DK152832B - Fremgangsmaade til fremstilling af en vandig insulinoploesning, der er fysisk stabiliseret mod graensefladepolymerisation - Google Patents

Description

! DK 152832B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af vandige insulinopløsninger, der er fysisk stabiliserede mod grænsefladepolymerisation, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at insulin blandes med et 5 phospholipid med den almene formel I

H-CH-OR' CH-OR" (I) 10 H-CH-O-P(O)(OH)-OR"1 hvor R' og R" er ens eller forskellige og hver betegner hydrogen, alkylcarbonyl, alkenylcarbonyl, alkadienylcarbonyl, alkatrienylcarbonyl eller alkatetraenylcarbonyl, med det forbehold, at ikke både R' og R" samtidig betegner hydrogen, 15 og R"1 betegner en hydrofil gruppe, og med vand og eventuelt med et zinksalt, et konserveringsmiddel, et middel, der gør opløsningen isotonisk, og et pufferstof, hvorhos vægtforholdet mellem phospholipidet og insulinet er i området 1:5 til 1:10.000, og koncentrationen af phospholipidet er i om-20 rådet fra ca. 10 til ca. 200 μg/ml.

Insulin, som er opløst i et flydende medium, f.eks. vand, kan opbevares adskillige år ved stuetemperatur, og præparaterne er stabile inden for den pågældende periode. Hvis man imidlertid opvarmer en insulinopløsning til ca.

25 80°C, denaturerer insulinet i løbet af få minutter, hvilket her betegnes varmedenaturering eller varmepolymerisering.

Hvis man ryster en insulinopløsning i nogle få dage ved en lavere temperatur, hvor der ikke sker nogen eller i det væsentlige ikke nogen varmedenaturering, f.eks. ved 41°C, vil 30 der ske en anden slags polymerisering, og denne slags poly-merisering betegnes her ikke-covalent grænsefladepolymerise-ring.

Hos insulinfabrikanterne, insulinforhandlerne og patienterne opbevares insulinpræparater sædvanligvis ved ca.

DK 152832 B

2 5°C, og der sker tilsyneladende ikke nogen grænsefladepoly-merisering i sådanne præparater, selv om præparaterne uundgåeligt fra tid til anden rystes under transport.

I løbet af de sidste år er der blevet ydet en sta-5 dig større indsats for at udvikle bærbare eller implanter-bare systemer til kontinuerlig infusion af insulin. Den mekaniske del af et apparat til kontinuerlig afgivelse af insulin omfatter i princippet bestanddele såsom et insulinreservoir, et pumpesystem og et egnet kateter til afgivelse 10 af insulin til patienten. Hvis insulinopløsningen tilføres af en pumpe, kan den også virke som insulinreservoir.

Når insulin i kommercielt tilgængelige opløsninger anbringes i sådanne systemer, har det desværre vist sig, at insulinet har en evne til at undergå grænsefladepolymerise-15 ring ved legemstemperatur og dermed tilstoppe både mekaniske dele og tilførselskatetre. Dette karakteristikum ved insulinopløsninger har vist sig at være en stor hindring for yderligere udvikling og klinisk anvendelse af kontinuerligt infusionsapparatur.

20 Det er klart, at insulinopløsninger i en hvilken som helst slags kontinuerligt tilføringsapparatur udsættes for bevægelser, der giver grænsefladepolymerisering. Den generelle ufuldkommenhed af kendte insulinpræparater i denne sammenhæng er righoldigt dokumenteret i litteraturen, jfr.

25 f.eks. Diabetologia 19 (1980), 1-9.

Til løsning af dette problem er det blevet foreslået at anvende sure insulinopløsninger indeholdende gluta-minsyre eller asparaginsyre, jfr. Diabetes 30 (1981), 83. Insulin er imidlertid kemisk ustabilt i syre, selv ved tem-30 peraturer under legemstemperatur. Det er yderligere blevet foreslået at anvende insulinpræparater indeholdende ikke-ioniske overfladeaktive stoffer, jfr. DE offentliggørelsesskrift nr. 2.952.119. Ikke-ioniske overfladeaktive stoffer kan imidlertid betragtes som uønskede i lægemidler til pa-35 renteral anvendelse.

3 DK 152832 B

sådanne gener overvindes ifølge den foreliggende opfindelse, der angår en fremgangsmåde til fremstilling af vandige insulinopløsninger, i hvilke insulinet er væsentligt mindre tilbøjeligt til at undergå ikke-covalent grænseflade-5 polymerisering under de betingelser, der foreligger i kontinuerligt insulintilførselsapparatur, end det er tilfældet med konventionelle insulinpræparater.

Det har nu overraskende vist sig, at vandige insulinopløsninger kan stabiliseres mod grænsefladepolymerise-10 ring, når der er mindst et phospholipid med formel I til stede i opløsningen.

I phospholipider med formel I er den hydrofile gruppe (R,n) fortrinsvis 2-(trimethylammonio)ethyl, 2-amino-ethyl, 2-carboxy-2-aminoethyl, 2,3-dihydroxypropyl eller 15 2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl, idet de pågældende phos pholipider giver særlig fordelagtige egenskaber, og blandt de pågældende substituenter foretrækkes 2-(trimethylammo-nio)ethyl. De ovennævnte alkylcarbonyl-, alkenylcarbonyl-, alkadienylcarbonyl-, alkatrienylcarbonyl- og alkatetraenyl-20 carbonylgrupper kan indeholde fra ca. 8 til ca. 22 carbon- atomer, og i en udføreselsform for denne opfindelse indeholder de fra ca. 12 til ca. 22 carbonatomer.

De ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede vandige insulinopløsning kan indeholde 25 ét eller flere phospholipider med formlen I og eventuelt et zinksalt, et konserveringsmiddel, et middel, der gør opløsningen isotonisk, et pufferstof og andre fysiologisk acceptable forbindelser, der er kendt som additiver til insulinopløsninger .

30 En foretrukken undergruppe af forbindelser med formlen I er forbindelser, hvor R' og R" hver betegner alkylcarbonyl. En yderligere foretrukken undergruppe af forbindelser med formlen I er forbindelser, hvor R"1 betegner 2-(trimethylammonio)ethyl, hvilke forbindelser er kendt som 35 lecithiner. Yderligere foretrækkes forbindelser med formlen I, hvor R' og R" hver betegner alkylcarbonyl med fra ca. 8

4 DK 152832 B

til ca. 16 carbonatomer eller fra ca. 12 til ca. 16 carbon-atomer, og R" * betegner 2-(trimethylammonio)ethyl. Den mest foretrukne undergruppe af forbindelser med formlen I er forbindelser, hvor R' og R" hver betegner octanoyl. Forbindel-5 ser med formlen I, hvor R' og R" hver betegner octanoyl, foretrækkes, fordi de ikke synes at danne liposomer og endvidere fordi de ikke ved lavere koncentrationer, f.eks. under ca. 160 μg/ml, synes at danne miceller.

Mængden af et phospholipid med formlen I, der er 10 nødvendig til stabilisering af en insulinopløsning, er i området fra ca. 10 til ca. 200 μg/ml, mere foretrukket fra ca. 10 til ca. 100 μg/ml, fortrinsvis fra ca. 25 til ca. 75 μg/ml, mest foretrukket fra ca. 30 til ca. 50 μg/ml, insulinopløsning. Koncentrationen af opløst insulin i de ved 15 fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede opløsninger er i området fra ca. 5 til ca. 1000 internationale enheder (I.U.) pr. ml eller endog højere.

Nogle af de stabiliserede insulinopløsninger, der er fremstillet ifølge de følgende eksempler, kan indeholde 20 liposomer. Det er imidlertid usandsynligt, at sådanne liposomer indeholder insulin, idet de er dannet før tilsætning af insulin. Hvis der er liposomer til stede i de ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede insulinopløsninger, foretrækkes det, at insulinet i det væ-25 sentlige er uden for sådanne liposomer. Udtrykket i det væsentlige betegner, at fortrinsvis mere end 90%, dog helst mere end 99%, af insulinet er uden for eventuelt tilstedeværende liposomer.

Kendte liposomer indeholdende insulin, jfr. f.eks. 30 europæisk patentansøgning nr. 32.622, kan skelnes fra denne opfindelse både ved deres formål og på grund af, at tilstedeværelsen af insulin inde i en evt. tilstedeværende lipo-somvesikel i de ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede insulinopløsninger udelukkende er 35 tilfældig. Medens de ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede insulinopløsninger er beregnet

s DK 152832 B

til parenteral administration, er oral administration den primære begrundelse for at indkapsle insulin i liposomer. Et formål med liposomer indeholdende insulin er at beskytte insulinet mod uønsket kemisk angreb, f.eks. kemisk nedbrydning 5 af insulinet i maven, hvis insulinet administreres oralt.

Artiklerne vedrørende liposomer indeholdende insulin beskæftiger sig slet ikke med fysisk stabilisering af insulinopløsninger mod grænsefladepolymerisering. I kendte liposomer indeholdende insulin er vægtforholdet mellem phospholipidet 10 og insulin f.eks. i området fra 1:0,01 til 1:0,001, medens vægtforholdet for de ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede insulinopløsninger er i området fra 1:5 til 1:10.000, fortrinsvis fra 1:10 til 1:1000.

Vesttysk offentliggørelsesskrift nr. 2.652.636 an-15 går en fremgangsmåde til stabilisering af følsomme proteiner ved tilsætning af beskyttelsesforbindelser med amphophil opbygning. Modsat den foreliggende opfindelse opnås stabiliseringen ifølge ovennævnte offentliggørelsesskrift ved indkapsling af det følsomme protein for at undgå kontakt med 20 vand. Insulin er yderligere, ifølge ovennævnte offentliggørelsesskrifts terminologi, ikke at betragte som et følsomt protein.

Et formål med denne opfindelse er at holde insulinet i kontakt med vand, d.v.s i opløsning, idet insulinet 25 udelukkes fra kontakt med andre grænseflader.

De ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede insulinopløsninger indeholder fortrinsvis okse-, svine- eller humaninsulin.

Ifølge en foretrukken udførelsesform indeholder de 30 ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede insulinopløsninger zink. Mængden af zink skal imidlertid vælges således, at der ikke sker nogen udfældning. En god stabilitet mod grænsefladepolymerisering opnås i insulinopløsninger, hvor forholdet mellem den molære koncentra-35 tion af zinkioner, der er til rådighed for insulinet, og den molære koncentration af insulin beregnet som hexamer insulin

6 DK 152832B

er i området fra ca. 1,5 til ca. 4,6, fortrinsvis fra ca. 3 til ca. 4,5, mest foretrukket fra ca. 3,6 til ca. 4,3. Foretrukne zinksalte er opløselige zinksalte såsom zinkacetat eller -chlorid. Hvis de ved fremgangsmåden ifølge den fore-5 liggende opfindelse fremstillede insulinopløsninger indeholder forbindelser, der danner komplekser med insulin, såsom en aminosyre, f.eks. glycin eller histidin, eller en hydroxy c arboxy syre, f.eks. citronsyre, er kun en del af det totale zinkindhold til rådighed for insulinet.

10 Et eksempel på fremstilling af insulinopløsninger ifølge opfindelsen omfatter opløsning af insulin, f.eks. krystallinsk zinkinsulin, f.eks. højrenset insulin såsom "monokomponent" insulin, jfr. britisk patentskrift nr. 1.285.023, i vand i nærværelse af syre, f.eks. saltsyre. Der 15 fremstilles separat en vandig opløsning af et konserveringsmiddel, f.eks. phenol, en alkylphenol såsom cresol, eller p-hydroxybenzoesyremethylester, og opløsningen indeholder om ønsket også et middel, der gør opløsningen isotonisk, såsom natriumchlorid eller glycerol. Konserveringsmiddelopløsning-20 en kan endvidere indeholde et pufferstof såsom natriumortho-phosphat, natriumcitrat, natriumacetat eller TRIS (tris(hydroxymethyl) aminomethan) . Den resulterende konserveringsmiddelopløsning sættes derefter om ønsket til den sure insulinopløsning efterfulgt af tilsætning af en base, f.eks. en 25 natriumhydroxydopløsning, til indstilling af pH-værdien på neutral. I sammenhæng med denne opfindelse angiver betegnelsen neutral en pH-værdi i området fra ca. 6,5 til ca. 8. Phospholipidet med formlen I kan sættes til insulinopløsningen som en opløsning eller kolloid opløsning, der er 30 fremstillet ved at opløse eller suspendere phospholipidet med formlen I i vand og om nødvendigt underkaste en eventuel suspension for ultralydbehandling før blanding med insulinopløsningen. Phospholipidopløsningen kan om ønsket indeholde et pufferstof og et konserveringsmiddel. Efter tilblanding 35 af phospholipidet kan insulinpræparatets pH-værdi indstilles på neutral. Den resulterende insulinopløsning fyldes til

7 DK 152832 B

slut op til det beregnede rumfang ved tilsætning af vand, steriliseres derefter ved filtrering og overføres efterfølgende aseptisk til sterile hætteglas, som derefter lukkes.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse 5 kan udføres ved at blande insulin med en forbindelse med formlen I og evt. med et zinksalt, et konserveringsmiddel, et middel, der gør opløsningen isotonisk, og et pufferstof i nærværelse af vand.

Nogle forbindelser med formel I er kendte, og de 10 resterende forbindelser med formel I kan fremstilles analogt med fremstillingen af kendte forbindelser.

Yderligere detaljer for udførelsen af den foreliggende opfindelse gives i de følgende eksempler. Det insulinudgangsmateriale, der benyttes i eksemplerne, indeholder fra 15 ca. 20 til ca. 35 μg zink pr. mg nitrogen. Bestemmelsen af stabilitetsfaktoren fremgår af det følgende.

Til bestemmelse af insulinopløsningernes stabilitet mod grænsefladepolymerisering underkastes opløsningerne en stabilitetstest under forcerede betingelser på følgende 20 måde: 12,5 ml's hætteglas indeholdende 10 ml testprøve forsynes hver med en gummiprop og anbringes vertikalt i et rysteapparatur (forhandles af Heto, Danmark), der er totalt neddyppet i et vandbad, som holdes ved 41°C +/- 0,1°C. Hæt-25 teglassene underkastes horisontalt, rokkende bevægelser med en frekvens og amplityde på henholdsvis 100 rpm og 50 mm.

Testprøvernes opalecens bestemmes med regelmæssige tidsintervaller på et "Fischer DRT 1000 nefelometer" (forhandles af Fischer, Canada). Det skønnes at der er sket 30 grænsefladepolymerisering, når uklarheden overstiger 10 NTU (nephelometric turbidity units).

Stabilitetsfaktoren beregnes som forholdet mellem den tid der går, før der sker grænsefladedenaturering i testprøven, og den tilsvarende tid for en kontrolprøve, der 35 er fremstillet på samme'måde som testprøven, med det forbehold, at der ikke er tilsat en forbindelse med formlen I.

Eksempel 1

DK 152832 B

8 500 mg semisyntetisk humaninsulin opløses i 10 ml 0,045 N saltsyre, og der tilsættes 359 mg p-hydroxybenzoe-syremethylester, som er opløst i 300 ml destilleret vand.

5 Der tilsættes endvidere 476 mg natriumacetattrihydrat, 2,46 g natriumchlorid og 4,73 ml af en 0,2 N natriumhydroxydop-løsning opløst i 15 ml destilleret vand. 9 mg dimyristo-yl,L-alfa-phosphatidylcholin suspenderes i 10 ml af en opløsning af 70 mg natriumchlorid, 13,6 mg natriumacetat og 10 10 mg p-hydroxybenzoesyremethylester i destilleret vand. Der bobles nitrogen gennem opslæmningen, som behandles med ultralyd i et ultralydbad i 2 timer. Den resulterende kolloide opløsning sættes under omrøring til insulinopløsningen. pH-værdien indstilles på 7,45 med 0,2 N saltsyre eller en 0,2 N 15 natriumhydroxydopløsning, og der tilsættes destilleret vand til et rumfang på 350 ml. Den resulterende insulinopløsnings stabilitetsfaktor er over 125.

Eksempel 2 9,65 g svineinsulin opløses i 400 ml 0,02 N salt-20 syre, der tilsættes 5,0 g krystallinsk phenol og 40 g vandfrit glycerol, og der tilsættes yderligere destilleret vand til et rumfang på 2200 ml. pH-værdien indstilles på 7,45 med en 0,2 N natriumhydroxydopløsning. 125 mg distearoyl,L-alfa-phosphatidylcholin opløses ved forsigtig opvarmning i 2 25 ml ethanol (96%) og sprøjtes under kraftig omrøring via en kanyle ned i 100 ml destilleret vand med en temperatur på 70°C. Den resulterende, uklare opløsning behandles i 15 min med ultralyd med en højenergiultralydsonde, den resulterede, kollide opløsning sættes under omrøring til insulinopløs-30 ningen, og der tilsættes destilleret vand til et rumfang på 2500 ml. pH-værdien indstilles om nødvendigt på 7,45. Stabilitetsfaktoren er over 30.

Eksempel 3-8

9 DK 152832B

Der fremstilles insulinopløsninger på analog måde som beskrevet i eksempel 1 med det forbehold, at de anvendte phospholipider er lecithiner, hvori de hydrofobe dele, 5 d.v.s. R' og R", er identiske og er som angivet i tabel I. Resultaterne fremgår også af tabel I.

Tabel I _______

Eksempel R' og Insulin- Stabilitets- nr.___art_faktor_ 10 3 myristoyl svin over 120 4 palmitoyl svin 104 5 stearoyl svin over 117 6 lauroyl human over 133 7 myristoyl human over 133 15 8 palmitoyl human 75

Eksempel 9

Der fremstilles en insulinopløsning på analog måde som beskrevet i eksempel 1 med det forbehold, at det anvendte phospholipid er æglecithin, og det anvendte insulin er 20 svineinsulin. Stabilitetsfaktoren er 96.

Eksempel 10-14

Der fremstilles insulinopløsninger på analog måde som beskrevet i eksempel 1 med det forbehold, at svineinsulin er tilsat i en mængde, der giver de i tabel II angivne 25 slutkoncentrationer. Resultaterne fremgår også af tabel II.

10 DK 152832 B

Tabel IX__

Eksempel Insulin, Stabilitets- nr._I. U. /ml_faktor_ 10 20 over 120 5 11 40 over 120 12 100 97 13 200 79 14 500 53

Eksempel 15 10 1,50 g svineinsulin opløses i 6,5 ml 0,2 N salt syre, og der tilsættes vand til et rumfang på 50 ml. 1,0 g p-hydroxybenzoesyremethylester og 1,78 g natriumphosphat opløses i 900 ml destilleret vand, og insulinopløsningen tilsættes. pH-værdien indstilles på 7,45 med en 0,2 N natrium-15 hydroxydopløsning. En kolloid dimyristoyl,L-alfa-phosphati-dylcholinopløsning, der er fremstillet på analog måde som beskrevet i eksempel 2, tilsættes sammen med destilleret vand til et rumfang på 1000 ml til opnåelse af en phospholipids lutkoncentration på 50 μg/ml. Stabilitetsfaktoren er 20 over 30.

Eksempel 16

Der fremstilles en insulinopløsning på analog måde som beskrevet i eksempel 15 med det forbehold, at den endelige opløsning indeholder 20 I.U. insulin pr. ml. Stabili-25 tetsfaktoren er over 17.

Eksempel 17

u DK 152832B

Der fremstilles en insulinopløsning på analog måde som beskrevet i eksempel 15 med det forbehold, at den endelige insulinkoncentration er 500 I.U./ml, og det endelige 5 indhold af dimyristoyl,L-alfa-phosphatidylcholin er 50 μg/ml. Stabilitetsfaktoren er over 30.

Eksempel 18-20

Der fremstilles insulinopløsninger på analog måde som beskrevet i eksempel 2, med det forbehold, at dimyri-10 stoyl,L-alfa-phosphatidylcholin anvendes i en mængde til opnåelse af den i tabel III angivne slutkoncentration. Resultaterne fremgår også af tabel III.

Tabel III________

Eksempel Dimyristoylforbindelse, Stabilitets- 15 nr _ _μg/'ml_ faktor 18 1 1,3 19 10 1,8 20 50 over 33

Eksempel 21 20 Dioctanoyl,L-alfa-phosphatidylcholin opløses i destilleret vand og sættes, i en tilstrækkelig mængde til opnåelse af en slutkoncentration på 30 μg/ml, til en insulinopløsning, der er fremstillet analogt med insulinopløsningen i eksempel 1. Stabilitetsfaktoren er over 63.

Claims (10)

12 DK 152832B 3.65 g semisyntetisk humaninsulin opløses i 100 ml 0,02 N saltsyre og 2,0 g krystallinsk phenol. Der tilsættes 16 g vandfrit glycerol og 0,3 ml zinkchloridopløsning inde- 5 holdende 4% zink, og der tilsættes endvidere destilleret vand til et rumfang på 900 ml. pH-værdien indstilles på 7,45 med en 0,2 N natriumhydroxidopløsning. 50 mg dioctanoyl,L-alfa-phosphatidylcholin opløses i destilleret vand og sættes til opløsningen. Destilleret vand tilsættes til et rumfang 10 på 1000 ml. Stabilitetsfaktoren er 65. Eksempel 23 3.65 g semisyntetisk humaninsulin opløses i 100 ml 0,02 N saltsyre og 2,0 g krystallinsk phenol. Der tilsættes 16 g vandfrit glycerol og 0,3 ml zinkchloridopløsning inde- 15 holdende 4% zink, og der tilsættes endvidere destilleret vand til et rumfang på 900 ml. pH-værdien indstilles på 7,45 med en 0,2 N natriumhydroxidopløsning. 40 mg dioctanoyl,L-alfa-phosphatidylcholin opløses i insulinopløsningen, og destilleret vand tilsættes til et rumfang på 1000 ml. Stabi-20 litetsfaktoren er over 30.

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en vandig insulinopløsning, der er fysisk stabiliseret mod grænsefladepolymerisation, kendetegnet ved, at insulin blandes med et 25 phospholipid med den almene formel I DK 152832B H-CH-OR’ CH-OR" (I)

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den hydrophile gruppe er 2-(trimethylammonio)ethyl, 2-aminoethyl, 2-carboxy-2-aminoethyl, 2,3-dihydroxypropyl eller 2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendeteg net ved, at insulinet i det væsentlige er uden for eventuelt tilstedeværende liposomer

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at R'" betegner 2-(tri- 25 methylammonio)ethyl.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at R1 og R" hver betegner alkylcarbonyl indeholdende fra ca. 8 til ca. 16 carbonatomer.

5 H-CH-O-P(O)(OH)-OR"' hvor R' og R" er ens eller forskellige og hver betegner hydrogen, alkylcarbonyl, alkenylcarbonyl, alkadienylcarbonyl, alkatrienylcarbonyl eller alkatetraenylcarbonyl, med det forbehold, at ikke både R' og R" samtidig betegner hydrogen, 10 og R"' betegner en hydrofil gruppe, og med vand og eventuelt med et zinksalt, et konserveringsmiddel, et middel, der gør opløsningen isotonisk, og et pufferstof, hvorhos vægtforholdet mellem phospholipidet og insulinet er i området 1:5 til 1:10.000, og koncentrationen af phospholipidet er i området 15 fra ca. 10 til ca. 200 μg/ml.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, 30 at R' og R" hver betegner alkylcarbonyl indeholdende fra ca. 12 til ca. 16 carbonatomer.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at R' og R" hver betegner octanoyl.

14 DK 152832 B

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at koncentrationen af phospholipid med formlen I i den pågældende opløsning er i området fra ca. 10 til ca. 100 μg/ml.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at vægtforholdet mellem phospholipidet med formlen I og insulin er i området fra ca. 1:10 til ca. 1:1000.

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af 10 de foregående krav, kendetegnet ved, at vægtforholdet mellem den molære koncentration af zinkioner, som er til rådighed for insulinet, og den molære koncentration af insulin beregnet som hexamert insulin er i området fra ca. 1,5 til ca. 4,6. 15