DK153794B

DK153794B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 23-monoestre eller 2',23-diestre af omt

Info

Publication number: DK153794B
Application number: DK553982A
Authority: DK
Inventors: Herbert Andrew Kirst
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1981-12-14
Filing date: 1982-12-13
Publication date: 1988-09-05
Also published as: JPS58110598A; GR77094B; DE3268461D1; KR850000978B1; IL67452A; EP0082003A1; GB2111497B; DK153794C; IE822952L; DK553982A; DK623786A; IL67452A0; GB2111497A; US4401660A; CA1189503A; IE54283B1; KR840002855A; DK623786D0; HU194268B; EP0082003B1

Description

DK 153794 B

o

Den foreliggende opfindelse angår en analogifrem-gangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte antibiotika, nemlig 23-mono- eller 21,23-diester-derivater af OMT.

Hidtil ukendte, forbedrede antibiotika behøves konti-5 nuerligt. Udover antibiotika, der er anvendelige ved behandling af sygdomme hos mennesker, er forbedrede antibiotika også nødvendige på det veterinære område. Forøget styrke, udvidet spektrum for bakteriel inhibering, forøget in vivo effektivitet og forbedrede farmaceutiske egenskaber, såsom 10 større oral absorption, højere blod- eller vævskoncentrationer, længere halveringstid i kroppen og mere fordelagtige grad eller måde til udskillelse og grad eller form af metabolisme* er nogle af målene for forbedrede antibiotika.

T5 OMT er et antibiotikum beskrevet i US-patentskrift nr.

3.459.853. Aliphatiske og aromatiske esterderivater af OMT, bl.a.

23-O-benzoyl-OMT, er tidligere beskrevet i J. Antibiotics 34, nr. 1G (1981), 1377-80, og det er angivet, at sådanne esterderivater har en rimeligt stærk antibakteriel virkning.

20 Overraskende er esterderivaterne af OMT fremstil let ifølge den foreliggende opfindelse meget kraftige og har f.eks. væsentligt forbedret styrke i forhold til OMT og dets kendte estere.

I overensstemmelse hermed angår den foreliggende

25 opfindelse en analogifremgangsmåde til fremstilling af 23--monoestre eller 2',23-diestre af OMT med den almene formel (I) Q

iV* 30 / \ fl CHa-fl \-CHa-CH' 0 „ J CHs i R -(0Η2ν°“°^Η2Υ Y \

CH3-CH2-A · al-OH ? ?R

35 V il V

C(^ /»-N-CHs OHa (I)

O

2

DK 153794B

hvori R er hydrogen, eventuelt 1-3 gange med Cl, Br og/eller F substitueret C^-C^-alkanoyl eller benzoyl, phenylacetyl eller phenylpropionyl, hvori phenylkernen eventuelt er 5 substitueret 1-5 gange med Cl, Br, F og/eller CH_ eller 1-2 gange med CH^O, NO2 og/eller OH, m er 1 eller 2, R er 3-pyridyl eller en gruppe med formlen R6 hvori 5 6 R og R uafhængigt er hydrogen, chlor, methyl, ethyl, methoxy 15 eller nitro, X er 0 eller S, og n er 0 eller 1, hvilken fremgangsmåde er karakteriseret ved, at mycarose spaltes fra en forbindelse, som svarer til forbindelsen med den almene formel (I), men hvori hydrogen-20 atomet i 41-hydroxygruppen er erstattet med en gruppe med formlen

OH

/ ^\CH3 -/ 4-Vqh Ό-/

25 I

ch3 ved syrehydrolyse, hvorpå der, hvis R er forskellig fra hydrogen i den således fremstillede forbindelse med den almene formel (I), eventuelt foretages deesterificering 30 af produktets 2*-stilling ved opvarmning eller tilbagesvaling i vandigt methanol til fremstilling af en forbindelse med den almene formel (I), hvori R er hydrogen.

Udtrykket "C^-C^-alkanoyl", som det anvendes heri, betyder en acyldel afledt fra en carboxylsyre indeholdende 35 fra 1 til 5 carbonatomer. I en sådan del kan alkylgruppen være ligekædet eller forgrenet. Som nævnt bærer gruppen 3

O

DK 153794B

eventuelt 1 til 3 halogensubstituenter. Acetyl, chlorace-tyl, trichloracetyl, trifluoracetyl, propionyl, n-butyryl, isobutyryl, n-valeryl og isovaleryl er eksempler på sådanne grupper.

5 Strukturen af OMT er vist ved formlen (II) 1.

I p

CHa-J^ \-CHs-IL

V\

\ Vfl-CHa \·-4«- OH

(II) 0H3 2',23-Diesterderivaterne af OMT fremstilles som nævnt ved 20 syrehydrolyse af mycarose fra de tilsvarende 21,23-diesterderiva-ter af DMT (demycinosyltylosin).

23-Monoesterderivaterne af OMT fremstilles enten ud fra de fremstillede tilsvarende 2',2 3-di ester derivater af OMT ved fjernelse af acylgrupperne fra 2'-stillingen. Denne selektive deesterifice-25 ring udføres ved opvarmning eller tilbagesvaling i vandigt methanol. Deesterificeringsreaktionen kan overvåges ved hjælp af standardteknik, såsom TLC, til bestemmelse af den tid, der er nødvendig til fjernelse af 2'-acylgruppen.

Alternativt fremstilles 23-monoesterderivater af 30 OMT hensigtsmæssigt ved syrehydrolyse af mycarose fra de tilsvarende 23-monoesterderivater af DMT.

Som det er beskrevet, fremstilles de omhandlede esterderivater af OMT ved hydrolyse af de tilsvarende estre af DMT. Strukturen af DMT er vist ved formlen (III) 35

O

4

DK 153794B

! ir ,

5 CHzS f-CHs-CH

- /' «ζΧ HO-CHs-γ Y \

Ota-Ote-i » i-OH f f ·

VSV shk Γ V

io c( V-n-chs ·—»h:h3 \ r'/-o-/ Λ·"0Η CHs U-f (III) CHe 15 Disse DMT-estre tilvejebringer værdifulde udgangsmaterialer til fremstilling af de tilsvarende OMT-estre, idet 4'--hydroxylgruppen er substitueret og således beskyttet i-mod acylering. Mycarosylsubstituenten kan derfor fjernes ved en mild syrehydrolyse, når først de Ønskede acylerin-20 ger er udført.

DMT' fremstilles ved fermentering af Streptomyces fradiae NRRL 12170 under submerse aerobe forhold, indtil der er dannet et væsentligt niveau af antibiotisk aktivitet. DMT kan ekstraheres fra et næringsmediumfiltrat, 25 som er gjort basisk, med organiske opløsningsmidler, såsom ethylacetat, og kan renses yderligere ved ekstraktion, chromatografi og/eller krystallisation. Den DMT-produce-rende stamme af Streptomyces fradiae er blevet deponeret og gjort til del af stamkultursamlingen hos Northern 30 Regional Research Center, Agricultural Research, North Central Region, 1815 North University Street, Peoria,

Illinois, 61604, hvorfra den er tilgængelig for offentligheden under accessionsnummer NRRL 12170.

Illustrative OMT-estre fremstillet ifølge den foreliggende 35 opfindelse omfatter de forbindelser med formel (I), der er anført i tabel I.

O

5

DK 153794 B

TABEL X

Illustrative OMT-esterderivater

Forbindelse 5 nr,_ _5_ S3-(cH2)n-C°- 1 acetyl (p-chlorphenyl)- acetyl 2 H (p-chlorphenyl)- acetyl 10 3 phenylacetyl phenylacetyl 4 acetyl phenylacetyl 5 acetyl phenylpropionyl 6 H . phenylpropionyl 7 acetyl (2,5-dimethoxy- phenyl)acetyl 15 8 H (2,5-dimethoxy- phenyl)acetyl 9 acetyl (p-nitrophenyl)- acetyl 20 10 H (p-nitrophenyl) - acetyl OMT-esterderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse inhiberer væksten af pathogene bakterier, især grampositive bakterier, Mycoplasmaarter og Pasteurella-25 arter. Eksempelvis viser tabel II og III de minimale in-hiberingskoncentrationer (MIC), ved hvilke de illustrative forbindelser inhiberer visse bakterier. MIC i tabel. III er bestemt ved standardagarfortyndingsbestemmelser. MIC i tabel III er opnået under anvendelse af et konventionelt 30 næringsmediumfortyndingsmikrotiterforsøg. Til sammenligning anføres også MIC af 23-O-benzoyl-OMT (sammenligningsforbindelse A), af 23-O-acetyl-OMT (sammenligningsforbindelse B), 23-O-propionyl-OMT (sammenligningsforbindelse C), 23-O-n-butyryl-OMT (sammenligningsforbindelse D) og 23-0-35 -i-butyryl-OMT (sammenligningsforbindelse E). Det vil af disse resultater ses, at estere fremstillet ifølge opfin-

DK 153794 B

6

O

delsen udmærker sig ved et generelt bredere og/eller kraftigere virkningsspektrum end de kendte forbindelser.

5 10 15 20 25 30 35 7

DK 153794B

1Γ) m ID m ft CN U") U") CN (NU") in CN min CM Η* * * * * * * * * - *- oooo oo o o oo mm in min m id in m

Q CN CN in CN N IN CN O CN CN CN CN

* * * * * * * * * * OOOO oo o o oo in m in m inininin cncn cn cn in m

(J CN CN CN CN HH Η H CNCN H NT

* * * * k k k *. * * oooo oo o o oo in m m m m m m m m m

(¾ CN CN in CN CNCN Η H CM in rH'vT

oooo oo o o oo m mm mm m 10 m m <; m m m m cm in η o cncn cncn * * * * * * ** * ** ** OOOO oo o o oo inminininm mm

CN CN CN CN CNCN ID CO CNCN

OiHrHrHrH i—ί i—I Ο O Η H t—IrH

i-_| * * * * * * * * * * OOOO oo o o oo m m m m m mmm

μ CNCNCNCN (N in ID H CNCN

Cl) Η Η Η H i—I CN O O i—i Η Η H

.p OM * * * ** * * * *· “·“·

rd OOOOOOOOOO

>

•H

p cd m m oj cn cn m κι m in in id co cn m

rø H cdhcncncn cncn o O HCN HCN

μα) *.·.·· * * * * «·«

dl rø OOOO OO O O OO

4J c* to -H m in m m 0)^5 m m m cn m in 0 ro cncn I p γ* cn cn cn H hcn 0 0 hh hcn jp 0 * * * * * * * *. * »

g! ιμ OOOO OO Ο O OO

O CD

tn m -s m mm mmm nit/) cNmmcN mm id h mm mm i ρ oHmmH nm 0 0 hh mm Π +> 0 *.*···*· «... «, - «.·> - M CD ft oooo 00 0 0 00 00

A -H

[a > m mmm mH m mmm mm id h mm mHCNCNCN mm 0 0 hh mm ^ k. V *» k. *» k. V ^

EH(tJ OOOO OO O O OO OO

M

cn mm mmmmmmm -rt mmmmmmmHmm

_p *3* Η H CN H i—I 1—I 1—I O HH HH

0 »i**'* - -.-. * * * *

H OOOOOOOOOO

Λ •rl 4J mmmmmmiDcnmm pi cn m mmm mm ο ο mm hh H ********** oooo 00 0 0 00 m mm mm mmmm mm id m mm

CNHCNCNH HCN Ο O HH

**** * * * * * * Eh Eh oooo 00 o o 00 s la mmmm m mm mmmm mm m cn m m ^ Η H 1—ICNH HCN Η O HH id **** * * * * ** Eh Eh oooo 00 0 0 00 3 3 +)

CD

HHOHHCNcn >

Heroen HH O ID O -P CN ·&

Η>τΡΗ ft ft m H ID ID ΗΙΠ P

CD x X co WW O X £ OCN ft g X O) K K Ή in 01 tn Ρ Ω id -H pi pi cn in <d tn

CO ϋ pi pi ft pi JJ

cdu υ in υ υ o cn tn 0 O "H D O CD O Pi CD ,¾

μ O ο Ό O O <d O H cd H

0 0 OH 0 cn 0 -Η Ο Η N

cn H H S s OCD OP! 0 = Λ C ! ‘ II

tn >, in = = = >1 P -P p! HQ -P <D ft a) Ό. Λ pi Λ0) ft φ ft 6 ft ft 0 2 Eh cn ft cd ft Ό id tn 0) 3 m ft S h 2 ρ c? p cd-H ρ ο P a) P pi cum 0 -P pi -P ft +> >1 -P Pi P> P id Pi 0 ft CD id CD CD CO ft CO ft CD O' HI Ή Id

8 DK 153794 B

If) ^ CO O vO 04 LD LO CTi

r-ί Lf) r-ί G O CO

M * E"l E** E* fH IH {H ** “* GOrtmzaøøgs0 in i> • οι oi vp cn ιπ o oo q oh oh _ o o r« - » v eh & t< B ti B - *· *· o o h o g S S S 2 S3 o o o m σι σι o oo cm i© o o o ni o o m n oh o t-~ H o o cm cm h o o cm «. k, «k k. k. k. *» >» »i *> *· *· **

O O HOOHH lOOO O O O

in ^ cno iDioiDcvio cm o cm m o oo cq o h m in in h in h cm h o o t-~ kk k. k k k s ·· ** ** ^ ^ w s

O O HHHOH O O O O O O

in σιο locoio io o o cm in o o pj. no ,-h o r~- m in cm cm H o o o - - * * *· o o hohsh idioo o o o in m cno cm cm cm id cm cm cm cm o in oo O OH ΗΗΗιηΗ HHH H O I'' H «*· * » * » * ' ' “ - * '

o o O O O H O O O O O O O

Γ'

00 in l© 10 10 10 10 CM CM O O O CO

o c— o o o o o o hhh o o t"~ w i, «. ·. ». k k ». *. ·* ** ** **

0 O HHHHH OOO O O O

V V

o οσ> o cm o cm o in in o m o oo inH cm H cm h cm cm o cm o o in h,*. k k k k s ** *· k k, ** w

0) p-io 10 O 10 O 10 10 CM 10 O O H

ω Η V

η co cn cm cm cm o o cm o o in co cr^ Η H O Η H CM CM H Od O O Γ" >r| Ν k k. k» k, k. k» k. k. k. * * **

n O O O CM O O <0 10 O <0 O O O

P -π V V

0 ^ m lo lo r-* co oocoiøocmcocmcmcmo oo iJilO HH O 'CM Η E" HHH O Γ' -ft k. kk k k k k *· *k k» k. ** £H Mk ω o o ohiooo ooo o a o

H P

1-10 in

u Gu O

CTlOlOlOlOOOCOCMCMCMO ο

lJ οΗΟΟΟογ"Γ'-ηηηο _ H

Η ^*· *-*·«···* ‘».•.k Ej '

S O O HHHOO OOO O g O

$ ' V V

ti in 01 m iooooj^co o cm cm in in o <3< ho o r~ h <d r~ cm η h o o in kkk* ** “ k *k *» ·>.

O O HOOgO 10 O O O O H

V V V

in cn in iDioioiooo cm cm cm in in cm cn ho in in in in r~ hhh o o h .. .. -.·.·.·»*- *-“· *. - - o o hhhho ooo o o o p~ r~ cno looocoocn iocmcm in m cm cm o o inr^r'ino o η h o o h kk*> k. k k k k k Mk k ** o o hooho hoo o o o ' m in voooioooo iocmid in in cm h o o inr-'ininr·'- oho o o h

O O HOHHO H OH O O O

v V V V

-P

ohCpCøouqu a> oo r- O cm o co CMHO > H'ØCM'M'IØCM'^CM "Θ.

. P

cu ft S ω 10 Μ - m Η 3 ω § Λ.

cod d Q) 03 Ο O dj ιΰ Jj . U ^ tji 0UH Ηϋ *3 'i 2 § ri Μ Ο OHIO Η -Η βω Η Π Ω 0(1)1½ Ο-P 03 04 Μ <D CQ ·Η ° Η ΟΡΗ S >. *3 ίί ^3 3 S " •s xidftoo tu o & rn QjQJQJ-P-P HS OH O 0 OP g 2 ffppiDH m « OH od o 0 o Hd+Jdd dd — £ Wdo ftl Λ Λ StngMSi! «

9 DK 153794B

O

OMT-esterderivaterne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse har vist in vivo antimikrobiel aktivitet overfor bakterieforsøgsinfektioner forårsaget af grampositive bakterier. Hvis to doser af forsøgsforbindelsen indgives til 5 mus med forsøgsinfektioner, er den iagttagne aktivitet

målt som en ED^Q-værdi (virksom dosis i mg/kg til beskyttelse af 50% af forsøgsdyrene: se Warren Wick et al.: J. Bacteriol. 81, 233-235 (1961)). EDg-værdier, der er iagttaget for en illustrativ forbindelse, er anført i tabel IV

10 sammen med de ED^-værdier, der er iagttaget for sammenligningsforbindelse A.

TABEL IV

ED50-værdier af OMT-esterderivatera 15

Forsøgsforbindelse0 Streptococcus pyogenes C203

Subkutant Oralt 4 6,5 155 A 10,6 136 20 ct mg/kg x 2; dosis, der indgives 1 og 4 timer post-infektion; forbindelsesnummer fra tabel I.

25 Visse OMT-esterderivater er aktive in vivo overfor

Pasteurellainfektioner. Tabel V opsummerer resultaterne af de forsøg, hvor esterderivaterne er indgivet til 1 dag gamle kyllinger ved et dosisniveau på 30 mg/kg ved subkutan injektion 1 og 4 timer efter inficering af kyllingerne med _3 30 Pasteurella multocida (0,1 ml af en 10 fortynding af en 20-timer gammel tryptosenæringsmediumkultur af fjerkræ-P. multocida indgivet subkutant). Alle ikke-behandlede inficerede kyllinger (10 i hver kontrolgruppe) dør i løbet af 24 timer af Pasteurellainfektion.

35

O

10 DK 153794 B

TABEL V

Behandling af Pasteurellainfektioner i kyllinger

Antal dødsfald hos behandlede Forbindelse9, kyllinger/antal behandlede 5 1 10/10 2 2/10 4 8/10 5 6/10 6 0/10 10 8 15/20 10 11/15 A 10/10

Forbindelsesnummer fra tabel I.

15

De ved den foreliggende opfindelse fremstillede forbindelser anvendes til kontrol af infektioner af grampositive bakterier og Pasteurella. Herved indgives en virksom mængde af en forbindelse med formel (I) parenteralt til 20 et inficeret eller modtageligt varmblodet dyr. Den dosis, der er virksom til kontrol af infektioner af grampositive bakterier og/eller Pasteurellay varierer med, hvor alvorlig infektionen er, dyrets alder, vægt og tilstand. Den samlede dosis, der er nødvendig til beskyttelse, er imidlertid al-25 mindeligvis i området fra ca. 1 til ca. 200 mg/kg og fortrinsvis i området fra ca. 5 til ca. 100 mg/kg. Egnede dosissystemer kan konstrueres.

Forbindelserne kan indgå i præparater, som er anvendelige til kontrol af infektioner af grampositive bak-30 terier og/eller Pasteurella. Disse præparater indeholder en forbindelse med formel (I) sammen med en egnet farmaceutisk grundmasse. Sådanne præparater kan formuleres til parenteral indgivelse ved hjælp af metoder, som er anerkendte i den farmaceutiske industri. Virksomme, injicerbare 35 præparater indeholdende disse forbindelser kan være i form af enten suspension eller opløsning. De frie baser er mere

O

u DK 153794 B

opløselige i fortyndede syrer eller i sure opløsninger end i neutrale eller basiske opløsninger.

I opløsningsform opløses forbindelsen i en fysiologisk acceptabel grundmasse. Sådanne grundmasser indeholder et 5 egnet opløsningsmiddel, om «nødvendigt konserveringsmidler, såsom benzylalkohol, og puffere. Anvendelige opløsningsmidler omfatter f.eks. vand og vandige alkoholer, glycoler, og carbonatestre, såsom diethyrlcarbonat. Sådanne vandige opløsninger indeholder almindeligvis ikke mere end 50 vo-10 lumen% organisk opløsningsmiddel.

Injicerbare suspensionspræparater anvender et flydende suspenderingsmedium, med eller uden hjælpestoffer, som grundmasse. Suspenderingsmediet kan f.eks. være vandig polyvinylpyrrolidon, indifferente olier, såsom vegetabil-15 ske olier eller højt raffinerede mineralolier, eller vandig carboxymethylcellulose.

Egnede fysiologisk acceptable hjælpestoffer er nødvendige for at holde forbindelsen suspenderet i suspensionspræparaterne. Hjælpestofferne kan udvælges blandt fortyknings-20 midler, såsom carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidon, gelatine og alginater. Mange overfladeaktive midler er også anvendelige som suspenderingsmidler. Lecithin, alkylphenol-polyethylenoxidaddi tionsprodukter, naphthalensulf onater, alkylbenzensulfonater og polyoxyethylensorbitanestrene er 25 anvendelige suspenderingsmidler.

Mange stoffer som påvirker hydrophiliciteten, vægtfylden og overfladespændingen af det flydende suspenderingsmedium kan hjælpe til ved fremstilling af injicerbare suspensioner i individuelle tilfælde. Eksempelvis kan siliconeantiskum-30 midler, sorbitol og sukkerarter være anvendelige suspende ringsmidler .

Til yderligere illustration af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes følgende eksempler.

35

O

12

DK 153794B

Fremstilling af DMT

a) Fermenterin2_af_DMT_i_en_rYStekolbe_____

En lyophiliseret perle af Streptomyces fradiae NRRL 12170 5 dispejcgeres i 1-2 ml steriliseret vand. En portion på 0,5 ml af denne opløsning anvendes til podning af et vegetativt medium på 150 ml, som har følgende sammensætning;

Ingrediens ·. Mængde (%) 10 Maj sstøbevæske 1,0 Gæreks.trakt 0,5

Soyabønnegrutning 0,5

CaC03 0,3 Rå soyabønneolie 0,45 15 Afioniseret vand 97,25

Alternativt optøes en vegetativ kultur af S. fradiae NRRL 12170, opbevaret i 1 ml volumener i flydende nitrogen, hurtigt og anvendes til podning af det vegetative medium.

20 Det podede vegetative medium inkuberes i en 500 ml Erlenmeyer kolbe ved 29°C i ca. 48 timer på et lukket ryste-apparet ved 300 omdr./min.

Dette inkuberede vegetative medium på 0,5 ml anvendes til at pode 7 ml af et produktionsmedium med følgende sammen-25 sætning:

Ingrediens Mængde (%)

Sukkerroemelasse 2,0 Måjsmel 1,5 30 Fiskemel 0,9

Majsgluten 0,9

NaCl 0,1 (NH4)2HP04 0,04

CaCO^ 0,2 35 Rå soyabønneolie 3,0

Afioniseret vand 91,36

DK 153794B

O

13

Det podede fermenteringsmedium inkuberes i en 50 ml flaske ved 29°C i ca. 6 dage på et lukket rysteapparat ved 300 omdr./min.

5 b)

For at tilvejebringe et større volumen podestof anvendes 1200 ml inkuberet vegetativt medium, fremstillet på samme måde som beskrevet under a), til podning af 950 liter af et vegetativt vækstmedium på andet stadium^'med følgende 10 sammensætning:

Ingrediens Mængde (%)

Ma j s s tøbevæs ke 1,0

Soyabønneoliemel 0,5 15 Gærekstrakt 0,5

CaC03 0,3 Rå soyabønneolie 0,5 Råt lecithin 0,015

Vand 97,185 20 pH-Værdien indstilles på 8,5 med en 50%'s NaOH-opløsning.

Dette vegetative medium på andet stadium inkuberes i en 1330 liters tank i ca. 48 timer ved 28°C med tilstrækkelig gennemluftning og omrøring.

25 549 liter således fremstillet inkuberet medium fra andet trin anvendes til at pode 3800 liter sterilt produktionsmedium med følgende sammensætning: 30 35

O

14

DK 153794B

Ingrediens Mængde (%)

Fiskemel 0,875

Majsmel 1,5

Majsgluten 0,875 5 CaC03 0,2

NaCl 0,1 (nh4)2hpo4 0,04

Sukkerroemelasse 2,0 Rå soyabønneolie 3,0 10 Lee i tin 0,09

Vand 91,32 pH-Værdien indstilles på 7,2 med en 50%'s NaOH-opløsning.

15 Det podede produktionsmedium får lov at fermentere i en 6080 liters tank i 8-9 dage ved en temperatur på 28°C. Fermenteringsmediet gennemluftes med steril luft for at holde niveauet af . opløst oxygen mellem ca. 30 og 50%, og omrøres med konventionelle omrørere ved ca. 250 20 omdr./min.

c) Isolering_af_DMT

3800 liter høstet helnæringsmedium, opnået som beskrevet under b), filtreres under anvendelse af en filter-25 hjælp. Myceliumkagen vaskes med vand, og denne vandvaske-væske sættes til filtratet.

Filtratets pH-værdi indstilles på 9,2 under anvendelse af 9,15 liter af en 50%'s vandig opløsning af natriumhydroxid. Filtratet ekstraheres med 2000 liter ethylacetat.

30 450 liter afioniseret vand og 6,4 kg monobasisk natriumphos- phat sættes til ethylacetatekstrakten med grundig blanding. pH-Værdien af denne blanding indstilles på fra 6,0 til 4,35 under anvendelse af 3300 ml phosphorsyreopløsning (2 dele vand pr. 1 del phosphorsyre). Den vandige fase fraskilles.

35 pH-Værdien af den berigede vandige fase indstilles på 6,5

O

15

DK 153794B

under anvendelse af 700 ml af en 50%'s vandig natriumhydroxidopløsning .

Den resulterende opløsning koncentreres til et volumen på ca. 225 liter under vakuum. pH-værdien af den koncen-5 trede opløsning indstilles på 9/2 ved tilsætning af 16 liter af 10%'s vandigt natriumhydroxid. Den resulterende basiske opløsning får lov at stå natten over. De krystaller, der dannes, fraskilles ved filtrering, vaskes med 50 liter afioniseret vand og tørres til opnåelse af 10 ca. 8,6 kg produkt. Det således opnåede produkt kan omkrystalliseres fra acetone-vand.

Eksempel 1 15 2 '-0-Acetyl-23--C)- (p-chlorphenylacetyl) -OMT (forbindelse 1) 4,3 g (25 mmol) p-chlorphenyleddikesyre og 3,4 g (25 mmol) 1-hydroxybenzotriazol opløses i 150 ml THF. Opløsningen afkøles i et isbad og behandles med 5,2 g (25,3 mmol) N,N'--dicyclohexylcarbodiimid. Reaktionsblandingen omrøres ved 20 0°C i 3 timer og anbringes derefter i et køleskab natten over. Blandingen filtreres, og filtratet inddampes under formindsket tryk. Remanensen opløses i 75 ml acetone, filtreres og behandles med 10 g (12,8 mmol) 2'-O-acetyl-DMT og 0,87 g (12,8 mmol) imidazol. Acetone tilsættes til op-25 nåelse af et opløsningsvolumen på 125 ml, og derefter tilsættes 1,87 ml (12,8 mmol) triethylamin. Efter at reaktionsblandingen er omrø'rt i 20 timer ved stuetemperatur, af-dampes opløsningsmidlet under formindsket tryk. Remanensen hældes på en lynchromatografisilicagelsøjle, som elueres 30 med en gradient af 4:1 toluen-ethylacetat til ethylacetat alene. De ønskede fraktioner kombineres på basis af TLC--resultaterne og inddampes til tørhed til opnåelse af 4,75 g 2'-O-acetyl-23-O-(p-chlorphenylacetyl)-DMT.

4,35 g (4,65 mmol) af det således fremstillede 2'-O-acetyl— 35 -23-0-(p-chlorphenylacetyl)-DMT, opløses i 175 ml 1-N svovl syre og omrøres ved stuetemperatur i 1 time. En mættet

O

16

DK 153794B

NaHCOg-opløsning tilsættes forsigtigt, indtil opskumning opEører, og produktet ekstraheres over i dichlormethan. Det organiske lag fraskilles, tørres over Na2S0^ og filtreres; og filtratet inddampes under fomindsket tryk. Remanensen 5 renses ved lynchromatografi på silicagel, elueres indledningsvis med 4:1 toluen-ethylacetat, og derefter forøges mængden af ethylacetat til 100%. Fraktioner, der indeholder det ønskede produkt, lokaliseres ved TLC, kombineres og inddampes til tørhed til opnåelse af 3,1 g 2'-O-acetyl-10 -23-0-(p-chlorphenylacetyl)-OMT (1).

Massespektrum: 791 (M+).

Eksempel 2 23-0-(p-Chlorphenylacetyl)-OMT (forbindelse 2) 15 1,88 g (2,37 mmol) 2'-O-acety1-23-0-(p-chlorphenylacetyl)- -OMT, franstillet som beskrevet i eksempel 1, opløses i 113 ml 80%'s vandig methanol; opløsningen omrøres ved 80°C i 40 minutter. Opløsningen afkøles, koncentreres til fjernelse af methanol under formindsket tryk og fortyndes med 20 en mættet NaHCO^-opløsning. Den resulterende opløsning ekstraheres med dichlormethan. Det organiske lag fraskilles, tørres over Na2S0^ og filtreres. Filtratet inddampes under formindsket tryk til et udbytte på 1,70 g 23-0-(p-chlorphenylacetyl) -OMT (2).

25 Massespektrum: 749 (M+).

30 35

DK 153794B

17

O

Eksempel 3 2 1,23-Di-O-phenylacetyl-OMT (forbindelse 3) 2,72 g (27 mmol) phenyleddikesyre opløses i 50 ml 1:1 tetrahydrofuran:acetonitril og behandles med 2,79 g (13,5 mmol) 5 Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimid. Reaktionsblandingen omrøres natten over ved stuetemperatur. Et bundfald, der dannnes, fjernes ved filtrering. Filtratet behandles med 10 g (13,5 mmol) DMT og 10 ml pyridin. Efter omrøring ved stuetemperatur i 40 timer inddampes reaktionsblandingen under formindsket 10 tryk. Remanensen opløses i dichlormethan, og opløsningen vaskes med en mættet NaHC03-opløsning. Det organiske lag fraskilles, tørres over og filtreres, og filtratet inddampes til tørhed. Den opnåede remanens renses ved lyn-chromatografi på silicagel, elueres trinvist med toluen: 15 ethylacetat i forholdene 2:1, 1:1, 2:3 og til sidst med ethylacetat. Fraktioner analyseres ved TLC. Passende fraktioner kombineres og inddampes til tørhed. Det første produkt, der elueres^er 271 mg 2',23-di-O-phenylacetyl-DMT.

1,0 g 2',23-di-O-phenylacetyl-DMT, fremstillet på denne 20 måde, opløses i 40 ml 1 N svovlsyre, og amrøres i 1,5 timer ved stuetemperatur. NaHCO^ tilsættes forsigtigt)indtil gasudvikling ophører. Produktet ekstraheres med dichlormethan, og det organiske lag fraskilles, tørres over Na2SO^ og filtreres. Filtratet inddampes under formindsket tryk. Den 25 opnåede remanens renses ved lynchromatogr.afi på silicagel, elueres trinvist med toluen:ethylacetat, 400 ml 2:1, 600 ml 1:1, 600 ml 1:2, 400 ml 1:3, og til sidst med 600 ml ethylacetat. Fraktioner, der indeholder det ønskede produkt, lokaliseres ved TLC, kombineres og inddampes til tørhed 30 til et udbytte på 271 mg 2',23-di-O-phenylacetyl-OMT (3). Massespektrum: 833 (M+).

35

Claims

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af 23-monoestre eller 2'#23-diestre af OMT med den almene formel (I) 5 i V n - 10 / \ S Cfø-jj Vote-CH 3 ?. - / ^/\ , ο«,„νίΝ/«. M

15. VJl-CHa CHa (I) 20 hvori R er hydrogen, eventuelt 1-3 gange med Cl, Br og/eller F substitueret C^-C^-alkanoyl eller benzoyl, phenylacetyl __ eller phenylpropiony1, hvori phenylkernen eventuelt er 25 substitueret 1-5 gange med Cl, Br, F og/eller CH^ eller 1-2 gange med CH30, N02 og/eller OH, m er 1 eller 2, og R3 er 3-pyridyl eller en gruppe med formlen 35

19 DK 153794 B O hvori 5 6 R og R uafhængigt er hydrogen, chlor, methyl, ethyl, methoxy eller nitro, X er 0 eller S, og 5 n er 0 eller 1, kendetegnet ved, at mycarose spaltes fra en forbindelse, som svarer til forbindelsen med den almene formel (I), men hvori hydrogenatomet i 4'-hydroxygruppen er erstattet med en gruppe med formlen

10 OH •-e^-CHa -\ Ό-/ CHa 15 ved syrehydrolyse, hvorpå der, hvis R er forskellig fra hydrogen i den således fremstillede forbindelse med den almene formel (I), eventuelt foretages deesterificering af produktets 2'-stilling ved opvarmning eller tilbagesvaling i vandigt methanol til fremstilling af en forbindelse med den almene formel (I), hvori R er hydrogen.

2. Analogifremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R i udgangsmaterialet er hydrogen. 25 30 35