DK150496B - Alpha-acetolactat-decarboxylase samt fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Description

1 150496

Opfindelsen angår en hidtil ukendt a-acetolactat-decarboxylase og en fremgangsmåde til dens fremstilling.

Ved fermenteringen af alkoholiske produkter, 5 f.eks. øl eller vin, dannes der ofte små mængder diacetyl. Dannelsen af diacetyl er højst ufordelagtig p.g.a. dens stærke og ubehagelige lugt, og i tilfælde af øl har selv små mængder diacetyl på ca. 0,10 - 0,15 mg/liter en negativ indflydelse på øllets aroma og smag. Diacetyl i øl forårsa-10 ges delvist af en infektion med en Pediococeus stamme, der direkte producerer· diacetyl (E. Geiger, Diacetyl in Bier,

Brauwelt 46, 1680 - 1692, 1980), og delvist af det faktum, at ølgær ud fra pyruvat danner α-acetolactat, der ved en ikke-enzymatisk, men temperaturafhængig reaktion omdannes 15 til diacetyl. Under modningen af øl omdannes diacetyl til acetoin ved hjælp af reduktaser i gærcellerne. Acetoin er med hensyn til smag og aroma acceptabel i øl i meget højere koncentrationer end diacetyl.

En anden mulighed for at reducere diacetylmængden 20 i øl er direkte at omdanne α-acetolactat til acetoin ved hjælp af acetolactatdecarboxylase, jfr. dansk fremlæggelses-skrift nr. 145.502. Acetolactatdecarboxylasen kan tilsættes under hovedfermenteringen af øllet eller under modningsprocessen.

25 Enzymet, der er et intracellulært enzym, udvindes ifølge den kendte teknik fortrinsvis fra mikroorganismen Klebsiella pneumonia (Juni E., J.Biol.Chem. 195, 715 - 726, 1952). Da Klebsiella pneumonia er en patogen mikroorganisme er den imidlertid ikke velegnet til industriel anvendelse.

30 Den acetolactatdecarboxylase, der produceres af denne mikroorganisme, har desuden en dårlig stabilitet under betingelserne for dens påtænkte anvendelse, hvilket i tilfælde af øl er en pH-værdi på ca. 4,3 og en temperatur på ca. 10°C.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at 35 tilvejebringe et hidtil ukendt a-acetolactatdecarboxylase-enzym, der har en bedre stabilitet under de ovennævnte betingelser, og som yderligere kan udvindes fra ikke-pato-gene mikroorganismer i forbedret udbytte.

2 15049B

Opfindelsen er baseret på den overraskende erkendelse, at en hidtil ukendt acetolactatdecarboxylase med sådanne egenskaber fremstilles i høje udbytter af mikroorganismer, der hører til arten Bacillus licheniformis.

5 Det er i ovennævnte danske fremlæggelsesskrift nr.

145.502 antydet, at acetolactatspaltende enzymer kan fås fra andre kilder end Klebsiella pneumonia. Dette er imidlertid ikke dokumenteret, og det fremgår ikke af fremlæggelses-skriftet, at en α-acetolactatdecarboxylase med de fordelag-10 tige egenskaber af enzymet ifølge den foreliggende opfindelse kan fremstilles i høje udbytter ud fra Bacillus licheniformis.

Ifølge sit første aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en hidtil ukendt, stabil a-acetolactat-15 decarboxylase, der er ejendommelig ved, at den har et pH-optimum i området fra 5 til 6 og er identisk med den a-acetolactatdecarboxylase, der dannes ved dyrkning af Bacillus licheniformis ATCC 12759, ATCC 12713, ATCC 11946, ATCC 27326, NRRL B-3751, NCTC 2120, NCTC 8721, NCIB 6816, 20 NCIB 8537 eller NCIB 11868 i et egnet næringsmedium, der indeholder carbon- og nitrogenkilder og uorganiske salte.

Alpha-acetolactatdecarboxylasen kan være i fast eller flydende form og har sædvanligvis i fast form en aktivitet i området fra 0,1 til 10 NE (som defineret i det føl-25 gende) per mg protein.

Ifølge et yderligere aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstillingen af denne α-acetolactatdecarboxylase, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter dyrkning af en a-aceto-30 lactatdecarboxylase-producerende Bacillus licheniformis-stamme i et egnet næringsmedium, der indeholder carbon- og nitrogenkilder og uorganiske salte, hvorpå a-acetolactat-decarboxylasen udvindes fra cellerne i kulturvæsken.

Ifølge en foretrukket udføreIsesform for 35 fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse vælges Bacillus licheniformis-stamme fra gruppen bestående af ATCC 12759, ATCC 12713, ATCC 11946, ATCC 27326, NRRL B-3751, NCTC 2120, NCTC 8721, NCIB 6816, NCIB 8537 og NCIB 11868 eller 3 150496 mutanter og varianter heraf med væsentligt de samme egenskaber.

Ifølge en yderligere foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse omfat-5 ter næringsmediet en nitrogenkilde, hvis indhold af frie aminosyrer ikke undertrykker dannelsen af a-acetolactat-decarboxylasen, og der anvendes fortrinsvis en uorganisk nitrogenkilde.

Mikroorganismer, der er i stand til at producere 10 α-acetolactatdecarboxylaseenzymet ifølge opfindelsen, blev udvalgt på grundlag af deres evne til at omdanne a-acetolac-tat til acetoin, som derpå påvises.

Mere end 300 Bacillus stammer er blevet undersøgt ifølge den følgende procedure: 15 Stammerne blev dyrket i rystekolber ved 30°C og 37°C i 24 timer på følgende BCM-substrat: K2HP04 1 9

NaH2P04, 2H20 1 g (NH4)2S04 2,5 g 20 NaCl 0,25 g

MgS04,7H20 0,2 g

FeCl3,6H20 0,04 g

MnS04,H20 0,25 mg

Glucose 10 g 25 Gærekstrakt 3 g

Vand op til 1000 g

Efter dyrkning blev cellerne høstet ved centrifugering, vasket i 0,03 M phosphat/citratpuffer (pH 6,0) og resuspenderet i samme puffer indtil OD(450W40. Prøver på 2 30 ml blev derpå underkastet en ultralydbehandling eller en behandling med 1 mg lysozym per ml ved 37°C i 30 min. og blev derpå centrifugeret.

Alpha-acetolactatdecarboxylaseaktiviteten af supernatanterne blev bestemt ifølge proceduren beskrevet i 35 det følgende.

Screeningsproceduren afslørede, at kun et fåtal af de ca. 300 undersøgte mikroorganismer producerer a-acetolac-tatdecarboxylase i målelige mængder. Disse mikroorganismer 4 150495 er opstillet i den følgende tabel I sammen med enzymaktiviteten bestemt ifølge ovennævnte procedure.

5 Tabel I

Resultat af screeningsproceduren

Stamme Stamme Aktivitet Protein 10 (NOVOsamling (NE) pr. mg/ml nr.) mg protein B. brevTs A 303 0,13 4 B. coagulans A 345 0,007 3 15 B^ pumilus A 185 0,008 2 B. pumilus A 328 0,011 3 B. pumilus A 329 0,004 2 B. subtilis A 518 0,005 3 B. subtilis C 601 0,06 1 20 B^ licheni- formis A 446 0,11 3 B. licheni- formis C 600 0,19 2 B. licheni- 25 formis A 88 0,15 2 B. licheni- formis A 105 0,13 2 B. licheni- formis A 106 0,15 2 30 B. licheni- formis A 200 0,15 2 B. licheni- formis A 203 0,25 2 B. licheni- 35 formis A 244 0,11 2 B. licheni- formis A 248 0,14 2 B. licheni- formis A 1240 0,13 2 40

Stammerne C 600 og C 601 er blevet deponeret af ansøgerne ved National.Collection of Industrial Bacteria,

Torry Research Station, Aberdeen, Scotland den 27. maj 1983 og fik referencenumrene NCIB 11868 og NCIB 11869.

45 De resterende stammer blev opnået fra forskellige kultursamlinger, som det fremgår af følgende liste: 5 150496 NOVO nr. Deponeringsnr.

A 303 ATCC 11031 5 A 345 NRS 83 A 185 ATCC 71 A 328 ATCC 4520 (B. Mesentericus var flavus) A 329 ATCC 7065 A 518 IAM 1109 (B^ natto) 10 A 446 NRRL B-3751 (Bestemt af ansøgerne til at være en B. lieheniformis) A 88 ATCC 12759 A 105 ATCC 12713 = NRRL B-1001 A 106 ATCC 11946 15 A 200 NCIB 6816 A 203 NCIB 8537 A 244 NCTC 2120 A 248 NCTC 8721 A 1240 ATCC 27326 20

Ifølge den kendte teknik (Juni E., ibid.) er cellefri ekstrakter af Bacillus subtilis i stand til at decarboxylere a-acetolactat til dannelse af acetoin. Den kendte teknik beskriver imidlertid ikke anvendelsen af 25 sådanne ekstrakter. Opfinderne har undersøgt 69 forskellige Bacillus subtilis-stammer. Af disse udviste kun 5 a-aceto-lactatdecarboxylaseaktivitet, og disse 5 stammer var desuden meget dårlige enzymproducenter. Bacillus coagulans og Bacillus pumilus-stammer viste sig også at være for dårlige 30 enzymproducenter til industriel anvendelse.

Af de undersøgte Bacillus lieheniformis-stammer producerede 13 ikke α-acetolactatdecarboxylase i målelige mængder, 21 stammer producerede enzymet i meget lave mængder, og 11 stammer producerede enzymet i høje mængder.

35 Ved tandemkrydset immunoelektroforese viste det sig, at alle de nævnte Bacillus lieheniformis-stammer producerer et a-acetolactatdecarboxylaseenzym, der er immunologisk identisk med det enzym, der produceres af Bacillus lieheniformis-stamme C 600.

40 Bacillus brevis-stammerne blev dyrket på tre forskellige medier i rystekolber. Kun én stamme, A 303 (ATCC 11031) udviste α-acetolactatdecarboxylaseaktivitet på alle tre medier. De resterende 11 stammer udviste ikke a-aceto-lactatdecarboxylaseaktivitet i målelige mængder på nogen af 45 de tre anvendte medier, a-acetolactatdecarboxylaseenzymet 6 150498 produceret af Bacillus brevis A 303 viste sig, m.h.t. immumokemiske egenskaber, at være ikke-identisk med det enzym, der produceres af Bacillus licheniformis-stammen C 600. Det faktum, at α-acetolactatdecarboxylaseenzymerne fra 5 de forskellige Bacillus licheniformis-stammer udviser immunokemisk identitet, giver imidlertid grund til at tro, at andre a-acetolactatdecarboxylase-producerende Bacillus brevis-stammer end de undersøgte vil producere essentielt det samme enzym som Bacillus brevis A 303. Med hensyn til 10 "immunokemisk identitet" henvises der til N.H. Axelsen et al., "A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis" (Oslo 1973) kapitel 10.

Bacillus brevis-stammen adskiller sig fra Bacillus licheniformis, idet α-acetolactatdecarboxylasen fra Bacillus 15 brevis dannes uden uønskede bi-aktiviteter, især ferrulinsy-redecarboxylaseaktivitet, der produceres af alle de undersøgte Bacillus licheniformis-stammer. Ferrulinsyredecarboxy-lase decarboxylerer ferrulinsyre, som findes i gærende øl, til den meget ilde smagende forbindelse 4-vinylguajacol.

20 Ferrulinsyredecarboxylase må derfor fjernes fra dyrkningsmediet fra Bacillus licheniformis under oparbejdningsproceduren.

Bacillus brevis-stamen adskiller sig desuden Bacillus licheniformis, fordi Bacillus brevis producerer et 25 enzym, der omdanner de normale precursorer for 2,3- pentandion i øl til 3-hydroxy-2-pentanon, hvorved mængden af dårligt smagende pentandioner formindskes til et akceptabelt lavt niveau. Bacillus licheniformis-stammer producerer ikke et sådant enzym.

30 En NOVO enhed (NE) er defineret som den mængde enzym, der producerer et μπιοί acetoin pr. minut ved 20°C og pH 6.0 (0.03 molær citrat/phosphatpuffer) ved inkubering af en enzymholdig forsøgsprøve med et a-acetolac-tatsubstrat i følgende assay: 35

Substrat

Alpha-acetolactatsubstratet blev fremstillet umiddelbart før anvendelsen ved hydrolyse af a-acetoxy-a-methyl-aceto-eddikesyreethylester. 30 μΐ af diesteren (0,165 7 150498 m mol), 240 μΐ vand og 330 μΐ 1 M NaOH blev blandet og opbevaret på is i 15 minutter. Derpå blev der tilsat 5,4 ml vand, og det opnåede hydrolysat blev anvendt til prøven.

5 Assay

Puffer og forsøgsprøve med en enzymaktivitet på ca. 0,006 - 0,3 NE blev blandet og tempereret ved 20°C i nogle få minutter (rumfang 10,0 ml). Ved t = 0 blev der tilsat 400 μΐ hydrolysat, og prøver på 1 ml blev udtaget ved 10 t = 3, 6, 9, 20 og 50 minutter. Enzymreaktionen blev stoppet ved at anbringe prøverne på is og tilsætning af 200 μΐ 1M NaOH.

Den dannede mængde acetoin måles ifølge W.W.

Westerfeld (A Colorimetric Determination of Blood Acetoin, 15 J.Biol.Chem. 161, 495 - 502, 1945) ved tilsætning af 0,2 ml 0,5% creatin og 0,2 ml 5% α-naphthol i 2,5 N NaOH (frisk fremstillet) til 1,2 ml af de ovennævnte prøver. Efter 60 minutters reaktionstid blev E(524) målt. Som blindprøve blev der anvendt puffer i stedet for celleekstrakt. En standard-20 kurve aftegnes med 0, 0,5, 2 og 4 μg/ml acetoin.

En Bacillus-stamme, der er i stand til at fremstille a-acetolactatdecarboxylaseenzymet ifølge den foreliggende opfindelse, propageres sædvanligvis i et egnet fast næringsmedium ved ca. 30°C, før den dyrkes under aerobe 25 betingelser i et egnet dyrkningsmedium. Dyrkningsmediet indeholder assimilerbare carbonkilder (f.eks. glucose) og en basal saltblanding omfattende f.eks. ammoniumsulphat som nitrogenkilde. Det er essentielt for at opnå høje udbytter, at dyrkningsmediet, når der anvendes Bacillus licheni-30 formis-stammer, ikke indeholder overskud af frie aminosyrer, der kan undertrykke a-acetolactatdecarboxylaseproduktionen. Dyrkningen udføres ved ca. 30°C og ved pH ca. 7, der holdes omtrent konstant ved hjælp af automatiske hjælpemidler.

Beluftning og omrøring justeres til opnåelse af et positivt 35 oxygentryk. Efter dyrkningen høstes cellerne ved centrifugering og vask i en egnet puffer. Cellerne lyseres ved ultra-lydbehandling, behandling med en French presse, lysozymbe-handling, Manton-Gaulin-behandling eller en kombination heraf.

8 150498

Efter centrifugering opnås en rå ekstrakt, der kan underkastes et yderligere oprensningstrin som beskrevet i det følgende.

Alpha-acetolactatdecarboxylaseenzymet ifølge den 5 foreliggende opfindelse kan oprenses fra den rå ekstrakt ved en kombination af et eller flere af følgende trin: a) ammoniumsulphatudfældning b) polyethylenglycoludfældning c) DE 52-anionbytterchromatografi og dialyse, 10 d) syrefældning og dialyse, e) hydroxyapatitchromatografi og dialyse f) lyophilisering.

g) phenyl-sepharose chromatografi h) chromatofocusering 15 Oprensningen af α-acetolactatdecarboxylasen frem stillet ved dyrkning af en Bacillus licheniformis-stamme C 600 dyrket som beskrevet i eksempel 1, blev udført på følgende måde: 94 g celler (våd vægt) blev suspenderet i 20 mM 20 K-phosphatpuffér pH 6,8 og lysozymbehandlet i 30 minutter med 1 mg/ml lysozym ved 37°C og derpå behandlet med ultralyd i en Branson sonifier B 12. Efter centrifugering blev super-natanten påført en DE 52 anionbytterkolonne, hvorved enzymet blev fuldstændig adsorberet. Kolonnen blev vasket med 20 mM 25 kaliumphosphatpuffer (pH 6,8) og elueret med en kaliumphos-phatgradient (20 mM - 500 mM) pH 6,8. Fraktionerne blev analyseret for enzymaktivitet som beskrevet ovenfor. De aktivitetsholdige fraktioner blev samlet.

De samlede fraktioner blev syrefældet ved tilsæt-30 ning af phosphorsyre indtil en pH-værdi på 4,5. Efter centrifugering blev supernatanten dialyseret mod 20 mM kaliumphosphat pH 6,8. Dialysatet blev påført en hydroxyapa-tit (HA)kolonne, der efter vask med kaliumphosphatpuffer pH

6,8 blev elueret med en kali.umphosphatgradient som ovenfor.

35 De fraktioner, der udviste enzymaktivitet, blev ' samlet og dialyseret natten over mod 20 mM kaliumphosphat pH 6,8. Derpå blev dialysatet lyophiliseret. Enzymaktivitet og udbytte fremgår af følgende tabel: 9 150496 0) Ρ

•P

Xj ο οο «31 m Η co rtf © CM CM Οι ΟΊ ©

^ cip iH rH i—1 H rH

in i p

C M O

a) cr>4J m< m in m oo •Μ' P£.V k. ^ ^ ^ ^ ft-H (drH’S'rHCMCMf'OCM ο Ο β Mh cm cm cm cm m o

CD

β a -π tn a) m ο η- cm cm «3< o

Q) g .p CM H CO CD CD © H

g OOrPininminoo 6 WPP ' ia g; a. cu ooooooo

P

tn ip cti

H

tn ns c +J CM CO ID H CO O IT)

H-PWO o oo to r- t'·- © H

h c Z -P to to to cm cm co Λί

Η P

<D >i S3 -a (t

tn ttiH 00 O CO CO

p g eo co tn to cm oo 4H OO *3* CM CM rp

WP

P13ft OHrHrHrHrH

(U

rH

rH

tu fi

o *H

0) oo ο ο ο H oo ©

— 4J co Η H co © oo CO

4JO H in CO CO CO

tn p tn cm ro 83 ft H h > T5 °cd β _ > Φ tn ~ S _ 2 oo tnH oooornm© O t—i cor^oocM^ *·

•ςτ > g co cm co to cm cm H

© ip <D < -P <1) (ΰ tn tn w μη tn •P β >i Π3 >i

tn AiPP-PHpprH

β β(ϋα)β(0<υΐηπ3 •P β p +J 4J Τ3 -P H-> Ο ·Ρ β Ο +ΗΡ ιρρ τίΡ-Ρ t3 ω·ρ οι tu <υ (ϋ <υ <υ ρ c+j AtcMmpgpcu <0 ,* φΗΐηΗΦΟ)ΗΟ<1)>

Ρ cd Ο OP -POP -Ρ rH

Ο, Ρ οβΟΗΟίΡ'ΡΟ,β ΜΗ β Ο fe ρ$ (¾ q (¾ in Η fe υ fe fe in © m o m

Η H CM CM

10 150498

Sammenhængen mellem aktivitet af Bacillus licheni-formis-g-acetolactatdecarboxylaseenzymet ifølge opfindelsen og pH blev bestemt på ekstrakter af Bacillus licheniformis-5 stammer A 446 og C 600 ved forskellige pH-værdier i 0,03 M citrat/phosphatpuffer ved 20°C ved hjælp af metoden til bestemmelse af a-acetolactatdecarboxylaseaktivitet beskrevet ovenfor.

Opfindelsen skal beskrives nærmere under henvisning 10 til tegningen, på hvilken fig. 1 og fig. 2 grafisk illustrerer den relative aktivitet afbildet mod pH for a-acetolactat-decarboxylaseenzymet fremstillet henholdsvis fra stammerne A 446 og C 600. pH-optimet blev fundet til at ligge i området fra 5 til 6.

15

Stabiliteten af de rå ekstrakter af Bacillus licheniformis-enzymet blev undersøgt under anvendelsesbetingelserne, d.v.s. ved 10°C og i fermenteret, men ikke modnet øl. Stabiliteten fremgår af følgende tabel.

20

Tabel III

Stabilitetstest

Stamme Halveringstid i dage_ 25 A 446 21 C 600 15 A 446 11,5 (bestemt i fermenterende øl) 30 Da Klebsiella pneumonia-enzymet har en halverings tid på kun 2-3 timer udviser enzymet ifølge den foreliggende opfindelse en betydelig forbedret stabilitet under anvendelsesbetingelserne for ølbrygning i forhold til det kendte enzym.

35 pi-bestemmelse pi blev bestemt på en rå ekstrakt af stammen A 446 ved tyndtlagsgelelektroforese til at være ca. 4,7.

150496 11

Immunologiske egenskaber

En oprenset fraktion af a-acetolactatdecarboxy-lasen fra Bacillus licheniformis stamme C 600 blev anvendt til at immunisere kaniner ifølge proceduren beskrevet af 5 Harboe og Ingild i: N.H. Axelsen: Handbook of Immunoprecipi-tation-in-Gel Techniques, Blackwell Scientific Publications. London 1983.

Det antistof, der blev produceret på denne måde imod Bacillus licheniformis-enzymet, blev anvendt til at 10 udføre krydset immunoelektroforese og tandemkrydset immuno-elektroforese som beskrevet af A.O. Grubb og J. Krøll, i den ovennævnte publikation.

Da antigenet er inhomogent, er det dannede antistof polyspecifikt og producerer op til 15 bånd ved krydset 15 immunoelektrophorese, af hvilket ét er a-acetolactatdecar-boxylaseudfældningsbåndet. For at identificere dette bånd blev der anvendt en overlægningsteknik baseret på enzymaktiviteten: efter immunoelektroforesen blev pladen ikke fikseret og farvet som sædvanlig, men blev inkuberet i 5 20 minutter i 30 ml af den følgende blanding i låget af en petriskål med en diameter på 14 cm: 150 μΐ ethyl-2-acetoxy-2-methyl-acetoacetat, 1200 μΐ H20 og 1650 μΐ IN NaOH blev blandet og inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter. Derpå blev der fyldt op med vand til 30 ml.

25 Efter inkubering fik blandingen lov til at dryppe af fra pladen, som blev vredet i en Vita-Wrap plastfolie og i aluminiumfolie og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur.

Pladen blev derpå anbragt i låget af en petriskål 30 med en diameter på 14 cm og dækket med følgende blanding: 30 ml 2% LSA-agarose (H20) 3 ml 1% kreatin (H20) 6 ml 5% naphten i 2,5 N NaOH (blandet ved 55°C) 35

Den overdækkede plade blev inkuberet ved stuetemperatur i ca. 1 time. Båndet med a-acetolactatdecarboxy-laseudfældningen viste en rød farve og kunne identificeres.

12 150496

Som nævnt ovenfor viste tandemkrydset immunoelek-troforese af enzymet fra alle de omtalte Bacillus licheni-formis-stammer mod c 600 a-acetolactatdecarboxylase-antistof, at Bacillus licheniformisenzymerne er immunokemisk 5 identiske, medens a-acetolactatdecarboxylasen fra Bacillus brevis ikke krydsbinder med C 600 a-acetolactatdecarboxy-laseantistoffet, hvilket viser, at Bacillus licheniformis-og Bacillus brevis-stammerne producerer forskellige typer af a-acetolactatdecarboxylaseenzymet.

10 Opfindelsen skal forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Stammen A 446 (B^ licheniformis, NRRL B-3751) blev 15 propageret på et TY-medium i rystekolber ved 30°C indtil OD(450) 6.

TY-medium:

Trypticase 20 g 20 Gærekstrakt' 5 g

FeCl^,7 m9 ΜηΟΐ2#4Η2θ 1 mg

MgS04,7H20 15 mg

Destilleret vand op til 1000 ml 25 100 ml af rystekolbekulturen blev overført til en 1,5 liter Kieler-gæringstank indeholdende et uorganisk saltmedium, der pr liter indeholder: 13t 150496

CaCl2,2H20 0,5 g »

MgS04,7H20 0,5 g KH2P04 4,0 g 5 (NH4)2S04 22 g

Spormetalopl.* 3 ml Pluronic 1 ml

Glucose 150 g 10 *Spormetalopl.: H3B03 500 mg/100 ml

CuS04/ 5H2° ^3 mg/100 ml KI 100 mg/100 ml

FeCl3»6H O 333 mg/100 ml 15 MnS04,H20 448 mg/100 ml

NaMo04/2H20 200 mg/100 ml

ZnS04/7H20 712 mg/100 ml

Under dyrkningen blev pH-værdien holdt ved 7,0 ved 20 tilsætning af NaOH. Temperaturen var 30°C, og beluftningen og omrøring blev indstillet til opnåelse af et positivt oxygentryk .

Cellerne blev høstet ved centrifugering efter en celletæthed svarende til OD(450) på 34 var nået.

25 Gæringsforløbet fremgår af følgende tabel VI.

Tabel VI

Aktivitet målt under gæringen 30 Gæringstid NE/ml kultur OD(450) i timer__ - __ 0 0 1,35 5 0 1,69 21 0,022 19 35 24 0,076 28 28 0,440 34 14 150496

Eksempel 2 » Bacillus licheniformis-stamme A 446 blev propageret og dyrket som beskrevet i eksempel 1 med den undtagelse, at gæringsmediet indeholdt 180 g glucose, og at cellerne blev 5 høstet, når der var nået en celletæthed svarende til OD(450) på 47.

112 g celler (våd vægt) blev suspenderet i 20 mM K-phosphatpuffer pH 6,8, og blev lysozymbehandlet i 30 minutter med 1 mg/ml lysozym ved 37°C. De lyserede celler blev 10 underkastet en ultralydbehandling i en Branson sonifier B 12. Ammoniumsulfat blev tilsat til den opnåede rå ekstrakt indtil en mætning på 25%, og blandingen blev anbragt på is i 30 minutter.

Efter centrifugering fandtes aktiviteten i superna- 15 tanten.

Ammoniumsulphat blev sat til supernatanten indtil 70%'mætning, og blandingen blev anbragt på is i 30 minutter.

Efter centrifugering fandtes aktiviteten i bundfaldet.

Bundfaldet blev suspenderet i 20 mM K-phosphat pH 20 6,8, og derpå blev der tilsat 200 mg/ml polyethylenglycol (MW 6000). Blandingen blev henstillet i 30 minutter ved stuetemperatur. Aktiviteten fandtes i supernatanten efter centrifugering.

Proteinindholdet i supernatanten blev adsorberet på 25 en Whatman DE 52 anionbytter, der var blevet vasket med 20 mM K-phosphatpuffer pH 6,8, og blev derpå elueret med en K-phosphatpuffer gradient (20 mM - 500 mM) pH 6,8. De fraktioner, der indeholdt enzymaktivitet, blev blandet og dialyseret mod 20 mM K-phosphatpuffer pH 6,8. Til slut blev dialysatet 30 lyophiliseret. Forløbet af oprensningsproceduren fremgår af den efterfølgende tabel VII.

15 150498 «<—s φ ti C! Φ Φ i 'ΰ 4-1 H (C •P -H i—1 >i-P Φ h-^rj o 04 o uo o ro r- ø >, o Η o h o o r-

P dP tø H 04 ro ro Η H

tø I P

C tfl o „

(1) ϋο+j uo r- oo ro «=r O

pc!^; - κ - ^

OcrinS H cm ro o Η σο O C 4-1 H r-l β

00- P

g m O σι if in ro »i 4J1—i «3· uo 04 oo 00 «^

• o O O OrHHrHH

[ϊ| p p «. *· g aa, o o o 0000

1— I

ni 4J 00 «tf OO OO -tf 0£5 )"j H O 04 00 coi-iojror'·

j7g4J C4 -tf VO 04 04 H

I—I 0)

S H

i® g «5 ro r- H U0 -tf o1 oo uo 00 o uo ro . «tf o «tf ro σο σο t) ρ >- * *.*·>-

g d, o Η Η Η O O

c!

•H

φ vo o 00 ro 04 uo co 4J ro σο ro uo σο ο- i-4 0 UO i—I OO [" O0 04 04

J_j tjo «tf 04 HuOt-lHi-H

(¾ g i-H Η H

β Φ 6 ø H o O OOOOl-t OH ID (X) ID U0 ^ UO * >> g «tf «tfU0 04 O404 P S 1 o +J ø OO o

Φ | I φ 4-> Ή H O

4-> I JJ PHO P 44 β HJ *P OD g Λί·Ρβΐ0β.-4ΦΦΟ44βΙΡΟΡ cd p cd p tø tø ti Ét! cd O Φ P Φ £ P 4-> &o 4-> © 0 44 cd g 3 4-) H D04J 43 4-) 0 4) C C 3Ή 3d ØH Id I (d ft β 44 O 44 Φ

-Η M 0-H 3 -4 3 ft (3 4-) β -P Φ Φ tø P

4-) y U M 4 4 3 I tø 44 β cd 4 4 3 04 >1 Φ

li o φ φ φ 0-P O' 3 d Φ44 t so φ 0 d h uo η η > id PDoft4-)ØCdfitøfil3Hfift4->HO Oid H

p .(ΰ®ββ44043-ΗΦ3ββ·Ηβ44ίΒΟΜΟ·Η β

En ρί4444ωφιΰίΐββ!Λβιη3!>Λφ44βιΟβιΌ (¾ uo o uo o uo Η H 04 04