DK165461B

DK165461B - Biologisk ren kultur af mikroorganismen streptomyces cyaneogriseus noncyanogenes ll-f28249 med deponeringsnummeret nrrl 15773

Info

Publication number: DK165461B
Application number: DK051991A
Authority: DK
Inventors: Irwin Boyden Wood; John Anthony Pankavich; Guy Thomas Carter; Margaret Jennings Torrey; Michael Greenstein
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1984-06-05
Filing date: 1991-03-22
Publication date: 1992-11-30
Also published as: ES543948A0; DE3519834C2; DK165436B; DK165119B; JPH0776223B2; DK165210B; HU199900B; IE851391L; DK51991D0; DE3519834A1; JP2524688B2; PT80577B; EP0170006B1; EP0170006A2; HUT43637A; JPH07233170A; EP0170006A3; DK53691A; DK53591D0; AU588811B2

Description

DK 165461 B

Den foreliggende opfindelse angår en biologisk ren kultur af mikroorganismen Streptomyces cyaneogriseus, underart noncyanogenus betegnet LL-F28249, deponeret som NRRL nr. 15773.

5 Det har overraskende vist sig, at denne kultur er i stand til at producere de nedenfor nærmere beskrevne, antibiotiske forbindelser LL-F28249a, LL-F28249j8, LL-F28249-r, LL-F282496, LL-F282496, LL-F28249C, LL-F28249T], LL-F282490, LL-F282491, LL-F28249K, LL-F28249X, LL-F28249/i, LL-F28249» 10 og LL-F28249W i udvindelige mængder ved fermentering i et vandigt næringsmedium indeholdende asiimilerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske anioner og kationer.

De således producerede antibiotika kan anvendes til forebyggelse, behandling og bekæmpelse af helmintiske, ar-15 thropod-ektoparasitiske og acaricide infektioner hos varmblodede dyr ved indgift af en effektiv mængde af forbindelserne betegnet LL-F28249a, -β, -τ, -δ, -e, -£, -η, -Θ, -t, -κ, -λ, -μ, -υ og -ω eller blandinger deraf, såsom fermenterings-væsken, hele mæsken eller de pharmaceutisk og pharmakologisk 20 acceptable salte deraf. Plantenematoder bekæmpes også effektivt ved hjælp af disse antibiotika, blandinger og/eller salte deraf. Endvidere er disse antibiotika også effektive som insekticide midler.

De ovenfor beskrevne sygdomme afstedkommer ikke blot 25 ødelæggende problemer og tab for landbrugerne, der avler kødproducerende dyr, såsom svin, får, kvæg, geder, kaniner og fjerkræ. Desuden er sådanne sygdomme årsag til stor bekymring, når det drejer sig om selskabsdyr, som heste, hunde og katte. Disse sygdomme har været kendt i mange år, og der 30 findes præparater til behandling og/eller forebyggelse af sådanne sygdomme.

Således omtales i USA patentskrift nr. 3.950.360 visse antibiotiske stoffer, der fås ved dyrkning af en Strep-tomycesmikroorganisme, idet disse forbindelser er anven-35 delige som insekticider og acaricider. Men i relation til de karakteristika, der identificerer en sådan mikroorganisme, 2

DK 165461 B

er den foreliggende mikroorganisme distinkt. Endvidere angår en hel serie USA patentskrifter visse forbindelser, der fremstilles ved fermentering af Streptomyces avermitilis, en organisme, der klart adskiller sig fra den foreliggende 5 (USA patentskrifterne nr. 4.171.314, 4.199.569, 4.206.205, 4.310.519 og 4.333.925). USA patentskrift nr. 4.423.209 angår en fremgangsmåde til omdannelse af nogle af disse mindre ønskelige komponenter til de mere foretrukne.

Det fulde navn af mikroorganismen LL-F28249, nr.

10 15773 med hensyn til slægt, art og underart er Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus.

Stammen henhører under slægten Streptomyces på basis af morfologi og cellekemi (indhold af L-isomeren i diami-nopimelinsyre). Stammens morfologi og fysiologiske data 15 placerer den i nærheden af S. cyanoegriseus, repræsenteret ved ISP 5534 (ATCC 27426). Derpå foretages sammenligninger mellem dannelsen af grå opløselige luftmyceliumpigmenter på medier (tabel I) og spiralformede kæder af glatte konidier (3-25 sporer pr. kæde). Den foreliggende stamme er negativ 20 over for blåt opløseligt pigment, hvor sammenligningsstammen ISR 5534 er positiv. Stammerne har lignende reaktioner ved ISP-carbonhydratudnyttelsesprøverne, der er positive over for arabinose, fructose, glucose, rhamnose og xylose, men er negative over for inositol, mannitol, raffinose og sac-25 charose (ISP 5534 let positiv). Imidlertid er stammerne forskellige på flere punkter (tabel II) ud af 53 ved Gor-donprøverne. Disse forskelle understøtter teorien om dannelsen af en underart S. cyaneogriseus for den foreliggende mikroorganismes vedkommende.

30 35

O

3

DK 165461 B

Tabel I

Sammenligning af F 28249 og ISP 5534 på ISP-morfologi-prøvemedier (numrene er fra NBS-ISCC)

Medium_F 28249_ISP 5534_ 5 Gær-malt A.ra.^ middelgrå lys til middelgrå (ISP 2) (265) (264-265) V.m. lys brunlig (75) lysbrunlig-hvid til dyb gulbrun sortagtig blå (188) S.p. lysebrun lysebrun 10 Uorgani- A.m. lys olivengrå (112) middelgrå (265) ske sal- til middelgrå (265) te sti- V.m. dyb grå til sort grå-purpuragtig blå velse (266-267) (204) (ISP 4) S.p. grålig-gullig- intet 15 brun

Glycerol A.m. 263 (hvid) til gul- 263 (hvid) til lyse- aspara- lig-grå (93) grå (264) gin V.m. sort (267) til lys grå-purpuragtig blå (ISP 5) olivenbrun (96) (203-204) 20 S.p. let brunlig lys gullig-grå

Havremel A.m. gulgrå (93) intet (ISP 3) V.m. farveløs farveløs _S.p. let gullig intet 1) A.m. - luftmycelium 25 V.m. - vegetativt mycelium S.p. - opløseligt pigment 30 35

O

4

DK 165461 B

Tabel II

Sammenligning af lederle F 28249 med ISP 5534 (Gordonprøver) _F 28249 ISP 5534_ 5 Dyrket på/ved

Salicin + 10° - + 45° +

Produktion af 10 urease + -

Decarboxylering af mucate - +

Syreproduktion raffinose - + 15 saccharose - +

Begge stammer har følgende reaktioner:

Positiv Hydrolyse af casein, hypoxanthin, xanthin, tyrosin, adrenin, kartoffelstivelse, gelatine og 20 esculin.

Produktion af phosphatase Følsomhed over for lysozym

Decarboxylering af acetat, citrat, lactat, ma-lat, oxalat og propionat 25 Syreprodukt ud fra arabinose, cellobiose, dek- strin, fructose, galactose, glucose, glycerol, lactose, mannose, α-methyl-D-glucosid, rhamnose, salicin og trehalose.

Negativ Produktion af nitratreduktase 30 Decarboxylering af benzoat og tartrat

Syre ud fra adonitol, dulcitol, erythritol, inositol, mannitol, sorbitol, (3-methyl-D-xylosid.

Vækst på 5% NaCl.

35 5

DK 165461 B

Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus-kulturen (LL-F28249 deponeret under NRRL nr. 15773), som producerer komponenterne LL-F-28249 a, β, ί, 8, e, ζ, υ, Θ, ι, κ, λ, μ, υ og ω blev isoleret ud fra eukalyptussand i det sydlige 5 Australien.

Strukturen og stereokemien af komponenterne i LL-F28249 er ikke fuldt klarlagt, men de foreslåede strukturer vises nedenfor. Komponent LL-F28249a> er beslægtet med Honda-mycin (Albimycin), der er omtalt i The Journal of Antibiotics 10 22, nr. 11, 521-526 (1969).

OH

CH3 15 , T j-Ό «3 Y CH^

20 1Y

Xk T ch3 25 0R2 LL-F28249a-u 30 35 6 x

DK 165461 B

υυυυυυυυυυυυ 0 η ii ii ii n ii * ;i π u n n

tXXXXXXXXXXXX

XOOOOOOOOOOOO

t xxxxxx xxxxx υυυυυυχυυυυυ

£Q I I I I I I O I I I I I

1 XXXXXX ti xxxxx <υυυυυυυυυυυυ

III I I I I I I

N N (N (Ί N (Μ N M CN

O X X X XXXXX .X

x o o o ooooo o

+ 111 I I I I I I

ι/t O O O OOOOO O

X I I I I I I I I I

X

o vO cn cn cn

XX XX

o ου >r\ x

X O XX

O

enenenenenenencNcncnencn

• vTXXXXXXXXXXXX

xoooooooo. oooo cn

X

o en en cn en cn en en cm en cn cn · xooooxoouoooo cn cn cn cn cn

CM XX XXX

xxxooxxxxxooo

CN CN CN CM CN CM CN

^ />> /—\ /-> /—>. —s en cn en cn cn en cn cn

X XXXXX XX

O OOOOO o o w cn en en w cn'-'ww en w w "Ψ* xoooooooooooo B (fl > >o u u>cro -* M *< — θ' σ' θ' σ' σ' σ' σ' σ' σ' σ' σ'

Ssr'T'f'jC'jsrcvT'T'T'j

QJ CN CN CN CM CM CM CN CN CN CN CN CM

g cococoaocooocooococoaoco

9 CN CM CM CN CM CM CM CN CM CM CM CM

£ I I I I I I I I I I I I

OJJJ-J-J-JJJJ-JJ-J

DK 165461 B

JO»'

C«3 I

T CH

CH3 ΓΗ, h3c/^i γ CH3 i v°

Mil o—L!^CH3

OH

15 LL-F2824 9v oh rv ?h e2C^Y^^[ I T> ch3 J HjC^Y^CHj .0

26 f 0=S

h3<^1

O OH O

ao --VmYVm HO CH3 CH3 CH3 CH3

LL-F28249W

35

O

8

DK 165461 B

På tegningen viser fig. 1 et karakteristisk ultraviolet absorp-tionsspektrum af forbindelsen betegnet LL-F28249a, NRRL 15773, 5 fig. 2 et karakteristisk infrarødt'absorptions- spektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249a, NRRL 15773, fig. 3 et karakteristisk proton-kernemagnetisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249a, NRRL 15773, i CDCl^-opløsning, 10 fig. 4 et karakteristisk carbon-13-kernemagne- tisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249a, NRRL 15773, i CDCl3-opløsning, fig. 5 et karakteristisk elektronånslagsmas-sespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249a, NRRL 15 15773, fig. 6 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F282493, NRRL 15773, fig. 7 et karakteristisk infrarødt absorptions- 20 spektrum for forbindelsen betegnet LL-F282493, NRRL 15773, fig. 8 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^,

NRRL 15773, i CDC1V

25 fig. 9 et karakteristisk elektrorånslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249p, NRRL 15773, fig. 10 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249 , NRRL 15773, fig. 11 et karakteristisk infrarødt absorptionsspektrum for forbindelsen LL-F-28249^, NRRL 15773, fig. 12 et karakteristisk protonkernemagnetisk

resonnansspektrum for forbindelsen LL-F28249 , NRRL

35 Ύ 15773, i CDC13,

O

9

DK 165461 B

fig. 13 et karakteristisk carbon-13-kernemag-netisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249 , NRRL 15773, i CDC1,, I ^ fig. 14 et karakterisk elektronknslagsmas-5 sespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, NRRL 15773, fig. 15 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249ttj, NRRL 15773, 10 fig. 16 et karakteristisk infrarødt absorp tionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249C0, NRRL 15773, fig. 17 et karakteristisk protonkernemagne-tisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-15 F28249NRRL 15773, i CDCl-j, fig. 18 et karakteristisk kernemagnetisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249c,.>f NRRL 15773, i CDC13, fig. 19 et karakteristisk elektronenslags-20 massespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249(j, NRRL 15773, fig. 20 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249<£, NRRL 15773, 25 fig. 21 et karakteristisk protonkernemagne- tisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249<$, NRRL 15773, i CDC13, fig. 22 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, 30 NRRL 15773, fig. 23 et karakteristisk ultraviolet absorp-tionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, NRRL 15773, fig. 24 et karakteristisk protonkernemagne-35 tisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F-28249^, NRRL 15773, i CDC13, 10

DK 165461 B

o fig. 25 et karakteristisk elektron'ans*lags-massespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249g, NRRL 15773, fig. 26 et karakteristisk ultraviolet absorp-5 tionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249£, NRRL 15773, fig. 27 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, NRRL 15773, i CDC13, 10 fig. 28 et karakteristisk elektronanslags- massespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, NRRL 15773, fig. 29 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249 , 15 NRRL 15773, 1 fig. 30 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249 , NRRL 15773 i CDCl3, fig. 31 et karakteristisk elektronanslaqs-20 massespektrum for forbindelsen betegnet LL-28249 , NRRL 15773, ^ fig. 32 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249q, NRRL 15773, 25 fig. 33 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249-, NRRL 15773, i CDC13, fig. 34 et karakteristisk elektron.anslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, 30 NRRL 15773, fig. 35 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249{, NRRL 15773, fig. 36 et karakteristisk protonkernemagnetisk 35 resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^ , NRRL 15773, i CDC13, 11

DK 165461 B

o fig. 37 et karakteristisk elektron’anslags-massespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, NRRL 15773, fig. 38 et karakteristisk carbon-13 kernemag-5 netisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249g, NRRL 15773, i CDCl^ opløsning, fig. 39 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, NRRL 15773, 10 fig. 40 et karakteristisk infrarødt absorptions spektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, NRRL 15773, fig. 41 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249}^, NRRL 15 15773, fig. 42 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonnansspektrum for forbindelse.! betegnet LL-F28249je, NRRL 15773, fig. 43 et karakteristisk carbon-13 kernemag-20 netisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249j^, NRRL 15773, fig. 44 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249Pt/ NRRL 15773, 25 fig. 45 et karakteristisk infrarødt absorptions spektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, NRRL 15773, fig. 46 et karakteristisk elektronenslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, NRRL ' 30 15773, fig. 47 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, NRRL 15773, fig. 48 et karakteristisk carbon-13 kernemagne-35 tisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, NRRL 15773, 12

DK 165461 B

fig. 49 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249 , NRRL 15773, /

fig. 50 et karakteristisk infrarødt absorptions-5 spektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249 , NRRL

15773, . / fig. 51 et karakteristisk elektronens lagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249 , NRRL 15773, / 10 fig. 52 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249 , NRRL 15773, ^ fig. 53 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249}, 15 NRRL 15773, fig. 54 et karakteristisk infrarødt absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet F28249^, NRRL 15773, fig. 55 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, NRRL 20 15773, fig. 56 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249) , NRRL 15773, og fig. 57 et karakteristisk carbon-13 kernemagne-25 tisk resonnansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249^, NRRL 15773.

Det har vist sig, at de ovennævnte komponenter LL-F28249a-<a samt fermenteringsvæsken og hele mæsken af den omhandlede mikroorganisme er særlig effektive til bekæmpelse 30 af helminthiske, arthropod-ektoparasitiske og acaricide infektioner hos kødproducerende dyr, såsom kvæg, får, svin, kaniner, fjerkræ, såsom kyllinger, kalkuner, ænder, gæs, vagtler og fasaner samt husdyr.

Man kan bekæmpe eller behandle sådanne infektioner 35 hos varmblodede dyr ved indgift oralt, parenteralt eller 13’

DK 165461 B

topisk af en profylaktisk, pharmaceutisk eller terapeutisk effektiv mængde fermenteringsvæske eller hel mæsk af mikroorganismen Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus, NRRL 15773, eller forbindelserne betegnet LL-F28249a, LL-F28249ø, 5 Μ,-Γ28249Ύ, LL-F282495, LL-F28249e, LL-F28249£, 12^28249^, LL-F28249q, LL-F28249t, LL-F28249K, LL-F-28249Å, LL-F-28249M, LL-F28249JJ og ϋ-Γ28249ω som identificeret og karakteriseret her i beskrivelsen eller de pharmaceutiske og pharmalogisk acceptable salte deraf (kollektivt omtalt som aktivt stof).

10 Selv om indgift af forbindelsen eller fermen- teringsvæske/hel mæsk (herefter væske eller mæsk) i reglen sker mest praktisk i eller med foderet eller i drikkevandet, kan de ovennævnte forbindelser, væske eller mæsk, eller pharmaceutisk og pharmakologisk acceptable salte 15 deraf også indgives til individuelle værter i form af tabletter, store doser, geler, kapsler eller lignende eller ved injektion i form af en pasta, gel, pellet eller opløsning. Disse sidstnævnte indgiftsmetoder er naturligvis ikke så praktiske til behandling af større 20 grupper dyr, men de er ganske praktiske til brug i mindre målestok eller på individuel basis.

Når antibiotika LL-F28249a, β, δ, €, ς, v, θ, t, κ, μ, υ eller ω eller fermenteringsvæsken eller hele mæsken af Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenos NRRL 15773 an-25 vendes profylaktiske eller terapeutisk behandling af anthel-minthiske, arthropod-ektoparasitisk og acaride infektioner hos dyr og fjerkræ, er i reglen ca. 0,05 til 500,0 ppm og fortrinsvis 0,1 til 300 ppm af midler, væsken eller mæsken som beskrevet ovenfor, indgivet i dyrets foder eller drik-30 kevand, effektivt til at forebygge, bekæmpe eller behandle sådanne infektioner hos sådanne dyr.

O

14

DK 165461 B

Foder med tilsat medicin fremstilles i reglen ved omhyggelig iblanding af ca. 0,00001 til ca. 0,01 vægt% af midlet (antibiofcikaet) eller den ovenfor beskrevne væske eller mæsk med et næringsmæssigt afbalan-5 ceret foder som f.eks. det i de nedenstående eksempler beskrevne foder.

Når forbindelserne og/eller væsken eller masken anvendes til forebyggelse eller bekæmpelse af helminther, arthropod-ektoparasitter og acari-10 der, fremstilles det aktive middel først som en dyrefoder-forblanding. Forblandingen indeholder i reglen en forholdsvis stor procentdel af det aktive stof og blandes i reglen med dyrets foder umiddelbart før indgift.

Om ønsket kan foderforblandingen også anvendes som top-15 dressing på dyrets dagsration.

Foderforblandinger eller -koncentrater kan fremstilles ved iblanding af ca. 0,1 til 5,0 vægt% af de ovenfor identificerede midler, væske eller mæsk eller pharmaceutisk og pharmakologisk acceptable salte 20 deraf med ca. 99,9 til 95 vægt% af et passende bærestof eller fortyndingsmiddel.

Bærere, der er egnet til fremstilling af fodersuppleringssammensætninger, omfatter følgende: lucernemel, sojabønnemel, bomuldsfrøoliemel, hørføroliemel, na-25 triumchlorid, calciumcarbonat, calciumsulfat, majsmel, sukkerrørsmelasse, urinstof, benmel, majskolbemel, risskalmel og lignende. Bæreren fremmer en i det væsentlige ensartet fordeling af det aktive stof i det færdige foder, hvori tilskuddet blandes. Det udfører således 30 en vigtig funktion ved at sikre en passende fordeling af det aktive stof, dvs. ca. 0,1 til 100 ppm deraf, i hele foderet. Dette svarer til 0,00001 til 0,01 vægt% aktivt stof i det færdige foder. I praksis tilsættes 35

O

15

DK 165461 B

et halvt til flere kg forblanding pr. ton foder for at opnå det ønskede niveau af middel (antibiotikum) eller væske eller mæsk i det færdige foder.

Hvis tilskuddet eller forblandingen anvendes 5 som topdressing til foderet, hjælper det ligeledes med til at sikre ensartet fordeling af det aktive stof over den øverste del af det supplerede foder.

Eftersom forbindelserne og disses pharmaceu-tisk og pharmakclogisk acceptable salte er forholdsvis 10 uopløselige i vand, er det i reglen ønskeligt, når eventuelt en sådan forbindelse indgives i dyrets drikkevand, at opløse det aktive stof i et organisk opløsningsmiddel, såsom methanol, ethanol, acetone, DMSO, oleinsyre, linolsyre, propylenglycol eller lignen-15 de og iblande opløsningen en lille smule surfactant og/el-ler dispergeringsmiddel for at sikre opløsning og/eller dispersion af det aktive middel i dyrets drikkevand.

Det er bedst, når behandlingen af et mindre antal af de større kødproducerende dyr er nødvendig for at 20 bekæmpe parasitiske infektioner af disse, at midlerne LL-F28249a, g, γ,$ ^ e'('fc M ' u' ^ og' væ" ske eller mæsk eller pharmaceutisk eller'pharmakologisk acceptable salte deraf kan indgives oralt på daglig basis til værtsdyret i form af en medicinholdig gel.

25 De aktive stoffer udviser også nematodicid aktivitet over for plantenematoder, hvilket er påvist ved deres effektivitet til bekæmpelse af den frit levende jordbundsnematode C. elegans. Sammensætninger indeholdende disse aktive stoffer til 30 bekæmpelse af plantenematoder kan oparbejdes enten som væsker eller fugtelige pulvere. Flydende sammensætninger omfatter ca. 5-20% vægt/vægt aktivt stof (aktivt middel, fermenteringsvæske, hel mæsk eller salte) med passende mængder af et opløsningsmiddel, såsom methanol, 35 ethanol, acetone, acetonitril og andre og resten vand.

Fugtelige pulvere omfatter ca. 5-20% vægt/vægt aktivt

O

16

DK 165461 B

middel, ca. 1-10% surfactant og inaktive bærer, såsom lersorter, vermiculit, kønrøg eller lignende. Der påføres ca. 0,1-1,4 kg/ha på planternes løv, den jord, hvori de gror eller i deres stammer.

5 Disse midler er også aktive som topiske insek ticider, mavegifte og systemiske insekticider og er særlig effektive til bekæmpelse af insekter af ordenerne Lepedoptera, Coleoptera, Homoptera, Deptera og Thysan-optera. Plantemider, acarider bekæmpes yderligere med 10 midlerne#

Disse midler påføres i reglen som fortyndede, faste eller flydende sammensætninger på formeringsområderne, føde eller levested for sådanne insekter og/el-ler acarider. Påføringsmængden på sådanne arealer om-15 fatter ca. 0,01 til ca. 8,0 kg/ha, fortrinsvis ca. 0,05 til ca. 0,5 kg/ha.

Surfactanter, der kan anvendes i fugtelige pulvere, omfatter dem, der almindeligvis anvendes til tilberedninger af sådanne fugtelige pulvere, fortrinsvis alkyl-benzensulfonatnatriumsalte. Bentonit, ler eller blandinger deraf er foretrukne bærere.

Yderligere har de aktive stoffer også vist systemisk insekticid aktivitet mod m. ovinus hos 25 *.

i-O. i · I praksis er i reglen ca. 0,02 mg/kg/dag til ca. 3,0 mg/kg/dag effektivt til bekæmpelse af parasitinfektioner hos kvæg, får og svin samt husdyr. Til længere tids brug kan der anvendes mængder helt ned til 30 0,002 mg/kg legemsvægt/dag.

Også i praksis indgives ca. 0,1 mg/kg til 100 mg/kg til dyr inficeret med helminter.

De fysiokemiske karakteristika for , β, ,^, r ,j/ θ/{ * £ / ur $ og ^-komponenterne af LL- 35 F28249 er beskrevet nedenfor.

n 17

DK 165461 B

LL-F28249a: 5 (1) Molekylevægt: 612 (FAB-MS).

(2) Molekyleformel: C36H52°8: (3) Specifik optisk rotation: [a]^* = +133 + 3° (C 0,3, acetone).

(4) Ultraviolet absorptions spektrum: som vist i fig.

10 1/ UV^30H = 244 nm (^ 28.000).

IllclX. C·' (5) Infrarødt absorptionsspektrum: som vist i fig.

2 (KBr-skive): 3439, 2960, 2925, 1714, 1454, 1374, 1338, 1171, 1120, 996 og 967 cm-1.

(6) Protonkernemagnetisk resonnansspektrum (CDC10): 15 som vist i fig. 3.

(7) Carbon-13-kernemagnetisk resonnansspektrum (CDClg): som vist i fig. 4 og beskrevet i tabel III.

(8) Elektron’anslagsmassespektrum: som vist i 20 fig. 5 med nøjagtige massemålinger og foreslå ede grundstofsammensætninger som vist i tabel IV. LL-F28249p: (1) Molekylevægt: 584 (FAB-MS) .

(2) Molekyleformel: C34H4g°g* 25 (3) Specifik optisk rotation: [a]^ = +125° (C 0,30, acetone).

(4) Ultravioletabsorptionsspektrum: som vist i fig.

6, UV^0H = 244 nm (g, 25.600).

(5) Infrarødt absorptionsspektrum: som vist i fig. 7 30 (KBr-skive): 3520, 2910, 1735, 1717, 1450, 1375, 1335, 1180, 1170, 1119, 993 og 727 cm”1.

(6) Protonkernemagnetisk resonnansspektrum (CDClg): som vist i fig. 8.

(7) Carbon-13 kernemagnetisk resonnansspektrum 35 (CDClg): som vist i fig. 38 og beskrevet i tabel IVA:

O

18

DK 165461 B

(8) Elektronanslagsmassespektrum: som vist i fig. 9 med nøjagtige massemålinger og foreslået grundstofsammensætning \ervist i tabel y.

LL-F28249^.: 5 (1) Molekylevægt: 598 (FAB-MS).

(2) Molekyleformel: C-cH^Oo.

JO DU O rsr (3) Specifik optisk rotation: [a] ^ - +150 + 4° (C 0,3, acetone).

(4) Ultraviolet absorptionsspektrum: som vist i 10 fig· 10, W^30H = 244 nm ( £, 27.100).

(5) Infrarødt absorptionsspektrum: som vist i fig.

11 (KBr-skive): 3510, 2910, 1735, 1715, 1452, 1375, 1338, 1182, 1172, 1119 og 995 cm"1.

(6) Protonkernemagnetisk resonnansspektrum (CDClg): 15 som vist i fig. 12.

(7) Carbon-13-kernemagnetisk resonnansspektrum (CDCl^): som vist i fig. 13 og beskrevet i tabel VI .

(8) Elektronanslagsmassespektrum: som vist i 20 fig. 14 med nøjagtige massemålinger og fore slået grundstofsammensætning er vist i tabel VII.

LL-F28249,,,: (1) Molekylevægt: 806 (FAB-MS).

(2) Molekyleformel: C45H74°i2* 25 (3) Specifik optisk rotation: [a]^ = -49 + 3° (C 0,35, methanol).

(4) Ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig. 15, UV^30H = 225 nm ( & 27.400) 232 nm ( £, 25.700) .

30 (5) Infrarødt absorptionsspektrum: som vist i fig.

16 (KBr-skive): 3480, 2965, 2935, 2880, 1703, 1647, 1458, 1380, 1292, 1223, 1135, 1098 og 984 cm 1.

(6) Protonkernemagnetisk resonnansspektrum (CDC13): 35 som vist i fig. 17.

O

19

DK 165461 B

(7) Carbon-13 kernemagnetisk resonnansspektrum (CDCl.j) : som vist i fig. 18 og beskrevet i tabel VIII.

(8) Elektronanslagsmassespektrum: som vist i fig.

5 19 med nøjagtige massemålinger og foreslåede grundstofsammensætninger vist i tabel 'IX· LL-F28249^; (1) Molekylevægt: 616 (EI-MS).

(2) Molekyleformel: 10 (3) HPLC-retentionsvolumen på 14,0 ml i systemet vist i tabel x.

(4) Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol): som vist i fig. 20.

(5) Protonkernemagnetisk resonnansspektrum (CDCl^): 15 som vist i fig. 21.

(6) Elektronhnslagsmassespektrum: som vist i fig. 23.

LL-F28249g: (1) Molekylevægt: 598 (EI-MS).

(2) Molekyleformel: C^H^gOg.

20 (3) HPLC-retentionsvolumen på 14,8 ml i systemet vist i tabel X.

(4) Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol): som vist i fig. 23.

(5) Protonkernemagnetisk resonnansspektrum (CDCl^): 25 som vist i fig. 24.

(6) Elektronanslagsmassespektrum: som vist i fig. 25.

LL-F28249^: (1) Molekylevægt: 598 (EI-MS).

30 (2) Molekyleformel: C35H5o°8* (3) HPLC-retentionsvolumen på 16,0 ml i systemet vist i tabel X.

(4) Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol): som vist i fig. 26.

35 (5) Protonkernemagnetisk resonnansspektrum (CDClg): som vist i fig. 27.

O

20

DK 165461 B

(6) Elektronanslagsmassespektrum: som vist i fig.

23.

LL-F28249 s -^ (1) Molekylevægt: 612 (EI-MS).

5 (2) Molekyleformel: C3gH52°8* (3) HPLC-retentionsvolumen på 23,5 ml i systemet vist i tabel X.

(4) Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol): som vist i fig. 29.

10 (5) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDCl^): som vist i fig. 30.

(6) Elektronanslagsmassespektrum: som vist i fig. 31.

LL-F28249„: -tt 15 (1) Molekylevægt: 626 (EI-MS).

(2) Molekyleformel: C37H54°q· (3) HPLC-retentionsvolumen på 24,5 ml i systemet vist i tabel X.

(4) Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol): 20 som vist i fig. 32.

(5) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDC13): som vist i fig. 33.

(6) Elektronanslagsmassespektrum: som vist i fig. 34.

25 LL-F28249 (1) Molekylevægt: 626 (EI-MS).

(2) Molekyleformel: C^H^O^.

(3) HPLC-retentionsvolumen på 26,0 ml i systemet vist i tabel X · 30 (4) Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol): som vist i fig. 35.

(5) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDCl^): som vist i fig. 36.

(6) Elektronanslagsmassespektrum: som vist i fig.

35 3 7.

O

21

DK 165461 B

LL-F28249 (1) Molekylevægt: 584 (EI-MS).

(2) Molekyleformel: C35H52°7* (3) Specifik optisk rotation: [a]^ = +189° (C 0,165, 5 acetone).

(4) Ultraviolet absorptionsspektrum: som vist i fig.

39 UVCH30H = 241 nm (E 20.400).

max (5) Infrarødt absorptionsspektrum: som vist i fig.

40 (KBr -jskive>).

10 (6) Elektronknslaqsmassespektrum: som vist i fig.

41.

(7) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDC13): som vist i fig. 42.

(8) Carbon-13 kernemagnetisk resonansspektrum (CDClg): 15 som vist i fig. 43 og beskrevet i tabel XI.

LL-F28249 j: (1) Molekylevægt: 626 (FAB-MS).

(2) Molekyleformel: C^H^Og.

(3) Specifik optisk rotation: [a]^ = +145° (C 0,23, 20 acetone).

(4) Ultraviolet absorptionsspektrum: som vist i fig.

44 uvCH30H = 244 nm (E 30.000).

max (5) Infrarødt absorptionsspektrum: som vist i fig.

45 (KBr-skive;.

25 (6) Elektronanslagsmassespektrum: som vist i fig.

fig. 46.

(7) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDClg): som vist i fig. 48.

(8) Carbon-13 kernemagnetisk resonansspektrum 30 (CDClg): som vist i fig. 48 og beskrevet i ta bel XII.

LL-F28249 : (1) lioleky levægt: 612 (EI-MS) .

(2) Molekyleformel: C37H56°7· 35 (3) Ultraviolet absorptionsspektrum: som vist i fig. 49 UV^30H = 241 nm (E 16.800).

IuaX

DK 165461 B

O

22 (4) Infrarødt absorptionsspektrum: som vist i fig. 50 (KBr-skive) .

(5) Elektronansl&gsmassespektrum: som vist i fig. 51.

5 (6) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDCl^): som vist i fig. 52.

LL-F28249 : (1) Molekylevægt: 592 (EI-MS).

(2) Molekyleformel: C^gH^gO^.

10 (3) Specifik optisk rotation: [a]^ = +131° (C

0,325, actone).

(4) Ultraviolet absorptionsspektrum: som vist i fig. 53 UVCH30H = 256 (E 20.500), 358 (Ξ 8.830).

(5) Infrarødt absorptionsspektrum: som vist i fig.

15 54_(KBr-skive) .

(6) Elektronenslagsmassespektrum: som vist i (7) Protonkernemaonetisk resonansspektrum (CDClg): som vist i fig. 56.

(8) Carbon-13 kernemagnetisk resonansspektrum 20 (CDClg): som vist i fig. 57 og beskrevet i ta bel XIII.

25 30 35 23

DK 165461 B

c

C -H

OM fvt μ m n ¢4 η Λ M fO PI

g^uouuuuuoSooouoou α

ft *H P

CO

9

CO

•p ^ **

Tj 09Ρ*^·Γ*’^«,'·^Οβ'Ι^«0®Μ0',Λ0' o W af^fCBiniHO'e'eui^'enciminfn -<

x \Z *τ *τ *τ <n π π π Oi c* Oi *H

CO

•H

e a Φ σ\ « •μ*

CM

00

CM

Pu C .

Λ ,ηβ3ο\ο·^<Ν<η^·«ηΌΡ*οοσ\ο»-<<Ν<]2 *5* ,_q t^»M^CNCNCN<NCNcNCNCM<NCMnmnm n (ti

Η M U

h ° ►; H 4-1 g* H (ti Tj O -P g

Λ (0 W

(ti Ό 3 * , $ „ g* 2 S S *»· § 0·σσ = O· g g g °·σ= = = = g cn o P 7? Ή M +» ^ I (¾ H “ C -P u j.

O co ” •Q Λ ‘ ®

ti 3 CO *H

iti co S C (ti o _ B o c U Η Λ tn 0 (ti Μ ·Η

1 M (ti CO

H cn 44 O m g ^· « r·* m cm vo η η o ^ ^ ^ ^ ^ ^ φ m ®

«<n<Mmr»c^r»omoæa»ocr>OO'eo °?a Ϊ S

y. Er.^.Pr1nri<,nfn<NCN»HO\«r*r^(Ovo Og p CM Q) 0 V m £ 3 v* (D fo

W M > O

0) Λί +> tn C II ~ « ^ P o* θΗΝη,,^«»θ(θΗ,π:^ £ Μ (ti

U

Tabel IV

•lassemålinger ved stærk opløsning for ίί-Ρ28249α 24

DK 165461 B

O

_m/z_Grundstofsammensætning 612,3705 c36h52°8 S94;3543 C36H50O7 576,3472 C36H4806 484,3211 C30H44O5 10 482,2648 C29H38°6 466,3097 C3øH4204 448,2987 C3QH40O3 442,2375 C26H3406 15 425,2327 C26H3305 354,2181 C23H30°3 314,1877 C20H26°3 - 278,1144 ^15^18^5 20 265,1786 C16H2503 248,1405 ^15^20^3 247,1705 c16h23°2 237,1838 ^-15^25^2 219,1740 Cl5H23° 25 151,0753 C9Hn02 30 35

O

25

DK 165461 B

Tabel IVA

Carbon-13 NMR-data for LL-F282490 —-p

Kemisk skift Kemisk skift

Carbon_(ppm)_Carbon_(ppm) 5 1 173,3 18 68,3 2 142,6 19 67^8 3 139,5 20 67,7 10 4 137,7 21 48,4 5 137,3 22 45,7 6 133,9 23 41,0 7 123,8 24 40,8 15 8 123,4 25 36,1 9 120,3 26 35,° 1 10 120,2 27 34,7 11 118.0 28 22,3 20 7 7 '12 99,7 29 19,8 13 80,2 30 15.5 14 79,4 31 13,8 25 15 76,7 32 13,1 16 69,2 33 10,8 17 68^6 30 i Længere fremme fra TMS, CDCl^-opløsning 35

To uopløste signaler

Tabel V

Massemålinaer ved stærk oplosning for LL-F28249^ 26

DK 165461 B

O

m/z_Grundstofsammensætning 5 .584,3388 C34H4808 t 566;3306 C34H4607 456,2864 C28H40Os 442,2391 C26H3406 10 . 438,2780 C28H3804 425j2331. C26H3305 354,2187 C23H3o03 314,1858 C20H26O3

15 278,1168 C15H180S

237,1491 C14H2103 219,1380 £χ4Ηχ902 . 209,1534 C13H2i02 191.1418 Οχ3Η190 20 ' 151,0750 £9Ηχχ02 25 30 35

O

27

DK 165461 B

Tabel VI

Carbon-13 NMR-data for LL-F28249

Kemisk skift1^ Kemisk skift

Carbon_(ppm)_Carbon _(ppm)_ 5 1 173,6 19 68,3 2 142,4 20 67,9 3 139 j 9 21 57 j 7 4 137,3 22 48,5 5 136,0 23 45,8 10 6 134,0 24 41,2 7 123,8 25 40,8 8 123,6 26 36,2 9 120,4 27 36,1 10 119,6 28 36,0 15 11 118,5 29 34,8 12 99,8 30 22,3 13 80,5 31 19,9 14 77,8 32 15,5 15 77,0 33 13,8 20 1 6 7 6,8 34 1 3,1 17 69,3 35 10,8 18 68,6 25 1) Længere fremme fra TMS, CDCl^-opløsning.

30 35

Tabel VII

.'.-iassemåling ved stærk opløsning for LL-F28249 28

DK 165461 B

O

m/z_Grundstofsammensætning s 598^ 3543 C35H50O8 · 580;3422 C35H48O7 562,3292 C35H4606 496,2824 C30H4006 10 484,2440 C28H36O7 478,2687 *-30^3805 456,2576 C27H36O6 438,2772 C28H38O4 15 425,2341 C26H33O5 420,2651 ^28^36^3 354,2199 C23H3QO3 314,1875 c20h26°3 292,1307 C16H20O5 on 288,2075 ^19^28^2 248,1397 ^15^20^3 237,1490 ^14^21^3 219,1382 C14H19O2 25 2 0 9,1544 Cj.3H2i.O2

191,.1435 C13H19O

151,0759 C9H11O2 30 35

O

29

DK 165461 B

Tabel VIII

Carbon-13-NMR-data for LL-F28249c^

Kemisk skift1 Kemisk skift

Carbon_(ppm)_Carbon_(ppm)_ 5 1 220,7 23 42;22 2 219,6 24 40j4 3 165^2 25 38,3 4 148.7 26 37,6 5 133 j1 27 36j1 10 6 132,3 28 34,8 7 132,1 29 33,5 8 130,2 30 30,1 9 122,3 31 26,6 10 100,0 32 25,4 15 11 82,9 33 24.5 12 75,9 34 23,0 13 73,0 35 21,1 14 72,7 36 17,9 15 72,6 37 14,3 20 16 72,1 38 14,2 17 69,0 39 12,1 18 67,3 40 11,5 19 63.6 41 10,9 20 51,4 42 8r7 25 21 46,2 43 8j3 22 45,7 44 5,7 35 Længere fremme fra TMS, CDCl3-opløsning 2

To uopløste signaler 30 30

DK 165461 B

o

Tabel IX

Massemåling ved stærk opløsning for LL-F28249 _ - —. ~ Cu m/z_Grundstofsammensætning 5 462;3350 C28H46O5 444^3237 C28H44O4 425j2534 C23H37O7 407^ 2439 C23H35O6 10 406j3046 C25H42O4 387j2895 C25H39O3 337^2010 C19H29O5 297,2031 ^17^29^4 279,1944 C17H27O3 261j1851 ^17^25^2 253,1797 C15H25O3 235,1697 C15H23Q2 224,1754 ^14^24^2 20 209, 1530 C13H21O2

207,1744 C14H23O

184,1458 ^11^20^2 179,1048 C11H15O2 25 173,1205 C9H17O3 167^1051 ^10^15^2 155,1069 C9H15O2 30 35

O

31

DK 165461 B

Tabel X

HPLC-retentionsvoluminer for LL-F28249cc, 6» e. c > η > 6 -°9 5 Forbindelse Ret en ti ons volumen* (mjj LL-F28249 α 19,8 LL-F28249 6 14;0 LL-F28249 e 14;8 LL-F28249 ζ 16,0 10 LL-F28249 η 23,5 LL-F28249 θ 24,5 LL-F28249 ,. 26.0 1g * Systemet omfatter en kolonne 3,9 mm x 30 cm pak ket med C^g omvendt-fase-pakning fremkaldt med methanol/vand = 80:20 ved 1,0 ml/minut, påvisning sker ved absorbans ved 254 nm.

20 25 30 35 o 32

DK 165461 B

Tabel XI

Carbon-13-NMR-data for LL-F28249., * *

Kemisk skift Kemisk Skift

Carbon_(ppm)_Carbon_(ppm) s 1 173,9 19 . 56,7 2 140,7 20 48,4 3 138,3 21 47,7 4 136.6 22 41,1 5 136 ^5 23 40,6 10 6 133,8 14 37,1 7 124,7 25 36,3 - 8 124,4 26 36,0 9 123,8 27 35,9 10 120,1 28 34,6 15 11 118,5 29 22,0 12 99,7 30 19,3 13 77,2 31 16,0 14 76,6** 32 13,8 15 76,5 33 13,3 20 16 69,3 34 13,1 17 68,6 35 10,7 18 67,3 25 * Længere fremme fra TMS, CDCl-j-opløsning.

** Sammenfaldende med CDCl^-signaler.

30 35

O

33

DK 165461 B

Tabel XII

Carbon-13-NMR-data for LL-F28249^ tt · i i · r-. * Kemisk Skift

Kemisk skift

Carbon_(PPm) _Carbon_(ppm) 5 1 173;6 19 68,3 2 142;5 20 67,3 3 139,8 21 57,3 4 137,4- 22 48,6 10

5 137,2 23 45,S

6 136,0 24 41,2 7 130 ,7 25 40,5 c 8 123.6 26 36,1 **

9 120 , 3 27 36TG

. 10 119,7 28 34,9 11 118,6. 29 26,9 20 12 99,8 30 23r 0 ** 13 80,5 31 22,4 14 77,7 32 20,0 15 77,6 33 15,7 25 16 76,7 34 14,0 17 69,3 35 11,1 18 68,6 30 * Længere fremme fra TMS, CDCl^-opløsning.

** To uopløste signaler.

35

O

34

DK 165461 B

Tabel XIII

Carbon-13-NMR-data for LL-i’28249^

Kemisk skift* Kemisk skift

Carbon_(ppm)_Carbon_(ppm) 5 1 167,4 18 69,4 2 150,5 19 68,7 3 142,9 20 68,3 4 142,0 21 48,4 10 5 137f2 ** 22 41,0 ** 6 132,1 23 35,9 7 130,7 24 35,6 8 125.8 25 35,5 15 ' 9 125,5 26 34,4 10 124, 2 27 29,7 11 ' 123 y 7 28 26,8 20 12 1 23,2 2 9 2 2 ,9 13 121,3 30 22,8 14 118,0 31 22,1 15 100,0 32 15f 3 25 16 76.7 33 13,9 17 74.6 34 11,0 30 * Længere fremme fra TMS, CDCl^-opløsning.

fcfe To uopløste signaler.

35

O

35

DK 165461 B

Tabel XIV

Chromatografiske data TLC* HPLC**-retentionstid

Komponent relativ _(minutter)_ 5 α 1,00 13,8 ' 8 0,797 9,3 γ 1,42 12,6 6 0,758 10-4 10 c 1.06 10,9 ζ 1,12 11,5 η 1,03 16,2 15 θ 1,27 17,3 l 1.27 18r2 ic 1,83 24,7 λ 1,56 19,1 20 μ 1,92 38τ 0 v 1,95 42,3 ω -0.212 ' 7,1 25 * "Analtech Silica Gel GHLF250^u" fremkaldt med ethyl- acetat/methylenchlorid = 1:3, påvisning ved forkulning med ^SO^.

** "Altex Ultrasphere ODS" 5^u 4,6 mm x 25 cm fremkaldt med 85% methanol i vand ved 1,0 ml/minut, påvist ved 30 absorbans ved 254 nm 35 36

DK 165461 B

O _

Denne organisme opbevares i the Culture Collection of Medical Research Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, som kultur nr. LL-F28249.

En levende kultur af denne nye mikroorganisme er blevet 5 indleveret hos the Patent Culture Collection Laboratory, Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604 og er indgået i dets permanente samling. Den er frit tilgængelig for offentligheden under deponeringsnummer NRRL 15773.

10

Almindelige fermenteringsbetingelser

Dyrkning af Streptomvces cyaneogriseus noncyane-ogenus, NRRL 15773, kan foregå i en lang række forskellige flydende dyrkningsmedier. Medier, der kan anvendes 15 til fremstilling af midlerne LL-F28249a, ^ , £ , g i^' 'Λ ' u' ^ og ' omfatter en assimilerbar carbon-kilde, såsofa dekstrin, saccharose, melasse, glycerol etc., en assimilerbar nitrogenkilde, såsom protein, proteinhy-drolysat, polypeptider, aminosyrer, majsstøbevæske etc., 20 og uorganiske anioner og kationer, såsom kalium, natrium, ammonium, calcium, sulfat, carbonat, phosphat, chlo-rid, etc. Sporelementer såsom bor, molybdæn, kobber etc. tilføres som urenheder fra andre bestanddele i medierne. Beluftning i tanke og kolber sker ved at tvangs-25 tilføre steril luft gennem eller på overfladen af fermenteringsmediet. Yderligere bevægelse i tankene sker med et mekanisk skovlhjul. Der kan, om nødvendigt, tilsættes et antiskummemiddel, såsom siliconeolie.

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere 30 belyst ved hjælp af eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af podestof

Et typisk medium, der anvendes til dyrkning af 35 de forskellige stadier podestof, fremstilles efter følgende opskrift:

O

37

DK 165461 B

Dekstrose 1/0%

Dekstrin 2/0% Gærekstrakt 0,5% NZ-amin 0,5%

Calciumcarbonat 0,1% 5

Vand op til 100,0%

Mediet steriliseres. En portion på 100 ml af dette sterile medium i en kolbe . inokuleres med mycelie- afskrab fra en skråtstillet agar af Streptomyces cyaneo- griseus noncyanogenus NRKL 15773. Mediet rystes derpå 10 _ kraftigt pa en roterende ryster i 48-72 timer ved 28 C, hvilket giver primært podestof. Dette primære podestof anvendes derpå til at pode en liter af ovennævnte sterile medium, som derpå dyrkes aerobt ved 28°C i 48 timer, hvorved man får sekundært podestof.

15

Eksempel 2

Fermentering

Der fremstilles et fermenteringsmedium med følgende sammensætning: 20 Dekstrin 1,0%

Sojapepton 1,0%

Melasse 2,0%

Calciumcarbonat 0,1%

Vand op til 100,0% 25 Dette medium steriliseres, og derpå inokule res en portion på 30 liter med 1 liter af det sekundære podestof fremstillet som beskrevet i eksempel 1. Fermenteringen sker ved 30°C med en steril luftstrøm på 30 2 liter/minut, modtryk 1,56 kg/cm og omrøring med et skovl-30 hjul, der roterer med 500 omdr/min. i 91 timer, på hvilket tidspunkt mæsken høstes.

Eksempel 3

Isolering af LL-F28249 , „og - 35 up Ύ I alt 26 liter af hele den høstede mæsk, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 2, blandes med 1500 g diatoméjord og filtreres. Myceliekagen vaskes med 5 liter vand, og filtratet og vaskevæske kasseres. Mycelie- 38

DK 165461 B

0 kagen blandes med 10 liter methanol i en time-, filtreres derpå og vaskes med 5 liter methanol. Methanolekstrakten og methanolvaskevæsken kombineres og inddampes til en van-dig remanens på ca. 1-2 liter. Denne vandige remanens blandes med det dobbelte volumen methylenchlorid og blan-5 des i en halv time. Methylenchloridfasen fraskilles og inddampes derpå til en sirup, hvilket giver 27 g råmateriale.

Disse 27 g råmateriale opløses i en blanding af methylenchlorid og methanol, filtreres gennem vat og vand-10 fri natriumsulfat og inddampes derpå, hvilket giver 7,0 g af en olie.

En portion på 170 g silicagel opslæmmes i 12,5% ethylacetat i methylenchlorid og hældes op til dannelse af en kolonne på 2,5 x 58 cm. Olien opløses i 12,5% e-15 thylacetat i methylenchlorid og påføres kolonnen. Kolonnen fremkaldes med samme opløsningsmiddelblanding. Den mobile fase løber med 1,3 ml/minut til at begynde med, og der opsamles 15 minutters fraktioner. Strømningshastigheden nedsættes til ca. 0,5 ml/min. efter 10 frak-20 tioner, så at fraktionerne 1-10 er på 20 ml aftagende ensartet til ca. 10 ml, og fraktionerne 11-98 er på ca.

7 ml. Ved fraktion 99 forøges strømningshastigheden, så at der fås 25 ml fraktioner på 10 minutter. Der opsamles ialt 105 fraktioner. Disse fraktioner afprøves 25 med tyndtlagschromatografi i ethylacetat/methylenchlorid .= 1:1.

Fraktionerne 30-54 kombineres og inddampes, hvilket giver 1,08 g olie, der indeholder LL-F28249,y.

Fraktionerne 55-62 kombineres og inddampes, hvil-30 ket giver 150 mg faststof indeholdende LL-F28249a og

De 150 mg faststof indeholdende LL-F28249 og „ α p chromatograferes med præparativ HPLC ved hjælp af en om- (§) vendt-fase-kolonne ("^atman^S", 2,2 x 50 cm), fremkaldt med 80% vol/vol methanol i vand. Strømningshastigheden er 35 ca. 10 ml/min., og der indsamles 2 irtinutters fraktioner.

39

DK 165461 B

O Fraktionerne 58-69 kombineres/ methanolen af- dampes, der tilsættes tert.butanol/ og blandingen lyo-philiseres, hvilket giver 60 mg ren LL-F28249a.

Fraktionerne 40-43 kombineres/ methanolen afdam-pes, og den tiloversblevne vandige suspension ekstrahe-5 res med methylenchlorid, hvilket efter inddampning giver 10 mg ren LL-F28249p.

De 1,08 g olie, der indeholder LL-F28249Y, opløses i 10% ethylacetat i methylenchlorid og påføres en kolonne (2,5 x 50 cm) pakket med silicagel. Kolonnen 10 fremkaldes med 10% ethylacetat i methylenchlorid, idet der elueres med en strømningshastighed på 2 ml/min og opsamles 12 minutters fraktioner. Fraktionerne 19-29 kombineres og inddampes til en remanens, som renses ved præparativ omvendt-fase-chroma tograf i som beskrevet for 15 a~ °g ^-komponenterne. Fraktionerne 55-62 kombineres, methanolen afdampes i vakuum, der tilsættes tert.butanol, og blandingen lyophiliseres, hvilket giver 60 mg ren LL-F28249y.

20 Eksempel 4

Fermentering i stor målestok

Et podestof af Streptomyces cyaneogriseus non-cyanogenus, NRRL 15773, fremstilles som'beskrevet i eksempel 1, idet der anvendes 100 ml primært podestof til 25 fremstilling af 10 liter sekundært podestof.

Der foretages to gange 300 liters fermentering som beskrevet i eksempel 2, idet der anvendes 10 liter af ovennævnte sekundære podestof til hver 300 liter fermenteringsmedium. Efter 118 timer høstes mæsken.

30

Eksempel 5

Isolering af 1/1^28249^ I alt 450 liter høstet mæsk fra de to 300 liters fermenteringer, der er beskrevet i eksempel 4, behandles 35 som beskrevet i eksempel 3's første del, hvilket giver et råmateriale som en sirup.

40

DK 165461 B

0 ' Denne sirupsagtige remanens vaskes med hexan for at fjerne ikke-polære materialer/ og de tiloversblevne 9 g uopløseligt materialer underkastes "Sepha-de^L H-20"-adskillelseschromatografi.

Den chromatogråfiske kolonne fremstilles med 5 9 "Sephadej^^LH^O" / der i forvejen er kvældet i metha nol/ så at der dannes en kolonne på 10 x 110 cm. Kolonnen bringes i ligevægt ved at der ledes ca. 4800 ml mobil fase (methylenchlorid/hexan/methanol = 10:10:1) igennem den med en strømningshastighed på 5 ml/min.

10 De 9 g uopløseligt materiale kommes på kolonnen i 50 ml mobil fase. Et indledende forløb på 2150 ml fås med en strømningshastighed på 5 ml/min. Strømningshastigheden forøges derpå til 8 ml/min., og der opsamles fraktioner hver 45 minutter. Fraktionerne 9-12 kombineres, 15 og opløsningsmidlerne af dampes i vakuum, hvilket giver en remanens på 4,9 g.

Denne remanens opløses i en 1:1 blanding af cyclohexan og ethylacetat og for lov at inddampe langsomt ved stuetemperatur. Tilsætningen af n-hexan giver 2Π et bundfald, der opsamles, hvilket giver 3,1 g faststof.

3,0 g af dette faststof renses yderligere ved fældning ud fra 25 ml methylenchlorid, ved hjælp af 50 ml n-hexan.

Det således opnåede bundfald genopløses i 15 ml 25 methylenchlorid og fældes med 25 ml n-hexan, hvilket giver 510 mg ren LL-F2824^,.

Eksempel 6

Isolering af LL-F28249^, f , ^ ^, og i» 30 Fraktionerne 4-7 fra "Sephadex!^,H-20,,-kolonnen, der er beskrevet i eksempel 5, kombineres, og opløsningsmidlerne afdampes i vakuum, hvilket giver en remanens på 1,9 g.

Denne remanens chromatograferes på en kolonne

QC

af 200 g silicagel (2,5 x 83 cm), idet der anvendes 10% ethylacetat i methylenchlorid som elueringsmiddel.

O

41

DK 165461 B

Strømningshastigheden er ca. 2 ml/min., og der opsamles fraktioner hver 12 minutter.

Fraktionerne 65-67 og 73-79 kombineres sammen og opløsningsmidlerne afdampes i vakuum/ hvilket giver _ 250 ml remanens.

5

Disse 250 mg remanens underkastes præparativ omvendt-fase-chromatografi som beskrevet i eksempel 3, men der anvendes 75% methanol i vand som den mobile fase. Strømningshastigheden er ca. 10 ml/min. Den første por-10 tion på 2000 ml af eluatet kasseres, derpå opsamles 72 fraktioner med 2 minutters mellemrum. Efter at endnu en portion eluat er kasseret (mellem 300 og 400 ml), opsamles igen fraktioner, men med mellemrum på 2,5 minutter.

Fraktionerne kombineres som anført nedenfor.

De kombinerede fraktioner får lov at inddampe i et stinkskab natten over, derpå ekstraheres komponenterne over i methylenchlorid. Efter afdampning af opløsningsmidlet opnås ca. 1 ml af hver ren komponent.

Komb. fraktioner Forbindelse 20 - - 7-10 LL-F28249^· 19-22 LL-F28249£ 28-31 LL-F28249£ 81-83 LL-F28249 rt 86-88 LL-F28249.

25 “ 93-95 LL-F28249t

Eksempel 7

Isolering af LL-F28249*,, i , og ^ og Ialt 390 liter fermenteringsmæsk høstet fra fermenteringer foretaget som beskrevet i eksempel 2, oparbejdes hovedsagelig som beskrevet i første afsnit af eksempel 3, hvilket giver 120 ml methylenchloridkoncen-trat. Dette koncentrat fortyndes med 200 ml hexan og __ afkøles natten over ved 4°C. Det fremkomne bundfald 35 fjernes ved filtrering og kasseres. Filtratet fortyndes med 300 ml hexan. Det fremkomne bundfald (A) opsamles ved filtrering og opbevares. Dette filtrat inddam-

O

42

DK 165461 B

pes til tørhed, og den olieagtige remanens opløses derpå i 200 ml methylenchlorid og fortyndes med 1700 ml hexan. Det fremkomne bundfald (B) opsamles ved filtrering og opbevares. Dette filtrat koncentreres til en 5 olieagtig remanens, som derpå atter opløses i 50 ml methylenchlorid, der tilsættes 950 ml methanol, og denne opløsning opbevares ved 4°C i 3 dage. Det fremkomne bundfald fjernes ved filtrering og kasseres. Filtratet inddampes til tørhed, og remanensen (C) kombineres 10 med (A) og (B) og underkastes chromatografi på følgende måde: Kolonnen på 5,0 x 109 cm opslæmnings pakkes med "Woelm TSC"-silicagel i ethylacetat/methylenchlorid = 1:9. Kolonnen fremkaldes med samme opløsningsmiddelblanding ved en hastighed på 25 ml/min. De første 2 15 liter afløbsvæske kasseres, derpå opsamles 16 400 ml fraktioner.

Fraktionerne 2 og 3 kombineres og inddampes, hvilket giver 3,9 g olieagtigt materiale (D) .

Fraktionerne 4-7 kombineres og inddampes, hvil-20 ket giver 9,5 g olieagtigt materiale, som opløses i hexan og chromatograferes på en 2,5 x 110 cm kolonne, der er opslæmnings pakket med 300 g "Woelm"-silicagel i e-thylacetat/hexan = 1:4. Kolonnen fremkaldes med samme · opløsningsmiddelsystem med en hastighed på 4 ml/min. ,· 25 idet der opsamles fraktioner med 7 minutters mel lemrum t

Fraktionerne 45-54 kombineres og inddampes, hvilket giver 0,3 g materiale (E).

Fraktionerne 63-135 kombineres, inddampes til .tørhed, opløses derpå igen i tert.butanol og lyophili-30 seres, hvilket giver 4,6 g næsten hvidt faststof (F).

LL-F28249 L„ og „ K /**

Materiale (D) og (E) kombineres og chromatograferes på en 2,5 x 110 cm kolonne pakket med 300 g ''Woelm"-silicagel, idet der fremkaldes med ethylacetat/ 35 hexan = 1:9. Strømningshastigheden holdes på 4 ml/min., og der opsamles fraktioner med 7 minutters mellemrum.

43

DK 165461 B

O Fraktionerne 67-115 kombineres og inddampes til tørhed, hvilket giver 920 mg remanens (G).

Denne remanens (G) chromatograferes ved præparativ HPLC ved hjælp af en omvendt-fase-kolonne ("What-man^8" (2,2 x 50 cm) og fremkaldes med 85% vol/vol me-5 thanol i vand. Strømningshastigheden er ca. 10 ml/min., og der opsamles fraktioner med 2,5 minutters mellemrum.

Fraktionerne 33-40 kombineres, inddampes for at fjerne methanolen, ekstraheres derpå med methylen-chlorid. Remanensen, der fås efter inddåmpning, oplø-10 ses i tert.butanol og lyophiliseres derpå, hvilket giver 60 mg LL-F28249^.

Fraktionerne 52-58 oparbejdes på lignende måde, hvilket giver en lille smule LL-F28249 .

LL-F28249 > ^ 15 1 g af materiale (F) chromatograferes ved om- vendt-fase-HPLC, som beskrevet ovenfor, med undtagelse af, at der anvendes 80% vol/vol methanol i vand som elue-ringsmiddel.

Fraktionerne 61-75 kombineres og oparbejdes 20 som ovenfor, hvilket giver 100 mg LL-F28249^.

LL-F28249 ^ 396 g materiale hovedsaaelia det samme som materiale (D) ovenfor opløses i 500 ml methanol og afkøles derpå ved 4°C i flere timer. Det fremkomne bund-25 fald fjernes ved filtrering, vaskes med kold methanol og kasseres. Filtrat og vaskevæske kombineres og inddampes. Residualolien opløses i hexan og fyldes på en 5 x 50 cm tørt pakket silicagelkolonne ("Mallinkrodi®

SilicAR cc-7"). Kolonnen elueres med ethylacetat/hexan 30 = 1,5: 8,5 med en hastighed på ca. 50 ml/min.

Der opsamles fire fraktioner:

Fraktion Volumen (liter) 1 1 2 4 35 3 1 4 2 44

DK 165461 B

Fraktion 3 inddampes, hvilket giver 5,0 g remanens, som renses ved præparativ omvendt-fase HPLC ("Waters C^g", 5 x 60 cm). Kolonnen fremkaldes først med 16 liter 80% methanol i vand, vol/vol. Den første 5 liter afløbsvæske kasseres, og derpå opsamles fraktioner på 400 ml.

Fraktionerne 44-47 kombineres og oparbejdes som beskrevet ovenfor og giver 390 mg LL-F28249| som et bleggult faststof.

10

Eksempel 8 LL-F28249, NRRL 15773's fermenteringsvæskes antinematodiske virkning

Denne in-vitro-prøve er tænkt benyttet til den frit 15 levende nematode Caenorhabdotos elegans (C. elegans) for at påvise fermenteringsvæskers anti-namtodiske virkning mod mikroorganismer fra jorden. Prøvemetoden består i, at der pipetteres 50 eliter af hver væske i et af 96 huller på en mikrodyrkningsplade, hvorpå der tilsættes 10 /xliter af en 20 3-4 dage gammel kultur af C.elegans (i alle udviklingssta dier) suspenderet i C.briggsae-vedligeholdelsesmedium. Fermenteringsvæskernes virkninger iagttages og noteres 48 timer efter den indledende blanding af væske og nematoder.

LL-F28249, NRRL 15773-væske dræber alle voksne og 25 reducerer udpræget overlevelsen og mobiliteten hos forskellige larvestadier ved både den indledende og en gentagelsesprøve.

Eksempel 9

In-vivo anthelmintisk aktivitet hos fermenteringsprodukter 30 fra LL-F28249. NRRL 15773

Dette in-vivo-system skal påvise potentiel anthelmintisk aktivitet hos alle fermenteringsprodukter, der viser sig at have anti-nematodisk virkning mod c.elegans. Prøver af LL-F28249, NRRL 15773 blandes i foder med koncentrationer 35 fra 0,0031% til 2,0% (31 ppm til 20.000 ppm). Den medicin-tilsatte kost, der indeholder de varierende koncentrationer 45'

DK 165461 B

af fermenteringsprodukter fra LL-F28249, NRRL 15773, gives til Gerbillus-mus inficeret med 400 3. st.-larver af Tricho-strongylus colubriformis. Det medicintilsatte foder gives ad libitum, begyndende når infektionen er 7 dage gammel i 5 1/2 til 4 dage, hvorefter Gerbillus-musene obduceres. Ind voldene fjernes og anbringes i vand i en inkubator ved 45'C i 2 timer, så at parasitterne kan udvandre fra vævet. Hver behandlings effektivitet bestemmes ved at opgøre antallet af T. colubrif ormis, der er tilbage, sammenlignet med en 10 ubehandlet kontrol. Resultaterne af disse eksperimenter, der er anført i tabel XV nedenfor, viser den anthelmintiske aktivitet hos et fermenteringsprodukt fra LL-F28249, når det indgives i foder, indgives som en enkelt oral portion eller ved subcutan injektion.

46

DK 165461 B

tn m cm ni o o o o Ό *· - * - 0 o to o o i e ή p 0

P

3 in m m χ m o o o o o o o o o oo m (Μ o o H inooooomj m o r- g icj m cn oo σι P · oo o-·

r- to ø m ø P

η e -η I Λ J 111 Ή 0)

Di 3 Η -Η PS p ω 0 2 Ρ 03 Ο Ο Η Ο Ο Ο γ-ΙΟ Ή Ο Η Ο ΟΟΟ r-io •Η id - * »· ·. φ ·*· *·»· - - ·Η ' - ··- *.^3 m οο ο Γ' oo οοοοοοοΡο© οο σι Ρ - οο οο σι Η m ο ο r~ η ϋ mo ιο Ο p Ρ Id Ρ Η Q) Ρ οο O (D Μ ·Γ“Ι

οο 'd Ο G

Ν 111 Ο Ή b Ο Ή Ρ

1 Λ - η C

J +J Ο) iti j to id ο ο mo λ οο mo -Poo co in -Η10*·*·*"νί3 ****· 0 ·· - v ^ <d E Ρ O CO 000)00 OOl I U Ο Ο Ο (Ti > ρ ppm© ο οο ο Λ ο o ©

p 0 P oo p c ρ ρ p 0 H H

p c 0) to

rH Ρ P -*H

0) 0) P Ο Π3 Ό Λ Ή Λ i 0) αi

<d ip ø Ό S S

Eo 0 P <D

(DinQJOOCMO O O ip O OO O

^ d S m i—i i—i oo i—i i—i oo i—i i—i •Η «Η

-P £>- «-""N

X & Di tji di Cn (d ci —^ ^ χ χ χ χ

0 E S \ \ \ N

•HP ft# ft# trutfCncP 01 ό(I ir#

-pap. E E · E E

«|J "W · W · N-*· · > ' · ^ ·

<D o Ρ Ρ Ρ P -P -P

-P λ ·χ ·χ to χ to ,¾ tn x mx •HU UCDUd) -HOJ-HO) -HQ) . -HQ) >-h c p c p tn p tn p to p to p

-HP 0 P 0 P 0 P 0 P 0 P 0 P

Ρ Η « H WH Q ω Q W Q PJ Q W

<0 ~ ^

Ρ P P

χ -o; a) a)

tn P p P

•H 0) <D 0) P tn tn to

C Ή -Η P

•Η Λί Ρ X Η X f-t

Eg o tn Ή tOP top P ·& R3 X W si tø Λ tucvjga Ea s a X 00 o o o P CM P >1 H >1 p >1 d 1 ty p a) p o) p < (P K — O E — O >- d W w «

O

47

DK 165461 B

Eksempel 10

Anthelmintisk aktivitet hos LL-F28249a mod parasitiske ' ’ ' nematoder hos får Dette forsøg er tænkt til bedømmelse af akti-5 viteten hos LL-F28249a mod de økonomisk vigtige para sitter hos får. Fårene inokuleres ved forsøget med smitsomme larver af Haemonchus contortus, Ostertagia circumcincta og Trichostrongylus colubriformis for at opbygge infektioner, som LL-F28249a kan afprøves imod.

10 21 dage efter inokulering bestemtes infektionsniveauer ved en standard tællemetoder til "stoll"-tælling af nematoder for at bestemme antallet af æg af hver art pr. g fæces. Fårene fordeles tilfældigt under tre behandlingsgentagelser og kontrolgrupper baseret på tællinger 15 af nematodeæg. 22 dage efter infektion behandles fårene med LL-F28249Q med de doser og indgiftsveje, der er vist i tabel XVI nedenfor. 78 dage efter behandling aflives fårene, og ormene indsamles ved hjælp af standardmetoder til anthelmintisk bedømmelse. Hver behandlings 20 effektivitet mod hver art bestemmes ved at sammenligne antallet af orme ved de respektive doser med antallet af orm, der findes hos de tre ubehandlede kontroldyr. Resultaterne af disse bedømmelser, der er anført i tabel XVI nedenfor, viser hvor effektivt LL-F28249q er 25 som anthelmintisk middel.

30 35 48

O

DK 165461 B

Tabel XVI

F28249a's anthelmintiske effektivitet mod Haemonchus,

Ostertaqia og Trichostrongylus hos får

Dosis Indgifts- _Effektivitet (%) mod_ 5 mg/kg_vej_Haemonchus Ostertaqia T.colubriform.

1.0 oral 100,0 100,0 99,9 0,2 oral 100,0 100,0 99,9 0,1 oral 100,0 95,4 99,9 1.0 IM 100,0 100,0 100,0 10 0,2 IM 100,0 100,0 100,0

Gennemsnitligt antal fundne orme (omtr.) 0,0_=_2683,0 881,0 16.200,0_ IM = intramuskulær 15 Eksempel 11

Antibiotisk LL-F28249a,s effektivitet mod insektparasitten Melophagus ovinus hos får (fåretæge)

Dette forsøg gennemføres løbende på det samme får, der anvendes til bestemmelse af anthelmintisk akti-20 vitet som anført i eksempel 10. Fåret iagttages før behandling med hensyn til naturlige angreb af M. ovinus.

Halvdelen af hvert får inspiceres for tegn på anti-ek-toparasitisk aktivitet ved obduktion 7 dage efter behandling.

25 Hvert fårs venstre side klippes langsomt med elektrisk saks og inspiceres for levende og døde eksemplarer. Angrebsgraden anslås tilnærmelsesvis ved det antal pupper, der findes i ulden under inspektion og bedømmes fra 0 til +++, dvs. ingen pupper til mange pupper.

30 Antallet af eksemplarer noteres for hvert får uden kendskab til behandlingsniveauer for at opnå en uvildig bedømmelse. Indledningsvis noteres eksemplarer som levende eller døde, men efterhånden som man opnår erfaring, kan nogle eksemplarer noteres som døende på grund af en ab-35 normt langsom adfærd.

Selv om der forekommer store variationer i det

O

49

DK 165461 B

antal eksemplarer, der findes på fåret, viser'de data, der er anført i tabel XVII nedenfor, at LL-F28249a er effektiv mod M. ovinus, og at midlet har systemisk ek-toparasiticid aktivitet. Hos behandlede dyr reduceres 5 antallet af levende eksemplarer effektivt, og antallet af døde eksemplarer forøges hos de med intramuskulær injektion behandlede får.

Tabel XVII

10 Midlet F28249a's effektivitet mod Melophaqus ovinus hos får

Dosis Indgifts- Gen.snl. antal eksemplarer5^ mg/kg vej_Levende_Døde_% '1,0 Intramusk. 1,67 1,67 78,22 15 0,2 Intramusk._1,00_4,33_86,96 1,0 Oral 7,67 0,0 0,0 0,2 Oral 2,67 3,0 65,0 0,1_Oral_22,0_1,67_0,0

Kontrol - 7,67 0,67 - 20 __ a) Tre får pr. dosis b) Effektivit % = - inn y Gensn.antal hos kontr. - gensn.antal’ hos beh.

Gensn.antal hos kontr.

25

Eksempel 12

Insekticid aktivitet hos LL-F28249 a og γ

Den insekticids aktivitet hos LL-F28249 α og γ mod en række forskellige insekter ved forskellige koncentrationer af aktivt stof i acetone/vand-opløsninger bestem-30 mes ved hjælp af i-pigende insekticide prøveeksemplar. Resultaterne af disse prøver findes i tabel XVIII.

(A) Heliothis virescens, æg af tobaksknoporm. Et ungt bomuldsblad ca. 7-8 cm langt dyppes og bevæges i en 35 Λ prøvesuspension i 3 sek. Æg samles på osteklæde, som er skaret i kvadrater på 10-20 mm indeholdende ca. 50-100 æg (6-30

O

50

DK 165461 B

timer gamle). En kvadrat osteklæde med æg dyppes også i prøvesuspensionen og anbringes på det behandlede blad. Kombinationen anbringes i en "Dixie®-skål nr. 2168-ST" (240 ml, 6 cm høj, øverste diameter 9,5 cm, bunddiame-5 ter 8 cm) indeholdende 5 cm fugtig dentalvæge. Et klart plastlåg lægges på skålen, og behandlingerne pågår i 3 dage, før der foretages optælling af døde eksemplarer.

(B) Aphis fabae,.blandede stadier, bedelus. Potter indeholdende en enkelt nasturtium-plante (Tropaeolum sp.) 10 ca. 5 cm høj smittes med ca. 100 bladlus en dag før prøven. I et skab sprøjtes hver plante med prøvesuspensionen 2 omdrejninger af en drejeskive ved 4 omdr./min. méd en "nr. 154 DeVillbus"-forstøver. Potterne sættes til side på hvide emaljerede bakker og opbevares i 2 dage.

15 Herefter foretages et skøn af antallet af døde Bladlus.

(C) Empoasca abrupta, voksen kartoffelcikade.

Et Sieva limabønneblad ca. 5 cm langt dyppes og . bevæges i prøvesuspensionen i 3 sekunder og anbringes derpå i et skab for at tørre. Bladet anbringes i en 20 100 x 10 mm petriskål indeholdende fugtigt filtrerpapir i bunden af skålen. Der tilføres 10 voksne eksemplarer til hver skål, og behandlingerne foregår i 3 dage, hvorefter der foretages tælling af døde eksemplarer.

(D) Trichoplusia ni, tredje stadiums larver af kålmåler.

25 Blade af en Sieva-limabønneplante udfoldet til 7-8 cm's længde dyppes og bevæges i en prøvesuspension i 3 sekunder og anbringes derpå i et skab for at tørre. Et blad udskæres derpå og anbringes i en 100 x 10 mm petriskål indeholdende fugtigt filtrerpapir i bun- 30 den, og der anbringes 10 3.stadiums larver derpå. Skålen opbevares i 3 dage, før der foretages observationer med hensyn til dødelighed og reduceret fødeindtagelse.

(E) Spodoptera eridanis, 3.stadiums larver af hærorm.

Bladene fra en Sieva limabønneplante udfoldet 35 til 7-8 cm's længde dyppes og bevæges i prøvesuspensionen i 3 sekundér og anbringes i et skab for at tørre.

O

51

DK 165461 B

Derpå udskæres et blad og anbringes i en 100 x' 10 mm petriskål indeholdende fugtigt filtrerpapir i bunden, og der tilføres 10 larver i 3. stadium. Skålen opbevares i 5 dage, før der foretages observationer med hen-5 syn til dødelighed, reduceret fødeindtagelse eller eventuel forstyrrelse af normalt hamskifte.

(F) Heliothis virescens, larver i 3. stadium.

Bomuldskimblade dyppes i prøvesuspensionen og anbringes i et skab for at tørre. Kimbladet skæres i 10 4 dele, og hver del anbringes i et 30 ml plastmedicin- bæger indeholdende et stykke på 5-7 mm fugtig dentalvæge. Der tilsættes en larve i 3. stadium til hvert bæger, og der lægges et paplåg over bægeret. Behandlinger opretholdes i 3 dage, før der foretages optælling 15 af døde eksemplarer og skøn af reduceret fødeindtagelse.

(G) Musca dornestica, husflue.

Den ønskede koncentration af prøveforbindelsen tilsættes til standard CSMA-lucerneklid-larvemedium.

Husflueæg, 0-4 timer gamle, tilsættes til det behand-20 lede medium. Det behandlede medium opbevares, og der foretages observationer med hensyn til ægklækning, larvevækst og fremkomst af vbksne eksemplarer.

(H) Tribolium confusum. Melbiller fås fra laboratoriekolonier opdrættet på en blanding af hel 25 hvede og hvidt mel. Til denne prøve behandles hvidt mel med en acetoneopløsninu af prøvematerialet, idet der anvendes 1 ml opløsning pr. 5 a mel i en 30 ml krukke med bred åbnincr. Acetonen af dampes i et skab natten over. Indholdet omrøres med en spatel for at 30 udrøre klumper, der er dannet af orøveopløsningen.

Krukken anbringes derpå på en "Vortes-Genie"' vibrationsblandemaskine, så at prøvematerialet blandes om-hvggeligt i foderet. 10 voksne eksemplarer anbringes i hver krukke, og der lægges løst låg på krukken.

35 Efter 5 dage til æglægning fjernes insekterne, og e-~ ventuel dødelighed noteres. 2 og 4 uger efter den ind-

O

52

DK 165461 B

ledende smitning foretages observationer vedrørende antal og spor frembragt af udviklende larver gennem det behandlede mel. Sådanne iagttagelser viser forsinket vækst, dræbte æg eller larver eller eventuel 5 anden forstyrrelse i det normale vækstmønster. Efter o ca. 9 uger ved 27 C kommer de voksne eksemplarer frem, og de sidste observationer foretages ved at lade indholdet af hver krukke passere gennem en 50 mesh sigte.

Disse observationer omfatter antallet af voksne, pup-10 per og larver samt undersøgelse af affald, som ikke passerer gennem sigten, for at bestemme, om der findes døde æg eller nyklækkede.

(I) Tetranychus urticae (P-resistent stamme) Sieva-limabønneplanter med primære blade ud- 15 foldet til 7-8 cm udvælges og skæres tilbage til en plante pr. potte. Der skæres et lille stykke af et blad taget fra hovedkolonien og anbringes på hvert blad på prøveplanterne. Dette gøres ca. 2 timer før behand-ling^ for at miderne får tid til at flytte over på prø-20 veplanten og lægge æg. Størrelsen af det udskårne stykke varieres, så at der fås ca. 100 mider pr. blad.

På behandlingstidspunktet fjernes bladstykket, der blev brugt til at overføre miderne, og kasseres. De med mider smittede planter dvooes οσ bevæces i Drøvetilbe-25 rednincen i 3 sekunder οσ anbrinaes i et skab for at tørre. Planterne opbevares i 2 dage, før der foretages et skøn over voksne dræbte eksemplarer ved hjælp af det første blad. Det andet blad bliver på planten i endnu 5 dage, før der foretages observationer af dræbte æg 30 og/eller nyligt udviklede nymfer.

(J) Spodoptera eridania, hærorm i 3. stadium, systemisk prøve med nedskåret stilk.

Forbindelsen tilberedes som en emulsion indeholdende 0,1 g prøvemateriale, 0,1 g polyethoxyleret 35 vegetabilsk olie i 0,4 g vand, 10 ml acetone og 90 ml vand. Dette fortyndes ti gange med vand, hvilket gi-

O

53

DK 165461 B

ver den 100 ppm-emulsion, der skal anvendes til prøven. Sieva-limabønneplanter med netop udfoldede primærbla-de anvendes til denne prøve. Disse blade skæres af mindst 2,5 cm over jordniveau for at undgå forurening 5 med jordbakterier, der kan få stilken til at rådne under prøven. De åf skårne' stilke anbringes i prøveemulsionen. Efter 3 dages optagelse afskæres bladet og anbringes i en 100 x 10 mm petriskål indeholdende fugtigt filtrerpapir i bunden og 10 larver i 3. sta-10 dium. Der foretages optælling af døde eksemplarer og skøn af reduceret fødeindtagelse efter 3 dages forløb.

(K) Thrips palmi

Svæirt angrebne blade af bomuldsfrøplanter sprøjtes under markbetingelser med de ønskede koncen-15 trationer. Antallet af thrips tælles før og efter sprøjtning. Bekæmpelsen i procent er baseret på disse tællinger.

(L) Tetranychus urticae (P-resistent stamme)

Forbindelsen oparbejdes som en emulsion inde- 20 holdende 0,1 g prøvemateriale, 0,1 g polyethyleret vegetabilsk olie i 0,4 g vand, 10 ml acetone og 90 ml vand.

Dette fortyndes 10 gange med vand, hvilket giver en 100 ppm emulsion til prøven. Sieva-limabønneplanter med lige udfoldede primærblade anvendes til prøven. De af-25 skæres mindst 2,5 cm over jordbundsniveau for at undgå forurening med jordbakterier, som kan få stilken til at rådne under prøven. De afskårne stilke anbringes i prøveemulsionerne. Hvert blad smittes med ca. 100 voksne mider og opbevares i 3 dage, hvorefter dødeligheden op-30 tælles.

35 54

DK 165461 B

^ * * o

•P TI, I I O I

W -Η H

& * 5 . .

i ΰ ί' 1 s 6 co Q) ft <D o o o o T5 l o o o σι

•H ri H i—I

T) S

Φ £ ω t7> ft -d -Η -Η E ro <n η ft Λ σι oo i il I β s ^ 5-1

dP I <1) O O

I <D > O O I II

•H W J3 M rH iH

? ri m

*P K ^ H

+>

•H · rH

> 4-1 Q) •H C \ -P O tT> Q) O f-' ^ U O g- o i σ i i • Φ 3 r8 ^ g & Ή ft (o

H U E-< H

H +3 fe "e| ft ft *ln o o o & £) in t n i cm H tn w ro I 0 rd Q) ω fl) E-t Ti -H to o o o

O Ή, *8 1 ' S HH U

-p < tp ω o ro ro λ:

Sh ft _ oo oo ω

(D ή tn i o o o C

-H > $ rHH i—i ω

U) (D

- · · * * ω

>- H ft o o o oo <D

• o ο ·η o o o in ω

H4 00 k* H i—I H rH

CM 0) co , tn cm · tK ro

1 Ό · o o o o -P

fe Q Ό O I VD H1 ft

ft ft H O

tn co ro ω 0 %

- λ * V

B U O O -H

O -Η -H O O I II -P

T ft β Η H C

cm eh ro CO w

CM

i · „ ω

fe o g o o o o o T

c: ft o o o o o c O ft O ro rH OH 0) fe Η Η ω

•H

a a a >- >- i σι σι σι σι σι ro C Ί Μ> TJ 'd4 Η4 0)

-H <D CM CM CM CM CM TJ

Λ n oo co co oooo & ft H CM CM CM CM CM fe £>8|jl|xjfe fe [il *

Claims

DK 165461 B Biologisk ren kultur af mikroorganismen Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus LL-F28249 med deponeringsnummeret 5 NRRL 15773.