JPS63105679A - Ｒｎａポリメラーゼ遺伝子及び該遺伝子を保有する微生物 - Google Patents
Ｒｎａポリメラーゼ遺伝子及び該遺伝子を保有する微生物Info
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- JPS63105679A JPS63105679A JP61248503A JP24850386A JPS63105679A JP S63105679 A JPS63105679 A JP S63105679A JP 61248503 A JP61248503 A JP 61248503A JP 24850386 A JP24850386 A JP 24850386A JP S63105679 A JPS63105679 A JP S63105679A
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- dna
- plasmid
- bacteriophage
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、８Ｐ６パクテリオフアージＲＮＡポリメラー
ゼ産生遺伝情報を担うＤＮＡ及び該Ｄ ＮＡｔ−組込ん
だプラスミドを導入させた新規な微生物、特に大腸菌並
びにそれを用いるＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポリ
メラーゼの製造方法に関する。
ゼ産生遺伝情報を担うＤＮＡ及び該Ｄ ＮＡｔ−組込ん
だプラスミドを導入させた新規な微生物、特に大腸菌並
びにそれを用いるＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポリ
メラーゼの製造方法に関する。
ＳＰ６パクテリオフアージＲＮＡポリメラーゼは、ｊ９
８２年に発見され、生化学的研究が、なされてきた。近
年の分子遺伝学の進展に伴い、均一な大量ＲＮＡ合成、
ノザン（Ｎｏｔｈｅｒｎ ）、あるいはサザン（５ｏｕ
ｔｈｅｒｎ ） プロッティングに用いる高放射活性
な一末鎖ＲＮＡグローブ調製等の必要性が高まっている
。これらの必要性全解決するために、サルモネラ チフ
イムリウＡ （８ａ１ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ ） に感染するバクテリオファージ８Ｐ６
により産生されるＲＮＡポリメラーゼの有用性が確認さ
れるに至り、その有利な製造方法の開発が望まれていた
。
８２年に発見され、生化学的研究が、なされてきた。近
年の分子遺伝学の進展に伴い、均一な大量ＲＮＡ合成、
ノザン（Ｎｏｔｈｅｒｎ ）、あるいはサザン（５ｏｕ
ｔｈｅｒｎ ） プロッティングに用いる高放射活性
な一末鎖ＲＮＡグローブ調製等の必要性が高まっている
。これらの必要性全解決するために、サルモネラ チフ
イムリウＡ （８ａ１ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ ） に感染するバクテリオファージ８Ｐ６
により産生されるＲＮＡポリメラーゼの有用性が確認さ
れるに至り、その有利な製造方法の開発が望まれていた
。
従来知られている８Ｐ６バクテリオファージＲＮＡポリ
メラーゼの製造方法としては、ハトラーらの方法がある
。パトラ−らは、バクテリオファージｓｐ６’ｌサルモ
ネラ チフィムリウムに重感染させた後、その菌体より
回収する製造方法を確立している。本方法は、ジャーナ
ルオプ バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第２５７巻、第５７７
２頁（１９８２年）に記載されている。
メラーゼの製造方法としては、ハトラーらの方法がある
。パトラ−らは、バクテリオファージｓｐ６’ｌサルモ
ネラ チフィムリウムに重感染させた後、その菌体より
回収する製造方法を確立している。本方法は、ジャーナ
ルオプ バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第２５７巻、第５７７
２頁（１９８２年）に記載されている。
しかしながら、サルモネラ チフイムリウムにバクテリ
オファージ８Ｐ６’ｉ感染させて得られるＲＮＡポリメ
ラーゼの含量は少なく、また、操作も煩雑であり、本酵
素を大量に得ることは困難であった。一方、この遺伝子
の単離及び該遺伝子を種々ベクターに結合して、クロー
ニングする方法については、いまだ明らかにされていな
い。
オファージ８Ｐ６’ｉ感染させて得られるＲＮＡポリメ
ラーゼの含量は少なく、また、操作も煩雑であり、本酵
素を大量に得ることは困難であった。一方、この遺伝子
の単離及び該遺伝子を種々ベクターに結合して、クロー
ニングする方法については、いまだ明らかにされていな
い。
本発明の目的は、ＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポリ
メラーゼの工業的製造に適したＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子を含むプラスミド全導入した新規微生物、特に大腸菌
の割裂及びそれ音用いたＳＰ６バクテリオファージＲＮ
Ａポリメラーゼの製造方法を提供することにおる。
メラーゼの工業的製造に適したＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子を含むプラスミド全導入した新規微生物、特に大腸菌
の割裂及びそれ音用いたＳＰ６バクテリオファージＲＮ
Ａポリメラーゼの製造方法を提供することにおる。
本発明全概説すれば、本発明の第１の発明は、ＳＰ６バ
クテリオファージＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する。
クテリオファージＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する。
また、本発明の第２の発明は新規微生物に関する発明で
あって、ＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子が組込まれたプラスミドを保有していること’（
ｒ％徴とする。
あって、ＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子が組込まれたプラスミドを保有していること’（
ｒ％徴とする。
更に、本発明の第３の発明は、ＳＰ６バクテリオファー
ジＲＮＡポリメラーゼの製造方法に関する発明であって
、前記第２の発明の新規微生物全培養し、培養物よりＳ
Ｐ６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ全採取する
こと全特徴とする。
ジＲＮＡポリメラーゼの製造方法に関する発明であって
、前記第２の発明の新規微生物全培養し、培養物よりＳ
Ｐ６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ全採取する
こと全特徴とする。
本発明者らは、バクテリオファージ５Ｐ６ＤＮＡより、
ＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ遺伝子全
領域を含む２．７５ ｋｂＤＮ’Ａ’（ｌ−クローニン
グすることに成功し、更にこのＤＮＡ断片を含むプラス
ミド全導入した微生物、特に大腸菌を培養することによ
り、菌体中に著量のＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポ
リメラーゼが蓄積すること全見出し、本発明を完成した
。
ＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ遺伝子全
領域を含む２．７５ ｋｂＤＮ’Ａ’（ｌ−クローニン
グすることに成功し、更にこのＤＮＡ断片を含むプラス
ミド全導入した微生物、特に大腸菌を培養することによ
り、菌体中に著量のＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポ
リメラーゼが蓄積すること全見出し、本発明を完成した
。
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明に係る新規微生物、例えば大腸菌は次に例示する
工程により得ることができる。
工程により得ることができる。
１）ＤＮＡ供与体であるバクテリオファージＳＰ６から
ファージＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断し、ＤＮＡ断
片を回収する。
ファージＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断し、ＤＮＡ断
片を回収する。
２）回収したＤＮＡ断片を末端よｆ） Ｂａｄ ３１エ
キンヌクレアーゼにより、消化し短くする。
キンヌクレアーゼにより、消化し短くする。
６）プラスミドベクターを制限酵素で開裂し、この開裂
部位に、２）で得たＤＮＡ断片を結合させる。
部位に、２）で得たＤＮＡ断片を結合させる。
４）ファージＤＮＡ断片全結合させたプラスミド全宿主
に導入し、目的のＤＮＡ断片を含む形質転換体を選択す
る。
に導入し、目的のＤＮＡ断片を含む形質転換体を選択す
る。
５）４）で得た形質転換体からプラスミドを取出し、目
的のＤＮＡ断片全切出し、これヲ３）と同様の費領で発
現ベクタープラスミドに結合させる。
的のＤＮＡ断片全切出し、これヲ３）と同様の費領で発
現ベクタープラスミドに結合させる。
６）５）で得たｓｐ６バクテリオファージＲＮＡポリメ
ラーゼを含むＤＮＡ断片全結合させた発現ベクタープラ
スミドヲ４）と同じ機領で宿主に導入し、形質転換体金
得る。
ラーゼを含むＤＮＡ断片全結合させた発現ベクタープラ
スミドヲ４）と同じ機領で宿主に導入し、形質転換体金
得る。
上記ＤＮＡ供与体でｉるバクテリオファージＳＰ６
ＤＮＡ１ｊ、サルモネラ チフイムリウムＬＴ２株にバ
クテリオファージＳＰ６に感染させた溶菌液よりファー
ジ粒子を回収し、それより抽出する。抽出、精製、制限
酵素による切断等は、公知の方法を用いることができ、
当該法の詳細はモレキュラー クローニング アラポラ
トリー マニュアル（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ−
１ｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第
７５〜１７８頁、コールトスプリングツ＼−バーラボラ
トリ−出版（１９８２年）に記載されている。
ＤＮＡ１ｊ、サルモネラ チフイムリウムＬＴ２株にバ
クテリオファージＳＰ６に感染させた溶菌液よりファー
ジ粒子を回収し、それより抽出する。抽出、精製、制限
酵素による切断等は、公知の方法を用いることができ、
当該法の詳細はモレキュラー クローニング アラポラ
トリー マニュアル（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ−
１ｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第
７５〜１７８頁、コールトスプリングツ＼−バーラボラ
トリ−出版（１９８２年）に記載されている。
ファージＤＮＡの制限酵素による切断は次のように行う
。ファージＤＮＡに適当な制限酵素全加え、適当な反応
条件で反応全行うことによ＃）種々のＤＮＡ断片に切断
される。この切断に使用しうる酵素は、ファージＤＮＡ
全切断しうるものであり、かつＳＰ６バクテリオファー
ジＲＮＡポリメラーゼを産生ずる遺伝情報を担うＤＮＡ
部分全切断しないものであることが必要である。また、
ベクターとなるプラスミド全１か所切断できるものであ
ることが望せしい。
。ファージＤＮＡに適当な制限酵素全加え、適当な反応
条件で反応全行うことによ＃）種々のＤＮＡ断片に切断
される。この切断に使用しうる酵素は、ファージＤＮＡ
全切断しうるものであり、かつＳＰ６バクテリオファー
ジＲＮＡポリメラーゼを産生ずる遺伝情報を担うＤＮＡ
部分全切断しないものであることが必要である。また、
ベクターとなるプラスミド全１か所切断できるものであ
ることが望せしい。
一方プラスミドベクターの開裂も同様の方法で行うこと
ができる。
ができる。
プラスミドベクターとしては公知のものが使用できるが
、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などが
挙げられる。次にＤＮＡリガーゼを用いてベクターＤＮ
Ａの開裂部位に上述のＤＮＡ断片を組込１せるが、その
手段自体は公知の方法によるものであり、ベクターＤＮ
Ａの種類及び制限酵素の種類に応じて適当な反応条件が
選択される。
、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などが
挙げられる。次にＤＮＡリガーゼを用いてベクターＤＮ
Ａの開裂部位に上述のＤＮＡ断片を組込１せるが、その
手段自体は公知の方法によるものであり、ベクターＤＮ
Ａの種類及び制限酵素の種類に応じて適当な反応条件が
選択される。
ＤＮＡ断片の末端より消化し、短いＤＮＡ断片全得るた
めに、エキソヌクレアーゼが用いられるが、公知のもの
としては、Ｂａｌ ３１エキソヌクレアーゼがあり、過
当な反応条件下、種々の長さのＤＮＡ断片が得られる。
めに、エキソヌクレアーゼが用いられるが、公知のもの
としては、Ｂａｌ ３１エキソヌクレアーゼがあり、過
当な反応条件下、種々の長さのＤＮＡ断片が得られる。
次いで、ファージＤＮＡ断片を組込んだプラスミドを宿
主大腸菌に導入きせるが、宿主大腸菌としては、形質転
換能１に有するものであれば、野生株、変異株のいずれ
も使用できる。用いるベクタープラスミドにより、用い
る宿主大腸菌を適宜変えることも可能である。
主大腸菌に導入きせるが、宿主大腸菌としては、形質転
換能１に有するものであれば、野生株、変異株のいずれ
も使用できる。用いるベクタープラスミドにより、用い
る宿主大腸菌を適宜変えることも可能である。
この様にして目的のＤＮＡ断片全宿主に導入させ、プラ
スミドベクターの特性、例えばｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ
Ｖ部位にクローン化する場合には、アンピシリン耐性、
テトラサイクリン感受性コロニーを選択することにより
、クローン化することができる。
スミドベクターの特性、例えばｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ
Ｖ部位にクローン化する場合には、アンピシリン耐性、
テトラサイクリン感受性コロニーを選択することにより
、クローン化することができる。
クローン化されたＤＮＡの解析には、公知の方法を用い
て行う。すなわち、多数得られる形質転換株よりプラス
ミドｋｌＥＭｊ製し、過消な制限酵素で切断後、アガロ
ース電気泳動すればクローン化されたＤＮＡ断片の長さ
を知ることができる。この様にして解析したところ、２
．７５ｋｂのクローン化ＤＮＡ全有するプラスミド（ｐ
ｓｐ６−１）７得た。
て行う。すなわち、多数得られる形質転換株よりプラス
ミドｋｌＥＭｊ製し、過消な制限酵素で切断後、アガロ
ース電気泳動すればクローン化されたＤＮＡ断片の長さ
を知ることができる。この様にして解析したところ、２
．７５ｋｂのクローン化ＤＮＡ全有するプラスミド（ｐ
ｓｐ６−１）７得た。
更に、この全２．７５ｋｌ：詳細に解析し、この内部に
ＳＰ６バタテリオフアージＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が
存在することｔ′ｍ認した。ＳＰ６バクテリオファージ
ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む２．７５ｋｌ）ＤＮＡ
の制限酵素切断地図全第１図に示す。
ＳＰ６バタテリオフアージＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が
存在することｔ′ｍ認した。ＳＰ６バクテリオファージ
ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む２．７５ｋｌ）ＤＮＡ
の制限酵素切断地図全第１図に示す。
ＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ遺伝子ｋ
ｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＶ部位に組込んだプラスミドｐ
ｓｐ ６−１ ’ｅ導入した大腸菌のＲＮＡポリメラー
ゼ生産量は、それほど多くないので、更に大量生産する
ために他の発現ベクタープラスミドｐＵ０１８等に組込
む必要がある。例えは、ｐＵＣ１８に組込むには、プラ
スミドｐＳＰ６−１ＤＮＡより ＢａｍＨＩ、 Ｈｌｎ
ｄ ［１両制限酵素で、ＳＰ６バクテリオファージＲＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子ＤＮＡ断片を切出し、ＢａｍＨＩ
、Ｈｌｎｄ ＠両制限酵素で開裂したｐｔｙｃ １８に
結合し、宿主大腸菌（例えばＪＭ１０９株）に形質転換
する。
ｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＶ部位に組込んだプラスミドｐ
ｓｐ ６−１ ’ｅ導入した大腸菌のＲＮＡポリメラー
ゼ生産量は、それほど多くないので、更に大量生産する
ために他の発現ベクタープラスミドｐＵ０１８等に組込
む必要がある。例えは、ｐＵＣ１８に組込むには、プラ
スミドｐＳＰ６−１ＤＮＡより ＢａｍＨＩ、 Ｈｌｎ
ｄ ［１両制限酵素で、ＳＰ６バクテリオファージＲＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子ＤＮＡ断片を切出し、ＢａｍＨＩ
、Ｈｌｎｄ ＠両制限酵素で開裂したｐｔｙｃ １８に
結合し、宿主大腸菌（例えばＪＭ１０９株）に形質転換
する。
この様にしてプラスミドｐＳＰ６−２を得た。
プラスミドに組込筐れた８Ｐ６バクテリオファージＲＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子全導入した大腸菌がＲＮＡポリメ
ラーゼ蛋白全生産しているか否かを調べる手段としては
公知の方法が用いられる。例えば文献ジャーナル オプ
バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｉｏ
ｃｈｅｍｌｓｔｒｙ ）第２５７巻、第５７７２頁（１
９８２年）が用いられるが、著量生産している場合には
菌体を溶菌して得た抽出物を直接ＥＩＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で検出することができる。
Ａポリメラーゼ遺伝子全導入した大腸菌がＲＮＡポリメ
ラーゼ蛋白全生産しているか否かを調べる手段としては
公知の方法が用いられる。例えば文献ジャーナル オプ
バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｉｏ
ｃｈｅｍｌｓｔｒｙ ）第２５７巻、第５７７２頁（１
９８２年）が用いられるが、著量生産している場合には
菌体を溶菌して得た抽出物を直接ＥＩＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で検出することができる。
以上のようにして、８Ｐ６バクテリオファージＲＮＡポ
リメラーゼ遺伝子を組込んだプラスミド及びそれ全導入
し次大腸菌を調製することができる。
リメラーゼ遺伝子を組込んだプラスミド及びそれ全導入
し次大腸菌を調製することができる。
以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれら実施
例に限定されるものではない。
例に限定されるものではない。
実施例１
（１）バクテリオファージＳＰ６ ＤＮＡの調製サル
モネラ テフイムリウムＬＴ２株をモテイ７アイドＬ培
地（バクトドリプトン１０ｆ／ｌ、酵母エキス５ ｆ
／ ｔ、 ＮａＣｌ２ ｔ／ｌ。
モネラ テフイムリウムＬＴ２株をモテイ７アイドＬ培
地（バクトドリプトン１０ｆ／ｌ、酵母エキス５ ｆ
／ ｔ、 ＮａＣｌ２ ｔ／ｌ。
リン酸２ナトリウム６９／ｌ、 リン酸１カリウムｓ
ｔ／１）１ｔで４０℃培養する。菌数が１．６ Ｘ １
０’ ｃｅｌｌｓ ／−に達した時点テ、ノククテリオ
ファージ８Ｐ６’を菌１個当、ｊ）［１０５個加え、更
に４０℃培養し溶菌させる。
ｔ／１）１ｔで４０℃培養する。菌数が１．６ Ｘ １
０’ ｃｅｌｌｓ ／−に達した時点テ、ノククテリオ
ファージ８Ｐ６’を菌１個当、ｊ）［１０５個加え、更
に４０℃培養し溶菌させる。
溶菌後８１１１１！！のクロロホルムを加え、１５分培
養する。更にＤ Ｎａｓθ工、ＲＮａｓθＡ’ｉ各々１
■加え室温で３０分間培養する。次いで２９ｆの食塩を
加え４℃１時間放置後遠心分離し、上清を回収する０回
収した上清１ｔに６０ｔのポリエチレングリコール≠６
０００”ｅ加え溶解後４℃１晩放置する。１晩放置後、
遠心分ＳによりＳＰ６バクテリオファージを沈殿区分と
して回収する。回収した沈殿区分を６−〇Ｂ−Ａ−バッ
ファー〔α５％）二プツトＰ４０（シェル石油社製）、
１６ ｍＭ ＣａＣ４，５１ｎＭＭｇＣＺ２．５０ ｍ
Ｍ Ｆリス（Ｔｒｉｓ ） −ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、
１２０ ｍＭ ＫＣｔ、 ０．５ ｍＭ ＥＤＴＡ。
養する。更にＤ Ｎａｓθ工、ＲＮａｓθＡ’ｉ各々１
■加え室温で３０分間培養する。次いで２９ｆの食塩を
加え４℃１時間放置後遠心分離し、上清を回収する０回
収した上清１ｔに６０ｔのポリエチレングリコール≠６
０００”ｅ加え溶解後４℃１晩放置する。１晩放置後、
遠心分ＳによりＳＰ６バクテリオファージを沈殿区分と
して回収する。回収した沈殿区分を６−〇Ｂ−Ａ−バッ
ファー〔α５％）二プツトＰ４０（シェル石油社製）、
１６ ｍＭ ＣａＣ４，５１ｎＭＭｇＣＺ２．５０ ｍ
Ｍ Ｆリス（Ｔｒｉｓ ） −ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、
１２０ ｍＭ ＫＣｔ、 ０．５ ｍＭ ＥＤＴＡ。
３０吐 ２−メルカプトエタノール〕に溶解する。溶解
した液を３−の４０％グリセロールバッファー〔４０％
クリセロール、α５％）二プツトＰ４０．５０ｍＭ）リ
ス−ｕｃｚ（ｐＨ７、５）、１２０ ｍＭＫｃｌ、３０
ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕を含む遠心管上
に重層し、３５０００ ｒｐｍ ４℃１時間超遠心し、
ＳＰ６バクテリオファージを沈殿として回収する。
した液を３−の４０％グリセロールバッファー〔４０％
クリセロール、α５％）二プツトＰ４０．５０ｍＭ）リ
ス−ｕｃｚ（ｐＨ７、５）、１２０ ｍＭＫｃｌ、３０
ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕を含む遠心管上
に重層し、３５０００ ｒｐｍ ４℃１時間超遠心し、
ＳＰ６バクテリオファージを沈殿として回収する。
沈殿ＶＳ＊のリシス（Ｌｙｓｉｓ ） バッファー（
４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ （ｐＨａＯ） 、１ ０
ｍＭ−ＥＤＴＡ、２％ＳＤＢ、１００μｆ／−グロテイ
ネース（ｐｒｏｔｅｉｎａｅｅ ） Ｋ）に溶解し、５
５℃１時間反応させた。
４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ （ｐＨａＯ） 、１ ０
ｍＭ−ＥＤＴＡ、２％ＳＤＢ、１００μｆ／−グロテイ
ネース（ｐｒｏｔｅｉｎａｅｅ ） Ｋ）に溶解し、５
５℃１時間反応させた。
等量のフェノール溶液［１０ｍＭト！ｊスーＨＣ１（ｐ
ＨａＯ）、 １ ｍＭ−ＥＤＴＡで飽和したフェノール
〕を加え、ゆるやかに混合した後、遠心分離して水層を
採取した（以下この操作をフェノール処理という）。こ
れに２倍量のエタノールを加え、−７０℃３０分間保持
した後遠心分離勿行い、４５．５ｋｂの鎖長全有するＳ
Ｐ６バクテリオファージＤＮＡの沈殿を得た（以下この
操作全エタノール沈殿という）。
ＨａＯ）、 １ ｍＭ−ＥＤＴＡで飽和したフェノール
〕を加え、ゆるやかに混合した後、遠心分離して水層を
採取した（以下この操作をフェノール処理という）。こ
れに２倍量のエタノールを加え、−７０℃３０分間保持
した後遠心分離勿行い、４５．５ｋｂの鎖長全有するＳ
Ｐ６バクテリオファージＤＮＡの沈殿を得た（以下この
操作全エタノール沈殿という）。
エタノールを除去した後６−のＴＥ浴溶液１０ｍＭ
）リス−ＨＣｔ（ｐＨａ Ｏ）、１ ｍＭ ＥＤＴＡ
］に溶解し、次の工程に用いた。
）リス−ＨＣｔ（ｐＨａ Ｏ）、１ ｍＭ ＥＤＴＡ
］に溶解し、次の工程に用いた。
＋２１ＳＰｉＳバクテリオファージＤＮＡの制限酵素切
断地図の作製 上記（１１で得たバクテリオファージ５Ｐ６Ｄ Ｎ Ａ
２μｔｆ Ｈｌｎｄ ｌ、 ５ Ｕで最適条件〔１０
ｍＭ ）リス−ＨＣｔ（ｐＨ７，５）、 ７ ｍＭ
ＭｇＣｌ２．６０ｍＭ ＮａＣ１〕で３３７１１時間反
させ、１％アガロースゲル電気泳動により解析した。制
限酵素切断地図を第２図に示す。第２図中、Ａ〜Ｎは、
Ｈｌｎｄ ｌ 切断ＤＮＡ断片を示す。
断地図の作製 上記（１１で得たバクテリオファージ５Ｐ６Ｄ Ｎ Ａ
２μｔｆ Ｈｌｎｄ ｌ、 ５ Ｕで最適条件〔１０
ｍＭ ）リス−ＨＣｔ（ｐＨ７，５）、 ７ ｍＭ
ＭｇＣｌ２．６０ｍＭ ＮａＣ１〕で３３７１１時間反
させ、１％アガロースゲル電気泳動により解析した。制
限酵素切断地図を第２図に示す。第２図中、Ａ〜Ｎは、
Ｈｌｎｄ ｌ 切断ＤＮＡ断片を示す。
（３１Ｔ −７ＲＮ Ａポリメラーゼと類似性を有する
領域の解析 第２図に示す制限酵素地図及びカサペツテイスらの報告
〔ジャーナル オプ バイオケミントリー第２５７巻、
第５７７９頁（１９８２年）〕、スタールらの報告しジ
ャーナル オプ モレキュラー バイオロジー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
）第１４８巻、第４８１頁（１９８１年）〕より、Ｈ
１ｎｄ１−Ｃ断片（＆２ｋｂ）上に、ＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子情報がコードされている可能性が示唆されたの
で、一部分ＤＮＡシークエンスを明らかにし、アミノ酸
シークエンスに変換後Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとの類似
性全比較した。
領域の解析 第２図に示す制限酵素地図及びカサペツテイスらの報告
〔ジャーナル オプ バイオケミントリー第２５７巻、
第５７７９頁（１９８２年）〕、スタールらの報告しジ
ャーナル オプ モレキュラー バイオロジー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
）第１４８巻、第４８１頁（１９８１年）〕より、Ｈ
１ｎｄ１−Ｃ断片（＆２ｋｂ）上に、ＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子情報がコードされている可能性が示唆されたの
で、一部分ＤＮＡシークエンスを明らかにし、アミノ酸
シークエンスに変換後Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとの類似
性全比較した。
８Ｐ６ ＤＮＡ１００μｆｉＨ１ｎｄｌ ５００Ｕ
で切断後１チアガロースゲル電気泳動した。
で切断後１チアガロースゲル電気泳動した。
泳動後＆２ｋｂのＨｌｎｃｌ ｌ −Ｃ断片を含むアガ
ロースゲルを切出し、透析チューブ中電気泳動し緩衝液
中に溶出し、エタノール沈殿により回収した。
ロースゲルを切出し、透析チューブ中電気泳動し緩衝液
中に溶出し、エタノール沈殿により回収した。
このＤＮＡ断片′（ｆ−Ｋｐｎ工、８ａｕ ３ Ａ制限
酵素で切断し、メツシングらのＭ１３ジデオキシ シー
フェンス（ｄｌｄｅｏｘｙ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ）
法〔メソッド イン エンザイモロジー（Ｍθ−ｔｈｏ
ｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）第１０１巻、第２
０頁（１９８３年）〕に従いシーフェンスを行った。す
なわち、Ｋｐｎ Ｉ、Ｓａｕ ５ Ａ ＤＮＡ断片’（
ｒＭｌ ５ｍｐ １８ベクターのＢａｎ ＨＩ、Ｋｐ
ｎ工部位に結合し、大腸菌ＪＭ１０９に形質感染する。
酵素で切断し、メツシングらのＭ１３ジデオキシ シー
フェンス（ｄｌｄｅｏｘｙ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ）
法〔メソッド イン エンザイモロジー（Ｍθ−ｔｈｏ
ｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）第１０１巻、第２
０頁（１９８３年）〕に従いシーフェンスを行った。す
なわち、Ｋｐｎ Ｉ、Ｓａｕ ５ Ａ ＤＮＡ断片’（
ｒＭｌ ５ｍｐ １８ベクターのＢａｎ ＨＩ、Ｋｐ
ｎ工部位に結合し、大腸菌ＪＭ１０９に形質感染する。
得られたファージグラーク’ｉ、１．５ゴの２ＹＴ培地
（バクトドリプトン１６ ｆ／ｌ。
（バクトドリプトン１６ ｆ／ｌ。
酵母エキス８ｇ／１１食塩５ ｆ／ｌ、 ｐＨ７，２）
で培養し、１本領ＤＮＡ’（ＩＨ回収しシーフェンスを
行った。約１００ｂｐｉシークエンスし、アミノ酸シー
クエンスに変換しＴ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸シー
クエンスと比較したところ、高い類似性が認められ、Ｋ
ｐｎＩ制限酵素部位を含む約２．７５ｋｂ上に８Ｐ６バ
クテリオファージＲＮＡポリメラーゼ遺伝子情報がコー
ドされることが示唆された。
で培養し、１本領ＤＮＡ’（ＩＨ回収しシーフェンスを
行った。約１００ｂｐｉシークエンスし、アミノ酸シー
クエンスに変換しＴ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸シー
クエンスと比較したところ、高い類似性が認められ、Ｋ
ｐｎＩ制限酵素部位を含む約２．７５ｋｂ上に８Ｐ６バ
クテリオファージＲＮＡポリメラーゼ遺伝子情報がコー
ドされることが示唆された。
＋４１８Ｐ６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ遺
伝子ｋｉむ２．７５ｋｂＤＮＡ断片のクローニング 上記（３）で得たＨｌｎｄ ｌ−ＣＤＮＡ断片５０ｔｔ
ｆを、制限酵素Ｄｒａｌ １００Ｕ、 Ｂｂｉ… １
００Ｕを用い、制限酵素全失活〔トリス−ＨＣｌ （ｐ
Ｈ７，４）、５１ｎＭＨｇ、Ｃ４，７ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、α０１％ＢＳＡ ）中６０℃２時間反応
させ切断した。このＤＮＡ断片を１％アガロースゲル亀
気気泳動分離し、（３）で示す方法により五４ ｋｂ
ＤＮＡ断片１０μｆを回収した（Ｄ−Ｂ ＤＮＡ断片
）。
伝子ｋｉむ２．７５ｋｂＤＮＡ断片のクローニング 上記（３）で得たＨｌｎｄ ｌ−ＣＤＮＡ断片５０ｔｔ
ｆを、制限酵素Ｄｒａｌ １００Ｕ、 Ｂｂｉ… １
００Ｕを用い、制限酵素全失活〔トリス−ＨＣｌ （ｐ
Ｈ７，４）、５１ｎＭＨｇ、Ｃ４，７ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、α０１％ＢＳＡ ）中６０℃２時間反応
させ切断した。このＤＮＡ断片を１％アガロースゲル亀
気気泳動分離し、（３）で示す方法により五４ ｋｂ
ＤＮＡ断片１０μｆを回収した（Ｄ−Ｂ ＤＮＡ断片
）。
更に、五４ｋｂのＤ−Ｂ ＤＮＡ断片５ＪＩりを、エ
キソヌクレアーゼＢａ１３１５Ｕを用い、Ｂａｄ緩衝［
［２０ｍＭ トリス−ＨＣｔ（ｐ’ＨＢ、 Ｏ）、１
２ ｍＭ ＣａＣ４，１２ｍＭ Ｍｇ、Ｃ１２，１ｍＭ
ＥＤＴＡｂ６００ ｍＭ ＮａＣ／！、 〕中２０℃
５分反応させ、α５ＭＥＤＴＡ１０μｔを加え灰石を停
止後、フェノール処理、エタノール沈ＪｌｔＫよりＤＮ
Ａを回収した（ Ｂａｌ・ＤＮＡ断片）。
キソヌクレアーゼＢａ１３１５Ｕを用い、Ｂａｄ緩衝［
［２０ｍＭ トリス−ＨＣｔ（ｐ’ＨＢ、 Ｏ）、１
２ ｍＭ ＣａＣ４，１２ｍＭ Ｍｇ、Ｃ１２，１ｍＭ
ＥＤＴＡｂ６００ ｍＭ ＮａＣ／！、 〕中２０℃
５分反応させ、α５ＭＥＤＴＡ１０μｔを加え灰石を停
止後、フェノール処理、エタノール沈ＪｌｔＫよりＤＮ
Ａを回収した（ Ｂａｌ・ＤＮＡ断片）。
ベクターとしては、ｐＢＲ５２２を用いた。
ｐＢＲ５２２ノ２μ２を、制限酵素ＥｃｏＲＶ５Ｕで緩
衝液［１０ｍＭ トリス−ＨＣｔ（ｐＨ７，５）、７
ｍＭ ＭｇＣ１！、１５０ ｍＭ ＮａＣ１，７ｍＭ
２−メルカプト：ｒ＃／−ル、 （ＬＯ１％ＢＳＡ
）中３７℃１時間反応させた。６５℃１０分間加熱して
制限酵素全失活させた後、エタノール沈殿し、ＤＮＡ全
回収した。このＤＮＡをＢＡＰ緩衝液（１００ｍＭ
トリス−ＨＣｔ（ｐＨａｏ ）］に溶解し、１Ｕのアル
カリンホスファターゼを加え、５５℃３０分間反応させ
、フェノール処理、エタノール沈殿を行い、ベクターＤ
ＮＡを回収した。
衝液［１０ｍＭ トリス−ＨＣｔ（ｐＨ７，５）、７
ｍＭ ＭｇＣ１！、１５０ ｍＭ ＮａＣ１，７ｍＭ
２−メルカプト：ｒ＃／−ル、 （ＬＯ１％ＢＳＡ
）中３７℃１時間反応させた。６５℃１０分間加熱して
制限酵素全失活させた後、エタノール沈殿し、ＤＮＡ全
回収した。このＤＮＡをＢＡＰ緩衝液（１００ｍＭ
トリス−ＨＣｔ（ｐＨａｏ ）］に溶解し、１Ｕのアル
カリンホスファターゼを加え、５５℃３０分間反応させ
、フェノール処理、エタノール沈殿を行い、ベクターＤ
ＮＡを回収した。
Ｂａｌ ・ＤＮＡ断片０．１μｆと、ＥｃｏＲＶ切断し
たｐＢＲ３２２ｐＮＡα１５μｔをＴ４ＤＮＡリガーゼ
１００Ｕ’５：用いリガーゼ緩衝液〔６６ｍＭ ）
リス−ＨＣＡ （ｐＨ７，６） 、６．６ ｍＭ Ｍｇ
ＣＡ２．１０ｍＭ ＤＴＴ％（１５ｍＭ ＡＴＰ）中１
６℃４時間反応させ、Ｂａ１・ＤＮＡ断片とｐＢＲ３２
２全結合させた。
たｐＢＲ３２２ｐＮＡα１５μｔをＴ４ＤＮＡリガーゼ
１００Ｕ’５：用いリガーゼ緩衝液〔６６ｍＭ ）
リス−ＨＣＡ （ｐＨ７，６） 、６．６ ｍＭ Ｍｇ
ＣＡ２．１０ｍＭ ＤＴＴ％（１５ｍＭ ＡＴＰ）中１
６℃４時間反応させ、Ｂａ１・ＤＮＡ断片とｐＢＲ３２
２全結合させた。
大腸菌ＨＢ１０１株全５−のＬ培地（バクトドリプトン
１０９７１％酵素エキス５９／ｌ。
１０９７１％酵素エキス５９／ｌ。
食塩５ ｆ ／ｌ、 ｐＨ７，，２）で３７℃、１６時
間培養した。このＣ１−を５−の新らしいＬ培地に接種
して、６００ＵｍのＯＤ（光学濃度）がＣ６になる１で
揚とう培養した。この２．５−全氷冷し３０００ ｒｐ
ｍで１０分遠心し、上清を完全に除去した。これに予め
氷冷したα１Ｍ ＣｕＣ１ｚ の２．５−を加え混
合した後遠心分離により上清を除去した。更に、氷冷し
たα１Ｍ ＣｕＣ１鵞 を１．２５−加え穏やかに均
一に混合し、氷水中３０分保持した後、遠心分離で上清
を除去した。これに、Ｂａｄ・ＤＮＡ断片とｐＢＲ３２
２全納合させたＤＮＡ溶液１０μｔを加え氷水中ＩＣ５
０分保持した。次に４２℃９０秒加熱し、Ｌ培地２−′
に加え、３７℃３０分保持した。
間培養した。このＣ１−を５−の新らしいＬ培地に接種
して、６００ＵｍのＯＤ（光学濃度）がＣ６になる１で
揚とう培養した。この２．５−全氷冷し３０００ ｒｐ
ｍで１０分遠心し、上清を完全に除去した。これに予め
氷冷したα１Ｍ ＣｕＣ１ｚ の２．５−を加え混
合した後遠心分離により上清を除去した。更に、氷冷し
たα１Ｍ ＣｕＣ１鵞 を１．２５−加え穏やかに均
一に混合し、氷水中３０分保持した後、遠心分離で上清
を除去した。これに、Ｂａｄ・ＤＮＡ断片とｐＢＲ３２
２全納合させたＤＮＡ溶液１０μｔを加え氷水中ＩＣ５
０分保持した。次に４２℃９０秒加熱し、Ｌ培地２−′
に加え、３７℃３０分保持した。
アンピシリン５０μｆ／ｓ／ ｉ含むＬ寒天培地に塗布
した。３７℃で生育したコロニー全分離し、テトラサイ
クリン１５μｆ／ｄｉ含むＬ寒天培地で生育できないコ
ロニーを分離した後、プラスミドの解析を行った。
した。３７℃で生育したコロニー全分離し、テトラサイ
クリン１５μｆ／ｄｉ含むＬ寒天培地で生育できないコ
ロニーを分離した後、プラスミドの解析を行った。
アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性株葡５０μ
ｆ／−のアンピシリンを含む５ゴのＬ培地で５７℃１６
時間培養した後集菌した。これに、ａ２ゴの溶液１ ［
５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ トリス−ＨＣｔ（ｐ
ＨａＯ） 、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ＭＱ／−リンザイム
（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）］を加え氷水中３０分保持した後
、ｃＬ４−の溶液ＩＩ （ａ ２ Ｎ ＮａＯＨｓ
１ ％ Ｓ Ｄ Ｓ ） ｋ加えた。
ｆ／−のアンピシリンを含む５ゴのＬ培地で５７℃１６
時間培養した後集菌した。これに、ａ２ゴの溶液１ ［
５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ トリス−ＨＣｔ（ｐ
ＨａＯ） 、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ＭＱ／−リンザイム
（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）］を加え氷水中３０分保持した後
、ｃＬ４−の溶液ＩＩ （ａ ２ Ｎ ＮａＯＨｓ
１ ％ Ｓ Ｄ Ｓ ） ｋ加えた。
５分径α３ｄの溶液層（５Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ
４，８）３を加え、０℃５０分保持した後、遠心分離し
上清を回収した。エタノール沈殿し、［Ｌ２ｍの溶液１
’％ｌ（２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨａ５）、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、 １５０ ｍＭＮａＣ４、ＲＮａＳ
ｅ Ａ １ ”ｉ ／ ｔｒｔ 〕に溶解し、６７Ｃ
３０分反応させた。こ詐にα２−の溶液Ｖ（２０％ホリ
エチレングリコール◆６０００．２ＭＮａＣｔ）’ｒ加
え、混合後、−２０℃３０分保持した０ 遠心分離で沈殿を回収後、ＴＥ浴溶液溶解し、フェノー
ル処理、エタノール沈殿にエフプラスミドＤＮＡ’に回
収し、１０μｔのＴＥ浴溶液溶解した。
４，８）３を加え、０℃５０分保持した後、遠心分離し
上清を回収した。エタノール沈殿し、［Ｌ２ｍの溶液１
’％ｌ（２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨａ５）、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、 １５０ ｍＭＮａＣ４、ＲＮａＳ
ｅ Ａ １ ”ｉ ／ ｔｒｔ 〕に溶解し、６７Ｃ
３０分反応させた。こ詐にα２−の溶液Ｖ（２０％ホリ
エチレングリコール◆６０００．２ＭＮａＣｔ）’ｒ加
え、混合後、−２０℃３０分保持した０ 遠心分離で沈殿を回収後、ＴＥ浴溶液溶解し、フェノー
ル処理、エタノール沈殿にエフプラスミドＤＮＡ’に回
収し、１０μｔのＴＥ浴溶液溶解した。
このＤＮＡ溶液ｆ Ｂａｍ ＨＩ、Ｈｌｎｄ ｌで切断
後、アガロースゲル電気泳動を行って組込１れたＤＮＡ
断片のサイズ金満べた結果、最長２．７５ｋｂのＤＮＡ
′（ｌｌ−含む槓々のサイズのプラスミドが得られた。
後、アガロースゲル電気泳動を行って組込１れたＤＮＡ
断片のサイズ金満べた結果、最長２．７５ｋｂのＤＮＡ
′（ｌｌ−含む槓々のサイズのプラスミドが得られた。
この２．７５に’ｂのＤＮＡを含むプラスミド′？ｒ、
ｐ１３Ｐ６−１と命名した。該プラスミド會保有する大
腸菌は、エシェリヒアコーリＨＢ Ｉ Ｄ １ ／ ｐ
８Ｐ６−１と表示して、工業技術院微生物工業技術研究
所に、微工研菌寄第８９８９号（ＦＦ、ＲＭ Ｐ−８
９８９）として寄託されている。該プラスミドは、８Ｐ
６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ遺伝子全領域
′？を含むプラスミドである。
ｐ１３Ｐ６−１と命名した。該プラスミド會保有する大
腸菌は、エシェリヒアコーリＨＢ Ｉ Ｄ １ ／ ｐ
８Ｐ６−１と表示して、工業技術院微生物工業技術研究
所に、微工研菌寄第８９８９号（ＦＦ、ＲＭ Ｐ−８
９８９）として寄託されている。該プラスミドは、８Ｐ
６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ遺伝子全領域
′？を含むプラスミドである。
（５） ＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子ｋｌむＤＮＡ断片と、ｐＵｏ １ Ｂとの結合及
び大腸菌への導入 （４）で得たプラスミドｐ８Ｐ １ｓ−Ｉ Ｄ Ｎ Ａ
ｆ ＢａｍＨＩ、Ｈｌｎａｌで切断し、アガロースゲ
ル電気泳動により、前記２．７５ｋｂのＤＮＡ’ｉ：含
む５．１ｋｂｐ Ｄ Ｎ Ａ断片′（ｉｌ−得た。筐た
、ｐＵｏ １ Ｂ ＤＮＡも、ＢａｍＨＩ、Ｅ（ｉｎｄ
ｌで切断し、（４）で示す方法でアルカリンホスファ
ターゼ処理を行いベクターＤＮＡを得た。
遺伝子ｋｌむＤＮＡ断片と、ｐＵｏ １ Ｂとの結合及
び大腸菌への導入 （４）で得たプラスミドｐ８Ｐ １ｓ−Ｉ Ｄ Ｎ Ａ
ｆ ＢａｍＨＩ、Ｈｌｎａｌで切断し、アガロースゲ
ル電気泳動により、前記２．７５ｋｂのＤＮＡ’ｉ：含
む５．１ｋｂｐ Ｄ Ｎ Ａ断片′（ｉｌ−得た。筐た
、ｐＵｏ １ Ｂ ＤＮＡも、ＢａｍＨＩ、Ｅ（ｉｎｄ
ｌで切断し、（４）で示す方法でアルカリンホスファ
ターゼ処理を行いベクターＤＮＡを得た。
両ＤＮＡ断片を（４）に示す方法で結合後、大腸菌ＪＭ
ＩＤ９株に形質導入した。（４）と同様の方法で１ラス
ミドを解析した結果、Ｘ１ｋｌ）のＤＮＡ断片を含むこ
とが明らかとなり、このプラスミドをｐＳＰ６−２と命
名した０ ′（６） プラスミドｐＳＰ６−２を導
入した大腸菌（ニジエリア・コーリーＪ Ｍ １０９／
ｐＳＰ ６−２ ）によるＳＰ６バクテリオファージＲ
ＮＡポリメラーゼの生産 上記大腸菌をアンピシリン５０μ９／−を含む１０−の
Ｌ培地に接種し、３７℃１６時間前培養した。これを５
００イのＬ培地を含む２を容フラスコに移し、６７℃５
時間（１２０ｒｐｍ ） した後、ＩＰＴＧ（インプロ
ピル−１−チオ−β−ローガラクトピラノシド）５０１
ｍｖｔを加えたのち、史に３時間培養した。集画後緩衝
液■［５０ｍＭ）リス−ＨＣ’ｔ（ｐＨ８，す、１０％
砂糖、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール〕１５−に懸
濁する。これに２０μ２／−のＰＭＳＦ（フェニルメタ
ンスルホニルフルオライド） 、２ ”Ｉ ／ ｔｎｌ
のリゾチームを刀■え、氷水中３０分保持する。
ＩＤ９株に形質導入した。（４）と同様の方法で１ラス
ミドを解析した結果、Ｘ１ｋｌ）のＤＮＡ断片を含むこ
とが明らかとなり、このプラスミドをｐＳＰ６−２と命
名した０ ′（６） プラスミドｐＳＰ６−２を導
入した大腸菌（ニジエリア・コーリーＪ Ｍ １０９／
ｐＳＰ ６−２ ）によるＳＰ６バクテリオファージＲ
ＮＡポリメラーゼの生産 上記大腸菌をアンピシリン５０μ９／−を含む１０−の
Ｌ培地に接種し、３７℃１６時間前培養した。これを５
００イのＬ培地を含む２を容フラスコに移し、６７℃５
時間（１２０ｒｐｍ ） した後、ＩＰＴＧ（インプロ
ピル−１−チオ−β−ローガラクトピラノシド）５０１
ｍｖｔを加えたのち、史に３時間培養した。集画後緩衝
液■［５０ｍＭ）リス−ＨＣ’ｔ（ｐＨ８，す、１０％
砂糖、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール〕１５−に懸
濁する。これに２０μ２／−のＰＭＳＦ（フェニルメタ
ンスルホニルフルオライド） 、２ ”Ｉ ／ ｔｎｌ
のリゾチームを刀■え、氷水中３０分保持する。
３０分後［ＬＤ５％になる様デオキシコール酸とＱ、１
２りのスペルミジンを加えかくはんする。５分後、１０
５００ＸＩＦ１時間超遠心し、上澄を回収する。この分
画で活性を測定したところ、８０ＵのＳＰ６バクテリオ
ファージＲＮＡポリメラーゼが生産されており、サルモ
ネラ テフイムリウムＬＴ２にＳＦ３を感染させた場合
に比べ約３０倍生産性が増大した。
２りのスペルミジンを加えかくはんする。５分後、１０
５００ＸＩＦ１時間超遠心し、上澄を回収する。この分
画で活性を測定したところ、８０ＵのＳＰ６バクテリオ
ファージＲＮＡポリメラーゼが生産されており、サルモ
ネラ テフイムリウムＬＴ２にＳＦ３を感染させた場合
に比べ約３０倍生産性が増大した。
以上詳細に説明した通ジ、本発明によりＳＰ６バタテリ
オフアージＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が単離された。該
遺伝子を含有するプラスミドで形質転換した微生物によ
り遺伝子工学において有用ｎ５Ｐ６バクテリオファージ
ＲＮＡポリメラーゼを効率よく製造することが可能とな
った０
オフアージＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が単離された。該
遺伝子を含有するプラスミドで形質転換した微生物によ
り遺伝子工学において有用ｎ５Ｐ６バクテリオファージ
ＲＮＡポリメラーゼを効率よく製造することが可能とな
った０
第１図はＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ
遺伝子を含む２．７５ｋｂ ＤＮＡの制限酵素切断地図
、第２図はＳＰ６バタテリオフアージＤ’ＮＡの制限酵
素Ｈ１Ｍ ｌ切断地図である。
遺伝子を含む２．７５ｋｂ ＤＮＡの制限酵素切断地図
、第２図はＳＰ６バタテリオフアージＤ’ＮＡの制限酵
素Ｈ１Ｍ ｌ切断地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子。 ２、ＺＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ遺
伝子が組込まれたプラスミドを保有する新規微生物。 ３、８Ｐ６バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ遺伝
子が組込まれたプラスミドを保有する新規微生物を培養
し、培養物よりＳＰ６バクテリオファージＲＮＡポリメ
ラーゼを採取することを特徴とするＳＰ６バクテリオフ
ァージＲＮＡポリメラーゼの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61248503A JPH0763371B2 (ja) | 1986-10-21 | 1986-10-21 | Ｒｎａポリメラーゼ遺伝子及び該遺伝子を保有する微生物 |
| GB8723719A GB2197651B (en) | 1986-10-21 | 1987-10-09 | Rna polymerase gene microorganism having said gene and the production of rna polymerase by the use of said microorganism |
| DE19873735379 DE3735379A1 (de) | 1986-10-21 | 1987-10-19 | Rna-polymerase-gen, verfahren zu seiner herstellung und mikroorganismus mit diesem gen |
| US07/109,615 US5026645A (en) | 1986-10-21 | 1987-10-19 | RNA polymerase gene, microorganism having said gene and the production of RNA polymerase by the use of said microorganism |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61248503A JPH0763371B2 (ja) | 1986-10-21 | 1986-10-21 | Ｒｎａポリメラーゼ遺伝子及び該遺伝子を保有する微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63105679A true JPS63105679A (ja) | 1988-05-10 |
| JPH0763371B2 JPH0763371B2 (ja) | 1995-07-12 |
Family
ID=17179143
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61248503A Expired - Fee Related JPH0763371B2 (ja) | 1986-10-21 | 1986-10-21 | Ｒｎａポリメラーゼ遺伝子及び該遺伝子を保有する微生物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5026645A (ja) |
| JP (1) | JPH0763371B2 (ja) |
| DE (1) | DE3735379A1 (ja) |
| GB (1) | GB2197651B (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5693489A (en) * | 1984-03-30 | 1997-12-02 | Associated Universities, Inc. | Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase |
| US6291164B1 (en) | 1996-11-22 | 2001-09-18 | Invitrogen Corporation | Methods for preventing inhibition of nucleic acid synthesis by pyrophosphate |
| EP3415625A1 (en) | 2002-02-01 | 2018-12-19 | Life Technologies Corporation | Double-stranded oligonucleotides |
| US20060009409A1 (en) | 2002-02-01 | 2006-01-12 | Woolf Tod M | Double-stranded oligonucleotides |
| WO2003064621A2 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-07 | Ambion, Inc. | HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES |
| US20100075423A1 (en) * | 2002-06-12 | 2010-03-25 | Life Technologies Corporation | Methods and compositions relating to polypeptides with rnase iii domains that mediate rna interference |
| US20040248094A1 (en) * | 2002-06-12 | 2004-12-09 | Ford Lance P. | Methods and compositions relating to labeled RNA molecules that reduce gene expression |
| AU2003276666A1 (en) * | 2002-06-12 | 2003-12-31 | Ambion, Inc. | Methods and compositions relating to polypeptides with rnase iii domains that mediate rna interference |
| US20060142228A1 (en) * | 2004-12-23 | 2006-06-29 | Ambion, Inc. | Methods and compositions concerning siRNA's as mediators of RNA interference |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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1987
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