツク，エル．（Swick，L.）およびソン，シ
ー（Sonn，C.），ジヤーナル．イムノロジイー．
（J.Immunol.），70（1953）第400―410頁。 上記文献に記載される低分子量抗生物質はどれ
も菌細胞の分解による殺菌作用を示すこれは実証
されなかつた。 ジヤーナル．メデイカル．マイクロバイオロジ
イー．（J.Med.Microbiol.），12（1979）、第71―
82頁には、プロピオノバクテリウム・アクネス
（Propionobacterium acnes）の単離菌93種およ
びマイクロコツカセス（Micrococcaceae）の単
離菌148種種から成る人間の皮膚に常在する多く
の菌株について、各種指示株であるピー．アクネ
ス（P.acnes）およびスタフイロコツカス・エピ
デルミデイス（Staphylococcus epidermidis）
のその生育阻止能をスクリーンした実験が記載さ
れている。試験したこれらのうち53株が少なくと
も１つの指示株に対し若干の活性を示し、広いス
ペクトルと狭いスペクトル阻止が検出された。実
験した菌株は36人の〓瘡患者と８人の対照者から
とり、研究の主目的は、阻止菌の所持逆に言えば
患者の感受性菌の所持は〓瘡になり易いかどうか
を見出すことであつた。スクリーンされたピー．
アクネス（P.acnes）とマイクロコツカセス
（Micrococcaceae）の特定菌は内部基準による以
外は同定されない。更に、観察された阻止活性物
質の回収について試みられていない。 本発明は、スタフイロコツカス・エピデルミデ
イス（Staphylococcus epidermidis）の特定菌
株すなわちスタフイロコツカス・エピデルミデイ
ス （Staphylococcus epidermidis）NCIB11536
（本菌はナシヨナル・コレクシヨン・オブ・イン
ダストリアル・バクテリア，トレー・リサーチ・
ステーシヨン（National Collection of
Industrial Bacteria，Torrey Research
Station），ピー．オー．ボツクス（P.O.Box）
31，135アベー通り、アバデイーンAB9 8DGに
1979年10月３日寄託されかつ微生物工業技術研究
所の受託番号は第5972号である）を培養して、グ
ラム陰性菌に対し広い抗菌スペクトルを示しかつ
菌細胞の分解による殺菌作用を有する点で、スタ
フイロコツカイ（Staphylococci）により従来生
産される低分子量抗生物質とは区別される新規低
分子量ポリペプチド系抗生物質を生産し得るとい
う知見に基づくものである。 本発明の一側面によれば、10000より多くない
分子量を有しかつグラム陽性菌に対し殺菌・制菌
活性を有するポリペプチド系抗生物質化合物又は
その付加塩を供し、この化合物は分子構造内に次
式のアミノ酸誘導体単位を有する。 ―NH―R1―CO―，―NH―R2―CO―，―
NH―R3―CO―，―NH―R4―CO―，―NH―
R5―CO―，NH―R6―CO―，―NH―R7―CO
―および （式中、NH2―R1―COOH，NH2―R2―
COOH，NH2―R3―COOH，NH2―R4―
COOH，NH2―R5―COOH，NH2―R6―COOH
およびNH2―R7―COOHはそれぞれイソロイシ
ン、フエコルアラニン、アラニン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、リジンおよびグリシンを示
し、【式】はプロリンを示す。 本発明のの抗生物質ポリペプチドの内特に適当
なものは、約950の分子量を有し、かつその分子
構造内に次式のアミノ酸誘導体単位を有する抗生
物質である。 ―NH―R1―CO―，―NH―R2―CO―，―
NH―R3―CO―，―NH―R4―CO―，―NH―
R5―CO―，―NH―R6―CO―，―NH―R7―
CO―および【式】およびさらに― NH―R7―CO― （式中、NH2―R1―COOH，NH2―R2―
COOH，NH2―R3―COOH，NH2―R4―
COOH，NH2―R5―COOH，NH2―R7―COOH
および【式】上記の定義の通りで ある）をアミノ酸誘導体単位。 このポリペプチドのアミノ酸配列又は含量を変
えた場合は、ポリペプチドはその抗生物質性を保
持し得ることは勿論認識すべきである。したがつ
て、上記ポリペプチド系抗生物質およびその付加
塩は、式 ―NH―R1―CO―および―NH―R2―CO―
（式中、NH2―R1―COOHおよびNH2―R2―
COOHは上記定義の通りである）のアミノ酸単
位のものを除いて、１つ又はその以上、適当には
１〜３つの上記アミノ酸誘導体式単位がない場合
又は異なつたアミノ酸から誘導された式単位によ
り置換されている場合、本発明の範囲内に入ると
みなされる。 本発明の別の側面によれば、スタフイロコツカ
ス・エピデルミデイス（Staphylococcus）
epidermidis）NCIB 11536又はその変異株をそ
の培地内で又は培地上で好気的に培養させその後
その抗生物質化合物を回収する工程を包含する、
グラム陽性菌に対し殺菌・制菌活性を有する抗生
物質化合物の製造方法を供する。 本発明の製造法の別法として、個々のペプチド
縮合を継続して、ポリペプチド鎖を段階的に構成
していく非微生物的方法により、本発明のポリペ
プチド抗生物質を製造することが可能である。 本発明方法は適当な無機塩その他の栄養源と共
に炭素源および窒素源をを含有する流動又は固形
培地を使つて行なうことができる。適当な培地は
例えば次のものがある： (i) ブレーンハートインフユージヨン寒天
（BHIA） これはデイフコ・ラボラトリーズ（英国サレ
ー、ウエストモレシイーセントラル通り）より
市販されている培地であり、小牛の脳と牛の心
臓からの浸出物、プロテオースペプトン（デイ
フコ）、バクト―デキストロース、塩化ナトリ
ウムおよびリン酸二ナトリウムを含有する。 (ii) トリプチカーゼソイブロス これはベクトン・デイキンスン・アンド・カ
ンパニイ・リミテツド（Becton Dickinson
＆ Co.Limited）（英国ミドルセツクス、ウエ
ンブリー、エンパイア通り）より市販されてい
る培地であり、カゼインのパンクレアチン消化
物、大豆粉のパパイン消化物、塩化ナトリウム
およびリン酸二ナトリウムを含有する。 (iii) トリプトンンL42／酵母エキスL21培地 これは２重量％のトリプトンL42および１重
量％の酵母エキスL21を含有し、両成分はオキ
ソイドリミテツド（Oxoid Limited）（英国、
ロンドンSE19HF、サウスウオークブリツジ通
り）より市販されている。 (iv) 合成培地 これはグリフイス，シー．ジエー．
（Griffith，C.J.）およびメルビル，テイー．エ
イチ（Melville，T.H.）、アーク．オーラル．
バイオロジイー．（Arch.Oral.Biol.），19
（1974）、p.87―90に記述されている培地であ
り、次の組成を有する： 【表】 【表】 培養工程は好気的に、望ましくはは35〜40℃
で、更には約37℃で約12〜48時間、望ましくは24
〜36時間で行なう。培地の最初のPHは4.5〜７の
範囲でよく、５〜6.5のPHが望ましい。 培養工程の完了後、新しい抗生物質を培地から
回収する。回収工程を行なうのに有用であると判
つた方法は次の通りである。 １ 凍結―解凍抽出 この方法は公知の技術で、例えばマクギーチ
イ，ジエー．（McGeachie J.），ゼントラブル・
バクテリオロジイー（Zentrabl Bakteriol）
（Orig Ａ）、196（1965）、p.377―384に記述され
ている。抽出液を遠心分離して、細菌を除く。得
られた粗凍結―解凍抽出物（必要なら抗生物質の
試験に使用する）を、酢酸セルロース膜フイルタ
ー（孔直径0.45μｍ、オキソイド・リミテツド）
で過して殺菌し、必要なまで４℃で貯蔵するこ
とができる。非殺菌抽出物は−20℃で貯蔵するこ
とができる。 ２ 蒸発 粗凍結―解凍抽出物のPHを蒸発前に酸性にし、
望ましくは10NHClを加えて約PH５にする。新し
い抗生物質の阻止活性は酸性条件下でのみ熱安定
性であるからである。蒸発は減圧下回転エバポレ
ータ（ロタベーパー―イー．エル．Rotavapor―
EL，ブチ，スイス）により90℃で都合よく行な
うことができる。 ３ 限外過 適当な過膜、例えばアミコン・リミテツド，
ハイ・ワイコム，バツキンガムシヤー（Amicon
Limited，High Wycombe，
Buckinghamshire）、英国から市販されているア
ミコンモデル52（能力65ml）を使つて、濃縮又は
透析を陽圧過により行なうことができる。倍容
量の蒸留水で５回透析を行なうのがよい。 ４ 硫酸アンモニウム沈澱 硫酸アンモニウムを25〜30％飽和度を得るため
に、凍結―解凍抽出物に加える。撹拌後、沈澱タ
ン白質を例えば遠沈により除くことができる。上
清液に更に（NH4）2SO4を加えて50〜60％飽和度
にし、続いて撹拌と遠沈を行なう。抗生物質を含
む沈澱物は最小量のバツフアー、例えば0.05Mリ
ン酸塩バツフアー、PH6.0に再懸濁させることが
できる。この精製工程を行なう場合、
（NH4）2SO4を最初に添加し、約30％飽和度を得、
続いて約50％飽和度を得るように添加するのがよ
い。 ５ イオン交換クロマトグラフイ 蒸発又は硫安沈澱により部分的に精製した試料
をセフアデツクスＣ―25カチオン―交換カラムに
充填する。未結合物質は最初のバツフアー、例え
ば0.05Mリン酸塩バツフアー、PH6.0で溶離する。
ついで0.5Mリン酸塩バツフアー、PH6.0中直線的
に増大するイオン強度交配の０〜0.5M（400ml）
NaClを使つて、15mlh-1の流速で溶離することが
でき、5.5mlフラクシヨンを集める。 ６ ゲル過クロマトグラフイ 蒸発、硫安および／又はイオン交換クロマトグ
ラフイにより部分的に精製した試料をセフアデツ
クスＧ―50カラムに充填し、例えば0.05Mリン酸
塩バツフアー、PH6.0で溶離する。必要なら、セ
フアデツクスＧ―25、セフアデツクスＧ―15又は
バイオゲル（Biogel）P2カラムをセフアデツク
スＧ―50カラムの代りに使用することができる。 上記イオン交換工程およびゲル過工程におい
て、本発明の溶離したポリペプチド抗生物質はし
ばしばかなりのNaCl含量をを有することが判つ
た。このことはゲル過媒体（ポリアクリルアミ
ド又はデキストランゲル）に強力に結合させかつ
その解離のために高イオン強度バツフアーの使用
を必要とするポリペプチド内の芳香族残基の高度
カチオン性によりおきる。 したがつて実際上、イオン交換やゲル過クロ
マトグラフイ工程の３つの相互のコンビネーシヨ
ンが、蒸発又は硫酸アンモニウム沈澱により部分
的に精製される試料について操作するために開発
された。 (a) バイオゲルP2又はセフアデツクスG15カラム
による溶離続いてセフアデツクスC25カラムに
よる溶離で食塩含有の高力価を得ること、 (b) セフアデツクスC25カラムによる溶離続いて
セフアデツクスG10カラムによる溶離で低食塩
含量の低力価を得ること、および (c) セフアデツクスG15カラムによる溶離、続い
てセフアデツクスC25カラムによる溶離、セフ
アデツクスG10カラムによる溶離で、高分子量
物質の除去とNaClの除去とを組み合わせるこ
と。 上記精製工程は一例であり、またこれらの工程
は望みのその他の精製工程により置き換えること
もあるいは改良することもできる。例えば、硫酸
アンモニウム沈澱工程をエタノールやアセトンの
如き他の沈澱剤を使う類似の工程により置き換え
ることも可能である。 回収工程は凍結―解凍抽出、硫酸アンモニウム
沈澱、イオン交換クロマトグラフイおよびゲル
過クロマトグラフイを包含することがよい。 凍結―解凍抽出の別法として、更に望ましい回
収工程は、培地を約30分間約3000ｇで遠心分離し
細胞材料を除去し、ついで上澄液を硫酸アンモニ
ウム沈澱させそして凍結―解凍抽出物に対し上記
工程から成る。培養をブレーンハートインフユー
ジヨンブロスで行なう場合にこの方法は特に適し
ている。 イオン交換クロマトグラフイ又はゲル過工程
によつて、２種の抗生物質の分離があることが分
つた。すなわち例えば、硫酸アンモニウム沈澱続
いて上記ゲル過クロマトグラフイにより、選択
された指示株ケータ、エス．エピデルミデイス
（S.epidermidis）（コード番号MF87）およびエ
ス．コーニイー（S.cohnii）（コード番号MF121）
に対する阻止活性の２つのピークが検出された。
阻止活性の定量測定はダヤニとワナメーカー
（DajaniとWannamaker）の方法、ジヤーナル・
バクテリオロジイー（J.Bacteriol.），97（1969），
p.985―991の変法により行なう。抗生物質標品の
連続した２倍稀釈はブレーンンハートインフユー
ジヨン液（凍結―凍抽出法により得た粗標品）か
又は0.05Mリン酸塩バツフアー、PH6.0（カラムフ
ラクシヨン）において0.5ml容量を使つて行なつ
た。各稀釈の0.02ml容量を各指示株の接種板の表
面にスポツトし、乾燥させた。接種板は37℃で６
―７時間好気的に培養させた。指示株の生長密度
の一定の減少をおこす稀釈は終点とみなし、かつ
阻止活性の−ユニツトml-1を含むと考えられた。
添付図面の第１図はゲル過クロマトグラフイに
より得たカラムフラクシヨンについて得た結果を
示し、空容量（void volume）で溶離した最小ピ
ークとゲルにより得た最大ピークがある。第１図
に示した結果は、PH６で0.05Mリン酸塩バツフア
ーと使つてセフアデツクスG50により溶離した硫
酸アンモニウム沈澱インヒビターのものである。
カラムからの全体の活性回収率は84.3％であつ
た。最小ピークは比較的高分子量（多分30000以
上）の物質により得られ、また最大ピークは比較
的低分子量（10000未満）の物質により得られる
ことが分つた。低分子量抗生物質、ポリペプチド
抗生物質の比活性では20倍の増大があつた。
（MF121に対し2.06〜40単位mg-1タン白）が、高
分子量抗生物質では次の表１に示すようにそうで
はなかつた。 【表】 高分子量抗生物質のフラクシヨンは、限外過
により再濃縮するまで、指示株エス・エピデルミ
デイス（S.epidermidis）（MF87）を阻止しなか
つた。カラムから回収した活性の4.0％を示した
に過ぎなかつた。本発明において主な関心のある
抗生物質は、図１の最大ピークによる比較的低分
子量の抗生物質である。 エス．エピデルミデイス（S.epidermidis）
（MF87）に対する本発明に係る低分子量抗生物
質の作用形態は生育培地（BHI）および非生育
培地（リン酸塩バツフアー）において研究され、
この作用形態が制菌性、殺菌性又は溶菌性である
かどうかを決定した。この作用形態の測定のため
に、エス．エピデルミデス（Sepidermidis）
（MF87）を37℃で一晩生育させ、108細胞ml
-1BHI又は0.5Mリン酸塩バツフアー、PH6.0の初
期濃度で基質として使用した。不活性インヒビタ
ーは対照として使用し、121℃／0.25h、PH9.0の
オートクレーブにより得た。PHは使用前6.0に調
整した。蒸発濃縮物のセフアデツクススG50クロ
マトグラフイ（生育培地での研究のため）か又は
セフアデツクスＣ―25に対する低分子量物質のイ
オン交換クロマトグラフイ（非生育培地での研究
のため）により活性物質を得た。等容量の細胞と
抗生物質（又はオートクレーブ処理した抗生物
質）をT0で混合し、各混合物の部分を、0.08時間
間隔で600nmにセツトした自動化ダブルビームス
ペクトロフオトメータ（SP1800、パイ・ユニカ
ム）に保持したキユーベツト中37℃で培養した。
各混合物の残り（37℃で同じく培養）を使つて生
菌数を算えた。バクテリアの顕微鏡による外観を
グラム染色により測定した。 図２は、抗生物質の存在および不存在下、栄養
培地におけるエス．エピデルミデイス（S.
epidermidis）（MF87）の細胞サスペンジヨンの
生菌数および光学密度の変化を示す。抗生物質が
存在しない場合、微生物は生育し、5.25時間培養
後に定常相に達した。しかし、抗生物質が存在す
る場合、生菌数は直ぐに落ち始め、0.17時間後に
初のレベルの10％に減少し、光学密度の減少はな
かつた。その後間もなく、光学密度は落ち始め、
６時間の培養後殆んど零になつた。この点で生菌
数は10微生物ml-1であつた。いつでも対照培養物
のグラム染色フイルムは完全にグラム陽性球菌を
示した。抗生物質含有の培養物は0.17時間後に分
解を始め（グラム陰性細胞、生態不明瞭、細胞外
にグラム陰性物質）、分解度は長期の培養につれ
増大した。４時間培養後、完全な細胞は殆んど残
存しなかつた。 非生育培地では、類似の結果が得られたけれど
も、インヒビターの効果は減少し、0.5時間後に
生菌数は最初のレベルの10％に落ちた（生育倍地
の0.17時間と比較して）。 本発明による培養方法において生産した抗生物
質（低分子量と高分子量の両方）および抗生物質
を回収した粗標品の次のような性質を観察した。 １ プロテアーゼ感受性（低分子量抗生物質の） イオン交換した低分子量抗生物質（1.75mgml-1
タン白含有）はトリプシン（2.5mgml-1）に対し
感受性であるが、サーモリシン（160μｇml-1）、
サブチリシン（650μｇml-1）およびプロナーゼ
（1.5mgml-1）に対し耐性であつた。活性は0.05M
リン酸塩バツフアー中PH6.0で測定した。培養は
37℃／３時間であつた。 ２ 粗製剤（すなわち凍結―解凍抽出物）および
分離した低分子量と高分子量抗生物質の阻止ス
ペクトル 下記の表２は、粗製凍結―解凍抽出物、低分子
量抗生物質および高分子量抗生物質の阻止スペク
トルを示す。これらはセフアデツクスG50につい
て硫酸アンモニウム沈澱物をゲル過により分離
した。 【表】 【表】 活性はグラム陽性菌の阻止に限定した。低分子
量抗生物質のスペクトルは粗製剤の場合と同一で
あつた。高分子量抗生物質は殆んど阻止されなか
つたが、このことは実際のスペクトルの差よりむ
しろその低力価を反映すると考えられる。なぜな
ら阻止されないそれらの微生物は粗製剤に対し最
大の耐性を示したものであつたからであつた。 ３ 粗製剤（すなわち凍結―解凍抽出物）の他の
性質 抗生物質の粗凍結―解凍抽出物の活性に及ぼす
各種処理の影響は次の表３に示す。 【表】 【表】 活性は酸性PHで非常に熱安定性であるから、濃
縮製剤はPH5.0で凍結―解凍抽出物を蒸発させて
得ることができることが判つた。PHが酸性の場
合、阻止活性は４℃で安定であり、37℃でエス．
エピデルミデイス（S.epidermidis）の活性細胞
に吸着された。活性は硫酸ナトリウム（０―50％
飽和）により沈澱した。BHI寒天で生産中、阻
止活性は指示株の製造培養物と生育培地間の寒天
の表面において透析膜（保持制限分子量14000）
を通した。しかし、粗製剤の活性は蒸留水に対す
る透析により合体的に除かれなかつた。分画分子
量10000と30000の限外過膜は18.75―25％の阻
止活性を保持した。膜を通過しうる少なくとも99
％の分子はこの操作により除去されるべきであ
る。これらの結果は、低分子量と高分子量抗生物
質の存在を示している。 ４ エス．エピデルミデイス（S.epidermidis）
NCIB11536に関する抗生物質の活性 高分子量抗生物質はエス．エピデルミデイス
（S.epidermidis）NCIB11536に関し強力な制菌活
性を示し、他方そのような活性は低分子量抗生物
質について観察されないことが判つた。 ５ 低分子量抗生物質のアミノ酸分析 アミノ酸分析の結果、低分子量抗生物質はイソ
ロイシン、フエニルアラニン、アラニン、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸、リジン、グリシンおよ
びプロリンから誘導されるポリペプチドであるこ
とを示している。特に、イソロイシン、フエニル
アラニン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミ
ン酸、リジンおよびプロリンの各々から誘導され
る１ユニツトおよびグリシンから誘導される２ユ
ニツトのアミノ酸組成を示している。当業界で既
知のポリペプチド系抗生物質では、イソロイシン
とフエニルアラニンの存在は実証されなかつた。
しかし、（スー．シー―ワイ）（Hsu，Ｃ―Ｙ）と
ワイズマン，ジイー．エム．（Wiseman，G.M.）
（カナダ．ジヤーナル．マイクロバイオロジイー．
（Can.J.Microbiol.）18（1972）121―５）はアラ
ニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシ
ン、リジンおよびプロリンが存在するエピデルミ
デインス（epidermidins）を報告したが、これら
のエピデルミデインスの作用様式は殺菌性・溶菌
性というより制菌性であることが留意されるべき
である。 ６ 抗生物質の作用様式 粗製剤（すなわち凍結―解凍抽出物）は細胞の
溶解を伴なう殺菌作用を示す。エス．エピデルミ
デイス（S.epidermidis）細胞を低分子量抗生物
質の吸着の主たる効果ではなく、その理由は細胞
の90％以上が溶解が始まる前に死滅したからであ
ることが観察された。活性は非生育培地について
も実証した。 グラム陽性菌に対するその殺菌作用およびその
広スペクトルからみて、本発明に係る低分子量抗
生物質はグラム陽性菌感染、特に皮膚感染の処理
に有用である。この低分子量抗生物質は、感染し
た湿疹、膿湿疹、ねぶと、結合織炎および特に坐
瘡の如き皮膚感染の処理に有用である点に特に興
味ある。多くのピー．アクネス（P.acnes）の指
示株に対する該抗生物質の活性は実証された。皮
膚に常在する微生物により生成される低分子量抗
生物質は通常使用する抗生物質より皮膚に対し一
層安定性が高くかつ活性を有する様である。 本発明の別の側面によれば、グラム陽性菌の感
染、特に〓瘡膿痂疹又は感染湿疹の如き人間のグ
ラム陽性菌皮膚感染を克服するための人体又は動
物の体を処理する方法に使用するために、上記の
ポリペプチド抗生物質又はその酸付加塩を供す
る。 更に別の側面によれば、本発明に係る抗生物質
化合物を活性成分として医薬上の担体又は賦形剤
を含む医薬組成物を供する。 本発明に係る組成物は例えば経口、非経口、腸
内又は局所適用に適した剤型にすることができ
る。局所適用の製剤が望ましく、そのような製剤
は例えば溶液、エマルジヨン、ゲル、ローシヨ
ン、軟膏、クリーム又はパウダーの形でよい。常
法の医薬担体や賦形剤、ならびに通常の製造法を
本発明に係る医薬製剤の製造に使用できる。 本発明の別の側面によれば、本発明に係る抗生
物質化合物を人体又は動物体に適用して、グラム
陽性菌感染を克服する方法を供する。 人体又は動物体の処理法に係る望ましい態様
は、局所用に適した剤型で本発明の医薬組成物を
人間の皮膚に局所適用して、人間の〓瘡、膿痂疹
又は感染湿疹を処理するものである。 エス．エピデルミデイス（S.epidermidis）
NCIB11536株は成人の人体の顔面皮膚から単離
し、クリース，ダブリユー．イー．（Kloos，W.
E.）とシユライフアー．ケー．エイチ．
（Schleifer，K.H.），ジヤーナル．クリニカル．
マイクロバイオロジイー（J.Clin.Microbiol.）、
１（1975）p.82―88の手法により同定した。この
菌株の公知の特徴は次の通りである。 沿 革 最初の着色に関する記述：灰白色、タン白分解性
（チヨコレート寒天）。 単離の日：1976年５月。 源：コーカサス人の男性の顔面の皮膚面、健康な
皮膚（〓瘡ブルガリスなし又は他の皮膚病の
徴候なし）25才令。 貯蔵：40％（ｖ／ｖ）グリセロール／リン酸塩緩
衝塩（PBS）中。 生育条件：流動培養―ブレーンハートインフユー
ジヨン、１晩培養、37℃、好気性。 接種：グリセロール／PBSストツク培養物から
0.1ml（注：長期間貯蔵―凍結乾燥培養物お
よび液体窒素に保持した培養物）。 特性： 【表】 栄養（好気的生育） １ ビタミン要求：ニコチン酸 チアミン ピオチン
（オレイン酸と置換可能） ２ アミノ酸要求：十分に測定しなかつたが、７
アミノ酸含有合成培地に生育する。 ３ 生育に対しグアニン、ウラシル又はアデニン
を要求しない。 抗生物質の感染性 抗生物質の量／デイスク 感染性：アンピシリン 10μg ペニシリンＧ 1unit カルベニシリン 100μg テトラサイクリン 10μg クリンダマイシン 2μg ゲンタマイシン 10μg エリスロマイシン 5μg クロラムフエニコール 25μg フロキソン 50μg ノボピオチン 5μg 本発明の別の側面によれば、望ましくは殺菌培
地中スタフイロコツカス・エピデルミデイス
（Staphylococcus epidermidis）NCIB 11536又
はその変異株を供する。 セルウイン，エス．マーチ，ピー．デイー．
（Selwyn，S.March，P.D.）、およびセスナ，テ
イー，エヌ．（Sethna，T.N.）チモセラピイー
（Chemotherapy）５（1975）391―６の第９回国
際会議により報告された実験によれば、スタフイ
ロコツカス菌はそれらが生育し得る健康な皮膚に
移すことができる。 更に本発明の別の側面によれば、スタフイロコ
ツカス・エピデルミデイス（Staphylococcus
epidermidis）NCIB 11536又はその変異株と殺
菌担体又は賦形剤とを包含する香粧又は予防薬組
成物を供する。 本発明の香粧組成物又は予防薬組成物は皮膚に
局所適用するために適した剤型がよい。 本発明の別の側面によれば、〓瘡、膿痂疹又は
感染湿疹を避けるために人間の皮膚の香粧的又は
予防的処理方法において、本発明に係る香粧組成
物又は予防薬組成物、すなわち本発明に係る抗生
物質を含む香粧組成物又は予防薬組成物と担体又
は賦形剤とを含む香粧組成物又は予防薬組成物を
人間の皮膚に局所適用する方法である。 次の例により本発明を説明する。 微生物 当該抗生物質生産菌エス．エピデルミデイス
（S.epidermidis）NCIB 11536のような指示株エ
ス．エピデルミデイス（S.epidermidis）NF87と
エス．コーニイ（S.cohnii）MF121を成人の顔面
から単離した。この菌株をゴア，エル．エフ．
（Gore L.F.）とウオルシユ，ピー．（Walsh P.）、
ジヤーナル．メデイカル．ラボラトリイー．テク
ノロジイー（J.Med.Lab.Technol.），21（1964），
p.244―246の変法を使つて40％（ｖ／ｖ）グリセ
ロール／PBSに維持した。 培 養 エス．エピデルミデイス（S.epidermidis）
NCIB11536（上記の40％（ｖ／ｖ）グリセロー
ル／PBSに維持したストツク培養物から取つた）
の単離物をBHIブロス中、ブロス10ml当り単離
物0.1mlの量で、オービタル振盪器を使つて37℃
で１晩好気培養した。 こうして得たブロス培養物0.1mlをBHI寒天
（BHIA）プレートに接種した。この培地はデイ
フコラボラトリーズから市販され、培地１当り
次の組成を有する。 カーフブレーンフユージヨン 200ｇ ビーフブレーンフユージヨン 250ｇ プロテオースペプトン，Difco 10ｇ バクト―デキストロース ２ｇ 塩化ナトリウム ５ｇ リン酸二ナトリウム 2.5ｇ 寒天―最終濃度１％（ｖ／ｖ）に添加培地PH
は６である。 37℃の温度で24時間プレートを好気培養し
た。 抗生物質の回収 １ 凍結―解凍抽出 この工程はマクギーチー，ジエイ．
（McGeachie，J.）、ゼントラブル，バクテリオ
ロジイー（Zentrabl，Bakteriol）（Orig Ａ），
196（1965），p.377―384の変法により行なつ
た。培養物を−20℃の温度で１晩貯蔵し、その
後室温で解凍し、そして絞り出した流動液を集
めた。この流動液を４℃／１時間、3000ｇで遠
沈した。こうして得た上澄液を以後粗凍結―解
凍抽出液と呼ぶ。 1a 遠心分離 オービタル振盪器を使つてブレーンハートイ
ンフユージヨンブロス中37℃で48時間好気培養
を行なう別法では、培養したブロスを3000ｇで
30分遠沈し細胞材料を除いた。こうして得た上
澄液を続いて粗凍結―解凍抽出液について記述
した同じ方法で処理した。 ２ 硫酸アンモニウム沈澱 固形の硫酸アンモニウム（アナラー
（analar），（B.D.H.）を粗凍結―解凍抽出液に
加え、30％飽和液を得た。４℃／３時間撹拌し
た後、生成沈澱物（抽出液に存在するタン白質
を若干含有する）を４℃／１時間3000ｇで遠心
除去した。更に50％飽和になるまで固形硫酸ア
ンモニウムを加えた。４℃で１晩撹拌した後、
生成した沈澱物（回収すべき抗生物質を含む）
を上記の様に再度遠心分離した。この２番目の
沈澱物をPH6.0／４℃の0.05Mリン酸塩緩衝液
少量に溶解し、未溶解沈澱物を遠心分離により
除き、更に精製のために上澄液を得た。 ３ イオン交換クロマトグラフイ 硫酸アンモニウム沈澱法により得た上澄液の
試料10mlを、0.05Mリン酸塩緩衝液、PH6.0で
予備平衡させたセフアデツクスＣ―25カチオン
交換カラム（カラム寸法1.5×30cm）に装入し
た。未結合物質は室温で出発緩衝液で溶離し
た。結合物質はその後室温で0.05Mリン酸塩緩
衝液、PH6.0中０―0.5M（400ml）NaClの直線的
に増大するイオン強度勾配を使つて、15mlh-1
の流速で溶離した。高分子量抗生物質は未結合
であり、出発緩衝液で溶離液中で得られた。溶
離中、5.5mlフラクシヨンを集め、低分子量抗
生物質（その阻止活性より同定）を含有した。 ４ ゲル過クロマトグラフイ 低分子量抗生物質を含有するイオン交換クロ
マトグラフイからの極大フラクシヨン10mlを、
0.05Mリン酸塩緩衝液、PH６で予備平衡させた
セフアデツクスG25カラム（2.2×45cm、Vo＝
61.5ml、Vt＝141ml）に装入した。カラムは
0.05Mリン酸塩緩衝液、PH6.0を使い、12mlh-1
の流速で室温で溶離した。低分子量抗生物質
（MF121に対するその阻止活性により同定）を
含む４mlフラクシヨンを集めた。 次の表４は得られた結果を要約するものであ
る： 【表】 タン白試験 上記表および本明細書を通じて、対照として牛
の血清アルブミンを使つて、ローリイ，オー．エ
イチ．，ロスグブラウ，エヌ．ジエイ．，フアー，
エイ．エル．およびランドール，アール．ジエ
イ．（Lowry，O.H.，Rosgbrough，N.J.，Farr，
A.L.およびRondall，R.J.），ジヤーナル．バイオ
ロジイー，ケミストリイー．（J.Biol.Chem.），
193（1951），p.265―275の方法によりタン白質を
評価した。 最小栄養実験 更に本発明の抗生物質の生産を研究するため
に、最小栄養実験を行なつた。これらの実験で
は、菌株エス．エピデルミデイス（S.
epidermidis）NCIB 11536（上記した40％（ｖ／
ｖ）グリセロール／PBSに保持したストツク培
養物から取つた）の単離菌をオービタル振盪器を
使つて37℃／24時間好気培養した。上記の合成培
地（若干の成分を変更し、あるいは濃度を変え
た）中培養を行なつた。上記合成培地に言及し
て、最小栄養実験に対し、リン酸塩含量を200mg
-1NaH2PO4に減じ、PIPESを10000mg
-1MES（２（モルホリノ）エタンスルホン酸）と
置換し、K2HPO4は500mg-1KClと置換し、そ
してグルコース含量は2000mg-1に固定した。最
小栄養実験のベースとしてこの合成培地をとり、
合成培地のアミノ酸含量は培地から各種アミノ酸
を除いていろいろ変えた。合成培地のアミノ酸含
量はエス．エピデルミデイス（S.epidermidis）
NCIB 11536の生育を妨たげずにあるいは本発明
の抗生物質の生産を妨げずに下記の様に減じ得る
ことが判つた。 800mg-1L―アルギニン 400mg-1L―システイン 2000mg-1L―グルタミン酸 400mg-1グリシン 400mg-1L―プロリン 400mg-1L―トリプトフアンおよび 400mg-1L―ヒスチジン。 これらの実験では、全アミノ酸濃度を2800mg
-1から11200mg-1まで上げると、８〜16倍の力
価の増加となつたが、バクテリアの収率にわずか
１％しか上がらなかつた。 これらの結果は、アミノ酸組成が抗生物質の生
産に顕著な影響を有することを示す。 紫外線吸収スペクトル 添付図の第３，４および５図は、エス．エピデ
ルミデイス（S.epidermidis）NCIB 11536の好気
培養により得た低分子量抗生物質の３試料を使
い、200―300nmの吸収範囲で記録したU.V.スペ
クトルを表わす。試料は各々約270―280nmに中
心をもつ弱い吸収極大と約210nmに中心をもつ吸
収極大を示した。第３図と第４図はセフアデツク
スＣ―25カチオン交換カラムで溶離することにイ
オン交換クロマトグラフイに続く抗生物質の試料
のU.V.スペクトルを表わし、夫々256と512ユニ
ツトml-1の力価を示す。第５図はセフアデツクス
Ｇ―25カラムで溶離してゲル過クロマトグラフ
イに続く抗生物質試料のU.V.スペクトルを表わ
す。
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