DK149821B - Fremgangsmaade til udvinding af enzymer fra en blanding opnaaet ved behandling af enzymholdige mikroorganismeceller - Google Patents

Description

149821 i ο

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til udvinding af enzymer fra en blanding opnået ved behandling af en-zymholdige mikroorganismeceller, ved hvilken enzymerne opløseliggøres.

5 Fast stof-væske-adskillelsen til adskillelse af cellerester eller celler fra enzymopløsninger er stadig et teknisk problem, navnlig når der skal behandles store rumfang. Konventionelle metoder til sådanne adskillelser er centrifugering og filtrering. Begge metoder 10 frembyder vanskeligheder, der skyldes viskositeten af de fremkomne suspensioner, bestanddelenes kolloide natur og ofte ringe massefyldeforskelle mellem suspenderet stof og væske, og som fører til lavere gennemstrømningshastigheder, jfr. Naeher & Thum i Spencer, Industrial Aspects 15 of Biochemistry, 1974.

Eksempelvis frigøres enzymet ved adskillelsen af pullulanase fra Klebsiella pneumoniae i et første trin fra intakte celler ved hjælp af detergenter. Dette skridt kan gennemføres uden vanskeligheder i vilkårlig 20 målestok. Ved forsøg på fraskillelse af cellerne har det imidlertid vist sig, at der hertil kræves forholdsvis høje G-tal, som ikke kan realiseres i teknisk målestok.

En adskillelse ved hjælp af filtrering er kun meget vanskeligt gennemførlig på grund af de tilstedeværende de-25 tergenter, jfr. tysk fremlæggelsesskrift nr. 2.245.342.

Fra Biochemistry, 1973, bind 12, side 2525-2530, er det kendt at udvinde et enzym (phospholipase A 1) fra Escherichia coli under anvendelse af en faseforde-lings-metode. Man går herved frem på den måde, at man 30 homogeniserer cellerne, fraskiller cellevæsken ved centrifugering og derefter opløser enzymet fra cellemembranen. Til fasefordelingen anvendes der flerfasesyste-mer med et indhold af polypropylenglycol, polyethylen-glycol, trimethylaminopolyethylenglycol, polyethylen-35 glycolsulfonat, ficoll og dextran. Bortset fra, at det nævnte trykskrift næppe giver anvisninger på anvendel-

O

149821 2 sen af den foreslåede fremgangsmåde til udvindingen af andre enzymer, lader fracentrifugeringen af cellevæsken sig ikke gennemføre i teknisk målestok. Dette gælder også for de fra Eur. J. Biochem., 1974, bind 46, side 75 5 til 81, og Eur. J. Biochem., 1974, bind 48, side 63-69 kendte fasefordelings-metoder, ved hvilke der enten gås ud fra rensede enzymer eller fra gærlysat, som fås ved centrifugering af en homogeniseret gærsuspension.

Formålet med opfindelsen er at anvise en frem-10 gangsmåde til udvinding af enzymer fra mikroorganismeceller i teknisk målestok, ved hvilken fremgangsmåde man kan udvinde enzymerne uden forudgående adskillelse fra cellevæske, cellerester eller celler ud fra oplukkede eller hele celler ved hjælp af en fordeling i et flerfase-15 system. Ved denne fremgangsmåde kan der gås ud fra vilkårlige mikroorganismeceller til isolering af vilkårlige enzymer, f.eks. pullulanase (amylopectin-6-glucanohydro-lase) og phosphorylase fra Klebsiella-arter, maltase (α-glucosidase), f.eks. fra ølgærceller, og aminoacyl-2o -tRNA-synthetaser, f.eks. fra Escherichia coli.

Det har nu overraskende vist sig, at der også kan opnås tilfredsstillende adskillelser i vandige fler-fasesystemer, når man ikke i forvejen adskiller cellevæsken fra celleresterne eller cellerne.

25 Ifølge opfindelsen opnås det angivne formål ved hjælp af en fremgangsmåde af den allerede omtalte art, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at blandingen indeholdende cellevæsken og celleresterne eller cellerne fordeles mellem faserne i et vandigt fler-30 fasesystem med et indhold af et højmolekylært stof udvalgt blandt eventuelt substituerede polyalkoholer, polyethere, polyestere, polyvinylpyrrolidoner og poly-saccharider samt yderligere enten mindst ét uorganisk salt eller endnu mindst ét højmolekylært stof udvalgt 35 blandt eventuelt substituerede polyalkoholer, polyethere, polyestere, polyvinylpyrrolidoner og polysaccha- 3

O

148821 rider, eller begge dele, hvorpå fasen med enzymerne adskilles fra fasen med celleresterne eller cellerne, og den enzymholdige fase oparbejdes, og enzymerne isoleres bl.a. fra det deri indeholdte højmolekylære stof.

5 Der kan f.eks. anvendes et flerfasesystem med et indhold af polyethylenglycol. Ved anvendelse af et flerfasesystem med et indhold af en eventuelt substitueret polyalkohol eller polyether kan dens gennemsnitlige molekylvægt være mindre end 40.000 og navnlig mindre 10 end 10.000.

Der kan eksempelvis anvendes et flerfasesystem med et indhold af et sulfat, f.eks. et alkalimetalsulfat, og/eller et phosphat, f.eks. et alkalimetalphosphat, såsom kaliumphosphat.

15 Således kan eksempelvis et flerfasesystem inde holde et højmolekylært stof, f.eks. polyethylenglycol, og et salt, f.eks. kaliumphosphat. Et sådant flerfasesystem er f.eks. egnet til adskillelse af enzymer, f.eks. aminoacyl-tRNA-synthetaser, fra Escherichia coli. Ved 20 anvendelse af et sådant system kan der arbejdes med sådanne mængder vand, højmolekylært stof og salt, ved hvilke disse komponenter alene kun ville danne én fase.

Af økonomiske grunde kan man anvende et flerfasesystem med et indhold af polyethylenglycol og dex-25 tran.

Som højmolekylære stoffer kan man anvende en eventuelt substitueret polyalkohol eller polyether med en tydeligt mindre gennemsnitlig molekylvægt end molekylvægten for enzymet, fortrinsvis med en gennemsnitlig 30 molekylvægt mindre end 40.000, navnlig mindre end 10.000, især mindre end 6.000, f.eks. i området fra 5.000 til 1.550, f.eks. på ca. 4.000, og et eventuelt substitueret polysaccharid med en tydeligt større gennemsnitlig molekylvægt end molekylvægten for enzymet. (Enzymet pullula-35 nase har eksempelvis en molekylvægt på ca. 145.000).

Herved kan man opnå, at enzymerne går over i po- 4

O

149821 lyalkohol- eller polyether-fasen, og at disse højmolekylære stoffer eksempelvis ved ultrafiltrering let lader sig skille fra enzymerne.

I flerfasesystemet kan totalindholdet af poly-5 ethylenglycol hensigtsmæssigt andrage mindst 1 og fortrinsvis 4 til 9 vægtprocent, og totalindholdet af dex-tran kan være fra 0,1 til 15 vægtprocent, fortrinsvis fra 0fl til 7 vægtprocent.

Ved tilsætning af phosphationer, f.eks. ortho-10 phosphat- (f.eks. i form af forskellige kaliumphospha- ter), pyrophosphat-, polyphosphat- og/eller methaphosphat-ioner, kan den her omhandlede fremgangsmåde yderligere forbedres i afhængighed af pH-værdien.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der 15 gås ud fra vilkårlige mikroorganismeceller, der indeholder det ønskede enzym. Til fraskillelse af pullulanase og aminoacyl-tRNA-synthetaser kan man med fordel anvende et flerfasesystem med et indhold af et højmolekylært stof og et uorganisk salt, og til fraskillelse af pullulanase, 20 phosphorylase og maltase kan man med fordel anvende et flerfasesystem med et indhold af mindst to højmolekylære stoffer.

Enzymerne kan eksempelvis opløseliggøres ved oplukning af mikroorganismecellerne og/eller behandling med 25 detergenter. Som detergenter egner sig f.eks. triton, cho-lat, desoxycholat og dodecylsulfat.

Som i flerfasesystemet uopløselige andele anses eksempelvis cellerester eller ikke-oplukkede celler.

Ved den her omhandlede fremgangsmåde kan der væ-30 re salte til stede, som f.eks. hidrører fra detergenter eller pufferstoffer.

Der kan anvendes alle højmolekylære stoffer, som hidtil har været anvendt i flerfasesystemer til fordeling af mikroorganismer eller højmolekylære biokemiske 35 forbindelser. I denne forbindelse skal der eksempelvis henvises til Albertsson, Partition of Cell Particles and

O

149821 5

Macromolecules, NY 1971 og følgende oplag.

Eksempler på højmolekylære stoffer, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er poly-propylenglycol, polyethylenglycol, methoxypolyethylen-5 glycol, trimethylaminopolyethylenglycol, polyethylengly- colsulfonat, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, me-thylcellulose, ethylhydroxyethylcellulose, DEAE-cellulo-se, alkalicarboxymethylcellulose, dextran, hydroxypropyl-dextran, DEAE-dextran, dextransulfat, alkalimetalcarboxy-10 methyldextran og ficoll.

Der kan anvendes et flerfasesystem med et forhold mellem totalrumfang og cellemasse større end eller lig med 2 og fortrinsvis større end eller lig med 5.

Fortrinsvis arbejdes der ved en pH-værdi på 6-9, 15 navnlig 7-8.

Faserne lader sig skille i storteknisk målestok ved hjælp af f.eks. separatorer, f.eks. ved hjælp af tallerkenseparatorer eller dekanteringsapparater.

I forbindelse med den foreliggende opfindelse 20 har det vist sig, at faserne også lader sig adskille ved samtidig tilstedeværelse af cellerester eller celler under anvendelse af kommercielt tilgængelige separatorer.

Herved står en højt udviklet separator-teknologi til sådanne enzymadskillelser til rådighed, som muliggør sær-25 deles høje behandlingsmængder og dermed undgåelse af ak tivitetstab for enzymer på grund af lange behandlingstider.

En yderligere fordel ved den foreslåede væske--væske-adskillelse er desuden at se deri, at man ved for-30 delingen mellem flere faser ikke blot opnår adskillelse af de uopløselige bestanddele fra den ønskede enzymopløsning, men at der tillige kan opnås en yderligere rensning på grund af proteinernes forskellige K-værdier.

De højmolekylære stoffer, som opbygger det her 35 omhandlede flerfasesystem, og via cellerne medindbragte proteiner, kan fraskilles ved anvendelse af metoder, der

O

6 149*21 er gængse i teknikken. Som eksempler kan nævnes udfældning af enzymerne eller fasefordeling, ultrafiltrering, dialyse, gelpermeering, adsorbensbehandling, ionbytning eller elektroforese.

5 Man kan gennemføre den her omhandlede fremgangs måde ved stuetemperatur, navnlig når enzymerne stabiliseres af de anvendte højmolekylære stoffer.

Til bedre forståelse af disse forhold skal der i det følgende henvises til tegningen. På tegningen viser 10 fig. 1 et fasediagram for et system af polyethy- lenglycol (gennemsnitlig molekylvægt 6.000), dextran (gennemsnitlig molekylvægt 500.000) og vand, fig. 2 afhængigheden af fordelingskoefficienten K for pullulanase af den gennemsnitlige molekylvægt af 15 polyethylenglycolen i et vandigt polyethylenglycol/dex-tran-system, fig. 3 afhængigheden af fordelingskoefficienten K for pullulanase af pH-værdi og pufferion i et vandigt polyethylenglycol/dextran-system, 20 fig. 4 afhængigheden af fordelingskoefficienten K for pullulanase af phosphatkoncentrationen i et vandigt polyethylenglycol/dextran-system, fig. 5 afhængigheden af fordelingskoefficienten K for pullulanase af natriumcholat-koncentrationen i et 25 vandigt polyethylenglycol/dextran-system, fig. 6 afhængigheden af fordelingskoefficienten K for pullulanase af natriumdesoxycholat-koncentrationen i et vandigt polyethylenglycol/dextran-system, fig. 7 graden af adskillelse af pullulanase fra 30 Klebsiella-celler i den øvre fase i afhængighed af natriumcholat-koncentrationen i et vandigt polyethylenglycol/-dextran-system, fig. 8 afhængigheden af fordelingskoefficienten K for pullulanase af indholdet af DEAE-dextran i den ned-35 re fase af et vandigt polyethylenglycol/dextran-system, fig. 9 afhængigheden af fordelingskoefficienten o 149821 7 K for maltase af phosphatkoncentrationen i vandige poly-ethylenglycol/dextran-systerner, fig. 10 afhængigheden af fordelingskoefficienten K for maltase af kaliumchlorid-koncentrationen i van-5 dige polyethylenglycol/dextran-systemer, fig. 11 afhængigheden af fordelingskoefficienten K for maltase af natriumsulfat-koncentrationen i vandige polyethy1englycol/dextran-systerner, fig. 12 afhængigheden af fordelingskoefficienten 10 K for maltase af pH-værdien i vandige polyethylenglycol/-dextran-systemer, fig. 13 afhængigheden af fordelingskoefficienten K for maltase af koncentrationen og af den gennemsnitlige molekylvægt af den anvendte polyethylenglycol i vandige 15 polyethylenglycol/dextran-systemer, fig. 14 afhængigheden af fordelingskoefficienten K for maltase af koncentrationen af dextranen og af den gennemsnitlige molekylvægt af polyethylenglycolen i vandige polyethylenglycol/dextran-systemer, 20 fig. 15 afhængigheden af fordelingskoefficienten K for maltase af andelen af cellemassen i totalsystemet i et vandigt polyethylenglycol/dextran-system, og fig. 16 afhængigheden af aktivitetsudbyttet af andelen af cellemassen i totalsystemet i et vandigt poly-25 ethylenglycol/dextran-system, og fig. 17-22 viser afhængigheden af fordelingskoefficienten K for isoleucyl-tRNA-synthetase af forskellige parametre i et tofasesystem med et indhold af polyethylenglycol og dextran.

30 Pig. 1 viser altså et fasediagram af vandige sy stemer med et indhold af dextran (gennemsnitlig molekylvægt 500.000) og polyethylenglycol (gennemsnitlig molekylvægt 6.000). Under den optrukne kurve optræder der ingen faseadskillelse, således at der i dette område foreligger 35 et homogent system. Over den optrukne kurve optræder der imidlertid en faseadskillelse. Punktet A repræsenterer 149821 8

O

f.eks. et system med 6 vægtprocent dextran og 5 vægtprocent polyethylenglycol. Et sådant system udgør to faser, idet punktet B svarer til sammensætningen af den øvre fase, medens punktet C svarer til sammensætningen af den 5 nedre fase. Ethvert' punkt, der ligger på de linier, der forbinder punkterne B, A og C, og afspejler totalsammensætningen af et bestemt system, gælder for et tofasesy-stem af samme sammensætning i de to faser, men med forskellige rumfang af faserne. Forholdet mellem afsnittet 10 B-A og afsnittet A-C af den af punkterne B og C begrænsede og gennem punktet A løbende strækning svarer til vægtforholdet mellem nedre fase og øvre fase. Da massefylden af faserne andrager ca. 1 g pr. ml, afspejler forholdet mellem afsnittene B-A og A-C omtrentlig forhol-15 det mellem rumfangene af faserne (med hensyn til diskussion af et sådant fasediagram henvises der også til Albertson, Methods Microbiol, 5B, 385 til 423 (1971)).

Også for disse vandige tofasesystemer gælder den Nernst'ske sætning: 20

k = cT/cB

hvor CT og CB betegner koncentrationen af et over de to faser fordelt stof i den øvre fase henholdsvis den ned-25 re fase. Fordelingen kan også beskrives alment ved hjælp af Brønsted-ligningen:

In K = lambda M/k T, 30 hvor M betegner molekylvægten, T betegner den absolutte temperatur, og lambda er en faktor, som afhænger af systemets andre egenskaber. Det fremgår af ligningen, at de mindste ændringer af lambda ved høj molekylvægt medfører drastiske absolutte ændringer af fordelingskoeffi-35 cienten.

Når det således også forud for den foreliggende

O

149621 9 opfindelse var teoretisk tænkeligt at fordele enzymer i et flerfasesystem ensidigt, så måtte dog yderligere den ekstra opgave løses, også ensidigt at fordele cellerester eller celler (fra hvilke enzymerne skal adskilles), 5 og dette i en anden fase. Denne opgave er først blevet løst gennem den foreliggende opfindelse.

I det følgende skal fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af det som eksempel udvalgte polyethylenglycol/dextran-system for pul-10 lulanase og maltase som eksempler på enzymer. Por dette system er det blevet fastslået, at cellerne overraskende nok fuldstændigt overgår i den dextranrige, nedre fase.

For enzymerne kan der eksempelvis konstateres fordelingskoefficienter på 0,3. Dette betyder, at koncentrationen 15 af et enzym i den øvre fase forholder sig til dets koncentration i den nedre fase som 0,3 til 1. Et system med en K-værdi på 0,3 er altså udmærket egnet til adskillelse af enzymerne over den øvre fase, da cellerne foreligger fuldstændigt i den nedre fase. Ganske vist skal der 20 arbejdes med et ikke-optimalt rumfangsforhold i begge faser til opnåelse af en tilfredsstillende adskillelse: dette fremgår af følgende definition af adskillelsesgraden G: 25 G = CT VT/CB VB = K VT/VB , hvor VT og Vg betegner rumfanget af henholdsvis den øvre og den nedre fase. Af den ovenstående ligning for adskillelsesgraden fremgår ved en K-værdi på 0,3, at rumfanget 30 af den øvre fase skal være ca. 3 gange så stort som rumfanget af den nedre fase til opnåelse af en koncentrering på 50% af et fordelt enzym i den øvre fase.

Med hensyn til adskillelsesgraden er det også fordelagtigt at arbejde med et flerfasesystem med et total-35 indhold af polyethylenglycol på mindst 1 og fortrinsvis 4 til 8 vægtprocent og med et totalindhold af dextran på 149821 o ίο 0,1 til 15 vægtprocent, fortrinsvis 0,1 til 7 vægtprocent.

Hertil kommer, at fordelingskoefficienten for enzymerne ved ens komponenter i systemet kan være gunstigere, når polyethylenglycol-koncentrationen falder, jfr. fig. 13.

5 Da det er ønskeligt at arbejde ved endnu højere K-værdier end 0,3, skal der i det følgende undersøges yderligere parametre, med hvilke fordelingskoefficienten for enzymerne kan forskydes mod højere værdier. Således fremgår det af fig. 2 og 13, at man ved anvendelse af po-10 lyethylenglycol med mindre kædelængder opnår en stejl stigning af fordelingskoefficienten, og at der kan opnås værdier på ca. 1. (Herved skal det udfra et andet synspunkt fremhæves, at det ifølge opfindelsen er fordelagtigt at anvende polyalkoholer og polyethere med en tyde-15 ligt mindre gennemsnitlig molekylvægt end molekylvægten af pullulanasen, fortrinsvis med en gennemsnitlig molekylvægt mindre end 40.000, navnlig mindre end 10.000, især mindre end 6.000, f.eks. i området fra 5.000 til 1.550, f.eks. på ca. 4.000).

20 Ved tilsætningen af phosphationer, f.eks. ortho- phosphat-, pyrophosphat-, polyphosphat- og/eller metha-phosphationer, navnlig orthophosphationer, lader fordelingskoefficienten sig på overraskende måde forøge i afhængighed af pH-værdien, jfr. fig. 3-4 og fig. 9-12.

25

Pullulanase.

Når man ved dette enzym gennemfører fordelingen i et vandigt polyethylenglycol/dextran-system ved en fordelingskoefficient på 0,3, en natriumphosphat-koncentra-30 tion på 100 mmol og et rumfangsforhold mellem øvre fase og nedre fase på 10:1, fås der for et enkelt fordelingstrin følgende udbytte:

Udbytte i % = 100/(1 + VB/VT*K) =97.

Fortrinsvis arbejdes der ved en mere end 0,001, 35 o 149821 11 især mere end 0,02 molær phosphation-koncentration, og ved en pH-værdi på 6-9 og navnlig 7-8.

Det forhold, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen lader sig gennemføre på særlig fordelagtig måde i nær-5 værelse af phosphationer og i omegnen af neutralpunktet, er af følgende grunde overraskende: 1. Når man varierer pH-værdien i området fra 6 til 8, uden at der tilsættes phosphationer, lader fordelingskoefficienten sig ikke påvirke væsentligt. Endvide- 10 re fører en forøgelse af ionstyrken, f.eks. med natrium-chlorid, til nedsættelse af fordelingskoefficienten, således at man ved høj natriumchlorid-koncentration foretrækker den dextranholdige nedre fase, jfr. også fig. 10.

2. Pullulanase udviser en maksimal aktivitet ved 15 en pH-værdi på 5. Da den her omhandlede fremgangsmåde imidlertid lader sig gennemføre ved højere pH-værdier uden skadelig indflydelse på pullulanase-aktiviteten, antages det, at de højmolekylære stoffer stabiliserer enzymet. Disse overvejelser gælder selvsagt også for andre 20 enzymer.

Fasediagrammet og fordelingskoefficienten afhænger desuden af temperaturen. Da pullulanase kan stabiliseres af de højmolekylære stoffer, f.eks. polyethylenglycol og dextran, kan der arbejdes ved stuetemperatur uden ak-25 tivitetstab. Også disse forhold gælder selvsagt for andre enzymer.

En foretrukken fremgangsmåde til fraskillelse af pullulanase fra de højmolekylære stoffer og proteinerne består i, at man fælder pullulanasen med en forbindelse 30 med den følgende almene formel: 12 3 4 NRRRRX, i hvilken R^ betegner, en organisk rest med mindst 10 car- o 3 4 35 bonatomer, især 10-20 carbonatomer, Rz, R og R , der kan være ens eller forskellige, betegner hydrogenatomer eller 149821 12

O

organiske grupper med 1-20 carbonatomer, især 1-6 car- 1 4 bonatomer, idet de organiske grupper R -R er udvalgt blandt alkylgrupper, substituerede alkylgrupper, alken- grupper, arylgrupper, substituerede arylgrupper, aralkyl- 3

c grupper og mættede og umættede cycliske grupper, idet R

4 2 og R tilsammen kan danne en cyclisk gruppe, idet R kan mangle, når det drejer sig om en umættet cyclisk gruppe, og hvor X betegner en uorganisk eller organisk anion, f.eks.

en halogen-, phosphat-, nitrat-, sulfat- eller acetation.

10 Eksempler på ammoniumkationen er dodecylmethyl- ammonium-, dodecyltrimethylammonium-, tetradecylammonium-, cetylmethylarnmonium-, cetyldimethylammonium-, cetyltrime- thylammonium-, octadecyltrimethylammonium-, benzyldode- cyldimethylammonium-, Ν,Ν-diethylmorpholinium-, cetylpyri- 15 dinium-, decenyltrihydroxyethylarnmonium-, dioctadecyldi- ethylammonium-, dioctadecylmorphlinium-, dilauryldimethyl- ammonium- og diastearyl-2-chlorethyl-butylammoniumionen.

Naturligvis kan man også fælde pullulanasen først efter fraskillelsen af de·højmolekylære stoffer og protei- 20 nerne.

Pullulanasen lader sig derved overraskende udfælde i form af en støkiometrisk forbindelse med den empiri- Λ ske formel Pullulanase* · Ammoniumkation eller dennes salte med den empiriske formel Pullulanase · 4 25 R NX. Denne fældning kan igen opløses i saltopløsninger med stigende ionstyrke, således som det fremgår af de følgende eksempler.

Fra tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.251.855 er det ganske vist allerede kendt r at man kan behandle enzy-30 mer, blandt andet pullulanase, med langkædede, kvaternære ammoniumforbindelser til forbedring af opbevaringsstabili-teteh. Som det fremgår af side 4 forneden til side 5 foroven i det nævnte trykskrift, skal de behandlede enzymer foreligge på solubiliseret form (eksempel 3) eller intra-35 cellulært (eksempel 1) eller på indifferente bærestoffer (eksempel 2 og 4). Denne kendte teknik giver altså ingen o 13 U9S21 anvisning på, at pullulanase kan fældes støkiometrisk. Støkiometriske fældninger af enzymer med langkædede ammoniumforbindelser har overhovedet hidtil ikke været kendt. Fremstillingen af en støkiometrisk forbindelse af 5 pullulanase må være så meget desto mere overraskende, som f.eks. a-amylaser og proteaser, f.eks. ved en fældning af pullulanase med cetyltrimethylammoniumbromid, forbliver i opløsning.

Den specifikke fældning af pullulanasen fremby-10 der den fordel, at generende aktiviteter, f.eks. af amylase, glycosidase og proteaser, kan elimineres.

De dannede fældninger lader sig let fraskille ved centrifugering ved små G-tal.

Pullulanase spalter glucose-a-1,6-bindinger og 15 anvendes til spaltning og fuldstændig nedbrydning af stivelsesarter og glycogener sammen med andre enzymer, f.eks. i bryggerier, ved brødfabrikation og til analytiske formål. Ren pullulanase kan føre til linearisering af stivelse og til udvinding af lineære oligo- eller a-l,4-po-2o lyglucaner.

De følgende eksempler vedrørende pullulanase illustrerer også det tilfælde, at man allerede med et enkelt højmolekylært stof fra den af eventuelt substituerede polyalkoholer, polyethere, polyestere og polysaccha-25 rider dannede gruppe samt et uorganisk salt kan opbygge et vandigt flerfasesystem, idet der eksempelvis arbejdes i nærværelse af polyethylenglycol og ammoniumsulfat og eventuelt phosphat.

30 Maltase.

Forholdene ved maltase svarer i det væsentlige til forholdene ved pullulanase, idet virkningerne dog er noget mindre udprægede. For udførelsesformen af den her omhandlede fremgangsmåde med mindst to højmolekylære stof-35 · fer gælder følgende: Når der arbejdes i nærværelse af phos- phationer, kan der anvendes en phosphationkoncentration 149821 14

O

på mere end 0,1, fortrinsvis mere end 0,3 og navnlig på mere end 0,5 molær.

Aminoacyl-tRNA-synthetaser.

5 De for aminoacyl-tRNA-synthetaser følgende ek sempler illustrerer yderligere det tilfælde, at man allerede med et enkelt højmolekylært stof fra den af eventuelt substituerede polyalkoholer, polyethere, polyestere < og polysaccharider dannede gruppe, fortrinsvis polyethy-10 lenglycol, samt celler eller cellerester kan opbygge et vandigt flerfasesystem, idet der arbejdes i nærværelse af et uorganisk salt, fortrinsvis kaliumphos-phat.

I det følgende skal den foreliggende opfindelse 15 belyses nærmere ved hjælp af en række eksempler, idet M betegner den gennemsnitlige molekylvægt. Eksemplerne 1-7, 9, 10, 15, 16, 30-42, 49-54, 56 og 57 viser en række baggrundsundersøgelser, eksempel 17 er et sammenligningseksempel og de øvrige eksempler illustrerer fremgangsmåden 20 ifølge opfindelsen. Enzymerne isoleres fra den opnåede enzymholdige fase som omtalt for pullulanase (eks. 12-14).

Eksempel 1 (fig. 1)

Dette eksempel på et fasediagram for vandige sy-25 stemer med et indhold af polyethylenglycol (M 6.000) og dextran (M 500.000) hidrører fra angivelser af Albertsson, j fr. ovenfor.

Eksempel 2 (fig. 2) 30 Der foretages en undersøgelse af afhængigheden af fordelingskoefficienten K for pullulanase af middelstor polyethylenglycol-molekylvægt i et vandigt system med et indhold af polyethy lenglycol, dextran (ΪΪ 500.000) og enzym. Forholdet mellem polyethylenglycol og dextran andra-35 ger 12:1 på vægtbasis. De opnåede værdier er anført grafisk i fig. 2.

o 149821 15

Eksempel 3

Der foretages en undersøgelse af afhængigheden af fordelingskoefficienten K for pullulanase af middelstor dextran-molekylvægt i et vandigt system med et ind-5 hold af polyethylenglycol (M 4.000), dextran, enzym og (a) uden phosphat henholdsvis (b) med phosphat (koncentration 0,1 molær, pH--værdi 7,5).

Den anvendte enzymopløsning har en aktivitet på 10 20,8 E/ml, en saltkoncentration på 0,02 molær og en pH- -værdi på 7,5.

Systemerne indeholder hver gang 10 dele polyethylenglycol og 5 dele dextran og fyldes op til 100 dele med vand.

15 De fremkomne værdier ses af den følgende tabel I.

Det ses heraf, at den gennemsnitlige molekylvægt af det anvendte dextran næppe har indflydelse på fordelingskoefficienten K.

20 Tabel I

M Dextran Øvre fases Nedre fases E/ml E/ml K-værdi η n5 rumfang rumfang øvre nedre x _(ml)_(ml) fase fase_ a) 1,1 7,7 1,9 6,4 28,8 0,22 25 5,0 7,8 2,0 7,0 24,8 0,28 20.0 7,8 1,8 6,8 28,4 0,24 10,0+ 8,0 1,8 7,9 22,7 0,35 b) 30 1,1 7,5 2,0 4,5 3,9 1,15 5,0 7,4 2,1 4,6 3,6 1,28 20.0 7,6 2,0 4,5 3,7 1,22 10,0+ 7,8 1,6 4,3 5,1 0,80 + Natriumdextransulfat 35 ..............................

149821 16

O

Eksempel 4 (fig. 3)

Der foretages en undersøgelse af afhængigheden af fordelingskoefficienten K for pullulanase af pH-vær-di og af pufferioner i et vandigt system med et indhold 5 af polyethylenglycol (M 4.000), dextran (M 500.000), enzym og (a) natriumphosphat henholdsvis (b) tris/acetat.

Forholdet mellem polyethylenglycol og dextran 10 andrager 9:1,25 på vægtbasis, og koncentrationen af pufferstoffer (a) og (b) er hver gang 100 mmol. De fremkomne værdier er vist grafisk på tegningen i fig. 3.

Eksempel 5 (fig. 4) 15 Der foretages en undersøgelse af afhængigheden af fordelingskoefficienten K for pullulanase af phosphat-koncentrationen i et vandigt system med et indhold af polyethylenglycol (M 4.000), dextran (M 500.000), enzym og natriumphosphat. Forholdet mellem polyethylenglycol og 20 dextran'andrager 9:1,25 på vægtbasis. pH-værdien af natriumphosphat-puf feren andrager 7,8. De opnåede værdier er afbildet grafisk på tegningen i fig. 4.

Eksempel 6 (fig. 5) 25 '' Der udføres en undersøgelse af afhængigheden af fordelingskoefficienten K for pullulanase af natriumcho-lat-koncentrationen i et vandigt system med et indhold af polyethylenglycol (M 4,000), dextran (M 500.000), natriumphosphat og enzym. Forholdet mellem polyethylenglycol og 30 dextran andrager 9:1,25 på vægtbasis, koncentrationen af natriumphosphatet er 100 mmolær, og dets pH-værdi andrager 7,8. De fremkomne værdier er vist grafisk på tegningen i fig. 5.

35 Eksempel 7 (fig. 6)

Der foretages en undersøgelse af afhængigheden 149821 17

O

af fordelingskoefficienten K for pullulanase af natrium-desoxycholat-koncentrationen i et vandigt system med et indhold af polyethylenglycol (M 4.000) dextran (M 500.000), natriumphosphat og enzym. Forholdet mellem polyethylengly-5 col og dextran andrager 9:1,25 på vægtbasis, koncentrationen af natriumphosphatet er 100 mmolær, og dets pH-værdi er 7,8. De opnåede værdier er afbildet grafisk på tegningen i fig. 6.

10 Eksempel 8 (fig. 7)

Der udføres en undersøgelse af adskillelsen af pullulanase fra Klebsiella pneumoniae-celler, fra hvilke enzymet er blevet frigjort, i den øvre fase af et vandigt system med et indhold af polyethylenglycol (M 4.000), dex-15 tran (M 500.000), natriumphosphat og celler i afhængighed af natriumcholat-koncentrationen. Forholdet mellem polyethylenglycol og dextran andraget 9:1,25 på vægtbasis, og forholdet mellem celler og pufferstof andrager 1:1,4. Koncentrationen af natriumphosphat er 200 mmolær, og pH-vær-20 dien andrager 8,0. De opnåede resultater er afbildet grafisk på tegningen i fig. 7.

Eksempel 9 (fig. 8)

Der foretages en undersøgelse af afhængigheden af 25 fordelingskoefficienten K for pullulanase af indholdet af DEAE-dextran i dextranfasen i et vandigt system med et indhold af polyethylenglycol (M 4.000), dextran (M 500.000), natriumphosphat og enzym. Forholdet mellem polyethylenglycol og dextran andrager 9:1,25 på vægtbasis, natriumphos-30 phat-koncentrationen er 100 mmolær, og pH-værdien er 7,8.

De opnåede værdier er vist grafisk i fig. 8.

Eksempel 10

Der foretages en undersøgelse af pullulanase-ud-35 byttet ved en éttrinsekstraktion i et vandigt system med et indhold af polyethylenglycol (M 4.000), dextran (M

O

18 U9821 500.000), natriumphosphat og enzym i afhængighed af phos-phatkoncentrationen. Forholdet mellem polyethylenglycol og dextran andrager 9:1,25 på vægtbasis, og pH-værdien af natriumphosphatet er 7,8. Det totale rumfang af det an-5 vendte system er 5 ml, og aktiviteten af den anvendte enzymopløsning svarer til i alt 231,4 E.

Resultaterne fremgår af den følgende tabel II.

19 14S821 0) +j 4J r'rvlajO'i'nr'r'Cs

A # Hmrotiimiijr-r-'OO »Ο^-'σΐσισισισισισΊσ'σί D

EHlfflNojr^HcncoOooa' ϋ lu NiniOi-ir'C^t^t^ro II rHrHrH<NrH£PP">^l,t'- *—-.

rH

njr^'Or'i-it^oonoor^ .jj ..I*».*.».*.*.*.*

OcoinLnnOoouiin'i -P i—I H rH t—I H

-P W Q> 0) — in -P

id Ή p > —n QJJJg ΡΛΙ'ν,Γ'-,-Η.-ΗωίΟΙΝΓΟΗΓ' 'd<WrOfOrO£NCMCNHi-l (1) ^ 25 >~ooooooooo

H

H

rH '

Q) rH

XI ^OlNONOlNtOOl ^ +J - . r r - r r r ..

EH Oinnr^COHOt^OiU) 4J OrHro^fOJncM'a'in

tMCMOJOHCMCHCNCNCH

•P H (U w ID -P

ω ·η id |> r-* m-rlHr^lfir'.rHCHC'J'^LnHj' JJg - *»->·«>' ni iN ui h μ m οι οσιιηοο > —

BL

• s, rl rl ΙΛΙϋΐηΐΠΦΰΙΟΙΛΗ1 og -

P I

(UHI+J ^Β101ΗΊΙ>>ΌΊΙ fl li rl I) ^ - *· *· r · «· »· * * (^ρΡΡΗ^ίΤιΓΗΗΓΗσίΓΗΙΛΗ 30X4-H'-'CNCHinvDfO(rl(TliniX)

Pu +J Π3 > CNICNCNCNCNCNCNCNCN

•P

id i fi P

ft 0 Ή rl rH O O O O O O O O

MO-PO HCSrO'tfLnOOO

0 fi id g h ch n .cops ft M -p a) i> · •SMHCHn'tfLnvorcocri p fi ft 0 149821 20

Eksempel 11

Klebsiella pneumoniae-celler suspenderes med et 1,4 gange så stort rumfang af en vandig 0,5 molær natrium-phosphatpuffer (pH = 8,0). Der tilsættes 1% natriumcholat 5 og omrøres kraftigt i 90 minutter ved stuetemperatur. Derefter indvejes der 9% polyethylenglycol (M 4.000) og 1,25% dextran (M 500.000), hvorefter der blandes i ca. 10 minutter med et blandeapparat (Vibro-Mischer) og afcentrifugeres i 20 minutter ved 12000 omdrejninger pr. minut. Den 10 cellefri, ovenstående væske lader sig godt afhælde. Der dialyseres i 48 timer mod strømmende vand (kølerum).

Eksempel 12-14

Disse eksempler skal belyse, at der til oparbejd-15 ningen af pullulanase fra den polyethylenglycol-rige fase foreligger flere muligheder.

(Eksempel 12) Til en polyethylenglycol-rig fase med et indhold af pullulanase (eksempel 11) sættes der 18% ammoniumsulfat, hvorved der fås et nyt tofasesystem 20 (polyethylenglycol/ammoniumsulfat). Pullulanasen går herved kvantitativt over i saltfasen. De to fuldstændigt klare faser kan adskilles i en separator. Fra den nedre fase udfældes enzymet ved forøgelse af ammoniumsulfatkoncentra-tionen til 35%. Fældningen skilles fra ved centrifugering, 25 opløses i en 20 mmolær phosphatpuffer og dialyseres mod den samme puffer. Den på denne måde fremkomne pullulanase har en specifik aktivitet på 28 E/mg og er efter elek-troforese-resultaterne ca. 70% ren. Udbyttet er 78%. Præparatet indeholder endnu spor af protease.

30 (Eksempel 13) Fra en til eksempel 11 svarende øvre fase bindes enzymet til DEAE-cellulose, efter at detergenterne er blevet fjernet ved dialyse mod vand, og saltkoncentrationen i opløsningen er blevet hævet til en værdi på ca. 0,1 molær (phosphat). DEAE-cellulose kan let 35 skilles fra ved filtrering og fjernes i en sigtecentrifu-ge. Ved vaskning af DEAE-cellulosen med puffer fjernes po-

O

21 149*21 lyethylenglycolen praktisk taget fuldstændigt. Pullula-nasen elueres derefter med en puffer med en tilstrækkelig saltkoncentration. Denne arbejdsmåde er også gennemførlig i teknisk målestok. Udbytterne ligger fra 30 til 5 50%.

(Eksempel 14) Ved tilsætning af dextran med et indhold på ca. 8% DEAE-dextran til en polyethylenglycol--rig fase opnået ifølge eksempel 11 lader sig opbygge et nyt tofasesystem. Ved dette DEAE-dextranindhold på ca. 8% 10 er fordelingskoefficienten K mindre end 0,05, således at praktisk taget hele enzymet overføres til den nedre fase, jfr. fig. 8. Ved passende indstilling af rumfangene kan der også på denne måde opnås (koncentrering).

15 Eksempel 15

Der anvendes et system ifølge Albertsson, Biochemistry 12, 2525 (1973). Systemet indeholder 6,7% dextran (M 500.000), 8,0% ficoll og 5,3% polyethylenglycol (M 6.000) og udgør et tofasesystem. Der anvendes en pul-20 lulanase-opløsning med en aktivitet på 20,8 E/ml, en 0,02 molær saltkoncentration og en pH-værdi på 7,5.

Fordelingskoefficienten andrager 0,66.

Eksempel 16 25 Der anvendes et system ifølge Albertsson, Bio chemistry 12, 2525 (1973) med et indhold af 5% dextran (M 500.000), 6% ficoll, 4% polyethylenglycol (M 6.000) og 25% polypropylenglycol (M 2020), hvorved der fås et trefasesystem. Der anvendes herved en pullulanase-opløs-30 ning med en aktivitet på 20,8 E/ml, en 0,02 molær saltkoncentration og en pH-værdi på 7,5.

Pullulanasen fordeler sig på følgende måde: Øvre fase: 1,3 E/ml.

Midterfase: 5,2 E/ml.

35 Nedre fase: 16,2 E/ml.

På basis heraf beregnes følgende fordelingskoef- 149821 22

O

ficienter: K1 = CT//Cmidte + CB “ 0,06 K2 = Cmidte/CT + CB = °'1 2 3 4 5 6 K3 = CB/CT + Cm.dte ~ 2,49 5 K4 CT//Cmidte =0,25 K5 = Cmidte/CB = 0,32

Eksempel 17 (sammenligningseksempel)

Der anvendes et system ifølge Albertsson (Bio-10 chemistry 12, 2525, navnlig side 2527 til højre (1973)).

Hertil sættes der 20 g Klebsiella pneumoniae-celler i 150 ml (i stedet for 1.500 ml) med koncentrationer på 1% (vægt pr. rumfangsenhed) Triton X-100, 2 molær natrium-rhodanid, 1 mmol EDTA og 10 mmol tris (pH = 8,0), og der 15 omrøres i 1 time ved stuetemperatur. Til suspensionen sættes der 22,2 g dextran (M 500.000) og 17,8 g polyethylen-glycol (M 6.000).

Der foregår en upåklagelig adskillelse i to faser. Cellerne befinder sig i den nedre fase. Pullulanase-20 -aktivitetstesten generes imidlertid meget let af det tilstedeværende natriumrhodanid (anvendelsen af det som erstatning for natriumrhodanid anbefalede natriumchlorid (l.c. side 2526 til højre) er heller ikke tilfredsstillende, eftersom der fås små fordelingskoefficienter).

25 Følgende eksempler 18-28 illustrerer udfældningen af pul-lulanase fra opløsninger opnået som omtalt i eksempel 11--14 med cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) eller andre kationer af nitrogenbaser.

Eksempel 18 (bestemmelse af den optimale CTAB-koncentra- 2 tion) 3 På basis af for-forsøg er en formindskelse af 4 pullulanase-aktivitetsudbyttet i fældningen fra CTAB- 5 -fældningen med større CTAB-koncentration blevet fast- 6 slået. Med henblik på en afhængighed af fældningen af mol-forholdet mellem CTAB og Pullulanase angives CTAB- 149821 23

O

-koncentrationen i fældningsblandingen i det følgende i pnol)E pullulanase.

Forsøgene gennemføres på følgende måde. Der sættes hver gang 10 ml pullulanase-opløsning (renhed 60-5 -70%, 0,02 til 0,03 molær P04 , pH 7,0, 38 E/ml) til stigende mængder af en 10%1 s CTAB-opløsning og omrøres i 15 minutter ved 0°C. Fældningen skilles fra ved centrifugering og opløsning i 0,5 molær kaliumphosphat (pH 7,5). Resultaterne fremgår af den følgende tabel III.

10

Tabel III

jimol CTAB/E pullulanase Aktivitetsudbytte (%) 0,12 70 0,14 72 15 0,16 82 0,18 80 0,24 72 0,32 60 20

Eksempel 19 (afhængighed af CTAB-fældningen af pullula-nase-koncentrationen)

Forsøgene gennemføres på følgende måde. En pullulanase-opløsning (renhed ca. 70%, 42 E/ml, 0,02 molær 3- P04 , pH = 7,5) fortyndes med stigende mængder af en 25 0,02 molær kaliumphosphatopløsning (pH = 7,5). Fældningen sker ved tilsætning af en 10%'s CTAB-opløsning svarende til et molforhold på 0,16 jimol/E. Der omrøres i 15 minutter ved 0°C. Fældningerne skilles fra ved centrifugering og opløses i 0,5 molær kaliumphosphat (pH = 7,5).

30

Resultaterne fremgår af den følgende tabel IV.

35 149821 24

O

Tabel IV

Aktivitetsudbytte pmol CTAB/E_E/ml_i fældning 5 0,16 42,0 82% 0,16 30,0 79% 0,16 21,2 81% 0,16 14,0 54% 0,16 9,9 40% 10

Eksempel 20 (afhængighed for CTAB-fældningen af pH-vær-dien) 5 ml af en 60-70% ren pullulanase-opløsning (42 E/ml, 0,02-0,03 molær kaliumphosphat, pH = 7,5) brin-15 ges hver gang med 0,1 molær saltsyre eller 0,1 molær kaliumhydroxid på pH-værdier på henholdsvis 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 og 8,0 og fortyndes til rumfang på 10 ml. De heraf resulterende fældningsbetingelser er følgende: 0,02-0,03 3- - molær PO^ (Cl ), variabel pH-værdi, 0,16 jmol CTAB/E 20 pullulanase, 20-22 E/ml. Fældningen sker ved tilsætning af en 10%'s CTAB-opløsning. Der omrøres i 15 minutter ved 0°C. Fældningerne skilles fra ved centrifugering og opløses i 0,5 molær kaliumphosphat (pH = 7,5). Resultaterne fremgår af den følgende tabel V.

25

Tabel V

Aktivitetsudbytte jimol CTAB/E_pH_E/ml_i fældning 0,16 8,0 22,5 50 30 0,16 7,5 22,1 65 0,16 7,0 20,3 74 0,16 6,5 20,3 65 0,16 6,0 20,0 36 35 o 149821 25

Eksempel 21 (afhængighed for CTAB-fældningen af saltkoncentrationen og pufferens ionart)

Forsøgene gennemføres på følgende måde. 5 ml af en 60-70%'s pullulanase-opløsning (ca. 42 E/ml, saltkon- 3_ 5 centration 0,02 molær P04 ) bringes hver gang med en 1 molær kaliumphosphat-opløsning eller med en 1 molær am-moniumsulfat-opløsning (pH = 7,0) på et opløsningsrumfang på 10 ml med en saltkoncentration svarende til en molari-tet på 0,04, 0,06 og 0,08. De herudfra resulterende fæld-10 ningsbetingelser er følgende: 0,16 pmol CTAB/E pullulanase, 20-22 E/ml, pH = 7,0 og variabel saltkoncentration. Fældningen sker efter tilsætning af en 10%'s CTAB-opløsning.

Der omrøres i 15 minutter ved 0°C. Fældningerne skilles fra ved filtrering og opløses i 0,5 molær kaliumphosphat 15 (pH = 7,0). Resultaterne fremgår af den følgende tabel VI.

Tabel VI

Saltkoncen- Aktivitetsudbytte tration_pH μιηοΐ CTAB/E E/ml_i fældningen 20 0,02 m P043- 7,0 0,16 20,8 80% 0,04 m PO:43- 7,0 0,16 22,0 60% 0,06 m P043" 7,0 0,16 20,5 10% 25 0,08 m P043- 7,0 0,16 23,0 2% __ .

/0,01 m P04 ( % 7,0 0,16 20,6 50% V0,01 m S04 30 3- /0,01 m P04 ( % 7,0 0,16 21,1 3% v0,03 m S04 /0,01 m P043- 35 ( % 7,0 0,16 19,8 2% \0,05 m S04 149821 26

O

Eksempel 22 (aktivitetsudbyttets og den specifikke aktivitets afhængighed af opløsningen af CTAB-fæld-ningen i saltopløsninger med stigende saltkoncentration) 5 Forsøgene gennemføres på følgende måde. 10 ml af en dialyseret øvre fase (eksempel 11) indstilles hver gang på en pH-værdi på 7,0 og fortyndes til 15 ml. Fældningsbe- 3- tingelserne er følgende: 0,02 molær PO^ , pH = 7,0, ca.

30 E/ml, ca. 11 E/mg og 0,16 pnol CTAB/E. Fældningen sker 10 efter tilsætning af 10%'s CTAB-opløsning. Der omrøres i 15 minutter ved 0°C. Fældningerne skilles fra ved filtrering og opløses under 15 minutters omrøring i kaliumphos-phat- henholdsvis ammoniumsulfat-opløsninger med stigende koncentrationer. De opnåede resultater fremgår af den føl-is gende tabel VII.

Tabel VII

Saltop- Saltkoncen- Aktivitets- Specifik løsning tration_udbytte aktivitet Bemærkninger (NHJoSO. 0,05 m 13% 14 E/mg uopløst re- 20 q Δ * manens " 0,10 m 60% 24 E/mg " 0,15 m 65% 25 E/mg ringe mængder uopløst remanens " 0,20 m 73% 28 E/mg ringe mængder 25 uopløst re manens " 0,25 m 74% 27 E/mg " " (Κ,Η)-ΡΟ. 0,05 m 3% 9 E/mg uopløst re- J manens 30 " 0,10 m 22% 13 E/mg " " 0,15 m 34% 16 E/mg " 0,20 m 40% 21 E/mg " 0,30 m 56% 27 E/mg ringe mængder " 0,40 m 67% 28 E/mg uopløst re- " 0,50 m 73% 27 E/mgJ manens U9821 27

O

Eksempel 23 til 26 (CTAB-fældningsforsøg med forskellige ud- gangsoplø sninger) I de følgende forsøg fældes pullulanase under de i eksemplerne 18-22 fundne optimale betingelser fra for-5 skellige udgangsopløsninger.

(Eksempel 23) udgangsopløsning: 70 ml dialyseret øvre fase fra (eksempel 11) saltkoncentration svarende til 0,02-0,03 molær PO^3-, pH = 7,0, aktivitet 72 E/ml, specifik aktivitet efter en gel-elektroforese 3,6 E/mg 10 (£.9% ren pullulanase).

Fældningen sker ved tilsætning af en 10%'s CTAB- -opløsning svarende til 0,18 jimol CTAB/E pullulanase. Der omrøres i ca. 2 timer ved 0°C. Fældningen skilles fra ved centrifugering og opløses i 50 ml 0,5 molær kaliumphosphat 15 (pH = 7,5) .

Der fås følgende analytiske værdier: Aktivitetsudbytte 85 E/ml =. 80%, specifik aktivitet ca. 21 E/mg (A.52%), rensnings faktor 5,8 (rensningsfaktor lig specifik aktivitet i opløst fældning/specifik udgangsaktivitet).

20 (Eksempel 24) udgangsopløsning: 50 ml dialyseret øvre fase (eksempel 11), saltkoncentration svarende til 3_ 0,03 molær P0^ , pH = 7,0, aktivitet 42 E/ml, specifik aktivitet efter gel-elektroforese 12 E/mg (30%).

Fældningen sker efter tilsætning af en 10%'s CTAB-25 -opløsning svarende til 0,16 jimol CTAB/E pullulanase. Der omrøres i ca. 1 time ved 0°C. Fældningen skilles fra ved centrifugering og opløses i 10 ml 0,5 molær kaliumphosphat (pH = 7,5) .

Der fås følgende analytiske værdier: aktivi-30 tetsudbytte 147 E/mg = 70%, specifik aktivitet efter gel-elektroforese 30 E/mg (Λ.75%), rensnings faktor 2,5.

Ved afprøvninger af protease-aktivitet fås der i udgangsmaterialet spormængder, medens der i det opløste bundfald efter CTAB-fældning ikke kunne påvises nogen 35 aktivitet. Ved eftervisning af α-amylase (Phadebas a-amy-lasetest/Pharmacia) fås der i udgangsmaterialet en værdi 149821 28

O

på 30 E/l = 0,03 E/ml, medens der i det opløste bundfald, efter CTAB-fældning ikke kan påvises nogen aktivitet.

(Eksempel 25) udgangsopløsning: 20 ml dialyseret øvre fase. (Eksempel 11) saltkoncentration 0,03 molær 3 _ 5 P04 , pH = 7,0, aktivitet 28 E/ml, specifik aktivitet ef ter gel-elektroforese 8,4 E/mg (21%).

Fældningen sker ved tilsætning af en 10%'s CTAB--opløsning svarende til 0,18 umol/E pullulanase. Der omrøres i ca. 15 minutter ved 4°C. Fældningen skilles fra 10 ved filtrering og opløses i 20 ml 0,5 molær kaliumphos-phat (pH = 7,5).

Der fås følgende analytiske værdier: aktivitetsudbytte 22,5 E/ml = 80%, specifik aktivitet efter gel--elektroforese 23 E/mg (£58%), og rensningsfaktor 2,8.

15 (Eksempel 26) udgangsopløsning: 15 ml af en øv

re fase (eksempel 11), der dialyseres over Amicon XM

3- 100/XM 300, saltkoncentration 0,02 molær P04 , pH = 7,5, aktivitet 19 E/ml, specifik aktivitet efter gel-elektro-forese 23 E/mg (Δ58%), og specifik aktivitet ifølge 20 Lowry 25 E/mg (£62%).

Fældningen sker efter tilsætning af en 10%'s CTAB-opløsning svarende til 0,16 umol/E pullulanase. Der omrøres i ca. 15 minutter ved 0°C. Fældningen skilles fra ved centrifugering og opløses i 10 ml 0,5 molær kalium-25 phosphat (pH = 7,5).

Der fås følgende analytiske værdier: aktivitetsudbytte 22,8 E/ml = 80%, specifik aktivitet efter gel--elektroforese 34 E/mg (Δδ5%), specifik aktivitet ifølge Lowry 36 E/mg (Δ. 90%) og rensningsfaktor 1,45.

30 Forsøg på påvisning af α-amylase-aktivitet og protease-aktivitet var negative.

Eksempel 27

Der foretages en undersøgelse af muligheden for 35 fældning af pullulanase med forskellige kationer af nitrogenbaser .

149821 29

O

Der gås ud fra en enzymopløsning med følgende værdier: aktivitet 20,8 E/ml, saltkoncentration 0,02 mo- 3_ lær PO^ , pH = 7,5. Fældningen opløses hver gang i 0,4 molær natriumchlorid. Af fældningsmidlerne fremstilles 5 der hver gang en 10%'s vandig opløsning.

De opnåede resultater fremgår af den følgende tabel VIII.

Tabel VIII

10 For- % Aktivitet % Aktivitet søg Fældningsmiddel i fældning i opløsning Bemærkninger 1 tetramethylam- 0 85 ingen fældning moniumchlorid 2 N-dodecylpyri- 80 20 diniumchlorid 15 3 N-cetylpyridi- 82 6 niumchlorid

Eksempel 28 I dette eksempel sammenlignes kvaliteten af fæld-20 ninger af pullulanase med cetyltrimethylammoniumbromid, N--dodecylpyridiniumchlorid og N-cetylpyridiniumchlorid.

Som udgangsopløsning anvendes der en ved ultrafiltrering over Amicon XM 100 koncentreret opløsning (ca.

35 E/ml, ca. 31% pullulanase i det opløselige protein, 25 0,05 molær kaliumphosphat og pH = 7,5).

Fældningen sker hver gang ved tilsætning af 0,02% (efter vægt pr. vægtenhed) af fældningsmidlet svarende til 0,15 til 0,20 pnol/E pullulanase. Der omrøres i 15 minutter ved ca. 0°C, og bundfaldene opløses i 0,4 molær natri-30 umchloridopløsning.

Resultaterne fremgår af den følgende tabel IX.

35 0 149821 30

Tabel IX

Aktivitet Aktivitet Pullulanase ik-i fældnin- i opløs- ke i protein- Rensnings-Fældningsmlddel gen (%) ningen (%) fældningen (%) faktor

Cetyltrimethyl- 53 26 61 1,97 5 ammoniumbromid N-Dodecylpyri- 80 20 48 1,54 diniumchlorid N-Cetylpyri- 82 6 53 1,70 diniumchlorid 10 Fældningen med CTAB giver med hensyn til rensningsfaktoren det bedste resultat. Yderligere forsøg viser bedre udbytter.

Eksempel 29

Der udføres en undersøgelse af adskilligheden 15 af et tofasesystem med pullulanase og Klebsiella-celler i en tallerkenseparator.

Til dette formål opspaltes et vandigt tofasesy-stem med 10% polyethylenglycol (M 4.000) og 2% dextran (M. 500.000) i en tallerkenseparator (α-Lavel Gyrotester 20 B). Ved forskellige forsøg med fire dyser opnås der en optimal dyselængde på 13,5 mm og en optimal gennemstrømningsydelse på 200 ml pr. minut. Ved denne gennemstrømningsydelse andrager opholdstiden ca. 135 sekunder. Der opnås en renhed af den øvre fase på ca. 100% ved en ren-25 hed i den nedre fase på ca. 82% og et tab af øvre fase på ca. 2%.

Pullulanasen lader sig udvinde for ca. 80%'s vedkommende med en specifik aktivitet på 5-8 enheder E/mg.

30

Eksempel 30-35 Ølgær indfryses tre gange ved -20°C og optøes ved +4°C. pH-værdien holdes på 6,2 med ammoniak. Den klart centrifugerede ovenstående væske tjener som ud-35 gangsopløsning til vandige tofasesystemer. Faserne adskilles ved hjælp af en bordcentrifuge (ca. 5 minutter ved 3.800 omdrejninger pr. minut og 1.850 G).

149821 31

O

Maltasen bestemmes ved hjælp af pseudosubstra-tet 4-nitrophenyl-a-D-glycopyranosid (PNPG) ved 30°C under måling af extinktionsforøgelsen ved 400 nm {én enhed svarer til en omsætning af et pnol PNPG pr. minut 5 ved 30°C).

(Eksempel 30-31; fig. 9). Der foretages en undersøgelse af afhængigheden af K-værdien af phosphat-koncentrationen og polyethylen-glycol-molekylvægten.

Til dette formål arbejdes der med et vandigt polyethy-10 lenglycol-dextran-system med et totalrumfang på 5 ml, 7% polyethylenglyco1 (M 4.000 eller 6.000), 2,5% dex-tran (efter vægt pr. vægtenhed; M 500.000), ca. 0,1 ml enzymopløsning og en kaliumphosphat-puffer med en pH--værdi på 6,8. De fremkomne resultater er angivet gra-15 fisk i fig. 9.

(Eksempel 32-33; fig. 10). Eksemplerne 30-31 gentages med den undtagelse, at der arbejdes i nærværelse af kaliumchlorid i stigende mængder og 0,067 mol kaliumphosphat-puffer (pH = 6,8). De opnåede resultater er 20 angivet grafisk i fig. 10.

(Eksempel 34-35; fig. 11). Eksemplerne 30-31 gentages med den undtagelse, at der arbejdes i nærværelse af natriumsulfat i stigende mængder og 0,067 molær kaliumphosphat-puffer (pH = 6,8). De opnåede resultater er 25 afbildet grafisk i fig. 11.

Eksempel 36 til 38 (fig. 12)

Der foretages en undersøgelse af afhængigheden af K-værdien for maltase af pH-værdien (jfr. eksemplerne 30 30-35). Til dette formål arbejdes der i vandige polyethy- lenglycol-dextran-systemer med - 7% polyethylenglycol (M 4.000) og 2,5% dextran (vægt pr.

vægtenhed; M 500.000) (eksempel 36), - 7% polyethylenglycol (M 6.000) og 2,5% dextran (vægt pr.

35 vægtenhed; M 5.000.000) (eksempel 37), henholdsvis - 9% polyethylenglycol (M 4.000) og 1,25% dextran (vægt pr. vægtenhed; M 500.000) (eksempel 38) og 149821 32

O

med hver gang et totalrumfang på ca. 5 ml, ca. 0,1 ml enzymopløsning og 0,067 molær kaliumphosphat-puffer. De opnåede resultater er angivet grafisk i fig. 12.

5 Eksempel 39-40 (fig. 13)

Der foretages en undersøgelse af afhængigheden af K-værdien for maltase af koncentrationen og af den gennemsnitlige molekylvægt af den anvendte polyethylen-glycol (jfr. i øvrigt eksempel 30-35). Til dette formål 10 arbejdes der i et vandigt polyethylenglycol-dextran-sy-stem med et totalrumfang på ca. 5 ml, stigende mængder af polyethylenglycol (M 4.000 henholdsvis 6.000), 2,5% dextran (vægt pr. vægtenhed; M 500.000), ca. 0,1 ml enzymopløsning og 0,067 molær kaliumphosphatpuffer (pH = 15 6,8). De opnåede resultater er angivet grafisk i fig. 13.

Eksempel 42 (fig. 14)

Der foretages en undersøgelse af afhængigheden af K-værdien for maltase af dextrankoncentrationen og 20 den gennemsnitlige molekylvægt for den anvendte polyethylenglycol (jfr. også eksempler 30-35). Til dette formål anvendes der vandige polyethylenglycol-dextran-systemer med et samlet rumfang på ca. 5 ml, 7% polyethylenglycol (vægt pr. vægtenhed; M 4.000 henholdsvis 6.000), stigen-25 de dextranmængder (vægt pr. vægtenhed; M 500.000), ca.

0,1 ml enzymopløsning og 0,067 molær kaliumphosphat-puffer (pH = 6,8). De opnåede resultater er afbildet grafisk i fig. 14.

30 Eksempel 43 (fig. 15-16)

Der foretages en undersøgelse af afhængigheden af K-værdien og aktivitetsudbyttet for maltase af andelen af cellemassen i den totalt anvendte mængde.

Til dette formål optøes og indfryses ølgær fi-35 re gange (aktivitet ca. 47 143 mE/g) . Der arbejdes i vandige polyethylenglycol-dextran-systemer med et to- 149821 33

O

talrumfang på ca. 5 ml, 9% polyethylenglycol (M 4.000), 2% dextran (vægt pr. rumfangsenhed; M 500.000) og 0,5 molær kaliumphosphat-puffer. pH-værdien andrager ca.

7,2. Cellemængden varierer. Resultaterne fremgår af den 5 følgende tabel X.

Forsøgene viser, at det ved en celleandel i området fra ca. 20% af det totale rumfang (totalrumfang pr. cellemasse (ml/g == 5) er muligt at opnå et aktivitetsudbytte i området fra 75 til 85%. Gærceller-10 ne foreligger ved alle forsøgene i den nedre fase, som endnu er godt strømmedygtig. De opnåede resultater er afbildet grafisk i fig. 15-16.

Yderligere forsøg med frisk tilberedt gær gav et endnu gunstigere rumfangsforhold.

149821 34 •Η Q) Q) }j cfp +)>^<ΝΓ-00000 4J -Q. v * κ ·* w «* ** >1 φρ-Γ'-νοιηιοΟίη icwoooooocor^r^ro ο Φ n) D « Ή E-TT ffl m Q O m id O id O Id ro O ro m σι in vo

W CM CM CM CM Η Η O

0) 01 td r—i SM*Hr-~HCMCMin α)\ΗΓΊΐΛΐ>σισιοο +J k Η · · . t i .

a>OSCMrom«d<ioOcM +1 (V iS r) N

H 3 +1 > a) ty *ri tu +1 fi +) «1 _

jj(d ,¾ id —ι Ο σι m h cm σι O

>,IH tflHH.QCMHC-r-CMQ

S e βΟ'ίΝΟιηΊ'Ο S 3 a v. ··»··· · 3 jj kPJinvOOOHmiOin

01 H > S Η Η Η H

4-> Id ID S·—< ai -P oi +J ο oi h k id > S a) a s ω mm +j a> ·—i oi id

,¾ H rl Id <H

id h ai Ή rr1 m O m Q m in in ai o ai H i-ι oo 'Φ ro O vo m cd tn i ai k sis -

0 +J Μ Π0 1—1 CM CM CM CM Η Η O

+> « J> ω >a c ai c 82 ai Ό ai Η ·Η H k* ai ό o a

•Q k X! Id ID

id M k ω

Eh > ο ή Id Λ iiHid ΐΗ-^ΜίοιηοοΟίΜΓ^

WIH+1 (DEHHHHCMCMCM

IH Id CP k ^

Id « 13 ai > a) fl oi 3 01 id cp

Λ +> O

tJ> rH

•η (d φ

Cn S w

C fO

tø M M-l ~ 430 rHC^ φ in ΐί) η ^ n ΐμ ιμ (yg·, -·.·»·»·»·.·*

eC k^cococnmnmcM

> ·© 0)

Oi 01 a oi id id i-ι E '—* gaitPH η o «a· cm m o 3Η^~ ' ~ - - - *

k Η Η Η 01 in M1 CO CM

H 0) g H

id o ^ +> $ k ft

CP

•a 01 H CM Cl M1 m 10 C~~ k o h U9821 35

O

Eksempel 44 I dette eksempel undersøges adskilligheden af et vandigt tofasesystem med maltase og oplukkede ølgærceller i en tallerkenseparator (o-Laval-Gyro-Tester B).

5 Til dette formål gås der ud fra 830 g ølgær, der er blevet oplukket ved tre ganges optøning og ind- g frysning (i alt 229,2 x 10 mE). Der arbejdes med et system med et totalrumfang på 2.500 ml, 9% (224 g) poly-ethylenglycol (M 4.000), 2% (49 g) dextran (vægt pr.

10 rumfangsenhed? M 500.000) og 0,5 molær kaliumphosphat-puffer. pH-værdien andrager 7,2.

Der arbejdes med fire dyser, en dyselængde på 13,5 mm, en gennemstrømningsydelse på 200 ml pr. minut og en opholdstid på 135 sekunder ved stuetemperatur.

15 Aktivitetsudbyttet af de samlede fraktioner af øvre fase andrager 74,4% af udgangsmaterialet (teoretisk 79%) .

Eksempel 45 20 Der foretages en undersøgelse af adskillelighe den af et vandigt tofasesystem med maltase og oplukkede Ølgærceller i en tallerkenseparator (a-Laval-Gyro-Tester B) .

Til dette formål gås der ud fra 800 g ølgær, 25 der er blevet oplukket ved tre ganges optøning og ind- g frysning (aktivitet i alt 197,1 x 10 mE). Der arbejdes med et vandigt system med et samlet rumfang på 2,2 liter (2.400 g), 9% (216 g) polyethylenglycol (M 4.000), 1,75% (vægt pr. vægtenhed; 42 g) dextran (M 500.000) og 0,5 mo-30 lær kaliumphosphatpuffer med en pH-værdi på 7,2.

Den anvendte separator har fire dyser med en dyselængde på 13,5 mm. Der arbejdes ved en gennemstrømningsydelse på 200 ml pr. minut, en opholdstid på 135 sekunder og ved stuetemperatur. Aktivitetsudbyttet af de 35 samlede øvre faser udgør 70,8% af udgangsmaterialet (teoretisk 73,4%).

149821 36

O

Yderligere forsøg med 20% cellemasse (totalrum-fang/cellemasse = 5) viser, at der kan opnås endnu højere udbytter.

5 Eksempel 46

Der suspenderes 1 kg Escherichia coli MEE 600 i 0,05 molær vandig kaliumphosphat (pH =8,0) og oplukkes 2 to gange ved 600 kg pr. cm i en højtrykshomogemsator (Manton Gaulin). Proteinkoncentrationen andrager 47,2 mg 10 pr. ml. Denne oplukning anvendes til forskellige forsøg, for hvilke der er angivet enkeltheder i tabel XI.

Ifølge fasediagrammet for polyethylenglycol (M 6.000)/kaliumphosphat-systemet skulle der ikke indtræde nogen faseadskillelse under betingelserne for forsøg 15 nr. 3. Det er. imidlertid kendt, at celler eller cellerester indgår som polymere i fasediagrammerne. Ved forsøg nr. 3 indtræder der en tydelig faseadskillelse, idet celleresterne går over i den højviskose nedre fase.

20 Eksempel 47

Der suspenderes 1 kg Escherichia coli MEE 600 i 1,4 liter (0,05 mol) vandig kaliumphosphatpuffer (pH = 8,0) , og der oplukkes som beskrevet i eksempel 46. Til suspensionen sættes der 656 g af en 50%'s polyethylengly-25 colopløsning (M 6.000) og 525 g af en 50%'s dikaliumhy- drogenphosphat-opløsning (pH = 7,8). Faserne skilles i en tallerkenseparator (α-Laval-Gyro-Tester B) med en dyselængde på 14,5 mm og en gennemstrømningshastighed på 160 ml pr. minut. Opholdstiden er 169 sekunder.

30 35 i 149821 37 rtj tK> m § (0 +J Q) I tfl <U i—I rd

+> >,+) VO H VO

4-1 O 0) H CM Ον

>1 d iS

Λ 0) -P

d H ti D O >1

to to Η I

0) to (0 m co Η σ> OH ' '

H g CM CM H

τι ^ 0) is Q) to to in —. m r- m* h *· *· * <U g t— r- r-~ n -- > o< 0 ft — K <*> I I 00

H CM

X w

r—I

<u ο o Λ o o

(d Ο O

E-l is o o i o o o o

CM CM

a <d U —

4J <*> o* co I

K ~ a> a o o o

m m O

lg in in O

* · ·

i—I r—i VO

1 i—i >1 0 Λ 0 +i >,Λ r— Γ'' Ο 0 Η όΡ r-t rH i—) >ι

Η β Ο (0 ft rH

tn •a · to Μ

β β .-1 CM CO

Ο ft 149821 38 o

Der opnås en god adskillelse af celleresterne ved godt enzymudbytte og samtidig forbedring af den specifikke aktivitet med en faktor på ca. 2. Enkeltheder fremgår af den følgende tabel XII.

5

Tabel XII

Volumen Protein Aktivitet %

Prøve_(ml) (mg/ml) (%) IRS LRS PRS

Råeks- 10 trakt 2.100 41,6 100 100 100 100 Øvre fase 2.640 16,4 49 82 82 100

Forkortelser: IRS = Isoleucyl-tRNA-synthetase LRS = Leucyl-tRNA-synthetase 15 PRS = Phenylalanyl-tRNA-synthetase

Eksempel 48

Der suspenderes 500 g Escherichia coli i 700 ml 0,05 molær vandig kaliumphosphatpuffer (pH = 8,0), og der 20 oplukkes ved tre ganges gennemledning gennem en glasperlemølle (Dynamomølle fra Bachofen) (glasperler 0,25-0,5 mm, 5 liter pr. time, 3.000 omdrejninger pr. minut). Den fremkomne suspension indstilles på værdier på 10% polyethylen-glycol (M 6.000) og 8% kaliumphosphat (pH = 7,8) og opde-25 les som beskrevet i eksempel 47 i en separator.

Der opnås igen en god adskillelse af celleresterne fra den øvre fase ved samtidig højt enzymudbytte og en forbedring af den specifikke aktivitet med en faktor 2. Enkelthederne fremgår af den følgende tabel XIII.

30

Eksempel 49-54

Der foretages en undersøgelse af afhængigheden af fordelingskoefficienten K for isoleucyl-tRNA-syntheta-se af forskellige parametre i et vandigt tofasesystem med 35 et indhold af polyethylenglycol og dextran.

(Eksempel 49; fig. 17) . Der foretages en vinder-

O

39 149β21 søgelse af afhængigheden af fordelingskoefficienten K af pH-værdien i nærværelse af forskellige pufferstoffer. Til dette formål anvendes der et tofasesystem med 5,0% poly-ethylenglycol (M 6.000), 5,0% dextran (M 500.000), 2 mmol 5 DTE, 1,5 jumol isoleucyl-tRNA-synthetase og 0,06 molær puffer (kaliumphosphat, natriumcitrat, tris-maleat, natrium-cacodylat, natriumacetat eller tris/HCl).

Ved kaliumphosphat- og natriumcacodylat-puffer stiger K-værdien med stigende pH-værdi. I nærværelse af 10 andre pufferstoffer er K-værdien uafhængig af pH-værdien.

Heraf fremgår det, at pH-værdien ikke som enkelt parameter har indflydelse på fordelingen af enzymet.

(Eksempel 50; fig. 18). Der foretages en undersøgelse af afhængigheden af fordelingskoefficienten K af 15 koncentrationen af forskellige pufferioner. Hertil anvendes der et system med 5,0% polyethylenglycol (M 6.000), 5,0% dextran (M 500.000), 2 mmol DTE, 1,5 jumol isoleucyl--tRNA-synthetase og følgende puffere: kaliumphosphat (pH = 7,5), natriumcitrat (pH = 6,3), natriumcacodylat (pH = 20 7,0), tris/HCl (pH = 7,0) og natriumacetat (pH = 6,0).

K-værdien stiger kun med stigende koncentration af phosphatpufferen. Ved andre pufferstoffer er den praktisk taget uafhængig af pufferkoncentrationen.

(Eksempel 51; fig. 19). Der foretages en under-25 søgelse af afhængigheden af fordelingskoefficienten K af den gennemsnitlige molekylvægt af polyethylenglycolen.

Hertil anvendes der et system med 9,2% polyethylenglycol, 6,3% dextran (M 2.000.000), 73 mmol kaliumphosphat (pH = 7,0), 2 mmol DTE og 3,4 umol isoleucyl-tRNA-synthetase.

30 Ved en gennemsnitlig molekylvægt for polyethy lenglycolen på mindre end 20.000 stiger K-værdien kraftigt med faldende molekylvægt. Enzymet foretrækker mere og mere den polyethylenglycol-rige fase med faldende molekylvægt for polyethylenglycolen.

35 (Eksempel 52; fig. 20). Der foretages en under søgelse af afhængigheden af fordelingskoefficienten K af 0 149821 40 den gennemsnitlige molekylvægt af dextranen. Hertil anvendes der et system med 9,2% polyethylenglycol (M 6.000), 6,2% dextran, 73 mmol kaliumphosphat (pH =7,0), 2 mmol DTE og 3,4 umol isoleucyl-tRNA-synthetase.

5 Molekylvægten for dextranen udøver ligesom mole kylvægten for polyethylenglycolen en indvirkning på K-vær-dien. Imidlertid stiger K-værdien med stigende molekylvægt for dextranen.

(Eksempel 53Γ-54; fig. 21-22). Der foretages en 10 undersøgelse af afhængigheden af fordelingskoefficienten K af dextran-koncentrationen og polyethylenglycol-koncen-trationen. Hertil anvendes der et tofasesystem med 10,2% polyethylenglycol (M 1.550), dextran (M 2.000.000), 73 mmol kaliumphosphat (pH = 7,0), 2 mmol DTE og 2,8 pmol 4 15 isoleucyl-tRNA-synthetase eller et tofasesystem med poly-ethylenglycol (M 1.550), 6,3% dextran (M 2.000.000), 73 mmol kaliumphosphat (pH = 7,0), 2 mmol DTE og 2,8 pnol isoleucyl-tRNA-synthetase.

Det fastslås, at koncentrationerne af de højmo-20 lekylære stoffer i de undersøgte områder ikke har nogen stor indflydelse på fordelingskoefficienten K.

Eksempel 55

Der foretages en undersøgelse af afhængigheden 25 af K-værdien af pullulanase af andelen af cellemassen i den samlede udgangsmængde i vandige tofasesystemer. Til dette formål behandles frosne Klebsiella-celler som sædvanligt med phosphatpuffer, polyethylenglycol (M 4.000) og dextran (M 500.000). Phosphatkoncentrationen er 0,3 mo-30 lær. Derefter fraskilles der ved centrifugering, og de fremkomne resultater er sammenstillet i tabel XIV.

Når der foreligger cellemasse i en mængde på ca.

25% og mere, må man regne med en formindskelse af K-værdien. Endvidere forandrer volumenforholdet sig til gunst for 35 den nedre fase, således at der fås større aktivitetstab.

En cellemassekoncentration på fra ca. 25 til 149821 41

O

30% synes således hensigtsmæssigt, eftersom viskositetsforøgelsen i dette område holder sig inden for visse grænser og kan opnås med separatorer med højere gennemsnitsydelser end ved større cellemassekoncentrationer.· Med vær-5 dierne fra tabel XXV fås der for en suspension med ca. 25% cellemasse (phosphatpuffer:cellemasse = 3) ca. følgende udbytte: 100/(1 + VB/VT K) = 100/1,123 =90%.

Eksempel 56-57 10 Der foretages en undersøgelse af afhængigheden af fordelingskoefficienten K af pullulanase af forskellige parametre i et vandigt tofasesystem med et indhold af polyethylenglycol og ammoniumsulfat.

(Eksempel 56). Til dannelse af tofasesystemet 15 anvendes der polyethylenglycol (M 4.000, 50%'s vandig opløsning) , fast ammoniumsulfat og hver gang 5 ml af en 60%'s enzymopløsning (pH =7,5, saltkoncentration ca.

3_ 0,02 molær PO^ ). De enkelte værdier fremgår af tabel XV.

149821 42 I ^ o &» I H\

S rl H

H m g

Co'S· o^wovvonvoio f—j --------(1) id · a> wcttroro^incocom -p CJl M 2

0 G in ' S

t* <d g I

Ή B ®

' rH

(U

Q) O

P ω tt) i« \ ω h g r< p «) 0) _ _ ® ft j gTj t^O'S’OmOOui &

W *44 tt) ^ - - - " - - - - G

O '44 H <D ΟΗΗίΝΜΠ'φίΛ-Ρ

G 3 P P

ft ft tt) 0) 0 tt3

H

p 43 οιοσ)>ΌφνοΟΟ «Må σιοιοιοοσιωο > » U) ----'---· 1.0 O HCttcacsmoicMfo Z ~ 43 ft .. o (1) Dl in id tt) <44 tp in

> (BOOinr'r-i'S'Or-tmcN

H (1) p --------- X p Ό OrP'PMt'JCMronoo H tå Φ *8 E4 0)

Dl

Π) <Q

ip ^ ^•t^^'nco^f-uiroO

Ulla mroroncttCMCttrttrP

P ^ Ό tt)

Z

0) m G „ in ip lOinooooOooOio øS ^lovøvovør^r^coco u w § tø

+JdP NWNMMMWOIOI

X ~ 0)

Q

1 r-t >1 O 43 O

p >i — al h tf σισισιοσιΦΟ'Ο'Ο' >i o>~ r4 G O tt) ft r4

Tabel XV

43

O

umi

Polyethylen- Aktivitets- _g yco udbytte i Øvre Nedre 2S°4 (M 4.000; saltfase fase fase (%/vægt/vagt) %/vægt/vægt) K-værdl_(%)_(ml) (ml) 8.5 16 0,37 56,5 8.5 18 0,40 45,5 3,6 1,1 9;5 14 0,37 60,4 3,0 1,8 9.5 16 0,47 52,8 3,1 1,7 10 9,5 18 0,51 48,2 3,3 1,5 11 11 0,33 79,0 2,2 2,5 11 12 0,38 69,4 2,4 2,3 11 14 0,39 66,9 2,6 2,1 15 11 16 1,08 43,4 2,4 2,2 11 18 2,38 23,2 2,6 2,1 12 8 0,28 88,2 1,5 3,2 12 9 0,27 84,6 1,6 3,1 12 10 0,29 77,6 1,8 2,8 20 12 12 0,73 52,8 2,0 2,7 12 14 0,93 44,2 2,1 2,5 12 16 1,10 30,1 2,2 . 2,4 12 18 9,36 7,8 2,3 2,3 25 .

(Eksempel 57). Til dannelse af tofasesystemet anvendes der polyethylenglycol (M 4.000, 50%'s vandig opløsning), fast ammoniumsulfat, hver gang 5 ml af en 60%'s enzymopløsning (pH = 7,5, saltkoncentration ca. 0,02 molær 3_ 30 PO^ ) og en kaliumphosphatpuffer (pH = 7,5). De enkelte værdier fremgår af den følgende tabel XVI.

35

Tabel XVI

44

O

14***1 , , Aktivi-

Polyethylen- tetsud- fNH 1 so ^glycol Kalium- bytte i Øvre Nedre *^4 2S°4 (M 4.000} phosphat K- saltfase fase fase 5 (%/vagt/vægt) %/vægt/vægt) (mmol) -værdi (%)_(ml) (ml) 9.5 14 - 0,38 58,5 3,0 1,6 9.5 14 10 0,29 69,9 2,8 1,9 9.5 14 20 0,42 62,9 2,8 2,0 9.5 14 30 0,31 72,5 2,6 2,1 10 9,5 14 50 0,40 67,1 2,6 2,1 9.5 14- 100 0,88 52,1 2,4 2,3 9.5 14 200 6,47 12,9 2,3 2,3 9.5 14 300 42,63 1,1 2,1 2,6 15 . Det fremgår af tabellerne XV og XVI, at pullula-nasen med stigende koncentration af ammoniumsulfat og po-lyethylenglycol opløses stærkere i den polyethylenglycol--holdige øvre fase. Endvidere kan der med stigende phos-20 phatkoncentration erkendes en kraftigere stigning i K-vær-dien.

Tabel XIII

Volumen Protein Aktivitet (%)

25 Prøve_{%)_(mg/ml) (%) IRS LRS PRS

Råekstrakt 1.050 44,0 100 100 100 100 Øvre fase 1.600 12,4 43 93 75 86 30

Forkortelser: IRS = Isoleucyl-tRNA-synthetase LRS = Leucyl-tRNA-synthetase PRS = Phenylalanyl-tRNA-synthetase 35

O

45 U9B21

Eksempel 58 I dette eksempel beskrives udvindingen af phos-phorylase ved hjælp af et vandigt polyethylenglycol-dex-tran-system.

5 Til dette formål fortyndes en ved pullulanase- -isoleringen fremkommen nedre fase (0,65 kg cellemasse pr.

liter) i forholdet 1:2 med vand, der tilsættes eventuelt 5 mg DNAase pr. liter til enzymatisk nedbrydning af DNA, der omrøres i flere timer, hvorefter der oplukkes med en 10 homogenisator (Manton-Gaulin) ved et tryk på 600 kg pr.

2 cm . Phosphorylaseaktiviteten andrager 11 enheder pr. ml, proteinindholdet 19 mg pr. ml og den specifikke aktivitet 0,6 enheder pr. mg.

Der opbygges et tofasesystem ved blanding af 15 følgende komponenter i de angivne mængder: 2,0 ml fortyndet nedre fase fra pullulanasefraskillelsen (eksempel 11) efter oplukning 0,9 ml 50%'s polyethylenglycol (M 1.550) 0,6 ml 5 molær NaCl 20 0,5 ml 2,5 molær K2HP04 (pH = 9,4) 0,7 ml vand med 5 jil β-mercaptoethanol 4,7 ml resulterende blanding (pH = ca. 7,8).

Suspensionen blandes kraftigt i 1,5 minutter og centrifugeres i 10 minutter med ca. 4.000 G. Herved fås 25 der 3,4 ml klar øvre fase og 1,3 ml nedre fase, der indeholder celleresterne. Phosphorylaseaktiviteten i den øvre fase andrager 5,5 enheder pr. ml, proteinindholdet 7,7 mg pr. ml, den specifikke aktivitet 0,7 enheder pr. mg, berigelsen ca. 1,2 og udbyttet 84%.

30

Anvendte forkortelser

Ficoll = syntetisk polysaccharid, dannet ved po lymerisation af rørsukker, M ca. 400.000.

Dextran = polysaccharid fra glycose, empirisk for- 35 mel ^C6H10°4^x*

Tris = tris-(hydroxymethyl)-aminomethan.

O

46 US$21 DEAE-dextran = diethylaminoethyl-dextran.

DEAE-cellulose = diethylaminoethyl-cellulose.

E ' = enzymenhed, der frigør 1 jumol malto- triose fra pullulan pr. minut.

5 Triton X 100 = octylphenyl-polyethylenglycolether (ik- ke-ionisk detergent).

EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre (dinatrium salt) .

CTAB = cetyltrimethylammoniumbromid.

10 Amicon XM 100 = ultrafiltreringsmembran, oplukningsgræn se ca. M 100.000 (Amicon Corporation).

Amicon XM 300 = ultrafiltreringsmembran, oplukningsgræn se ca. M 300.000 (Amicon Corporation).

Claims (13)

1. Fremgangsmåde til udvinding af enzymer fra en blanding opnået ved behandling af enzymholdige mikroorganismeceller, ved hvilken enzymerne opløseliggøres, R kendetegnet ved, at blandingen indeholdende cellevæsken og celleresterne eller cellerne fordeles mellem faserne i et vandigt flerfasesystem med et indhold af et højmolekylært stof udvalgt blandt eventuelt substituerede polyalkoholer, polyethere, polyestere, poly-vinylpyrrolidoner og polysaccharider samt yderligere enten mindst ét uorganisk salt eller endnu mindst ét højmolekylært stof udvalgt blandt eventuelt substituerede polyalkoholer, polyethere, polyestere, polyvinylpyrroli- doner og polysaccharider, eller begge dele, hvorpå fasen 15 med enzymerne adskilles fra fasen med celleresterne eller cellerne, og den enzymholdige fase oparbejdes, og enzymerne isoleres bl.a. fra det deri indeholdte høj-molekylære stof.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g- 20 net ved, at der som det højmolekylære stof anvendes polyethylenglycol.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at der som det højmolekylære stof anvendes en eventuelt substitueret polyalkohol eller polyether 25 med en gennemsnitlig molekylvægt mindre end 40.000, navnlig mindre end 10.000.

4. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af de foregående krav, kendetegnet ved, at man anvender et flerfasesystem indeholdende sulfat og/eller phosphat, 30 fortrinsvis kaliumphosphat.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes et flerfasesystem indeholdende polyethylenglycol og dextran.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendete g-35 net ved, at dextranen har en gennemsnitlig molekylvægt væsentligt større end molekylvægten for enzymet. O 149821

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at der anvendes et flerfasesystem med et totalindhold af polyethylenglycol på mindst 1 og fortrinsvis på 4-9 vægtprocent.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendeteg net ved, at der anvendes et flerfasesystem med et totalindhold af dextran på 0,1-15 og fortrinsvis på 0,1-7 vægtprocent.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 5 til udvinding af 10 pullulanase, kendetegnet ved, at der anvendes et flerfasesystem med en phosphation-koncentration på mere end 0,001 molær, fortrinsvis mere end 0,005 molær, navnlig mere end 0,02 molær.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 5 til udvinding 15 af maltase, kendetegne t ved, at der anvendes et flerfasesystem med en phosphation-koncentration på mere end 0,1 molær, fortrinsvis mere end 0,3 molær, navnlig mere end 0,5 molær.

11. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af de fore-20 gående krav, kendetegnet ved, at der anvendes et flerfasesystem med et forhold mellem totalrumfang og cellemasse >2, fortrinsvis >5.

12. Fremgangsmåde ifølge mindst et af de foregående krav, kendetegnet ved, at dér anvendes 25 et flerfasesystem med en pH-værdi på 6-9, fortrinsvis på 7-8.

13. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af de foregående krav (med undtagelse af krav 10) til udvinding af pullulanase, kendetegnet ved, at pullulana-30 sen udfældes fra den enzymholdige fase, eventuelt efter fraskillelse af de højmolekylære stoffer, med en forbindelse med følgende almene formel: 12 3 4 NR R RJR X, 35. hvilken R^ betegner en organisk rest med mindst 10, 2 3 4 især 10-20 carbonatomer, R , R og R , der kan være ens