DK149939B - Fremgangsmaade til bestemmelse af ubundne hormonfraktioner i biologiske vaesker - Google Patents

Description

149939 i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af koncentrationen af den ubundne fraktion af et hormon i en biologisk væske som indeholder bundet og ubundet hormon i ligevægtstilstand.

Det er kendt at nogle af de hormoner der forekommer i legemsvæskerne har to former: den ene form er bundet til bærerproteiner og den anden er ubundet. De to fraktioner er i en indbyrdes ligevægtstilstand og den fri fraktion er i mange tilfælde direkte ansvarlig for de biologiske virkninger. Specielt er tyroidhormoner med tyroxin (T4) og trijodtyronin (T3), der forekommer i blodet, i. hovedsagen bundet til bærerproteiner ved hjælp af en ikke-kovalent binding. Bærerproteiner omfatter et a-giobulin (tyroxinbindende globulin, TBG) som binder ca. 75% af hormonerne, en præ-albuminfraktion (TBPA) og en albuminfraktion (TBA) som binder henholdsvis ca. 15% og ca. 10% af hormonerne. Associationskonstanterne for T3 og T4 med bindende proteiner er forskellige: T3-TBG associationskonstanten er mindre end T4-TBG associationskonstanten og T3-tbpa associationskonstanten er meget lille. Selv når kun meget små fraktioner af T3 og T4 findes ubundet i plasmaet (FT3 og FT4) menes kun ubundne fraktioner at være biologisk aktive. Der er leveret beviser for at bundne hormonfraktioner ikke kan passere gennem cellemembraner.

Det er derfor mere væsentligt at sætte hormonproduktionen i relation til mængden af den ubundne fraktion af hormonet end til den samlede mængde der er til stede i serum. Variationer i koncentrationen af de ubundne hormoner, der er iagttaget hos hypo- og hypertyroide personer, er nærmere korreleret med kliniske symptomer end dem der er fundet for de totale mængder tyroidhormoner. Mængderne af ubundne hormoner hos hypo- og hypertyroide personer overlapper ikke værdierne for de ubundne hormoner hos eu-tyroide personer. Derimod kan der være tilfælde af hypo-eller hypertyroidisme hvor den samlede koncentration af vedkommende hormoner, bundet plus ubundet overlapper den samlede koncentration af disse hormoner hos eutyroide personer. I sådanne tilfælde kan der ikke stilles en korrekt 149939 2 diagnose af hypo- eller hypertyroidisme på basis af den samlede hormonkoncentration, men det kan lade sig gøre på basis af bestemmelser af den ubundne fraktion af hormonerne.

Bestemmelse af ubundet T3 og T4 afslører nye og interessante forhold ved ikke-tyroidale sygdomme. Fx konstateredes der en stigning af niveauet af ubundet T4 hos patienter der er angrebet af angina pectoris. Muligheden for at måle koncentrationen af ubundet tyroidhormoner og navnlig koncentrationen af ubundet T3 og ubundet tyroxin kan muliggøre en forbedret bedømmelse af deres fysiologiske betydning, navnlig i nogle specielle henseender såsom opretholdelse af homøostase for hypotalamo-hypofyse-ty-roidea-systemet.

Reaktionen mellem tyroidhormoner og bindende proteiner kan beskrives som en reversibel reaktion på hvilken massevirkningsloven kan anvendes; ligevægten mellem den ubundne og den bundne hormonfraktion afhænger af associationskonstanten for T3 eller T4 med hvert bindende protein og af antallet af bindingssteder. Tilstedeværende hormon-proteinkomplekser kan betragtes som et reservoirsystem med hensyn til at undgå skarpe variationer i skjoldbruskkirtlens sekretionsaktivitet. Omkring 0,01 til 0,04% af den samlede mængde T4 og 0,2 til 0,4% af den samlede mængde T3 er ubundet. Med hensyn til hormoner med evne til binding til serumproteiner repræsenteres for hver arts bindingssted situationen af følgende ligevægt *i H + P . 2=¾ ' HP.

i i hvor H er koncentrationen af det ubundne hormon, P^ er koncentrationen af de ledige bindingssteder af type i, HP^ er koncentrationen af de besatte steder af typen i og er den relative associationskonstant.

I dette tilfælde er koncentrationen af det frie hormon 149339 3 HP± HP±

Ki.Pi Κ.ίΜ,-ΗΡ^ hvor M. er den totale koncentration af besatte og ledige steder af type i. Eftersom bindingsstederne hos et enkelt protein kan være af forskellig type såvel som de proteiner der er til stede i hele systemet, er på mere almen måde situationen i tilfælde af n arter bindingssteder i serummet ved ligevægtstilstanden repræsenteret af relationen: n Σ HP.

i=l 1 H = - ? VMi—ΗΡι> 1=1 hvor H er koncentrationen af det ubundne hormon, frL og HP^ har de ovenfor angivne betydninger og summationstegnene refererer til arten af bindingssteder i serummet og til de relative associationskonstanter over for hormonet.

TBG og TBPA har et enkelt bindingssted pr. molekyle, mens albumin har to bindingssteder med forskellige associationskonstanter.

Koncentrationen af et ubundet hormon i en biologisk væske bestemmes sædvanligvis ved multiplikation af procenttallet for den ubundne fraktion med mængden af den samlede mængde hormon til stede i væsken. Denne procentsats kan fx bestemmes ved dialyse af serummet blandet med en kendt mængde mærket ubundet hormon. Denne metode anvendt på tyroxin (T4) er fx beskrevet af S.H. Ingbar et al i J. Clin. Invest. 44, 1679 (1965). Den giver imidlertid ikke ret pålidelige resultater eftersom der er adskillige faktorer som kan påvirke resultatet såsom tilstedeværelse af I -ioner, der negativt påvirker beregningen af brøkdelen af bundet hormon i forhold til ubundet hormon.

4 149939

Clin. Invest. 44, 1679 (1965). Den giver imidlertid ikke pålidelige resultater eftersom der er adskillige faktorer som kan påvir-ke resultatet såsom tilstedeværelse af I -ioner, der negativt påvirker beregningen af brøkdelen af bundet hormon i forhold til ubundet hormon.

Den direkte metode der er angivet· af S. Ellis og R. Ekins (Acta Endocrinologies Suppl. 177, 106, 1973 - IX, Acta Endocrinologies Congress, Oslo 17-21 juni 1973) til bestemmelse af tyroxin og trijodtyronin fordrer god teknisk erfaring, der generelt ikke er sædvanlig blandt de teknikere som udfører den slags analyser, idet metoden er temmelig kompliceret. Også denne metode er baseret på dialyseprocesser.

I det særlige tilfælde med T4 er to andre forsøgsmetoder blevet undersøgt. Den første (ubundet T4 indeks) er baseret på bestemmelse af den samlede serumkoncentration af T4 (i overensstemmelse med fx US-PS nr. 3,659,104) og på optagelsen af T3 (fx ifølge -US-PS nr. 3,710,117). Den anden er baseret på fuldstændig dissociation af T4 i nærværelse af mærket T4, efterfulgt af absorption på en harpiks og eluering af mærket T4 fra harpiksen ved hjælp af en portion af det til undersøgelse værende serum (US-PS 3,941,564).

Ved anvendelse af den første fremgangsmåde er det aritmetiske produkt af den totale serurakoncentration af T4 og optagelsen af T3 et indirekte skøn over ubundet T4 (ubundet T4 indeks). Dette skøn er bedre korreleret med skjoldbruskkirtlens funktionali-tet end den samlede koncentration af T4; imidlertid er to særskilte prøver nødvendige, med deraf følgende forstørrelse af fejlkilderne. Begge metoder giver en indirekte værdi for ubundet T4.

Med disse metoder kan der ikke opnås nogen oplysninger om ubundet T3.

Af de ovenfor givne grunde er det klart at kun en direkte måling af ubundet T3 og T4 har god mulighed for at kunne udnyttes til diagnostiske formål.

Den foreliggende opfindelse angår derfor som nævnt en fremgangsmåde til direkte bestemmelse af de ubundne hormonfraktioner i biologiske væsker. Særlig angår opfindelsen en simpel og hurtig fremgangsmåde til bestemmelse af ubundet T3 og ubundet T4 i serum (FT3 og FT4).

Det har vist sig at når en prøve af serum indeholdende disse hormoner bringes i kontakt (fortrinsvis efter fortynding 149939 5 med en puffer for at stabilisere pH-værdien) med en fast matrix med evne til selektivt og reversibelt at binde de ubundne hormoner og forstyrre den ovenfor beskrevne ligevægt, så kan koncentrationen af de ubundne fraktioner af de nævnte hormoner let bestemmes ved at man måler de hormonmængder som er bundet til den faste matrix og dividerer den fundne værdi med en faktor (φ) som har relation til den faste matrix's fysiske egenskaber.

Det er klart at denne bestemmelse kun er mulig hvis den faste matrix kun i ringe grad forstyrrer den ligevægt som styrer systemet. Fx må variationen i koncentrationen af de ubundne hormonfraktioner på grund af forstyrrelsen i alle tilfælde være under 10%.

Det har nu definitivt vist sig at man ved passende valg af typen af fast matrix og mængden deraf med hensyn til rumfanget af serumprøven (efter fortynding med pufferen) kan tilfredsstille de ovenfor beskrevne betingelser.

Specielt har det vist sig at de nævnte direkte bestemmelser af ubundne hormonfraktioner er mulige når der vælges en bindende fast matrix som har en absorptionskonstant Kg overfor hormonerne som er meget lav og et samlet antal bindingssteder som er meget højt i sammenligning med antallet af bindingssteder hvortil hormonerne bindes (HS).

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Når de i krav 1 angivne arbejdsbetingelser er tilfredsstillet, er den mængde hormon der bindes til den faste matrix direkte proportional med den koncentration af det ubundne hormon, der oprindelig var til stede i den biologiske væske.

Faste matrixer som egner sig til selektiv og reversibel absorption af de ubundne hormoner fra biologiske væsker kan udvælges blandt en række stoffer af forskellig type, således ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt en naturlig, syntetisk eller modificeret harpiks; fx faste naturlige polymerer såsom stivelse eller dextran og de samme naturlige polymerer modificeret ved kemisk eller fysisk behandling. Særlig kan der ifølge opfindelsen med fordel som fast matrix bruges et modificeret tredimensionalt polysakkarid og ifølge opfindelsen med særlig fordel et tværbundet dextran med kontrolleret porestørrelse. Selv om det ikke er afgørende for opfindelsen, foretrækkes det at bruge faste matri 149939 6 xer som tillader let og fuldstændig genudvinding af de adsor-berende hormoner, fx ved hjælp af eluering med et opløsningsmiddel. Det har vist sig at visse i handelen gående syntetiske eller modificerede harpikser med fordel kan bruges, forudsat at forholdet mellem mængden af harpiks og rumfanget af prøven bestemmes passende. Eksempler på kommercielle syntetiske og modificerede harpikser er fx dem der sælges under varemærkerne "Sephadex" ® , "Sepharose" ®, "Amber li te" ® og "Dowex" ®.

Som vejledning med hensyn til valget af den faste matrix n kan værdien af summationen Σ K.(H.-HP.) beregnes ved at man i=l 11 1 indsætter de værdier for Kif og HP^, der er angivet af forskellige forfattere for specielle systemer som fx for bærerproteiner for T3 og T4 i serum.

Værdierne af produktet KsSQ kan beregnes eller bestemmes eksperimentelt for hver matrix der kommer i betragtning ved at man udnytter nedenstående relation mellem den kendte koncentration af det ubundne hormon i en standardprøve og mængden af hormonet HR bundet til matrixen efter kontakt med standardprøven:

π - HR

H" φ hvor φ er lig med produktet KsSQ.

I tilfælde af bestemmelse af de ubundne hormoner T3 og T4 (FT3 og FT4) opnås der højst tilfredsstillende resultater ved anvendelse af modificerede polysakkarider son fx "Sephadex" ^ G-25 (et modificeret dextran hvor makromolekylerne er tværbundne) eller "Sephadex" ® LH-20(en perleformet hydroxypropyleret dextran-gel hvor polysakkaridkæderne er blevet tværbundne til frembringelse af et tredimensionalt netværk). Ifølge opfindelsen bruges fremgangsmåden særlig fordelagtigt til bestemmelse af koncentrationen af ubundet tyroxin og/eller trijodtyronin, og i dette tilfælde bruges harpiksen ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt i en sådan mængde at produktet KgSQ bliver af størrelsen fra ca. 10 til ca. 80 og værdien af faktoren D mellem ca.

1 og ca. 20, idet der for hvert enkelt hormon vælges den relevante værdi.

7 143939

Ifølge opfindelsen kan man med fordel gå frem som angivet i krav 2. Til en prøve af en fortrinsvis frisk eller godt konserveret biologisk væske, især blodserum, som indeholder det ubudnne hormon der skal bestemmes, sættes en pufferopløsning så der fremkommer en sluttelig pH-værdi i området mellem 7,3 og 7,8. Det tilsatte puffers rumfang er omkring det samme som rumfanget af serumprøven. Den på denne måde vundne opløsning bringes i kontakt med en forud bestemt mængde af en passende udvalgt fast matrix ved en fysiologisk acceptabel temperatur. Når den ved tilstedeværelse af en fast matrix forstyrrede ligevægt er stabiliseret,fjernes den tilbageværende væske og matrixen vaskes gentagne gange med en puffer med pH 7,3 til 7,8 for at fjerne ethvert spor af prøveopløsningen.

Det på matrixen adsorberede hormon elueres med et opløsningsmiddel som fx metanol. Metanoleluatet inddampes derefter og det tilbageværende hormon bestemmes ved hjælp af en sædvanlig analysemetode.

I almindelighed er ifølge opfindelsen den bedst egnede analyseme-tode til disse bestemmelser en radioimmunbestertmelse. Fx kan man i tilfælde af tyreoidhormoner med fordel bruge den metode der er beskrevet af F. Pennisi et al. (Quaderni Sclavo di Diagnostica 1975, Vol. 11, side 311).

Den mængde hormon som er bundet til matrixen (HR) er korre-leret med den mængde fri hormon der er tilstede i serum (H) ved følgende relation: H - f' W=Vo> hvor φ(adsorptionsfaktoren) er en faktor som afhænger af de fysiske egenskaber af den faste matrix, der kan bestemmes eksperimentelt eller i nogle tilfælde beregnes teoretisk på basis af data i litteraturen.

149939 8

Foretrukne udførelsesforroer

For at give et eksempel på en foretrukken metode til at gennemføre fremgangsmåden ifølge opfindelsen beskrives i det følgende i detaljér følgende fremgangsmåde til bestemmelse af FT4 i serum.

En prøve på 0,5 ml serum indføres gennem den øvre åbning i en kromatografikolonne med en indvendig diameter på 10 mm og en længde på 70 mm. Kolonnen er delt i to afsnit og har to endeåbninger med respektive hætter. Den nederste åbning har mindre diameter end den øverste. I den øverste del er der anbragt 0,5 ml pufferopløsning pH 7,3 (0,1 M fosfat).

I den nederste del findes den faste matrix ekvilibreret med samme puffer. Matrixen er anbragt mellem to porøse polyætylenskiver. Den faste matrix består af 150 mg "Sephadex" ® LH-20.

Den opløsning der vindes ved at blande serummet med pufferen rystes omhyggeligt hvorefter overskud af væsken fjernes gennem den nederste åbning. Efter fjernelse af væsken lukkes kolonnen med hætter. Kolonnen indeholdende den faste matrix inhiberet med residual væske inkuberes i en time ved 37 - 2°C.

Derefter vaskes kolonnen to gange med 2 ml pufferopløsning pH 7,4 (0,1 M tris-(hydroxymetyl)-aminometan-saltsyre) ved 37-2°C og én gang med 0,4 ml metanol for at fjerne tilbageværende pufferopløsning. Vaskevæskerne kasseres. Det hormon, der er adsorbe-ret på den faste matrix i kolonnen,elueres derpå med 2 ml metanol. Eluatet opsamles i reagensglas og inddampes derefter til tørhed under vakuum i en termostat ved 37°C.

Den på denne måde vundne prøve underkastes derefter radio-immunologisk bestemmelse. Følgende fremgangsmåde følges med hensyn til bestemmelse af ubundet T4. Foruden selve den analyserede prøve underkastes seks standardprøver den radioimmunologiske bestemmelse. Disse prøver er fremstillet på i det væsentlige samme måde som den der er beskrevet for den til afprøvning værende prøve, men med anvendelse af forud bestemte inængder hormon T4. I disse standardprøver anvendes henholdsvis 0, 60, 120, 240, 480 og 720 picogram hormon T4. Der fremstilles også standardprøver for bestemmelse af T3 når der skal udføres ledsagende radioimmunologisk bestemmelse med hensyn til dette hormon i en enkelt serumprøve. Den radioimmunologiske bestemmelse udføres fortrinsvis på dobbeltprøver fremstillet ved at man til hver standardprøve og til den til analyse væren 149939 9 de prøve sætter 4 ml pufferopløsning pH 7,4 og overfører portioner på 0,5 ml af hver af de således vundne opløsninger til to reagensglas. Til hvert af disse reagensglas sættes der 0,1 ml af en 125 vandig opløsning indeholdende en forud bestemt mængde T4-I . Af det mærkede produkt (0,1 ml) og af pufferen (0,6 ml) fremstilles der yderligere to prøver for den samlede aktivitetsmåling og for blindprøven.

Til alle reagensglassene undtagen det sidste par sættes der 0,1 ml vandig opløsning indeholdende en forudbestemt mængde T4-antiserum. Alle reagensglas, der hvert indeholder 0,7 ml væske, o inkuberes derefter i fire timer ved 4 C. Derpå fraskilles det hormon, der er bundet til antistoffet, fra det ubundne hormon ved tilsætning til hvert reagensglas af 0,5 ml af en suspension af træ-kul/dextran i destilleret vand (trækul 20 mg/ml, dextran 2 mg/ml, γ-globulin 3 mg/ml i fosfatpuffer pH 7,4), efterfulgt af centrifugering med 4000 r.p.m. i 15 minutter. Trækullet sættes også til de reagensglas som ikke indeholder antiserum. Den ovenstående væske i hvert reagensglas overføres til et nyt sæt reagensglas til radioaktivitetsmålingen. I tilfælde af de reagensglas der er gjort i stand til total aktivitetsmåling og for blindprøvernes vedkommende (dem der ikke indeholder T4-antiserum) underkastes også det trækul, som er fældet ved centrifugering, målingen.

De reagensglas som indeholder den ovenstående væske underkastes radioaktivitetstælling (måling) ved beregning af den aritmetiske gennemsnitsværdi for hvert par.

Radioaktiviteten i de rør som ikke indeholder antiserum svarer til den radioaktivitet der er tilstede i den ovenstående væske også i fravær af antistoffet (blindforsøg).

Disse tællinger skyldes små mængder af stoffer som er immunologisk inaktive og må trækkes fra middeltællingerne for hvert par glas for at opnå den korrigerede middelværdi. Radioaktiviteten · af de udfældede trækul svarer til den samlede radioaktivitet der er sat til reagensglassene (total aktivitetstælling). Disse værdier er nyttige til kontrollering af kvaliteten af reagenserne og af arbejdsteknikken.

Med de korrigerede middelværdier (middeltællinger), der opnås fra parrene af standarder og analyseprøver er defineret værdierne for det reciprokke konkurrenceforhold (R.C.R.) for 149339 ίο alle standard- og analyseprøver. R.C.R.-værdierne svarer til forholdet mellem den korrigerede gennemsnitstælling for standardparret af reagensglas som ikke indeholder nogen mængde T4 (standard 0) og den korrigerede gennemsnitstælling for hver af de andre par af standardglas og glas med analyseprøver.

Der opnås således et antal R.C.R.-værdier som refererer til hver sin af standardprøverne og analyseprøverne og som kan korreleres med deres respektive oprindelige indhold af T4 ved hjælp af en lineær relation af typen: y = a + bx, hvor y er R.C.R.-værdien og x er den mængde hormon som er absorberet af matrixen, udtrykt i picogram (pg).

Koncentrationen af FT4 i den oprindelige analyseprøve bestemmes derfor ved aflæsning af værdien af x for den tilsvarende værdi af y opnået på den ovenfor beskrevne måde, og division deraf med faktoren φ.

Til bestemmelse af FT3 i serum følges i alt væsentligt den samme fremgangsmåde.

Der er foretaget sammenligningsforsøg mellem på den ene side selve den fremgangsmåde der indebærer dialyse (Ellis og Ekins) og på den anden side fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, idet man anvendte den samme heterogene gruppe patienter. Statistiske analyser anvendt på sammenligningsstudier (lineær regressionsanalyse og Student's t "parrede test") viser at de resultater der opnås ved anvendelse af de to metoder ikke er signifikant forskellige. Summarisk fremgår resultaterne af omstående tabel: 149939 11 (+ hi η My Γ w

I Ο Η· nj hd (D

r+ h y il il i-3 i-3 in (D (D ifc* ω (+

in p. ft (D

(+ (D H Hi K p i ·· y h (D y 3

Hi (D to Γ+ (D

pi H (D 3 d P H

K il) iQ Η H 01 il y h n> r+ <d <d ro y p tr--1- ft t n <P (+ ro Μ H tn in (D oi cdh-3H(+ σι oo a

i o P· ro σι h H

H y Pi O 3 ·< <D tn (D Ό 3 —· iq p y y ro χ· h y p® h - (D p H- Φ tn tn in h Hi r+ ro

Otn^^it-i 00¾

D. H- 01 H <i ' <P

O (D <P (D xJ \ p iPOUj II y ·· (OP. σι O 3 PUi ω ω η y y ω in ·< o y ip p« rt Ό u. tn tu o

P II Hi ft) F3C+IQ

btf y Η- Η H- po H-Pipyna y ρ.< *1 pp+pi O O iD tD (D 1-3 tn y tr ro P «»« ft ypiji

PiMHH) VD CO tr H

II p * in σι its η- P tr

Hl (Dpi 00 00 l-i Hi y <D

<cnyH- ro ø. < oi MH-^P (P I- (D (+

ip I- H iP y <D

y pi (D II >C Η O Ό (D (D&3 I— 0) x > id 01 ID 3 in in . ro os σι \ m oi o h ro

(Df+3 vo κ 3 ^ H- O 01 H

χ· P(D Η O I—1 O Hi (D 01 *ΰ y i+ y η· ro po p. o to y p ·· (+ p Pi P Di Hi

Hi ti ro y ro tn

II O Pi >· P R D* P

H Hi H 01 H- 3 ,,οΐφκ; o o *c ro p 3 ,__.U tfl !V t-J- χ χ n in y h ro 03 H- (D Η II vo so (D ^ y y o p η h its. -in μ Μοι r >y h 0~j mm μι pi (D po (D -----w 3 ip y oi py ro in d i i *d rø <+ μι* R O O iQ H* oy

øl (+ X x \ p O PnP

yp r o 3 in P (D

y r+ uiwhh yp (D (D H oo H Hi (+ H (D —'

'· r+ HH

O χ-' (D

H *0 R O Ό ~ 01 y x x (Q Dl «+ Od

II po »J σι \ σ m H

(D O oo 3 x- i r+ M"(+ OitsHPi Hip O (+ H ft

y < (D (D (D

y (D 01 3 H

(D Pi (+1 H1 P P o o f+ y xx Η- < σι oi rt

O (D Oi O

y y oo ω tn pi

W (D

O R

(D tn

Hl (D ---

Hi Η- P to R (+

Π Hi xx O

H· O vo x

(D O tD O

y its O OI

(+ VO R

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af koncentrationen af den ubundne fraktion af et hormon i en biologisk væske som indeholder bundet og ubundet hormon i ligevægtstilstand, kendetegnet ved at man bringer en prøve af den biologiske væske i kontakt med en fast matrix son har evne til reversibelt at absorbere det ubundne hormon og som har en værdi af produktet D.K .S ^ 10% af værdien af summationen Σ1? , c SO 1=1 Ki(Mi“HPi)t hvor D er den fortyndingsfaktor hvormed den biologiske væske fortyndes før den bringes i kontakt med den faste matrix, Kg er absorptionskonstanten for den faste matrix over for det ubundne hormon, SQ er den faste matrix' samlede antal bindingssteder og K^(M^-HP^) er summationen af produkterne af associationskonstanten for bindingsstederne af type i over for hormonet og koncentrationen (M^-HP^) af de ledige steder af type i, idet er den samlede koncentration af steder af type i og HP^ koncentrationen af besatte steder af type i for alle n arter bindingssteder i den biologiske væske, hvorpå man eluerer og bestemmer den mængde hormon som er bundet til den faste matrix,idet man direkte korre- lerer den til mængden af ubundet hormon til stede i den bio- HR logiske væske ved hjælp af relationen H = — , hvor H svarer til koncentrationen af ubundet hormon i den prøve af den biologiske væske, som er bragt i kontakt med matrixen, HR er mængden af hormon bundet til matrixen og ψ en faktor,som står i relation til de fysiske egenskaber af den faste matrix og bestemmes ved forsøg.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at den biologiske væske er blodserum og at kontakten meMpm blodserum og den faste matrix udføres ved en stabiliseret pH-værdi i området 7,3 til 7,8 ved en fysiologisk acceptabel temperatur.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1-2 λ kendetegnet ved at hormonet er tyroxin og/eller trijodtyronin.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3/ kendetegnet ved at værdien af produktet KgSQ er mellem ca. 10 og ca. 80 og at værdien D er mellem ca. 1 og ca. 20.