DK149125B - 6-(d-(-)alfa-amino-alfa-(p-acetoxyphenyl)acetamido)penicillansyre til anvendelse som mellemprodukt - Google Patents

Description

149125

Den foreliggende opfindelse angår den hidtil ukendte forbindelse 6-[D-(-)a-amino-α-(p-acetoxyphenyl)acetamiao]penicillansyre med formlen jø~\_ /s\/ch3 ch3-co-oy- CH-CO-NH —I-f

NH2 ^-N -*—COOH

til anvendelse som mellemprodukt ved fremstilling af 6-[D-(-)-a-amino-ot-(p-hydroxyphenyl) acetamido]penicillansyre (også kendt som amoxycillin eller p-hydroxyampicillin), hydrat eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

149125 2

Amoxycillin, som har formlen OH J '\_CH-CO- NH —_fy^^S\y'CE3 x^/ I I ^ch3

'-' NH2 J-N__COOH

cr er en kendt, antibiotisk aktiv forbindelse, som hidtil er blevet fremstillet ved behandling af 6-aminopenicillansyre med et acyleringsmiddel i form af et reaktionsdygtigt funktionelt derivat af sidekædesyren.

Det har nu vist sig, at denne værdifulde penicillin kan fremstilles ved behandling af den tilsvarende p-acetoxyforbindelse med visse esteraser, og opfindelsen bygger på denne erkendelse

Det er kendt at spalte forskellige kemiske bindingstyper ved hjælp af esteraser, f.eks. en imid-binding i 6-sidekæden i en penicillin, jfr. dansk patentansøgning nr. 534/68, og en oxygenbinding i en O-acetylgrup'pe i en cephalosporins 3-stilling, jfr. dansk patentansøgning nr. 3338/71 og dansk patent nr. 108.006. Der er imidlertid her tale om bindingstyper, der ikke er kemisk analoge med den binding for en O-acetylgruppe, som fraspaltes i mellemproduktet ifølge den foreliggende opfindelse.

Omdannelsen af mellemproduktet ifølge opfindelsen til amoxycillin, hydrat eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, sker ved, at man behandler 6-[D-(-)a-amino-α-(p-acetoxyphenyl)acetamido]-penicillansyre i vandig opløsning med esterase fra menneskeserum eller hvedeklid eller citrusesterase ved en pH-værdi mellem ca. 5,0 og ca. 7,5, isolerer produktet på i og for sig kendt måde, og om ønsket på i og for sig kendt måde omdanner produktet i form af den frie syre eller hydrat til det tilsvarende farmaceutisk acceptable salt deraf.

Ifølge et foretrukket udførelseseksempel anvender man som esterase kommercielt, groft hvedeklid, hvorhos behandlingen i vandig opløsning gennemføres ved en pH-værdi mellem 5,5 og 6,0 eller eventuelt i nærværelse af en puffer ved en pH-værdi på 7,0 ved en koncentration på ca. 10 mg/ml esterase pr. samlet volumen af opløsning.

3 149125

De ovennævnte farmaceutisk acceptable salte omfatter de ikke-toxi-ske carboxylsyresalte, f.eks. ikke-toxiske metalsalte, såsom natrium-, kalium-, calcium- og aluminiumsaltet, ammoniumsaltet og -saltene med ikke-toxiske aminer, f.eks. trialkylaminer, procain, dibenzylamin, N-ben zy1-β-phenethy1amiη, 1-ephenamin, Ν,Ν'-dibenzylethylendiamin, N-alkylpiperidin og andre aminer, der anvendes til at danne salte af penicilliner. Endvidere omfatter definitionen af farmaceutisk acceptable salte de ikke-toxiske syreadditionssalte (aminsalte), f.eks. salte med mineralsyrer, såsom hydrogenchlorid-, hydrogenbromid-, hydrogen-iodid-, phosphor- og svovlsyre samt salte med organiske syrer, såsom malein-, eddike-, citron-, oxal-, rav-, benzoe-, vin-, fumar-, mandel-, ascorbin- og æblesyre.

6-[D-(-)a-amino-α-(p-acetoxyphenyl)acetamido]penicillansyre kan fremstilles ved, at man omsætter 6-D-aminopenicillansyre eller en silylester eller et salt deraf med et acylerende middel med formlen « /~Λ

CH3 - c - 0-C y- CH - COOH

NHB

hvori B betegner en aminobeskyttende gruppe, og fjerner den amino-beskyttende gruppe. Silylestrene kan fremstilles ved hjælp af metoder, der er beskrevet i litteraturen, f.eks. USA patentskrift nr. 3.249.622. Silylestergruppen kan fjernes efter acyleringsreaktionen ved hydrolyse.

Eksempler på egnede aminobeskyttende grupper omfatter t-butoxy-carbonyl, carbobenzyloxy, 2-ethoxycarbonyl-l-methylvinyl og 2-methoxy-carbonyl-l-methylvinyl. En særligt værdifuld blokerende gruppe er en proton, som i forbindelsen med formlen CH3 - C - 0 J~\ CH - C0C1 NH2 , HCl .

F.eks. kan denne gruppe let fjernes efter acyleringen ved neutrali sering .

4 M9125

De særlige reaktionsbetingelser, f.eks. temperatur, opløsningsmiddel, reaktionstid, o.s.v., som udvælges til acyleringen, bestemmes af den anvendte acyleringsmetodes art og er velkendte for fagmanden. I almindelighed er det værdifuldt at tilsætte en organisk tertiær amin, f.eks. triethylamin, Ν,Ν-dimethylanilin, ethylpiperidin, 2,6-lutidin eller quinolin, der tjener som proton-acceptor eller saltdannende middel.

De følgende eksempler belyser fremstillingen af mellemproduktet ifølge opfindelsen og dettes omdannelse.

Udgangsmaterialer I. Fremstilling af D(-)a-amino-a-(p-acetoxyphenyl)eddikesyre Fremgangsmåde A (i eddikesyre som opløsningsmiddel) 203,5 g (1 mol) D(-)p-hydroxyphenylglycinhydrochlorid, 800 ml eddikesyre og 314 g (4 mol) acetylchlorid omrørtes i 48 timer ved stuetemperatur. Det faste stof opsamledes, udvaskedes 3 gange med acetone (3 x 250 ml) og 2 gange med ethanol ( 2 x 250 ml) og tørredes ved 40°. Udbytte 210 g (85,4%). Dette hydrochlorid opløstes i 3,0 liter vand; opløsningen afkøledes til +5 - 10°C, og pH-værdien indstilledes på 4,5 med 20% NH^OH. Suspensionen omrørtes i 1 time ved 5°C, og det faste stof opsamledes, udvaskedes 2 gange med vand og 2 gange med acetone og tørredes ved 40°C. Udbytte 133 g (64% fra D(-)p-hydroxyphenylglycin). aD (1% HG1 N/10 = -104,5.

Fremgangsmåde B (i methylenchlorid) 4,07 g (0,02 mol) D(-)p-hydroxyphenylglycinhydrochlorid, 30 ml methylenchlorid og 6,28 g (0,08 mol) acetylchlorid omrørtes i 48 timer ved stuetemperatur. Det faste stof opsamledes, udvaskedes 2 gange med acetone og 2 gange med ethanol. Udbytte 4,17 g (84,5%).

Analyse beregnet Cl = 14,8 (beregnet syre)

Fremgangsmåde C (i trifluoreddikesyre) 1,67 g (0,01 mol) D(-)p-hydroxyphenylglycin sattes under omrøring til 10 ml trifluoreddikesyre ved stuetemperatur. Efter opløsning tilsattes 1,57 g (0,02 mol) acetylchlorid. Efter en let exoterm reaktion kom et fast stof. Suspensionen omrørtes 1,5 time ved stuetemperatur, og trifluoreddikesyren fjernedes i vakuum. Det tilbageblevne faste stof opsamledes, udvaskedes med·methylenchlorid og med ethanol. D(-)a- 149125 5 amino-α-(p-acetoxyphenyl^eddikesyren var identisk med den ifølge fremgangsmåderne A og B fremstillede.

Udbytte: 1,9 g (75%).

11 Fremstilling af D(-)a-amino-a-(p-acetoxyphenvl)acetvl-_chloridhydrochlorid 83,6 g (0,40 mol) D(-)a-amino-a-(p-acetoxyphenyl)eddikesyre og 1,25 liter vandfri methylenchlorid afkøledes til -5°C under omrøring. Dernæst tilsattes langsomt 152 g phosphorpentachlorid efterfulgt af 4 ml dime thy1formamid. Blandingen omrørtes i 4 timer ved 0°C. Det faste stof opsamledes, udvaskedes méd vandfri methylenchlorid og vakuumtørredes ved stuetemperatur.

Udbytte; 61 g (57,5%)

Analyse. Total chlor = 27,2% (teoretisk 26,9%) III_Fremstilling af 6- [D- (-) ot-amino-a- (p-acetoxyphenyl) acetamido] -_peniciliansyre

Fremgangsmåde A. Vandfri:proces.

15,27 g (0,071 mol) 6-APA omrørtes i 500 ml vandfri methylenchlorid, 120 ml methylenchlorid afdestilleredes og 11,8 ml hexamethyldisi-lan tilsattes. Blandingen:omrørtes og tilbagesvaledes i 20 timer (efter ca. 10 til ca. 15 timers forløb var al 6-APA gået i opløsning). Ovennævnte opløsning afkøledes til 0°C, og 120 ml methylenchlorid tilsattes efterfulgt af 9,5 ml dimethylanilin og 7 ml af en opløsning af dimethylanilinhydrochlorid i methylenchlorid (30%). Dernæst tilsattes 20 g (0,0756 mol) D(-)a-amino-a-(p-acetoxyphenyl)acetylchlorid,hydro- o chlorid i små portioner ( ca. 1 1/2 time) ved +20 C og henstod i ca.

12 til ca. 18 timer ved +5°C. Dernæst tilsattes 5 ml methanol efterfulgt af 240 ml vand. pH-værdien indstilledes på 2,5 med triethylamin, og blandingen filtreredes gennem en "Celite"-pude; pH-værdien kontrolle-redes dernæst, og den vandige fase fraskiltes, udvaskedes 2 gange (2 x 150 ml) med methylenchlorid og behandledes med trækul. Opløsningen indstilledes på pH-værdi 4,5 og vakuumkoncentreredes til et volumen på ca. 150 ml. Suspensionen henstod i ca. 12 til ca. 18 timer ved +5°C, og det faste stof opsamledes og udvaskedes med vand og acetone og tørredes ved 40°C til opnåelse af titelforbindelsen, i det væsentlige uden indhold af L-(+) isomeren.

Udbytte = ca. 30% (af et 85-90% rent materiale). aD (0,5% HC1 N/10) = +205,5 149125 6

Elementæranalyse for ét trihydrat

Teoretisk Fundet C 46,85 47,17 H 5,89 5,72 N 9,10 9,02 S 6,93 7,27 H20 11,7 11,33 (KF) og 10,77 (T G A) NMR er i overensstemmelse med den formodede struktur, lodometrisk afprøvning (overfor ampiciHinstandard) = 738 ^ug/ml

Fremgangsmåde B. Våd proces.

10,8 g (0,05 mol) 6-APA opløstes i 45 ml vand og 11,7 ml HC1 6Nj 300 ml acetone tilsattes, og blandingen afkøledes til -5°C. Dernæst tilsattes 7,4 g (0,028 mol) D(-)a-amino-a-(p-acetoxyphenyl)acetylchlo-ridhydrochlorid i små portioner, og pH-værdien holdtes konstant på 1,4 - 1,6 ved tilsætning af triethylamin.

Den anden fraktion af chloridhydrochlorid tilsattes ved pH-værdi 1/2 - 1,4. Efter 1 times forløb ved -5°C fjernedes acetonen i vakuum, og opløsningens pH—værdi indstilledes pa 4,3 — 4,5. Det faste materia— le opsamledeso£ kasseredes· Modervæskerne podedes og henstod til udkrystallisation ca. 12 til ca. 18 timer ved +5°C. RN 1395 opsamledes, udvaskedes grundigt med en lille smule vand og med acetone og tørredes ved 40°C. Udbytte: 2,0 g (9%). Det opnåede produkt var identisk med det ved fremgangsmåde A fremstillede.

Eksempel 3»

Opløsninger af 0,5 mg/ml 6-[D-(-)a-amino-α-(p-acetoxyphenyl)acetami-do]penicillansyre (p-acetoxyampicillin) i normal saltopløsning og i menneskeserum fremstilledes. Standardopløsninger af 0,5 mg/ml 6-[D-(-)a-amino-α-(p-hydroxyphenyl)acetamido]penicillansyre (p-hydroxyampicillin) fremstilledes ligeledes i såvel normal saltopløsning som menneskeserum.

Alle de ovennævnte opløsninger inkuberedes ved 37°C med omrystning og prøver udtoges til kroraatografering efter 0, 2, 4, 8 og 24 timers forløb·. Opløsningerne i en mængde på ca. 5 mikroliter pr. strimmel anbragtes i form af pletter på Whatman nr. 1 strimler (ca. 12,7 mm), der tørredes og udvikledes i et opløsningsmiddelsystem indeholdende 80 dele butylacetat, 15 dele n-butanol, 40 dele eddikesyre og 24 dele vand. Dernæst bioautograferedes strimlerne på plader podet med bacillus subtilus ved en pH-værdi på 6,0.

Biokromatogrammerne viste, at p-acetoxyampicillin hydrolyseres hurtigt til p-hydroxyformen i menneskeserum, men synes at være stabil i normal saltopløsning.

7 149125

Eksempel 2 Følgende opløsninger fremstilledes: 0,5 mg/ml 6- [D- (-) ct-amino-α- (p-acetoxyphenyl) acetamido] penicillan-syre (p-acetoxyampicillin) i saltopløsning; 0,5 mg/ml p-acetoxyampicillin i en opløsning af citrus-esterase fortyndet 10 gange med 0,1 M kaliumphosphatpuffer til opretholdelse af en pH-værdi på 7,0; og 0,5 mg/ml p-acetoxyampicillin i en 10 mg/ml opløsning af groft » hvedeklid (Shiloh) indeholdende 0,1« kaliumphosphatpuffer.

Alle de ovennævnte opløsninger inkuberedes ved 37°C med omrystning, og prøver udtoges til kromatografering som beskrevet i eksempel 1.

Disse biokromatogrammer viste, at p-acetoxyampicillin er stabil i saltopløsning, men hydrolyseres hurtigt til p-hydroxyformen med både citrus-esterase og klid-esterase.

Eksempel 3 Følgende reaktionsblandinger fremstilledes, omrystedes ved 28°C og prøver udtoges efter 0, 1/2, 1, 2, 3, 4 og 6 timer som beskrevet i eksempel 1· 1. 25 mg affedtet klid (hvedeklid opnået fra Shiloh, behandlet med acetone og tørret), 4,5 ml 0,1 M, pH 6,0, kaliumphosphatpuffer og 0,5 ml 5 mg/ml 6-[D-(-)a-amino-a-(p-acetoxyphenyl)acetamido]penicillansyre (p-acetoxyampicillin) i samme puffer.

2. 25 mg affedtet klid, 4,5 ml 0,1 Mi pH 7,0, kaliumphosphatpuffer og 0,5 ml 5 mg/ml p-acetoxyampic.illin i samme puffer.

3. 25 mg affedtet klid, 4,5 ml 0,1 M, pH 7,5, kaliumphosphatpuffer •og 0,5 ml 5 mg/ml p-acetoxyampicillin i samme puffer.

4. 50 mg affedtet klid, 4,5 ml 0,1 M, pH 6,0, kaliumphosphatpuffer og 0,5 ml 5 mg/ml p-acetoxyampicillin i samme puffer.

5. 50 mg affedtet klid, 4,5 ml 0,1 M, pH 7,0, kaliumphosphatpuffer og 0,5 ml 5 mg/ml p-acetoxyampicillin i samme puffer.

6. 50 mg affedtet klid, 4,5 ml 0,1 M, pH 7,5, kaliumphosphatpuffer og 0,5 ml 5 mg/ml p-acetoxyampicillin i samme puffer.

Resultaterne af biokromatogrammerne er vist i tabel I.

Q 149125 o

Tabol I

% omdannelse til p-hydroxyampicillin Reaktionstid (timer)

Reaktionsnummer 0 1/2 12346 1 12 23 32 64 100 91 95 % 2 11 34 45 68 120 75 77 % 3 11 32 39 45 68 75 98 % 4 9 32 55 59 80 80 77 % 5 14 34 64 109 131 104 104 % 6 16 66 66 91 98 116 86 %

Optimale resultater:opnås således ved anvendelse af reaktionsblanding nr. 5, hvor den totale omdannelse til p-hydroxyampicillin er afsluttet på 2 timer ved en enzymkoncentration på 10 mg/ml og ved en pH-værdi på 7,0.

Eksempel 4 Følgende reaktionsblanding fremstilledes indeholdende 50 mq affedtet klid (Shiloh) 2,5 mg ‘6- [D-(-) oi-amino-α- (p-acetoxyphenyl) aceta-mido] penicillansyre (p-acetoxyampicillin) og 5,0 ml vand. Blandingen rystedes ved ca. 28°C og bestemtes kromatografisk efter 1, 2 og 3 timer, som beskrevet i eksempel 1.

Resultaterne af biokromatogrammerne viste 100% omdannelse af p-acetoxyampicillin til p-hydroxyampicillin på 3 timer. Reaktionsblandingens pH-værdi holdt sig konstant på ca. 5,7 trods den manglende tilstedeværelse af puffer.

Eksempel 5 Følgende materialer forenedes: 20 g affedtet klid (Shiloh) 1,0 g 6-[D-(-)a-amino-a-(p-acetoxyphenyl)acetamido]penicillansyre (p-ace-toxyampicillin) og 2 liter af en 0,01 M vandig opløsning af pH 7,0 ka-liumphosphatpuffer. Den resulterende blanding omrørtes ved ca. 28°C, og prøver udtoges hver time som beskrevet i eksempel 1.

Biokromatogramundersøgelserne viste 100% omdannelse på 3 timer. Dernæst centrifugeredes blandingen. Den ovenstående væske opsamledes, indstilledes på en pH-værdi 4,0 med saltsyre og lyofiliseredes. Lyofi-latet undersøgtes igen som beskrevet ovenfor og viste sig at indeholde ca. 900 mg p-hydroxyampicillin.

6,0 g af lyofilatet opslæmmedes i 20 ml vand. Til den resulterende blanding sattes 6N saltsyre til gradvis sænkning af pH-værdien til 2,0. Omrøringen fortsattes i yderligere 15 minutter, efterfulgt af