DK149841B

DK149841B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af alfa-fluor-methyl-alfa-aminoalkansyrer eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf

Info

Publication number: DK149841B
Application number: DK237978AA
Authority: DK
Inventors: Janos Kollonitsch; Arthur Allan Patchett; Stephen Marburg
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1977-06-01
Filing date: 1978-05-30
Publication date: 1986-10-13
Also published as: JPS5416423A; NO147382B; CH639639A5; IE46983B1; IE781078L; PT68102A; HK18184A; FI66840C; AR223463A1; JPS641474B2; LU79750A1; NO781892L; FI781674A7; IT7849637A0; FI66840B; PL207242A1; NL190485B; DE2824116C2; AU3658678A; SE7806440L

Description

149841 i

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmå-de til fremstilling af hidtil ukendte substituerede oj-fluormethyl-a-aminoalkansyrer med den i indledningen til krav 1 angivne almene formel I i form af optisk aktive forbindelser eller vilkårlige eller racemiske blandinger af sådanne forbindelser eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf.

Der kendes en usubstitueret ot-fluormethyl-a-aminoalkan-syre, nemlig 2-fluormethylalanin med formlen

CH0F

I 2

CIU- C-COOH

3 I

“>2 (A) (Kollonitsch et al., J. Org. Chem. 4JD, 3808-9 (1975)).

Forbindelsen (A), der fremstilles ved fluordehydroxyle-ring af den tilsvarende 2-hydroxymethylalanin, menes ikke at have nogen specifik biologisk virkning.

ot-Methylaminosyrer såsom L-a-methy1-3,4-dihydroxypheny1-alanin (a-methyldopa, et middel mod forhøjet blodtryk) vides at virke hæmmende på decarboxylase (Goodman et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Mac Milian Company, New/ York, New York 1970, p. 577, canadisk patentskrift nr. 737907).

De hidtil ukendte oi-flourmethyl-a-aminoalkansyrer, der opfattes af denne opfindelse, har en hæmningsvirkning over for decarboxylase, der er betydeligt stærkere end den fra a-methylaminosyrerne kendte.

Farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af forbindel- 149841 2 ser med formel I kan dannes med passende organiske eller uorganiske syrer. Foretrukne salte af uorganiske syrer er hydrohalogeniderne, dvs. hydrochlorider, -iodi-der og -bromider.

Forbindelserne med formel I har et chiralt center og kan således forekomme i optisk aktive former, dvs. som optiske isomere. Sådanne isomere betegnes sædvanligvis ved symbolerne L og D, + og -, 1 og d, S og R eller kombinationer heraf. Hvor der ikke er angivet isomer-betegnelse på en forbindelses navn eller formel, betegner navnet eller formlen en blanding af isomere af forbindelsen, såvel vilkårlige som racemiske blandinger.

Generelt foretrækkes forbindelser med S-konfiguration.

Den substituerede alkylgruppe R har fortrinsvis den i krav 3's kendetegnende del anførte betydning.

Foretrukne forbindelser med formel I er sådanne, i hvilke R betegner

H0 H

y~\ pc"2" W 2 ---i

De omhandlede forbindelser har fysiologiske og kemotera-peutiske anvendelsesmuligheder. Disse forbindelsers biologiske virkning skyldes, at de har en betydelig hæmningseffekt over for decarboxylase. Decarboxylaser er enzymer, der indvirker på α-aminosyresubstrater og fremkalder decarboxylering, hvilket resulterer i dannelse af den tilsvarende amin. Dette kan illustreres ved følgende reaktionsskema: U9841

L-CH-COoH decarboxylase L„CH

I 2 -—:—i2 nh2 nh2 α-aminosyresubstrat ainin (L= alkyl eller aromatisk substitueret alkyl)

Ved at hæmme denne decarboxylering kan man modulere eller hæmme den biosyntetiske vej til en række biologisk signifikante aminer, hvilket kan have fysiologisk nyttige konsekvenser. For eksempel hæmmes dopa-decarboxylase af a-fluormethyldopa, som kan benyttes i kombination med dopa til at potentiere sidstnævntes virkning ved behandling af Parkinsons syge. a-Fluormethylhistidin hæmmer biosyntesen af histamin via decarboxylering af histidin (ED5Q i mus ^0,4 mg/kg). Følgelig kan det, eventuelt i kombination med histaminantagonister, anvendes til forebyggelse af mavesår og til behandling af allergiske tilstande. α-Fluormethylornithin kan i kraft af sin hæmning af ornithindecarboxylase afbryde biosyntesen af polyaminer og er nyttig i behandlingen af visse former for neoplasma. α-Fluormethylarginin er et effektivt antibakterielt stof, og a-fluormethylglutaminsyre virker stimulerende på centralnervesystemet.

De omhandlede forbindelser er desuden meget specifikke i deres decarboxylasehæmning. Det betyder, at en a-fluor-methyl-a-aminosyre generelt hæmmer decarboxyleringen af den tilsvarende a-fluormethylsyre. For eksempel hæmmer α-fluormethyldopa decarboxyleringen af dopa, a-fluor-methylhistidin hæmmer decarboxyleringen af histidin etc. De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er kraftigt virkende irreversible inhibitorer in vivo, mens tilsvarende kendte forbindelser, f.eks. a-methylornithin og a-methylhistidin er 4 149841 reversible eller svage inhibitorer, jfr. Tetrahedron Letters, _17, side 1455-1458 (1977), J. Hed. Chem. 18, 600 (1975) og Proc. Nat. Acad. Sci. 73, 1626 (1976) samt J. Hed. Chem. _19, 945 (1975). a-Chlormethylhistidin er relativt ustabilt ved neutralt og basis pH, jfr.

Bouclier et al., Biochem. Pharm. J52, (10), 1553-1556 (1983). α-Hethylhistidin er en svag inhibitor, og a-bu-tylhistidin har ingen inhibitorvirkning. Derimod har a-fluormethylhistidin kraftigere virkning end den ot-methylanaloge, og den er irreversibel.

Ved hjælp af konventionelle in vitro forsøg er det vist, at repræsentative forbindelser har decarboxylasehæmmen-de virkning, jfr. Biochemical Pharmacology 32^, (10) (1983) s. 1553-1556, og Br. J. Pharmac. 2° (1980) s.

571-576.

a-Fluormethy 1-3,4-dihydroxyphenylalanin, ot-fluormethyl-tyrosin og a-fluormethylmetatyrosin har desuden vist sig at have antihypertensiv virkning. Denne virkning bestemmes ved at iagttage den antihypertensive effekt (blodtrykssænkning) af at indgive (peroralt eller paren-teralt) rotter med forhøjet blodtryk den pågældende forbindelse. Den observerede effekt viser, at forbindelserne kan anvendes som antihypertensive midler til personer med forhøjet blodtryk, når de indgives i mængder ved hjælp af egnede indgivelsesformer. Disse indgivelses-former omfatter velkendte, farmaceutisk acceptable fortyndingsmidler.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l’s kendetegnende del angivne.

De omhandlede forbindelser fremstilles således ved reak-tion mellem en a-hydroxymethyl-a-aminosyre og SF^ i flydende HF, som illustreret ved følgende reaktionsskema: 5 149041

CHo0II CH?F

I 2 I 2

R — <p —- COOH SF^/HF R—~ C COOH

KH2 I® 2

Reaktionen udføres generelt ved temperaturer i intervallet fra ca. -80 °C til ca. 20 °C. Denne almene reaktion betegnes også "fluordehydroxylering" og er beskrevet i J. Org. Chem. 40, 3809 (1975).

Til at fremme reaktionsforløbet kan anvendes BF^ eller AlCl^, idet det har vist sig, at fluordehydroxyleringen af visse arylsubstituerede ce-hydroxymethyl-a-aminosyrer bliver væsentligt fremmet ved at benytte BF^ eller AlCl^ som reaktant sammen med SF^. Specielt udgør dette en forbedret proces til fremstilling af en forbindelse med formlen

CHpF

i l ^

Rx -CH2-C-COOH (II) nh2. .

hvori R·*· er en arylgruppe, idet man omsætter en forbindelse med formel III

CHoOH

I 2 R1—~CHn-C-COOH (III) nh2 med a) SF^ og b) BF^ eller AlCl-j i flydende HF ved temperaturer i området fra ca. -80 °C til ca. 20 °C. R^ er en arylgruppe, der f.eks. kan være 149841 6 »o'W' .

nz~7r\ eller \y-· 9

H0 H

©7.0?· ·“« Ar, Η _ Η N" foretrukne R^-grupper er

HOn_ H

Ηα/7Λ ___ &.—.· W ' ^.W" °9 (v il

^ N—I

Denne proces udføres fortrinsvis ved atmosfæretryk, selv om der også kan anvendes højere tryk. De foretrukne temperaturer ligger i området fra ca. -80 °C til ca. O °C. Man kan udføre reaktionen ved at sætte SF^ og BF^ (eller AlCl^) til formel III/HF-systemet med det samme, eller man kan starte med at sætte SF^ til systemet, lade reaktionen forløbe i nogen tid og derefter tilsætte BF^ eller AlCl^ til blandingen og lade reaktionen forløbe til ende. Brugen af BF^ eller AlCl-j -giver et væsentligt forbedret udbytte af forbindelsen med formel III.

Syreadditionssalte af de omhandlede forbindelser kan fremstilles på kendt måde ved behandling af den frie cn-aminosyre med en passende syre, normalt i et egnet opløsningsmiddel.

149841 7

En enkelt enantiomer af en af de omhandlede forbindelser kan fås ved (1) at adskille den racemiske fluorerede aminosyre i optiske isomere ved anvendelse af velkendte adskillelsesmetoder eller ved (2) at opdele a-hydroxy-methyl-a-aminosyren, der benyttes som udgangsmateriale, i de optiske isomere og derefter fluorere den enantiomere syre. En almindelig metode til adskillelse af enantiomere består i at danne et salt af α-aminosyren med en optisk aktiv base og derefter udvinde den specifikke enantiomere fra saltet.

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

Alle temperaturangivelser er i °C. De beskrevne fluor-dehydroxyleringer udføres i reaktorer fremstillet af KEL-F® EKSEMPEL 1

Fremstilling af R, S-α-(fluormethyl)-3-hydroxytyrosin

CH-F

^ i

HO -sy 71-CII0-C — COOH

i II A \ NH2 1,5 g R,S-a-(hydroxymethyl)-3-hydroxytyrosin-hydrochlorid (a-hydroxymethyl-DOPA HC1) opløstes i 50 ml vandfrit hydrogenfluorid under afkøling i et is-acetonebad. Opløsningsmidlet blev efter at kølebadet var fjernet, bortdampet ved hjælp af en nitrogenstrøm. Denne operation omdanner HCl-saltet af udgangsmaterialet til HF-salTet. (Alternativt kan man benytte 1,3 g af den fri aminosyre som udgangsmateriale, hvorved man sparer ovennævnte operation). Det dannede HF-salt blev genopløst ved at gennemblæse reaktoren med HF-gas efter afkøling i et bad med tøris og acetone. Gennemblæsningen blev fortsat, 149841 8 indtil der var 30 ml flydende HF i reaktoren. SF^-gas (1,2 ml målt i flydende tilstand ved -78 °C) blev deref- tør lødt Igennem, og tørls/acetone-Dadet Dlcv fjernet og erstattet af et kølebad med en temperatur på -12 °C. Efter 15 timers henstand blev opløsningsmidlet fjernet ved hjælp af en strøm af N^, remanensen blev opløst i 50 ml 2,5 N HC1, inddampet til tørhed under vakuum og underkastet aminosyreanalyse med Spinco-Beckman amino-syreanalyseudstyr. Denne analyse påviste dannelsen af a-fluormethyl-3-hydroxytyrosin. Produktet R,S-a-fluor-methyl-3-hydroxytyrosin isoleres ved ionbytterchromato-grafi på samme måde som beskrevet i eksempel 2 for S-a-fluormethyl-3-hydroxytyrosin.

EKSEMPEL 2

Fremstilling af S-ct-fluormethyl-3-hydroxytyrosin A) Fremstilling af R-a-hydroxymethyl-3-hydroxytyrosin 50 g 3-(3',4'-diacetoxyphenyl)-2-acetamino-2-acetoxy-methylpropionsyre tilsættes 204 ml 4 M vandig KOH-opløs-ning under omrøring. Efter omrøring i 1 time (under nitrogen) indeholder opløsningen kaliumsaltet af 3—(31,4* — dihydroxyphenyl)-2-acetamino-2-hydroxymethylpropionsyre i stort set kvantitativt udbytte. Ved hjælp af methyle-ring med dimethylsulfat overføres dette produkt, uden isolering, i 3-(3',4'-dimethoxyphenyl)-2-acetamino-2-hydroxymethylpropionsyre. Denne operation foregår ved stuetemperatur i ^-atmosfære ved dråbevis tilsætning (ca. 1 time) af ca. 64 ml dimethylsulfat og ca. 148 ml 4 M KOH-opløsning under kraftig omrøring. Reaktionsblandingen omrøres i endnu 1 time og henstår natten over. Derpå gøres blandingen sur med 55 ml koncentreret saltsyre ved 5-10 °C, ekstraheres med 12 x 300 ml ethylacetat, tørres over ^£$0^ og inddampes under vakuum 149841 9 til opnåelse af R,S-3-(3',4'-dimethoxyphenyl)-2-acet-amino-2-hydroxymethylpropionsyre, der renses ved omkry- ( stallisation fra 1325 ml acetonitril. Smeltepunktet for produktet er 154 - 156 °C (dekomponering).

29,1 g stryknin suspenderes i 1,12 liter ethanol opvarmet til tilbagesvaling, og der tilsættes 26,1 g af det ovenfor opnåede produkt. Man lader opløsningen afkøle og henstå natten over, hvorved krystaller af strykninsaltet af antimer "A" (optisk isomer) udfælder. (Smeltepunkt 193 - 194 °C, "HM").

Moderluden fra udfældningen inddampes til tørhed under vakuum og omkrystalliseres fra 270 ml ethanol. Man lader den varme opløsning afkøle til stuetemperatur og henstå i 3 timer, hvorefter den anbringes i køleskab i 4 timer.

De dannede krystaller opsamles på et filter, og efter tørring omkrystalliseres fra acetonitril, hvilket giver strykninsaltet af antimer "B" af 3-(3',4'-dimethoxy-pheny1)-2-hydroxymethyl-propionsyre (smp. 130 - 132 °C under dekomponering). Udbytte 17,5 g.

17 g af dette strykninsalt dekomponeres ved at opløse det i 160 ml vand og tilsætte 31 ml 1 M vandig NaOH.

Det udskilte stryknin fjernes ved filtrering, og opløsningen inddampes til et lille rumfang under vakuum og overføres til en lille ionbytterkolonne (150 ml AG-X2 kationbytterresin Dowex'0^ 50, 200/400 mesh). Eluering med vand, efterfulgt af vakuuminddampning af de fraktioner, der udviser absorption, undersøges på et LKB UV-spektrofotometer (UVIC0RD II - 8300) giver antimer "B" af 3-(3',4'-dimethoxyphenyl)-2-acetamino-2-hydroxy-methyl-propionsyre. Denne forbindelse udviser [a]p : 78,3 + 0,5° (c, 1,425 i 0,1 M vandig NaOH).

Ovennævnte forbindelse omdannes til den tilsvarende U9S41 10 stereoisomere af a-hydroxymethyl-3-hydroxytyrosin på følgende måde: 4,43 g antimer "B" opløses i 100 ml koncentreret HC1 i et lukket Fisher-Porter rør, der opvarmes i 90 min. ved nedsænkning i et oliebad med temperaturen 130 °C. Opløsningsmidlet bortdampes i vakuum, og den nævnte behandling med HC1 gentages. Den opnåede remanens er R-a-hydroxymethyl-3-hydroxytyrosinhydrochlorid.

B) Fluordehydroxylerinq 8 g R-a-hydroxymethyl-3-hydroxytyrosin-hydrochlorid påfyldes en 1 liter reaktionsbeholder. Denne nedsænkes i et kølebad med tøris og acetone, og 80 ml flydende HF kondenseres oven på substratet. For at fjerne den tilstedeværende HC1 fjernes kølebadet, og opløsningsmidlet (HF) fjernes ved gennemblæsning med N^. Beholderen sænkes atter ned i kølebadet, og der indblæses HF-gas, indtil væskevoluminet er ca. 250 ml. Derefter bobles 6,2 ml SF^ (17,6 mmol/ml,v109 mmol) igennem opløsningen, som henstår i en time, hvorefter kølebadet udskiftes med et ethylenglycolbad (-16 °C). Efter yderligere 22 timers henstand indblæses BF^-gas til mætning, og opløsningen henstår ved -16 °C i 46 timer. Kølebadet tages bort, og opløsningsmidlet fjernes ved kraftig N^-gennemblæs-ning. Resten køles hurtigt i 100 ml isafkølet 2,5 M saltsyre, inddampes under vakuum, opløses i vand og overføres til en kationbytterkolonne, hvor der anvendes 2,2 liter AG 50-X-8 resin (200/400 mesh, 74 - 37 ^u).

Der elueres med 0,25 M saltsyre indeholdende 5% methanol i ca. 8 1/2 time, idet 7,2 liter af dette opløsningsmiddel pumpes gennem kolonnen. Der fortsættes med 7,2 liter 0,4 M saltsyre med 7,5% methanol i ca, 8 1/2 time og sluttes med 0,6 M saltsyre med 10% methanol. Der opsamles fraktioner å 22 ml, 10 glas pr. række. Glassene i række nr. 45 - 66 indeholder det ønskede produkt. Inddampning i vakuum giver HCl-saltet af den S-isomere af o-fluor- 11 U9841 methy1-3-hydroxytyrosin.

For at få udskilt den frie aminosyre opløses 4,826 g af forbindelsen i 90 ml isopropanol og filtreres gennem celit. 6,2 ml propylenoxid tilsættes filtratet, og sus-5 pensionen henstår ved stuetemperatur i 3,5 timer og derefter ved ca. 5 °C i 2,5 timer. Det dannede S-a-fluor-methyl-3-hydroxytyrosin opsamles ved filtrering, vaskes med isopropanol og tørres natten over ved 76 °C. [οι]^ : + 9,3° i 0,5°, c, 1,82 i en 1:1 blanding af trifluoreddi-10 kesyre og vand.

EKSEMPEL 3

Fremstilling af R-a-fluormethyl-3-hvdroxytyrosin

Til fremstilling af denne forbindelse blev stryknin-saltet af antimer "A" af 3-(3',4'-dimethoxyphenyl)-2-15 acetamino-2-hydroxymethylpropionsyre (eksempel 2, "HM") underkastet en procedure analog med den i eksempel 2 beskrevne. Slutproduktet udviste [oe]p : -9°, c, 2,5 i en 1:1 blanding af trifluoreddikesyre og vand.

EKSEMPEL 4 20 R,5-a-fluormethyltyrosin 1,05 g (0,005 mol) R,S-a-hydroxymethyltyrosin anbringes i en reaktionsbeholder, som sænkes ned i et kølebad med tøris og acetone, og der sendes HF-gas igennem beholderen, indtil der er opsamlet ca. 50 ml flydende 25 HF. Under fortsat afkøling ledes først gasformig SF^ (4 ml målt i flydende tilstand ved -78 °C) og derefter gasformig BF^ ind i beholderen indtil mætning ved -78 °C. Kølebadet fjernes, og opløsningsmidlet bortdampes ved at man leder en strøm af tør ^-gas gennem blandin- 12 14984 1 gen.

Remanensen opløses i 20 ml 2,5 M saltsyre og inddampes til tørhed i vakuum. Inddampningsresten opløses i vand og overføres til en stærk kationbytterkolonne på syre-form, indeholdende 100 ml AG 50-X-8 resin (200/400 mesh, 74 - 37 ^u). Kolonnen vaskes først med vand (1,8 liter) og derefter med 0,5 M saltsyre. Der opsamles 20 ml fraktioner af udløbet, og forløbet af elueringen følges på UVIC0RD II. Fraktionerne, der svarer til hovedudsvinget på UV-spektret, samles og inddampes til tørhed under vakuum, hvorved fås hydrochloridsaltet af R,5-fluormethyl-tyrosin. 400 mg af dette salt opløses i 6 ml vand, og efter få minutter begynder R,S-fluormethyltyrosin at udfælde. Efter henstand natten over ved 5 °C frafiltre-res produktet, udvakses med vand, ethanol og diethylether og tørres i vakuum ved 76 °C til opnåelse af R,S-a-fluor-methyltyrosin.

EKSEMPEL 5 R,S-ffl-Fluormethylhistidin (FM.HIST) H CH-,ΟΗ

I I

.CIi5-C~C0~H . CILj-C-CO-H

N—! 1) Race-mi sering Hi * I ij} 21 CnCf) Il i| L· >IV ' 3__"-Ν' *2 CH2C6h5 3> H2c=0 CH2C6H5 (L) (D/I·) (i) (1) 149841 13

f2°H CH2F

CII2-C~cq2H CH2“C“COOH

Ma/1% ’Qj ΗΡ/8Γ4Β?3_ ^2 « i

(D,L) FM-HIST

(1) (4) A) Racemisk N(im)benzylhistidin 30 g N(im)benzyl-L-histidin opløses i 600 ml f^O, og opløsningen opvarmes i en højtryksautoklav ved 200 °C i 8 timer under omrystning. Autoklaven afkøles til stuetemperatur, og den klare overfladevæske inddampes i vakuum til tørhed, hvorved fås R,S-N(im)benzylhistidin i form af farveløse krystaller.

B) R,S-ffl-Hydroxymethyl-N(im)benzylhistidin (2) 20 g racemisk N(im)benzylhistidin opløses i 1 liter varmt vand, hvorefter der gradvist tilsættes 40 g basisk kobbercarbonat, og blandingen varmes under tilbagesvaling og omrøring i 1 time. Den varme blanding filtreres, og filtratet inddampes i vakuum, hvorved fås et kobber-chelatkompleks af racemisk N(im)benzylhistidin i form af et blåt fast stof.

En blanding af 31 ml .formalin (38¾ H2C0), 3,1 ml pyridin og 2,13 g Na^CO^ opvarmes under omrøring til 70 °C, hvorefter 20 g af det ovennævnte Cu-chelat tilsættes, og der opvarmes til 73 QC og omrøres i 90 minutter.

Inddampning i vakuum giver en fast blå remanens. Denne 149841 14 opløses i en blanding af 50 ml h^O og 50 ml koncentreret NH^OH og overføres til en kationbyttersøjle (Dowex 50-X-8, 300 ml resin på NH^+-form), hvor den elueres med 2 M vandig NH^OH-opløsning. Udløbet underkastes UV-spektro-skopi, og den del af udløbet, der udviser absorption (1,1 liter), inddampes under vakuum til et fast stof.

Dette opløses i en blanding af 60 ml ^0 og 5 ml koncentreret vandig NH^OH-opløsning og overføres til en anion-byttersøjle (300 ml Dowex l-X-2 resin på 0H~-form).

Søjlen vaskes med 2 liter vand og elueres med 2 M saltsyre. Den del af udløbet, som udviser UV-absorption, inddampes til tørhed til opnåelse af meget rent HCl-salt af N(im)-benzyl-a!-hydroxymethylhistidin (2) (hidtil ukendt forbindelse). Denne forbindelse omdannes til a-hydroxymethylhistidin (3) på følgende måde: 12,5 g af forbindelsen (2) opløses i 200 ml flydende NH^ (3-ha-lset kolbe forsynet med en "kold finger" køler fyldt med tøris og acetone), og der tilsættes 5,5 g metallisk natrium i små stykker, indtil den blå farve opretholdes i 10 minutter. Derpå tilsættes NH^Cl til at forbruge overskydende Na (indiceres ved affarvning), og man lader opløsningsmidlet (ΝΗ^) fordampe ved hjælp af en strøm af N^-gas. Det opnåede produkt (3) renses ved chromatografi i en kationbyttersøjle (2,2 liter Dowe>P^ 50-X-8, 200/400 mesh, 74 - 37 ^u), idet det rå produkt (3) opløses i 100 ml H^O og påfyldes søjlen. Denne vaskes først med vand (4 liter), og derefter elueres med saltsyre (først 1,5 M og derefter 2 M). Der opsamles fraktioner å 20 ml ved en hastighed på 600 ml/time:

Fraktion nr. Pauly Reaktion 1 - 400 1,5 M HC1 401 - 670 2 M HC1 671 og derover +

Fraktionerne 671 - 760 kombineres og inddampes til tørhed 149841 15 i vakuum. Herved fås R, S-oi-hydroxymethylhistidin. 2HC1 (hidtil ukendt forbindelse).

C) R,S-g-Fluormethylhistidin (4) 2,73 g af forbindelsen (3) opløses i 70 ml flydende HF og inddampes til tørhed ved gennemblæsning med Ng-gas. Den resulterende substans er hydrofluoridsaltet af α-hydroxymethylhistidin. Det genopløses i 200 ml flydende HF (kølebad tøris-acetone), og der ledes SF^ til opløsningen (9 ml målt som væske ved -78 °C). Opløsningen henstår natten over i et kølebad ved -12 °C.

Derpå mættes den med BF^-gas, henstår i 5 timer, mættes igen ved -12 °C og henstår ved denne temperatur i 66 timer. Så fjernes kølebadet og opløsningsmidlet bortdampes med ^-gas. Inddampningsresten består væsentligst af HBF^-saltet af a-fluormethylhistidin. Denne opløses i 100 ml 2,5 M saltsyre, inddampes til tørhed og omdannes til HCl-saltet på følgende måde: Remanensen opløses i vand og overføres til en kationbyttersøjle (100 ml AG 50-X-2, 200/400 mesh) og elueres med H2O, indtil udløbet er neutralt og frit for F . Produktet frigøres derefter fra søjlen ved hjælp af 3 M saltsyre og inddampes til tørhed i vakuum til opnåelse af en rest, der væsentligst består af dihydrochloridet af (4). Til afsluttende rensning chromatograferes i en anden AG 50-X-2 søjle (900 ml resin). Der elueres med: 0,5 M saltsyre - 1 liter 1.0 M saltsyre - 1,5 liter 1,5 M saltsyre - 3,3 liter (her begynder opsamlingen, 20 ml.fraktioner) 2.0 M saltsyre - 8,0 liter.

Det ønskede produkt (4) påvises ved en Pauly test. Fraktionerne 390 - 470 samles og inddampes til tørhed under vakuum til opnåelse af det rene dihydrochlorid af (4).

16 U9841

Omkrystallisation fra vand-isopropanol (1:9 vol./vol.) giver det krystallinske monohydrochloridsalt af a-fluor-methylhistidin, smp. 226 - 227 °C (dekomponering).

EK5EMPEL 6

Syntese af R,5-a-fluormethylomithin A) R,S-oi-Hydroxymethyl^P-N-benzoylornithin 7,995 g kobberchelat af R,S-£-N-benzoylornithin sættes i små portioner til en blanding af formalin (38% ^CO, 12,45 ml), pyridin (1,25 ml) og natriumcarbonat (0,81 g) ved 70 °C under mekanisk omrøring. Efter yderligere 90 minutters omrøring ved 75 °C inddampes til tørhed i vakuum, og den mørkeblå inddampningsrest opløses i en blanding af 30 ml 1^0 og 30 ml koncentreret ammoniakvand, og overføres til en kationbyttersøjle (130 ml Dowe>^ 50-X-8 på NH^+-form) til fjernelse af Cu^+. Søjlen elueres med 250 ml 2 M ammoniakvand, og udløbet inddampes til tørhed under vakuum. Inddampningsresten genopløses i H^O og overføres til en anionbyttersøjle (Dou/ex l-X-2 på OH -form, 130 ml resin). Kolonnen vaskes med 250 ml og elueres med 3 M saltsyre. Udløbet fra elueringen koncentreres i vakuum til opnåelse af R,S-a-hydroxymethyl-^-N-benzoylornithin.

B) R,S-o!-Hydroxymethylornithin-dihydrochlorid 3,50 g af det opnåede produkt opløses i 40 ml 6 M saltsyre og varmes under tilbagesvaling i 21 timer. Derefter ekstraheres opløsningen med 2 x 40 ml toluen, og den vandige fase inddampes til tørhed i vakuum til opnåelse af R,S-a-hydroxymethylornithin-dihydrochlorid (hidtil ukendt forbindelse).

C) R,S-a-Fluormethylornithin 149841 17 1,10 g af det under B) opnåede produkt anbringes i en reaktionsbeholder, der nedsænkes i et kølebad med tøris og acetone. Der blæses HF-gas igennem reaktoren, indtil der er dannet 25 ml væskefase. Kølebadet fjernes, og opløsningsmidlet bortdampes med ^-gas. Inddampningsres-ten repræsenterer HF-saltet af R,S-a-hydroxymethylorni-thin. Denne rest genopløses i 50 ml flydende HF, hvorefter der tilledes gasformig SF^ (4 ml målt i flydende tilstand ved -78 °C). Blandingen henstår i 16 timer ved -15 °C, hvorefter der tilledes BF^-gas til mætning.

Efter yderligere 5 timers henstand fjernes kølebadet, og opløsningsmidlet bortdampes ved hjælp af gasformig N£. Resten opløses i 6 M saltsyre, inddampes til tørhed under vakuum og genopløses i 10 ml H^O. Denne opløsning overføres til en Dowe>^ 50-X-8 kationbytter (400 ml resin på H+-form). Kolonnen vaskes med 800 ml H2O, og der elueres med 2 N saltsyre, idet der opsamles 15 ml fraktioner. Flowhastighed: 600 ml/time. Hver femte fraktion chromatograferes på tyndtlag med ninhydrinspray.

Fraktionerne 171 - 220 kombineres og inddampes til tørhed under vakuum, hvilket resulterer i en blanding af aminosyrer, hvori hovedbestanddelen er R,S-a-fluormethyl-ornithin, 2 HC1. Til yderligere rensning rechromatogra-feres produktet i en anden kationbyttersøjle (Dou/ex*' 50-X-8). Søjlen vaskes med vand og elueres med 1,5 N saltsyre, flowhastighed 0,6 liter/time. Ued inddampning af fraktionerne 521 - 540 (20 ml fraktioner) fås ren R,S-oi-fluormethylornithin-dihydrochlorid.

Syntese af S-a-fluormethyltyrosin 18 149341 EKSEMPEL 7 A) Fremstilling af kobberchelatet af tyrosinmethylester 25 g R,S-tyrosinmethylester (128 mmol) opløses i 646 ml 0,2 N NaOH ved 80 °C, og denne opløsning tilsættes 16,1 g CuS0^.5H20 opløst i 1600 ml vand ved 80 °C. Der dannes omgående et bundfald, som frafiltreres efter henstand natten over. Der opnås 28,9 g af kobberchelatet af R,S-tyrosinmethylester.

B) R,S-a-hydroxymethyltyrosinmethylester 29 g af kobberchelatet (Cu ) af tyrosinmethylester (0,064 mol) tilsættes under omrøring ved 70 °C en opløsning af 3,9 g natriumcarbonat, 52 ml 37¾ vandig formaldehyd og 5,2 ml pyridin. Herefter tilsættes yderligere 18 ml formaldehydopløsning og 1,6 ml pyridin. Efter opvarmning til 70 °C i 3,5 timer lader man blandingen afkøle til smeltetemperatur og henstå natten over. Om morgenen er der fremkommet et fyldigt bundfald af blå krystaller, som frafiltreres, hvorefter filtratet inddampes under vakuum. Efter opløsning af remanensen i vand og fornyet inddampning til tørhed opløses resten i 90 ml 4 N HC1. Denne opløsning benyttes efter filtrering til at opløse de ovennævnte blå krystaller. Hertil kræves endnu 300 ml 4 N HC1. Så behandles opløsningen med H£S, filtreres gennem et filter af diatoméjord og koncentreres til ca. 40 g råprodukt. Dette overføres til en stærk kationbytterresin på syreform (0,5¾ Dowex 50-X-8) og elueres med 4 liter vand og derefter 2 N ammoniakvand.

Udløbet undersøges på UVIC0RD II (registrerende UV-spek-trofotometer), og den del, der udviser UU-absorption, koncentreres under vakuum til opnåelse af 22,16 g ren R,S-a-hydroxymethyltyrosin-methylester.

149841 19 C) R,5-N-acetyl-oi-hydroxymethyltvrosin-methylester 19,7 g R, S-ot-hydroxymethyltyrosinmethylester (87,5 mmol) suspenderes i 200 ml tør pyridin, og der tilsættes 68 ml eddikesyreanhydrid. Efter henstand natten over ved stuetemperatur inddampes opløsningen til tørhed i vakuum, hvorefter der destilleres azeotropisk med 2 x 50 ml toluen. Resten opløses i 118 ml methanol og 130 ml 2,5 N NaOH og omrøres ved stuetemperatur i 3,5 timer. Blandingen gøres sur med 30 ml koncentreret saltsyre og ekstraheres med 4 x 200 ml ethylacetat, hvorefter den tørres og koncentreres. Herved fås 21 g råprodukt, som omkrystalliseres fra 75 ml acetonitril til opnåelse af 9,35 g R,S-N-acetyl-a-hydroxymethyltyrosin-methyles-ter, der smelter ved 151 - 152 °C under dekomponering.

D) Optisk opspaltning af R,S-N-acetyl-a-hydroxymethyl- tyrosin-methylester_ 1 g af det under C) fremstillede stof og 6,18 g d-ephe-drin opløses i 50 ml methanol. Opløsningen koncentreres til tørhed i vakuum og genopløses derefter i 50 ml varm acetonitril. Krystallisation giver 7,34 g af d-ephedrin-saltet af R-N-acetyl-a-hydroxymethyltyrosin-methylester, smp. 125 - 131 °C (udbytte A). Dette udbytte A omkrystalliseres fra 40 ml acetonitril til opnåelse af 4,78 g (udbytte B) med smp. 130 - 134 °C. Moderluden fra A og B samles og koncentreres, hvorefter de opløses i 22,4 ml 2,5 N NaOH og 50 ml vand. Den vandige opløsning ekstraheres med 2 x 75 ml ethylacetat, afkøles og gøres sur med 5 ml kone. HC1, hvorefter den resulterende opløsning ekstraheres med 3 x 70 ml ethylacetat. Den tørrede organiske opløsning koncentreres til 7,73 g (udbytte C) . Dette udbytte C opløses sammen med 4,7 g 1-ephedrin i 50 ml methanol og koncentreres til 12,39 g (udbytte D) . Dette omkrystalliseres fra 50 ml acetonitril til 149841 20 opnåelse af 5,06 g af 1-ephedrinsaltet af S-N-acetyl-α-hydroxymethyl-tyrosinmethylester (udbytte E), der smelter under dekomponering ved 131,5 - 133,5 °C. Udbytte E omkrystalliseres fra 27 ml acetonitril og giver udbytte F (4,72 g med smp. 130,5 - 134,5 °C (dekomp.)). Moderluden fra udbytte F og E koncentreres til 7,31 g af udbytte G, som konverteres tilbage til den frie syre ved den metode, der benyttedes til at opnå udbytte C, og der opnås 3,0 g af udbytte H. Dette behandles på samme måde som R,S-udgangsmaterialet med 1,9 g d-ephe-drin. Omkrystallisation af saltet fra 17 ml acetonitril giver 2,4 g af udbytte J (smp- 127 - 130 °C), som omkrystalliseres til 2,06 g af udbytte K (smp. 130 - 134 °C med dekomponering). Udbytte B og K (ialt 6,52 g) omkrystalliseres fra 40 ml acetonitril til opnåelse af 6,06 g af d-ephedrinsaltet af R-N-acetyl-a-hydroxy-methyltyrosin-methylester (75,8% ialt). Den frie syre regenereres på samme måde, som moderluden fra udbytte A og B blev omdannet til udbytte C, og der opnås 3,50 g R-N-acetyl-a-hydroxymethyltyrosin-methylester: [a]p = +92° (c, 1,35, 0,27 N NaOH).

E) R-ct- Hydroxymethyl ty rosin 3,30 g R-N-acetyl-a-hydroxymethyltyrosin-methylester opløses i 100 ml koncentreret saltsyre og opvarmes i et lukket rør ved 130 °C i 2 timer. Opløsningen koncentreres til tørhed, og inddampningsresten opløses i 35 ml vand, filtreres og behandles med 1 ml pyridin, hvorved 2,11 g ren R-oi-hydroxymethyltyrosin (81%) udkrystalliserer: [ot]D = 0,86° (c, 1,15, 50% vandig tri-fluoreddikesyre). Cirkular-dichroisme-spektret (CD) har samme betydning som CD-spektret af 5-a-methyltyrosin.

F) S-ot-Fluormethyltvrosin 21 US$41

Dette produkt fremstilles ud fra R-a-hydroxymethyltyrosin ved samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 4.

EKSEMPEL 8 5 (- )-a-Fluormethylqlutaminsyre 6,56 g a-methylglutaminsyre-semihydrat fotofluoreres i flydende HF ved hjælp af den teknik, der er beskrevet i J. Am. Chem. Soc. j?2, 7494 (1970) og ibid. J?8, 5591 (1976). Substratet opløses i 120 ml flydende HF og be-10 lyses med en 2500 W ultraviolet lyskilde under omrøring, mens gasformig fluoroxytrifluormethan (CF^OF, 3,0 ml målt i flydende tilstand ved -78 °C) ledes igennem over en periode på 80 minutter under køling i et bad af tøris og acetone. Efter omrøring i yderligere 80 minutter 15 ledes endnu en strøm af CF^OF-gas igennem over en periode på 3 timer, mens der omrøres, køles og belyses med UV-lys. Blandingen henstår natten over i kølebadet, hvorefter den yderligere fluoreres med 3 ml CF^OF, der tilsættes over 5 timer, mens der belyses med UV-lys. Til fjer-20 nelse af opløsningsmidlet gennemblæses med nitrogen, og resten inddampes 2 gange i vakuum med 2,5 N saltsyre. Inddampningsresten opløses i 40 ml vand. Til 10 ml af denne opløsning sættes 10 ml koncentreret saltsyre, og blandingen varmes under tilbagesvaling i ca. 68 timer.

25 Efter filtrering med DARC0 G-60 inddampes filtratet i vakuum, og remanensen varmes under tilbagesvaling med 30 ml kone. saltsyre i yderligere 68 timer. Der filtreres og inddampes til tørhed, og remanensen opløses i 10 ml kone. saltsyre og opvarmes i et tilsmeltet gias-30 rør i 24 timer i et oliebad ved 130 - 135 °C. Inddamp-ning til tørhed under vakuum giver en rest, der opløses i vand og chromatograferes i en kationbyttersøjle fyldt 149841 22 med 360 ml AG 50-X-12. Elueringsmidler: 2,6 liter H20 efterfulgt af 0,1 N HC1 (1,5 liter) og derefter 0,15 N HC1. UV-absorption af udløbet måles ved 206 nm. Der opsamles 15 ml fraktioner af udløbet, og 20 sådanne fraktioner, svarende til den første UV-absorption, kombineres og inddampes i vakuum til tørhed til opnåelse af o-fluor-methylglutaminsyre-hydrochlorid. For at få frigivet aminosyren opløses produktet i isopropanol og filtreres, hvorpå der tilsættes propylenoxid. a-Fluormethylglut-aminsyre.0,7 H^O udkrystalliserer fra opløsningen. Denne forbindelse har en tidsafhængig hæmningsvirkning på glutaminsyredecarboxylase.

Spektraldata

Aminosyre if-værdi gruppe Q!-Fluormethyl-3- 3,13 ArCH2 hydroxytyrosin 3,22 do

4.82 CH„F

5,03 do^ 6,78 ArH (H2) 6,90 do (H-) 6,70 do (Hg) ce-Fluormethylhistidin 2,63 ArCH„

3,97 CH„FZ

4,05 do^ 6,63 Imidazol (Ης) 7.82 do (H2) α-Fluormethylornithin 1,7-2,2 (ca.) -CH2CH2~

3,1 " CH?N

4,88 " CH7F

4,93 " άοΔ ffi-Fluormethyltyrosin 3,13 ArCH« 3,32 do

4.87 CH F

4,99 do 6.87 ArH (Hg) 7,10 do (Hb)

Claims

149841 Aminosyre K-værdi gruppe ce-Fluormethylarginin 2,0 (m) a- og P-CH„ 3,33 CH?N 4,98 CH7F 5,03 άοΔ ce-Fluormethyl-meta- 3,33 ArCH2 tyrosin 3,57 do 5.07 CH„F 5,22 άοΔ 7.20 ArH 7.40 do a-Fluormethylglutaminsyre 2,5 (2,07-2,80) β- og X- CH? 4,94 CH,F 5,02 doz a-Fluormethyltryptophan 3,17 ArCH? 3,38 do 4,60 CH?F 4,93 do^ 7,00 Benzimidazol H (H,-) 7.07 do (H,) 7.20 do (Η;) 7.40 do (H7) 7,50 do (h')

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af substituerede ot-fluormethyl-a-aminoalkansyrer med den almene formel CH~F l R-C-COOH (I) nh2 i form .af optisk aktive forbindelser eller vilkårlige eller racemiske blandinger af sådanne forbindelser, eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, hvori R betegner en substitueret alkylgruppe med formlen r'V 149841 R20 — — CiI2— ' hvori R2 er hydrogen eller H alkanoyl med 2-6 C-atomer, ^_____'CH2— ( I \N— . itr» h2n-(cii?)2-ch2-, ch2-, ho——CII2~ » II0\ ^ NH I \ ’ H2N-C*-NII-C!UCH2CH2- , HOOC-CII2-CII2- _____ eller F| jj cli2 ’ kendetegnet LI Ji ved, at man omsætter en tx-hydroxymethyl-a-aminoalkansyre med formlen CH„OH R—— C--COOII ii2 hvori R har den ovenfor anførte betydning, med SF^ i flydende HF ved en temperatur på mellem ca. -80 °C og ca. 20 °C, eventuelt under tilsætning af BF^ eller AlCl^ til reaktionssystemet, hvorefter man om ønsket opspal-ter en fremkommen racemisk blanding i optiske isomere og/eller omdanner den fremkomne forbindelse til et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf.