DK151257B - Polycyklisk furanforbindelse, fremgangsmaade til fremstilling heraf og mikroorganismekultur til anvendelse hertil - Google Patents

Description

i 151257

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt polycyk-lisk furanforbindelse ejendommelig ved, at den har formlen

Me

KC Y^l H M1 / \ H(j B

/-v \—h H H

fl P H °«

Å1X

hvor Δ er hydrogen eller et alkalimetal, idet natriumsaltet er forbindelsen betegnet M 139603.

20 Nævnte polycykliske furanforbindelser er effektive til at nedsætte mængden af methan produceret ved drøvtyggerforgæring og forøge mængden af propionsyre i kvægvomvæske og antages derfor at have vækstfremmende egenskaber på drøvtyggere, idet det er velkendt at andre kemiske forbindelser, som forøger 25 mængden af propionsyre i vomvæsken resulterer i forøgede vækst hastigheder, når de gives til kvæg eller får. De hidtil ukendte forbindelser ifølge opfindelsen har også antibakteriel virkning over for grampositive organismer og anticoccidial virkning over for Eimeria tenella ved en in vitro prøve.

30

Forbindelsen M 139 603 har følgende egenskaber: a) Molekylformel C^H^OgNa, som vist ved massespectrometri, der udviser en molekulær ion M+ med massen 624,361 (beregnet 35 for C^H^OgNa = 624,364) og ved elementæranalyse: C = 67,5, H = 8,8% (beregnet for C35H53°gNa: c - 67,3, H 8,5 %), b) infrarødt spektrum i nujol, som vist på fig. 1, indehol- 2 151257 dende karakteristiske absorptioner ved 3300, 1725, 1645, 1565 og 915 cm , 5 c) protonmagnetisk resonansspektrum i deuteriumchloroform som vist på fig. 2, d) ultraviolet spektrum i ethanolopløsning som udviser karakteristiske absorptioner ved 234 nm (ε = 12900) og 272 nm 10 (ε = 10800), e) smeltepunkt 176-178°C, f) [a]^3 “ 82° = 0,2 i methanol) 15

Den frie syre med ovennævnte formel, hvor A er hydrogen, har molekylformlen C35H54°s' en kara^teristisk Rp = 0,55 (omtrentligt) på tyndtlagschromatografi på silica gel (Merck's "Kiselgel 60F-254" - varemærke), tykkelse 0,25 mm fremkaldt med en blanding af diethylether, methanol og myresyre i forhol-

u U

det 95:4:1 efter rumgang, og UV i ethanol udviser karakteristisk absorption ved 274 nm (ε = 13900) bred.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling 2g af ovennævnte forbindelser ejendommelig ved dyrkning af en M 139 603 producerende stamme af Streptomyces longisporofla-vus i et vandigt næringsmedium indeholdende en kilde til as-similerbart kulstof under rystede aerobe betingelser ved en temperatur mellem 22 og 32°C, ekstraktion af den således frem-3Q komne forgæringsblanding med et med vand ublandbart organisk opløsningsmiddel på sædvanlig måde og inddampning af opløsningsmidlet, om ønsket efterfulgt af isolering af M 139 603 i oprenset tilstand i form af den frie syre eller et alkalimetalsalt.

35

En egnet M 139 603 producerende stamme af Streptomyces longisporof lavus er den, der identificeres som NCIB 11 426, som uden begrænsning står til rådighed fra the National Collection of Industrial Bacteria, Ministry of Agriculture, Fisheries 3 151257 and Food, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Skotland indtil mindst 19. juli 2008, og som har følgende beskrivelse: 5 [De anvendte medier fremstilles i overensstemmelse med opskrifterne for "International Streptomyces Project" (ISP) og er som beskrevet af E.G. Shirling og D. Gottlieb (Internation Journal of Systematic Bacteriology, 16, (3), 313-340, 10 (1966)]. Inkubationsbetingelser ca. 25°C - dagslys.

ISPI tryptongær (men med tilsat agar).

5 dage - tynd, svagt våd, fløjlsagtig, lysebrun.

Bagside ufarvet.

15 13 dage - tynd, fløjlsagtig, svagt kornet, lysebrun.

Bagside ufarvet.

ISP2 gærekstrakt/maltekstrakt agar.

20 5 dage - tynd, fløjlsagtig, lysegrå.

Bagside meget bleg gullig brun.

13 dage - lys, hævet og rynket, fløjlsagtig, lysegul/brun/grå.

25 Bagside lysebrun.

ISP3 havremel agar.

5 dage - sparsom til tynd, fløjlsagtig, lysegul/grå.

30 Bagside ikke synlig.

13 dage - tynd, svagt hævet, fløjlsagtig lysegrå.

Bagside ikke synlig.

35 ISP4 uorganiske salte - startagar.

5 dage - tynd, lysebrun, svagt kornet.

Bagside ufarvet.

4 151257 ISP5 glycerin-asparagin agar.

5 dage - tynd, svagt kornet, lysebrun.

2 Bagside ufarvet.

13 dage - tynd, fløjlsagtig, lysegrå.

Bagside ufarvet.

10 ISP7 tyrosin agar.

5 dage - sparsom til tynd, svagt kornet, fløjlsagtig lysebrun/ grå. Bagside ufarvet.

15 13 dage - tynd, fløjlsagtig, svagt hævet, lysebrun.

Bagside lysebrun/grå.

På ISP7 bliver kulturen med alderen i almindelighed mere lyserød-lysebrun men viser nogle områder med mørkere farv- 20 ning, der står i forbindelse med kraftigere sporedannelse.

ISP9 kulstofudnyttelses agar

Bedømmelse 15 dage - intet kulstof - meget sparsom, neddykket 25 - glukose - tynd/lys, fløjlsagtig, lysebrun + - arabinose - sparsom - 30 - fruktose - tynd, fløjlsagtig, lysebrun + - inosit - meget sparsom - mannit - tynd, fløjlsagtig + 35 - raffinose - meget sparsom - rhamnose - sparsom ± 40 - xvlose - soarsom + 5 151257

Generelt.

Der produceres ingen melaniner.

5

Der produceres ingen bagsidepigmenter.

Der produceres ingen opløselige pigmenter.

10 Sporerne bæres i åbne og tætte spiraler ofte adskilt fra hovedaksen af en mere lige understøttende "hypha" eller måske kæde af sporer. Sporerne selv er vanskelige at se med normal mikroskopi, idet de er meget tæt forbundne. Sporevæggene (E.M. på 4% uranylacetatpræparat) er glatte.

15

Denne stamme af Streptomyces longisporoflavus er også uden begrænsning til rådighed fra Centraalbureau voor Schimmel- cultures, PO Box 273, Oosterstraat 1, 3740 Ag Baarn, Holland under reference CBS 312.79.

20

Opfindelsen angår endvidere en biologisk ren mikroorganismekultur til anvendelse ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde, ejendommelig ved, at den er en kultur af Streptomyces longisporoflavus NCIB 11 426.

25

Den "frie syre" svarende til natriumsaltet M 139 603 kan fås ved at syrne en opløsning af M 139 603 og ekstrahere den sure opløsning med et med vand ublandbart organisk opløsningsmiddel, og andre alkalimetalsalte kan fås ved at behandle en 30 opløsning af den "frie syre" med et passende alkalimetalhy- droxyd f.eks. lithiumhydroxyd, kaliumhydroxyd, cæsiumhydroxyd eller rubidiumhydroxyd. Hvis der anvendes natriumhydroxyd regenereres M 139 603, hvilket viser, at der ved disse reaktioner ikke sker nogen strukturelle ændringer.

35

Som ovenfor nævnt har forbindelserne den virkning at forøge mængden af propionsyre i vomvæske og især at forøge mængden af propionsyre på bekostning af methan og/eller eddikesyre.

Dette er kendt at være en ønskelig virkning ved ernæring af 6 151257 forstadium til gi tikose, hvoraf dyret afleder sin energi og vækst, end eddikesyre, medens den del af dyrets foderindtagelse, som omdannes til methan simpelthen er tabt for dy- g ret, idet methanen udskilles ved opstød. Den ændring af vommetabolismen, som opnås med forbindelserne ifølge opfindelsen, er således en meget nyttig virkning og antages at forøge væksthastigheden og foderomdannelsesvirkningsgraden af drøv-tyggende dyr.

10

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan derfor anvendes til en fremgangsmåde til brug i husdyrbruget med drøvtyggende dyr til forøgelse af deres væksthastighed og/eller til at forøge virkningsgraden af deres foderomdannelse, ved oralt 15 at administrere til dyrene en forbindelse ifølge opfindelsen eventuelt i uren form, som den opnås direkte ved forgæringen eller ved ekstraktion af forgæringsblandingen som ovenfor beskrevet.

20 Ved fremgangsmåden administreres forbindelserne ifølge opfin delsen fortrinsvis oralt til dyrene som et supplement til deres normale kost, dvs. i blanding med et sædvanligt fast foder, i foderblokke eller saltslikkesten, opløst i drikkevandet eller til unge dyr, såsom lam eller kalve, 25 opløst i sødmælk eller skummetmælk. Forbindelserne ifølge op findelsen inkorporeres i foderblokke, saltslikkesten, drikkevand, sødmælk eller skummetmælk i et sådant omfang, at hvert behandlet dyr vil indtage fra 0,01 mg/kg legemsvægt til 30 mg/ kg legemsvægt per dag, fortrinsvis fra 0,01 mg/kg til 10 mg/kg 30 per dag, af en forbindelse ifølge opfindelsen.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan alternativt administreres oralt til dyr i form af langsomt frigørende vompiller eller kugler, således at dyret vil absorbere en lignende mængde per 35 dag af forbindelserne ifølge opfindelsen.

Dyrene kan modtage forbindelserne ifølge opfindelsen i hovedsagelig hele deres vækstperiode eller i kun en del af deres vækstperiode, f.eks. den tidlige del, og/eller tiden der fører 7 151257

O

anvendelse af forbindelserne ifølge opfindelsen, gør det muligt, at dyr der opdrættes til kødproduktion kan bringes til markeds-vægt eller slagtevægt på kortere tid end normalt, eller den gør 5 det muligt at producere tungere dyr efter en normal vækstperiode. Den forbedrede virkningsgrad af foderomdannelsen, der opnås ' med forbindelserne^ ifølge opfindelsen, gør det muligt at behandlede dyr kan nå en ønsket vægt, medens de forbruger mindre foder end ubehandlede dyr vokset til den samme 10 vægt. Tilsat i de mængder, der fremmer optimal vækst, iagttages ingen tegn på nogen giftige virkninger af forbindelserne ifølge opfindelsen.

Forbindelserne anvendes som et middel, der omfatter en for-15 bindelse, et forgæringsprodukt eller en ekstrakt fremstillet ifølge opfindelsen sammen med en fast eller flydende spiselig, ugiftig bærer eller fortyndingsmiddel.

Et egnet flydende fortyndningsmiddel eller bærestof er f.eks. drikkevand, sødmælk eller skummetmælk.

Et egnet fast, spiseligt, ugiftigt fortyndningsmiddel eller bærestof kan f.eks. være et sædvanligt næringsmæssigt afba-lanceret drøvtyggerfoder, f.eks. et typisk kvæg eller fårefoder bestående af kornprodukter såsom bygmel, majsmel eller hvede, nødder og frøprodukter såsom afskallet jordnøddekage eller bomuldsfrøkage eller ekstraheret bomuldsfrøkage sammen med mindre mængder af f.eks. fjermel, tangmel, benmel, kridt, salt, urinstof, melasse, vitaminer og sporstoffer, eller det kan være et indifferent fast fortyndningsmiddel eller bærestof uden energiværdi f.eks. kaolin, talk, calciumcarbonat, fullerjord, attapulgit ler, formalede østersskaller eller formalet kalksten, eller det kan være stivelse eller, laktose.

35

Midlet _ kan have form af et suppléringsfoder til direkte ' fodring af dyrene, i hvilket tilfælde det vil indeholde fra 5 ppm til 3000 ppm af forbindelsen ifølge opfindelsen, i blanding med et sædvanligt drøvtyggerfoder, eller det kan 8 151257 0 have form af en koncentreret forblanding til fortynding med et sædvanligt drøvtyggerfoder til fremstilling af et suppleret foder egnet til direkte opfodring, og en sådan forblanding vil indeholde fra 0,3% w/w til 50% w/w af forbindelsen ifølge opfindelsen i blanding med enten et sædvanligt næringsmæssigt 5 afbalanceret drøvtyggerfoder, et indifferet fast fortyndnings-middel uden energiværdi f.eks. formalet kalksten eller stivelse eller laktose.

I alle midlerne, der er beskrevet.ovenfor, kan·forbindelsen 10 ifølge opfindelsen naturligvis.erstattes af forgæringsblandingen fremstillet ifølgé opfindelsen eller en ekstrakt fremstillet ifølge opfindelsen indeholdende en ækvivalent mængde M 139603, 15 Forbindelsen af formlen I bliver fortrinsvis . seriefortyndet med med et fortyndingsrøiddel eller et bærestof i to eller flere på hinanden følgende trin for at sikre ensartet blanding.

Som ovenfor nævnt har forbindelserne ifølge opfindelsen også 20 anticoccidial virkning. Dette demonstreres af en vævskulturprøve i kyllingenyreceller podet med sporozoiter af Eimeria tenella i overensstemmelse med standardmetoden beskrevet i Journal of Parasitology, bind 58, side 664 - 668 (1972). Ved denne prøve forhindrer M 139 603 vækst af sporozoiterne i en 25 koncentration 0,001 del pr. million og udviser kun giftige virkninger på værtcellerne i en koncentration 0,33 dele pr. million.

Forbindelsen M 139 603 har også grampositive antibakterielle 30 egenskaber og har som eksempel vist sig at forhindre væksten af Staphyllococcus aureaus, Streptococcus faecalis, Clostridium welchii og Corynebacterium acne i en koncentration^ 10 ug pr. ml og kan derfor anvendes som vækstfremmende middel i ikke-drøvtyggende dyr f.eks. fjerkræ og svin.

Opfindelsen illustreres yderligere af følgende eksempler.

35 9

Eksempel 1.

151257

Streptomyces longisporoflavus NCIB 11 426 blev dyrket i en 5 500 ml Erlenmayer kolbe på trypton-gær agar indeholdende:

Trypton - "oxoid" L42 (varemærke) 0,5% w/v Gærekstrakt - "oxoid" L21 (varemærke) 0,3% w/v 10 som forud var blevet steriliseret ved autoklavering i 20 min. ved normal tryk. pH-værdien af mediet var ca. 7,0. Kolben blev rystet ved 25°C i 120 timer på en roterende ryster.

ig Kolbens indhold blev så anvendt til at pode 10 lignende kolber, hver indeholdende 200 ml af følgende medium:

Glucosesirup 3,0% w/v

Calciumcarbonat 0,25% w/v 2Q Natriumchlorid 0,5% w/v

Magniumsulfatheptahydrat 0,05% w/v

Koncentrat af sporstoffer 0,1% w/v

Bakteriologiskpepton "oxoid" L37 - varemærke) 0,1% v/v

Okseekstraktpulver 25 "oxoid" L29 "Lab Lemco"- varemærke) 0,5% w/v

Afioniseret vand til 100.

pH - værdien blev indstillet til 7,8, og mediet blev forsteri-

o U

liseret ved autoklavering ved 120°C i 20 min. De podede kolber blev rystet ved 25°C i 120 timer på en roterende ryster, og kolbernes indhold blev så forenet og indstillet til pH 3 ved forsigtig tilsætning af 0,1 N saltsyre. Mediet blev ekstraheret med ethylacetat (2 x 600 ml), ekstrakterne blev

O O

forenet og tørret over natriumsulfat, og opløsningsmidlet blev afdampet til dannelse af en olieagtig rest (290 mg).

Ethylacetatekstrakten blev renset ved preparativ lagkromato- rrvti *P*i 1-4¾ 4-λ ei 1 ^ nar»l (ΜΛν·η1/ I r* λπλ! «λ1 M d ΠΤΡ_ O C /f _ 10 151257 tat som eluent. Båndet ved R^, = 0,39 (omtrentligt) blev af-θ' skrabet fra pladerne og ekstraheret med ethylacetat, og opløsningsmidlet.blev afdampet til dannelse af en viscos gummi (21 mg), som in vitro udviste antibakteriel virkning overfor S. aureus. Denne aktive fraktion blev yderligere renset ved preparativ lagkromatografi på en silicagelplade (Merck's 5 kiselgel" 60F-254, 20 x 20 cm, 0,25 mm tyk) under anvendelse af en blanding af diethylether, methanol og myresyre i forholdet 95:4:1 (efter rumfang). Båndet ved R^, = 0,55 (omtrentligt) blev skrabet fra pladen og ekstraheret med ethylacetat til dannelse efter afdampning af opløsningsmidlet af en vis-10 kos gummi (9 mg). Gummien blev omdannet til et natriumsalt M 139 603 ved rystning af en chloroformopløsning med en opløsning af natriumhydroxyd (0,1M). Chloroformlaget blev fraskilt og tørret over natriumsulfat, og opløsningsmidlet blev afdampet til dannelse af M 139 603 som et hvidt fast stof ( 8 mg)

15 O

smeltepunkt 129 til 132 C, hvis infrarøde spektrum (fig. 1) viste følgende maxima: 3 300, 1 725, 1 645, 1565 og 915 cm

Elementær analyse: fundet C = 67,5, H = 8,8%, beregnet for C35H53°8Na' C = 67,3, H = 8,5. Massespektrum: M+ = 624,361, beregnet for C-.J-H °oNa = 624,364. R_ = 0,39 (tyndtlags kro-20 53 0 * matografi på Merck's 60F-254, 0,25 mm plader fremkaldt med ethylacetat,gjort synlig som en brun plet efter sprøjtning med 3N svovlsyre og opvarmning til 100°C). Det proton magnetiske resonansspektrum i deuteriumchloroform er reproduceret som fig. 2.

25

Eksempel 2.

Evnen hos M 139 603 til at hindre produktionen af methan i vommen hos drøvtyggere og til at forøge mængden af propionat 30 på bekostning af acetat (Ac/Pr) i de producerede flygtige fedtsyrer (VFA) demonstreres som følger:

Vomvæske opsamles efter regelmæssig rutine fra to stude, som fodres med samme kost af hø plus koncentrat. Prøveudtagnings-35 tiden standardiseres så vidt som muligt, og væsken fra de to dyr samles i forholdet 50:50. Storpartiklet materiale fjernes ved filtrering af den samlede væske gennem fire lag musselin . klæde. Filtratet fortyndes så i forholdet et rumfang filtrat 11 151257 til 3 rumfang kunstig vomvæske (fremstillet som beskrevet af G.L. Bales med flere, Journal of Diary Science, 1976, bind 59, side 1850, men under udeladelse af eddikesyre), og pH-værdien af blandingen indstilles til 6,9 - 7,0 med mættet vandig natriumcarbonatopløsning. 50 ml portioneraf denne blanding dipenseres i 100 ml koniske kolber indeholdende tørret,formalet hø (0,5 g), og hver kolbe anvendes til at undersøge 5 en forsøgsforbindelse i en given koncentration.

Porsøgsforbindelsen sættes til den koniske kolbe som en opløsning i ethanol, kolben skylles med kuldioxid, tilproppes med et subalukke og inkuberes ved 39°C i 15 til 16 timer.

Efrer en time indføres en nål med snæver boring gennem su-10 balukket for at frigøre gastrykket, og nålen udtrækkes 30 min. før inkuberingen afsluttes. Forgæringen standses så ved at anbringe kolben i is, og efter 15 min. afkøling analyseres gassen over væsken for methan ved gaskromatografi. Kolbens indhold filtreres så gennem en forud tørret, sintret glastragt.

15 Tre prøver af filtratet analyseres ved gaskromatografi for VFA, og ved sammenligning med de tidligere bestemte mængder af VFA før inkubationen bestemmes nettoproduktionen af VFA (ace= tat og propionat) under inkubationen.

Der fremkom følgende resultater udtrykt som % af kontrolvær-20 dier, fremkommet når der ikke blev anvendt nogen forsøgsforbindelse. Monensin, et kendt vækstfremmende middel, som virker på vommen, er tilføjet som positiv kontrol.

Forbindelse Koncentration Methan - % i Forhold acetat/ yg per ml forhold til propionat - % 25 kontrol i forhold til _kontrol_ M 139 603 1,0 58 62 0,3 72 64 0,1 87 70 1

Monensin 1,0 67 79 0,3 90 87 0,1 100 95

Eksempel 3 12 151257

Streptomyces longisporoflavus NCIB 11 426 blev dyrket som skråkultur på ISP-7 agar (45 ml), i 7 dage ved 3Q°C. Hver enkelt af tre sådanne skråkulturer blev skrabet i 3 kolber 5 med 100 ml sterilt vand, og de fremkomne suspensioner blev anvendt til at pode tre 2—liter kolber hver indeholdende 1 liter af følgende medium:

Glycerin 3,0% w/v

Bacteriologisk pepton 10 ("oxoid" L-37-varemærke 2,0% w/v KH2P04 0,024% w/v

MgS04, 7H2d 0,02% w/v

Koncentrat af sporstoffer 0,1% v/v

Kridt 0,1% w/v 15 Afioniseret vand til 1 liter som var forud steriliseret ved autoklavering ved normal tryk i en halv time, og hvis pH-værdi var ca. 6,7.

De således fremstillede tre 2-liter kolber blev rystet ved 30°C i tre dage på roterende ryster. De tre flaskers ind-20 hold blev så forenet og anvendt til at pode en rustfri stålforgæringsbeholder indeholdende 30 liter steriliseret medium:

Glycerin 3,0% w/v

Sojamel BSP 70 1,0% w/v

Kridt 0,25% w/v 25 Cerelose 3,0% w/v

NaCl 0,5% w/v

MgS04, 7H20 0,05% v/v

Koncentrat af sporstoffer 0,1% w/v Destilleret vand til 30 liter 1

Forgæringsbeholderens indhold blev omrørt ved 30°C i 70 timer 13 151257 under anvendelse af en turbine med fire flade blade, der roterede med 350 omdrejninger/min. og blev luftet med en hastighed af 15 liter/min. 30 mml "silcolapse" (varemærke), et silikone antiskummemiddel var blevet sat til blandingen før 5 autoklaveringen. pH-værdien på høsttidspunktet var 7,9 og den fremkomne forgæringsblanding (22 liter) blev blandet og omrørt med et lige så stort rumfang.ethylacetat. Efter 30 min. blev biåndingen skilt i en centrifugalseparator, og ethylace= tatekstrakten (ca. 18 liter) blev tørret over vandfri natrium= 10 sulfat og filtreret. Filtratet blev koncentreret under reduceret tryk til dannelse af en olieagtig rest (10,7 g).

M 139 603 fremkom af ovenstående koncentrat ved følgende fremgangsmåde:

Den olieagtige rest (10,7 g) blev opløst i det minimale rum-15 fang ethylacetat, og den fremkomne opløsning blev påført foroven på en søjle af neutral aluminiumoxid (Woelm N, 200 g, 18 x 4 cm) som en opslemning med ethylacetat. Søjlen blev først elueret med ethylacetat efterfulgt af 50% v/v blanding af ethylacetat og methanol og til sidst med methanol. Følgende 20 fraktioner blev opsamlet, efter at opløsningsmiddelfronten var kommet ud af søjlen:

Fraktion nr._Rumgang_Eluent_ 1 150 ml ethylacetat 2 150 ml 25 3 150 ml " 4 150 ml 5 150 ml ethylacetatmethanol 50% v/v 6 150 ml 7 150 ml 30 8 150 ml 9 200 ml methanol 10 200 ml " 11 200 ml 14 151257

Fraktionerne 7 til 11 inklusive blev ved tyndlags kromatografi på silicagel fremkaldt med 20% v/v acetone i petro-leumsether (kogepunkt 60 - 80°C) påvist at indeholde M 139 603 (Rp ^ 0,22), og de blev derfor forenet og inddampet til 5 dannelse af en viskos gummi (840 mg), som blev yderligere renset ved preparativ lagkromatografi på silica (Merck's "Kiesel-gel 60F250" - varemærke, 40 x 20 cm, 20 mm tyk) under anvendelse som eluent af en blanding af 20% v/v acetone i petroleums-ether (kogepunkt 60 - :.80 °C) . De u.v. synlige bånd ved R^, 10 0,22 (omtrentligt) blev skrabet fra de to plader og ekstra heret med ethylacetat, og ekstrakten blev inddampet til tørhed til dannelse af en viskos gummi ( 240 mg), som krystalliserede ved tilsætning af petroleumsether (kogepunkt 60 - 80°C). Dette materiale blev omkrystalliseret af petroleumsether 15 (kogepunkt 60 - 80°C) til dannelse af M 139 603 som farveløse krystaller, der blev frafiltreret og tørret (210 mg), smeltepunkt 176 - 178°C. Det ultraviolette spektrum i ethanol viste absoptioner ved 234 nm (ε=12 900) og 272 nm (ε=10 800).

Det infrarøde spektrum og det kernemagnetiske resonansspektrum 20 var identiske med de, der fremkom af produktet fra eksempel 1.

Eksempel 4.

40 mg M 139 603 blev opløst i en blanding af 10 ml acetone og 2 ml vand, og der blev tilsat 1 ml 2N saltsyre, og blandingen blev omrørt kraftigt i 5 min. 20 ml destilleret vand 25 blev tilsat, og blandingen blev ekstraheret i dichlormethan (2 x 10 ml). Det organiske lag blev fraskilt og vasket med 2N saltsyre, efterfulgt af destilleret vand. Dichlormethanr laget blev så koncentreret til dannelse af en viskos gummi (33 mg) af den frie syre ækvivalent med M 139 603. Elementær 30 analyse fundet: C = 69,5, H = 9,1. Beregnet for C35H54°8: c = 69,8, H = 9,0. I.R. spektrum i nujoll, som vist på fig. 3, indeholdende karakterisktiske absorptioner ved 3 500, 1 765, 1 685, 1 650, 1 575 cm Det protonmagnetiske resonansspektrum i deuteriumchloroform er vist på fig. 4.

Eksempel 5 15 151257

Den frie syre ækvivalent med M 139 603 (30 mg) blev opløst i en blanding af tetrahydrofuran (7 ml) og vand (1 ml). Et alkalimetal hydroxyd ΧΟΗ (2N, 2ml) blev sat til den vandige te= 5 trahydrofuranblanding, som så blev omrørt. kraftigt i 10 min.

10 ml vand blev tilsat, og opløsningen blev ekstraheret i et= her (2 x 15 ml). Etherekstrakterne forenes og inddampes til dannelse af alkalimetalsaltene svarende til natriumsaltet M 139 603.

10 Når X = kalium, dannes kaliumsaltet, smeltepunkt 146 - 150°C, molekylformel C^H^OgK som vist ved massespectrometri, der viser en molekulær ion M+ med massen 640,335 (beregnet for C35H53O8K = 640,338) og ved elementær analyse: Fundet: C=65,7%, H = 8,5% (beregnet for C-^Hj-gOgK: C = 65,6%, H = 8,3%).

15 Når X = rubidium, dannes rubidiumsaltet, smeltepunkt 95 - 120°C, molekylformel C^j-H^OgRb som påvist ved masse spectrometri, der viser en molekulær ion M+ med massen 686,279 (beregnet for C35H53°gRb = 686,286).

Eksempel 6 20 Evnen hos M 139 603 til at forøge mængden af propionat på bekostning af acetat i vomvæsken hos får blev vist som følger: 1 2 3 4 5 6 7 8 får blev holdt individuelt og fodret med samme kost af 1 kg 2 tørrede græsterninger pr. dyr pr. dag opdelt på to fodringer pr. dag. Dyrene blev fordelt tilfældigt med 13 som negativ kon- 3 trol, 5 som positiv kontrol under anvendelse af monensin, en 4 kendt vommanipulator, og 5 som skulle doseres med M 139 603.

5

De behandlede dyr fik monensin eller M 139 603 oralt i en 6 mængde af 0,5 mg/kg hver af fire på hinanden følgende dage, 7 og prøver af vomvæske blev opsamlet med et maverør 6 timer 8 efter behandlingen på den 4. dag. Vomvæskeprøverne blev så analyseret for acetat og propionat som beskrevet i eksempel 2.

Claims (4)

151257 De fremkomne resultater var som følger: Molær% af total VFA Behandlingsgrupper Acetat propionat Negativ kontrol 69,9 19,8 5 Positiv kontrol- monensin 0,5 mg/kg 57,1 32,3 M 139 603 - 0,5 mg/kg 54,2 39,9 Acetatreaktionen for M 139 603 er signifikant ved p < 0,02 sammenlignet med den positive kontrol monensin, og propionat-10 reaktionen for M 139 603 er signifikant ved p < 0,001 sammenlignet med den positive kontrol monensin. 15

1. Polycyklisk furanforbindelse, kendetegnet ved, at den har formlen Me 20 H ' H H OHe >-x)-A°H H 25 ^ \ ή oH fl Me \>H '—i © ® 30 hvor A er hydrogen eller et alkalimetal, idet natriumsaltet er forbindelsen betegnet M 139603. 35 151257

2. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne ifølge krav 1, kendetegnet ved, dyrkning af en M 139 603 producerende stamme af Streptomyces longisporoflavus, i et vandigt næringsmedium indeholdende en kilde til assimilerbart kulstof under rystede aerobe betingelser vad en temperatur 5 mellem 22 og 32°C, ekstraktion af den fremkomne forgærings-blanding med et med vand ublandbart organisk opløsningsmiddel på sædvanlig måde og inddampning af opløsningsmidlet, om ønsket efterfulgt af isolering af M 139 603 i oprenset· tilstand i form af den frie syre eller et alkalimetalsalt. 10

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den M 139 603 producerende stamme af Streptomyces longi-sporoflavus er den, der identificeres som NCIB 11426. 15

4. Biologisk ren mikroorganismekultur til anvendelse ved udøvelse af fremgangmsåden ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den er en kultur af Streptomyces longisporoflavus NCIB 11426.