DK153799B - Maltogen amylase, fremgangsmaader til fremstilling deraf samt plasmid til anvendelse ved dens fremstilling - Google Patents

Description

1 DK 153799 B

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt maltogen amylase, fremgangsmåder til dens fremstilling samt plasmid til anvendelse ved dens fremstilling.

5 Beta-amylaser er maltogene exo-amylaser, der hy drolyserer alfa-1,4-glycosidiske bindinger fra den ikke-reducerende ende af amylose, amylopektin eller glycogen, hvorved der fås beta-formen af maltose. Beta-formen af maltose vil i vandige opløninger isomerisere spontant til en 10 blanding af alpha- og beta-formen.

Beta-amylaser kan anvendes til fremstilling af maltoseholdige sirupper til anvendelse i konfekture-, bageri- og bryggeriindustrier.

Beta-amylaser er blevet isoleret fra forskellige 15 planter og mikroorganismer (W.M. Fogarty og C.T. Kelly,

Progress in Industrial Microbiology, vol. 15, s. 112 - 115, 1979). Beta-amylaser kendt fra planter (byg, sødkartofler og sojabønner) og fra Bacillus-arterne B. mycoides, B. megate-rium og B. polymyxa er alle enzymer, hvis aktivitet inhibe-20 res af sulfydrylreagenser, f.eks. PCMB (parachlormercuriben-zoat), hvilket indicerer, at det aktive sted involverer en SH-gruppe.

Der er hidtil kun beskrevet en beta-amylase, som ikke inhiberes af PCMB, nemlig en beta-amylase fremstillet 25 ud fra Bacillus circulans (U.S.A. patentskrift nr.

4.001.136). Denne B. circulans beta-amylase er mere thermo-stabil end de ovenfor nævnte beta-amylaser. Den inaktiveres imidlertid hurtigt ved og over 65°C.

Ved en fremgangsmåde til fremstilling af maltose, 30 hvor stivelse i et vandigt medium hydrolyseres af en beta-amylase, er det imidlertid fordelagtigt at anvende en procestemperatur på ca. 60 - 70°C for at modvirke retrogradering og for at undgå mikrobielle infektioner.

Den ovennævnte Bacillus circulans beta-amylase er 35 derfor mindre velegnet til kommerciel brug ved ca. 65 - 70°C

p.g.a. en for hurtig deaktivering.

2 DK 153799B

I U.S.A. patentskrift nr. 3.804.715 beskrives en varmeresistent beta-amylase, der ekstraheres fra hvedeklid som beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.130.398. Denne beta-amylase er imidlertid mindre attraktiv ved en kommer-5 cielt proces i sammenligning med et enzym fremstillet fra en bakteriel kilde, fordi sidstnævnte kan fremstilles i større skala med forholdsvis lave omkostninger sammenlignet med omkostningerne for en beta-amylase af vegetabilsk oprindelse .

10 Der eksisterer derfor et behov for et effektivt mikrobielt maltogent amylasepræparat, der er tilstrækkeligt thermostabilt til at kunne anvendes ved 65 - 70°C i tilstrækkelig lang tid til at tillade hydrolyse af stivelse på en økonomisk måde.

15 Opfindelsens formål er at tilvejebringe en hidtil ukendt mikrobiel maltogen amylase, der ikke inaktiveres af sulphydrylreagenser, såsom PCMB, og desuden har en højere thermostabilitet sammenlignet med hidtil kendte mikrobielle beta-amylaser.

20 Den foreliggende opfindelse er baseret på den overraskende erkendelse, at et hidtil ukendt ekstracellulært maltogent enzym (C599-amylase) med sådanne gode egenskaber kan fremstilles fra en hidtil ukendt mikroorganisme, der hører til Bacillus stearothermophilus-komplekset.

25 Til bedre forståelse af den foreliggende opfindelse og den følgende beskrivelse henvises til tegningen, på hvilken fig. 1 grafisk illustrerer den relative aktivitet af det maltogene amylaseenzym mod temperaturen, 30 fig. 2 grafisk illustrerer den relative aktivitet mod pH, og fig. 3 viser restriktions endo-nuclease-spaltningskortet for det hidtil ukendte plasmid pDN452.

Ifølge sit første aspekt angår den foreliggende opfindelse en termostabil maltogen amylase, som er ejendom- 35

3 DK 153799B

melig ved, at den har et temperaturoptimum (målt ved 30 minutters reaktionstid i acetatpuffer (0,1 M)) ved pH 5,5 på ca. 60°C, et pH-optimum ved ca. 60°C i området fra 4,5 til 6 (bestemt i en MC Ilvaine puffer ved 30 minutters 5 reaktionstid), en restaktivitet efter 60 minutter ved 70°C (i acetatpuffer (0,1 M) ved pH 5,5) på mindst 75%, spalter maltotriose kvantitativt i ækvimolære mængder maltose og glucose og kan fremstilles ved dyrkning af Bacillus NCIB 11837 i et egnet næringsmedium, der indeholder carbon- og 10 nitrogenkilder og uorganiske salte, og påfølgende isolering af den dannede amylase med de ovennævnte egenskaber fra kulturvæsken.

Det maltogene amylaseprodukt kan være i fast eller flydende form. I fast form har det sædvanligvis en aktivitet 15 på fra 500 - 25.000 E (defineret i det følgende) per gram.

Ifølge sit andet aspekt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af den ovennævnte maltogene, termostabile amylase, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en Bacillusstamme NCIB 11837 20 eller varianter eller mutanter heraf med væsentlig samme egenskaber som denne dyrkes i et passende næringsmedium, der indeholder carbon- og nitrogenkilder og uorganiske salte, hvorefter den maltogene amylase udvindes fra kulturvæsken.

Ved hjælp af DNA-rekombinant teknik er desuden det 25 gen, der koder for den hidtil ukendte termostabile, maltogene amylase, blevet overført i en anden mikroorganisme, der under passende dyrkningsbetingelser frembringer den maltogene amylase i væsentligt større mængder i sammenligning med hvad der kan opnås ved dyrkning af 30 donormikroorganismen NCIB 11837.

Den foreliggende opfindelse angår således ifølge sit tredje aspekt en fremgangsmåde til fremstilling af den ovennævnte maltogene amylase, som er ejendommelig ved, at en transformeret værtsstamme fra slægten Bacillus, til 35 hvilken det gen, der koder for den termostabile, maltogene amylase, er overført fra Bacillusstamme NCIB 11837, dyrkes i et passende næringsmedium, der indeholder carbon- og nitro-

4 DK 153799B

genkilder og uorganiske salte, efterfulgt af udvinding af den maltogene amylase fra kulturvæsken.

Et rekombinant plasmid, der indeholder genet, der koder for den termostabile, maltogene amylase kan fremstil-5 les ved spaltning af kromosomalt DNA fra Bacillus NCIB 11837, med et passende restriktionsenzym til opnåelse af en lineær DNA-sekvens, der indeholder det amylasekodende gen, spaltning af en passende vektor til opnåelse af en yderligere lineær DNA-sekvens og sammenføjning af de to lineære 10 DNA-sekvenser til opnåelse af et rekombinant plasmid, der indeholder amylasegenet.

Vektoren, fortrinsvis et E. coli plasmid, spaltes med et passende restriktionsenzym, som giver lineære DNA med ender, der kan sammenføjes med enderne af fragmenterne af 15 donor-DNA.

Sammenføjningen af de to lineære kilder for DNA-sekvenserne udføres ved hjælp af en ligase under anvendelse af velkendt teknik.

Ifølge en foretrukket udførelsesform for 20 fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse vælges værtsstammen fortrinsvis fra Bacillus subtilis.

Transformeringen af værtsstammen udføres på velkendt måde ved transformering af rekombinantplasmidet i E. coli-celler, identificering af stivelsesmiddelnedbrydende 25 transformanter og subkloning af rekombinantplasmidet fra sådanne Amy+-transformanter i den valgte værtsstamme.

Værtsstammen (der fortrinsvis ikke udviser amylaseaktivitet) kan efter erhvervelse af rekombinantplasmidet fremstille den hidtil ukendte maltogene amylase, når 30 stammen dyrkes i et passende dyrkningsmedium. Amylasen udskilles i vækstmediet, hvilket tilvejebringer et simpelt udvindingstrin.

Den foreliggende opfindelse angår også et plasmid til anvendelse i en Bacillusstamme ved fremstilling af den 35 her omhandlede maltogene amylase, og dette plasmid er ejendommeligt ved at det er et rekombinant plasmid, der indeholder det fra Bacillusstamme NCIB 11837 overførte gen,

5 DK 153799 B

der koder for den maltogene amylase samt en nucleotid sekvens, der sikrer replikation i en Bacillus subtilis vært. Denne sekvens er fortrinsvis ifølge opfindelsen plasmid pBD64 eller pUBllO eller derivater deraf med i det 5 væsentlige samme egenskaber. Et sådant plasmid kan fremstilles ved at spalte kromosomalt DNA fra Bacillus NCIB 11837 med restriktionsenzymet Mbol, isolering af DNA-fragmenter i området fra 4 - 12 kb (kilobasepar), sammenføjning med E. coli plasmid pACYC184, der er blevet spaltet med 10 restriktionsenzymet BamHl, transformering i E. coli celler, identificering af stivelsesnedbrydende transformanter, der indeholder plasmider med amylasegenet, spaltning af disse plasmider med restriktionsenzym Sau3Al, sammenføjning af det DNA-fragment, der udtrykker amylaseaktivitet, med plasmid 15 pBD64, der er blevet spaltet med restriktionsenzymet BamHl, og transformering af det nye rekombinante plasmid i B. subtilis .

Ifølge opfindelsen er plasmidet fortrinsvis pDN452 med det på tegningens figur 3 viste restriktionsendonucle-20 asespaltningskort. Plasmid pDN452 er et 7,6 kb hybridplas-mid, der indeholder den nukleotide sekvens af pBD64 og DNA sekvensen fra Bacillus NCIB 11837, der koder for den omhandlede amylase, indsat på BamHl-stedet i dette plasmid.

Den maltogene amylase ifølge opfindelsen er 25 velegnet til fremstilling af maltoserige sirupper, ved hvilken stivelsen behandles med den maltogene amylase i et vandigt medium.

Forsøg har vist, at den maltogene amylase er egnet til fremstilling af maltose og maltoserige sirupper. Sådanne 30 produkter har betydelig interesse til fremstilling af visse sukkervarer p.g.a. maltosens ringe hygroskopisitet, lave viskositet i opløsning, gode varmestabilitet og milde, ikke for søde smag.

Den industrielle fremstillingsproces for maltose-35 sirupper omfatter forflydning af stivelse, forsukring med et maltosedannende enzym, eventuelt suppleret med et enzym, der

6 DK 153799B

spalter.1,6-forgreningspunkterne i amylopektin, f.eks. en alfa-1,6-amyloglucosidase.

Skønt den her omhandlede amylase i mange henseender reagerer ligesom de kendte beta-amylaser 5 adskiller den sig fra disse på adskillige væsentlige punkter, hvilket fremgår af den efterfølgende detaljerede beskrivelse, og følgelig er det nye enzym blevet karakteriseret som en maltogen amylase, og ikke en beta-amylase.

Det nye enzym vandrer ved SDS-polyacrylamid-gel-10 elektroforese som et enkelt bånd svarende til en molekylvægt på ca. 70.000 Dalton. Det isoelektriske punkt er ved isoe-lektrisk fokusering i pladegel fundet til 8,5.

Enzymet hydrolyserer amylopektin, glycogen og amylose, idet maltose udgør den væsentligste del af reak-15 tionsprodukterne. Glucose dannes i små mængder svarende til 1 - 10% af den dannede maltose.

Fra forgrenede polysaccharider, såsom amylopektin og glycogen, danner enzymet grænsedextriner, som kan hydrolyseres med glycoamylase.

20 Sulphydrylreagenser, såsom para-chlor-mercuri- benzoat og chelatbindende reagenser, såsom EDTA har ingen indflydelse på enzymaktiviteten.

Den maltogene amylase ifølge opfindelsen adskiller sig fra de kendte beta-amylaser på følgende måde: 25 1. Den hydrolyserer Schardinger-cyclodextriner kvantitativt. Schardinger-beta-cyclodextrin hydrolyseres til maltose + glucose i et molært forhold på 3:1, medens alfa-cyclodextrin hydrolyseres til maltose + glucose i et molært forhold på 10:1. 'HNMR spektralanalyse af alpha-cyclo-30 dextriner inkuberet med den maltogene amylase viser en første dannelse af alpha-maltose som det første hovedprodukt.

2. Maltotriose spaltes kvantitativt i ækvimolære mængder maltose og glucose. 'HNMR spektralanalyse af 35 maltotriose inkuberet med den maltogene amylase viser, at hydrolyseproduktet er alpha-maltose + glucose.

3. Den er stabil i puffer ved 70°C.

7 DK 153799B

4. Grænsedextrinerne fra den maltogene amylase danner ikke farvede komplekser med I2~KI-reagenser. Den maltogene amylase ifølge opfindelsen er således et exoenzym, der angriber alpha-1,4-glycosidiske bindinger, idet 5 hovedhydrolyseproduktet er alpha-maltose.

Da der i de senere år har været en forøget interesse for maltoserige sirupper, der indeholder mere end 80% maltose, er evnen af den maltogene amylase ifølge den foreliggende opfindelse til at spalte maltotriose, der findes i 10 kendte maltosesirupper, kvantitativt i maltose og glucose yderst fordelagtig, fordi maltoseudbyttet herved forøges.

En mikroorganisme, der er i stand til at fremstille den maltogene amylase ifølge den foreliggende opfindelse blev udvalgt på grundlag af dens evne til at vokse på et 15 agarsubstrat fremstillet som følger:

Trypton (Difco) (10 g), amylopektin (CPC snowflake 10 g), Bactoagar (agar-agar) (Difco) (40 g) og ionbyttet vand (1000 ml) blev blandet aseptisk ved 55°C med en tilsvarende mængde af en saltopløsning med følgende 20 sammensætning: (.NH^^SO^ : 0,04 vægtprocent

MgS04, 7H20 : 0,1 -

CaCl2 : 0,04 - KH2P04 : 0,6 - 25 pH-værdien af saltopløsningen blev indstillet til 3,0 med 10 N svovlsyre.

Jordprøver indsamlet ved Krisuvik, et areal med varme kilder på Island, blev spredt på det ovennævnte agarsubstrat og inkuberet ved 65°C.

30 Efter 48 timers forløb blev agaroverfladen farvet med joddampe og en koloni, C599, der var omringet af en zone af ufarvet amylopektin blev isoleret.

Den isolerede koloni af C599 med underliggende agar blev inkuberet natten over med stivelse ved pH 4,5 ved 35 60°C og 70°C. En tyndlagschromtografisk undersøgelse afslørede, at maltose var hovedproduktet fra hydrolysen.

8 DK 153799B

Den isolerede mikroorganisme C599 blev deponeret hos The National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Scotland, den 15. marts 1983 og fik referencenummeret NCIB 11837.

5

Taksonomi

Den nyopdagede mikroorganisme er en aerob, stavformet og sporedannende bakterie. Den hører således til slægten Bacillus.

10 På agarsubstrater, hvor sporuleringen er dårlig, autolyserer kulturen hurtigt og dør. Det har derfor været umuligt at udføre det normale taksonomiske program til klassificering af Bacillusarter.

Morfologien og væksttemperaturen, der ligger mel-15 lem 50 og 70°C, indicerer, at den nye mikroorganisme tilhører Bacillus stearothermophilus-komplekset.

Morfologi

Sporerne er ovale ca. 1 x 1,6 μ og er anbragt 20 terminalt til subterminelt.

Sporangierne er stærkt opsvulmet og ligner ketche-re eller trommestikker.

Bestemmelse af enzymaktivitet 25 En maltogen amylaseenhed (E) defineres som den mængde enzym, der under standardbetingelser (temperatur 60°C, pH 5,5 og reaktionstid 30 minutter) frembringer reducerende sukker svarende til 1 μιηοΐ maltose per minut.

En 0,5% opløselig stivelse (fra Merck) i 0,1 M 30 acetatpuffer eller 0,05 M fosfatpuffer (pH 5) inkuberes med 1 ml af enzymet opløst i ionbyttet vand indeholdende 0,1 -0,2 E per ml. Reaktionen standses efter 30 minutters reaktionstid ved tilsætning af 4 ml 0,5 N NaOH.

Indholdet af reducerende sukker bestemmes ifølge 35 Somogyimetoden (Somogyi: J.Biol.Chem., 153, p. 375-80 (1944)).

9 DK 153799 B

En alternativ måde til at bestemme enzymaktiviteten på er baseret på evnen af den maltogene amylase til kvantitativt at spalte maltotriose i equimolære mængder maltose og glucose.

5 En maltogen amylase NOVO enhed (MANE) defineres som den mængde enzym, der under standardbetingelser spalter et μιηοΐ maltotriose per minut. Enzymreaktionen stoppes ved at ændre pH til ca. 11. Den dannede glucose omdannes ved hjælp af glucosedehydrogenase (Merck, GlucDH) til 10 gluconolacton under dannelse af NADH. Mængden af dannet NADH måles kolorimetrisk ved 340 nm.

Standardbetingelser: Temperatur 37°C ± 0.05°C

pH 5.0

Inkuberingstid 30 min.

15

Reagenser 1. 0,1 M citratpuffer, pH 5,0 5,255 g citronsyre (CgHg07, H20) opløses i ca. 200 20 ml demimeraliseret vand, og pH-værdien indstilles til 5,0 med 4,0/1,0 N NaOH. Der fyldes op med demineraliseret vand til 250 ml, og pH-værdien kontrolleres. Pufferopløsningen kan opbevares i en uge i køleskab (pH-værdien skal kontrolleres før anvendelse), men fremstilles fortrinsvis 25 hver forsøgsdag.

2. Maltotriosesubstrat 20 mg/ml

Til 500 (1000) mg maltotriose (Sigma M 8378) sættes citratpuffer (reagens 1) til 25 (50) ml. Skal 30 fremstilles hver dag.

3. GlucDH reagens

Enzymblanding, Merck nr. 14055 flaske "1" og "2", fyldes op med pufferopløsning, Merck nr. 14051. Efter 15 35 minutters henstand overføres flaskernes indhold til en 500 ml målekolbe, der indeholder ca. 200 ml puffer (Merck nr.

10 DK 153799B

14051), og yderligere puffer tilsættes til op til 500 ml.

Stabil 14 dage i køleskab.

4. Stopreagens 5 0,06 N NaOH.

Glucosestandardkurve 1,6 g glucose opløses i 1000 ml demineraliseret 10 vand og prøver på 1,0, 2,0, 4,0, 6,0 og 10,0 fortyndes op til 100 ml med demineraliseret vand. De opnåede 5 standardopløsninger har en glueosekoncentration på henholdsvis 88,8, 177,6, 355,2, 532,9 og 888,1 μιηοΐ/liter.

Glucosestandardkurven fremstilles ved at blande 15 2,0 ml af de ovennævnte glueosestandardopløsninger med 3,0 ml GlucDH-reagens og inkubering i 30 minutter ved stuetemperatur, hvorpå OD-^g måles. Som blindværdi anvendes en prøve med demineraliseret vand i stedet for glucose.

20 Enzymforsøgsprøve

Forsøgsprøverne fortyndes med demineraliseret vand, således at slutfortyndingen ligger indenfor det interval, der dækkes af standardkurven.

25 Assay

Til 500 μΐ enzym (foropvarmet til 37°C) sættes 500 μΐ maltotriosesubstrat (foropvarmet til 37°C), og blandingen anbringes efter omhyggelig blanding på et vandbad (37°C).

Efter 30 minutters reaktionstid fjernes forsøgsglasset fra 30 vandbadet, og der tilsættes 1000 μΐ stopreagens. Derpå tilsættes 3,0 ml GlucDH-reagens, og OD34g måles efter 30 minutters henstand ved stuetemperatur. Som blindværdi anvendes en prøve, der indeholder enzym, stopreagens og maltotriosesubstrat. Maltotriosesubstratet tilsættes ikke 35 før umiddelbart efter stopreagenset.

11 DK 153799 B

Enzymfremstilling

En Bacillusstamme, der er i stand til at fremstille den maltogene amylase ifølge opfindelsen propageres sædvanligvis på en fast substrat før den dyrkes under aerobe 5 betingelser i et egnet dyrkningsmedium. Begge medier indeholder assimilerbare carbon- og nitrogenkilder foruden uorganiske salte eventuelt sammen med vækstfremmende næringsstoffer, f.eks. gærekstrakt. Dyrkningen udføres typisk ved 50 - 55°C og ved pH 6,5, der fortrinsvis holdes konstant ved 10 hjælp af automatiske hjælpemidler. Enzymet udskilles i mediet.

Den resulterende fermenteringsvæske kan befries for bakterieceller og bakterierester sammen med andre faste stoffer ved f.eks. filtrering. Supernatanten indeholdende 15 enzymet kan yderligere klares, f.eks. ved filtrering eller centrifugering, hvorefter den eventuelt koncentreres ved eksempelvis ultrafiltrering eller i en inddamper under formindsket tryk. Det resulterende koncentrat kan om ønsket omdannes til tørhed, f.eks. ved lyophilisering eller sprøj-20 tetørring. Det fremkomne rå enzymprodukt udviser typisk en aktivitet i området fra ca. 500 - 25.000 E per gram.

Oprensning af enzymet

Den maltogene amylase ifølge opfindelsen kan op-25 renses fra en kulturvæske fra en batchgæring på følgende måde: 250 liter af kulturvæsken med en enzymaktivitet på 4 E per ml filtreres, og filtratet ultrafiltreres, kimfiltreres og frysetørres. Der fås 193 g frysetørret pulver med 30 en aktivitet på 2400 E per g svarende til 47% af den oprindelige aktivitet.

Pulveret opløses i 15 mM acetatpuffer, pH 5,0 og dialyseres mod 15 mM acetatpuffer pH 5,0, indtil ledningsevnen er ca. 1 mS. Dialysatet overføres derpå til en kation-35 bytter CM-sepharose C1-6B® (Pharmacia Fine Chemicals), der er ækvilibreret med den samme puffer. Amylasen passerer

12 DK 153799 B

gennem kolonnen, mens 60% af de resterende proteiner fastholdes af ionbytteren.

pH-værdien af gennemløbet fra denne kolonne indstilles til 4,0 med eddikesyre, og eluatet tilsættes derpå 5 til en CM-sepharose C1-6B® kolonne, der er ækvilibreret med 15 mM acetatpuffer pH 4,0. Under disse omstændigheder adsorberes amylasen af ionbytteren. Enzymet elueres derpå med acetatpuffer pH 4,0 med stigende ionstyrke. Enzymaktiviteten i eluatet følger proteinindholdet i en symmetrisk top.

10 Topmaterialet udviser et enkelt skarpt proteinbånd ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Molekylvægten er ca.

70.000 Dalton, pi er ca. 8,5 bestemt ved isoelektrisk fokusering i pladegel. Den specifikke aktivitet er 325 MANE/mg protein af det krystalliserede, genopløste og 15 frysetørrede produkt.

Immunologiske egenskaber

Monospecifik antiserum blev fremstillet ved immunisering af kaniner med renset maltogen amylase ifølge meto-20 den beskrevet af N.H. Axelsen et al., A Manual og Quantitative Immunoelectrophoresis (Oslo 1973), kap. 23.

Krydset immunelektroforese ifølge den samme forfatter af rå C599-amylase mod dette serum gav en enkelt top af immunoprecipitat, hvilket bekræfter monospecificiteten af 25 antiseraet.

Enzymkemiske egenskaber

Sammenhængen mellem aktiviteten af den maltogene amylase ifølge opfindelsen og pH og temperatur blev bestemt 30 på den ovenfor beskrevne metode under anvendelse af en reaktionsblanding, i hvilken pH og temperatur blev indstillet til forudbestemte værdier.

Opfindelsen skal forklares nærmere, idet der igen henvises til tegningen, på hvilken 35 Fig. 1 grafisk illustrerer den relative aktivitet afsat mod temperatur (substrat 4% opløselig stivelse, pH 5,5 (0,1 M acetat), 30 minutters reaktionstid), og

13 , DK 153799B

Fig- 2 grafisk illustrerer den relative aktivitet afsat mod pH (temperatur 60°C, substrat 2% opløselig stivelse, 30 minutters reaktionstid, MC Ilvaine puffer).

Det fremgår af tegningen, at den maltogene amylase 5 har et aktivitetsoptimum ved pH 5,5 på ca. 60°C, og at dens pH optimum er i området fra 4,5 - 6,0. Mere end 50% af den maksimale aktivitet findes stadig ved 80°C.

For at bestemme termostabiliteten af det maltogene enzym blandes enzympræparatet, 1500 E/g, med 0,1 M acetat-10 puffer (150 mg/ml) med pH 5,5 ved en temperatur på henholdsvis 50°C, 60°C og 70°C. Den resterende amylaseaktivitet blev bestemt på den ovenfor beskrevne måde. Resultaterne fremgår af den følgende tabel.

Tabel I

v

14 DK 153799B

Temperatur Tid, min. Procent restaktivitet 5 0 100 15 100 50 30 100 60 100 10 - . ΤΐΓΟ ' 15 100 60 30 100 60 100 15 0 100 15 90 70 30 80 60 75 20

Efter 60 minutter ved 70°C er 75% af enzymaktiviteten bevaret. Ingen af de hidtil kendte beta-amylaser udviser en så god termostabilitet.

Indflydelsen af forskellige reagenser på 25 aktiviteten af den maltogene amylase ifølge opfindelsen fremgår af den efterfølgende Tabel II.

Tabel II

15 DK 153799 B

Inhibering af amylasen ifølge opfindelsen 5

Inhibitorer Restaktivitet efter 60 min.

ved stuetemperatur, % ______ _ 100 ' ~ 10 PCMB, ImM 92 EDTA, ImM 104

Schardinger-alfa-cyclo- dextrin, 1% 109

Schardinger-beta-cyclo- 15 dextrin, 1% 107

CaCl- ImM 85 lOmM 73 KC1 ImM 95 lOmM 94 20 MgCl- ImM 95 lOmM 93

CoCl9 ImM 91 lOmM 44

FeCl-, ImM 96 25 lOmM 74

MnCl~ ImM 78 lOmM 52

NaCl ImM 98 lOmM 96 30 CuCl~ ImM 10 lOmM 1

ZnCl- ImM 51 lOmM 15

BaCl„ ImM 98 35 1 lOmM 92 A1C1- ImM 98 J lOmM 84

HgCl~ 0,ImM 3

ImM 0 40 ___________

16 DK 153799 B

Tungmetalioner såsom Hg++ og Ca++ inhiberer aktiviteten af amylasen, medens hverken PCMB, EDTA eller Schardinger-cyclodextriner har nogen effekt på aktiviteten.

5

Kloning af det maltogene amylasegen fra Bacillus NCIB 11837

Som beskrevet i yderligere detaljer i det følgende kan det maltogene amylasegen klones og udtrykkes i B. subtilis på følgende måde.

10 Kromosomalt DNA fra Bacillus NCIB 11837 nedbrydes delvist med restriktionsenzymet Mbol (Biolabs Cat. No. 147). Fragmenter i området fra 4 - 12 kb isoleres og sammenføjes (med DNA ligase (Biolabs Cat. No. 202)) med E. coli plasmid PACYC184 (Chang et al., J.Bacteriol. 134, 1141 - 56, 1978), 15 der er blevet spaltet med restriktionsenzym BamHl (Biolabs Cat. No. 136).

Plasmid pACYCl84 udviser resistens mod både tetra-cyclin og chloramphenicol og indeholder et enkelt restriktionssted for restriktionsenzymet BamHl. Indføring af DNA i 20 BamHl-stedet ødelægger evnen til at udvise resistens mod tetracyclin, men ikke mod chloramphenicol.

Den ligerede blanding transformeres i kompetente E. coli-celler. De transformerede celler udspredes på et passende selektionsmedium, der indeholder opløselig stivelse 25 og chloramphenicol. Chloramphenicol-resistente transforman-ter, der indeholder et klonet fragment i BamHl-stedet, identificeres ved at være tetracyclinfølsomme. Blandt disse transformanter identificeres transformanter udvisende amyla-seaktivitet ved hjælp af den lyse zone rundt om sådanne 30 kolonier, når den stivelsesholdige agar udsættes for joddamp. En sådan transformant indeholder et første rekombinant plasmid, der indeholder et gen kodende for den hidtil ukendte maltogene amylase.

Plasmid pBD64 (et derivat af Staphylococcus aureus 35 plasmid pUBllO (Gryczan et al., J.Bacteriol. 141, 246 - 53, 1980)) anvendes til subkloning i B. subtilis. pBD64 er i

17 DK 153799B

stand til at repliceres i B. subtilis og udviser resistens mod kanamycin og chloramphenicol.

pBD64 spaltes med BamHl og sammenføjes med det ovenfor beskrevne første rekombinant plasmid, der er delvist 5 spaltet med Sau3Al (Biolabs Cat. No. 169). Denne subkloning udføres fortrinsvis ved hjælp af den såkaldte rescueteknik (Gryczan et al., Mol.Gen.Genet. 177, 459 - 67, 1980) under anvendelse af en amylase-negativ B. subtilis-stamme, indeholdende plasmid pUBllO, et plasmid fra Staphylococcus 10 aureus, som kan transformeres ind i B. subtilis.

Transformerede celler af den pUBllO-indeholdende B. subtilis-stamme udspredes derpå på et egnet selektionsmedium indeholdende opløselig stivelse og chloramphenicol.

En Amy+ transformant indeholdende et andet rekom-15 binant plasmid identificeres som ovenfor, og plasmidet fra denne transformant isoleres og transformeres ind i en amylase-negativ B. subtilis, der ikke indeholder pUBllO.

Transformerede celler udspredes derpå på et egnet selek-. . + txonsmedium, og Amy transformanter indeholdende det oven-20 nævnte andet rekombinantplasmid identificeres. Dette rekom-binantplasmid kan derpå transformeres ind i en egnet vært, f.eks. en B. subtilis.

Opfindelsen skal forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

25

Eksempel 1

Fremstilling af maltogen amylase fra Bacillusstamme NCIB 11837 30 NCIB 11837 kulturen blev dyrket ved 60°C i 1 - 2 dage på følgende agar:

Bactodextrose (glucose) (Difco) 2 g Bactoagar (agar-agar) (Difco) 25 -Ammonium-sulfat 0,5- 35 Spormetaller* 3 ml pr liter agar (NH4)2S04 0,5 g

Vand 1000 ml

18 DK 153799 B

*Spormetaller: H^BO^ 500 mg

CuS04 40 -

Kl 100 -

FeCl3 200 - 5 MnS04 400 -

ZnS04 400 -

Na-molybdat 200 -Ionbyttet vand 3000 ml 10 Forkultur

En frysetørret kultur fra det ovennævnte vækstmedium blev propageret i 500 ml rystekolber i 100 ml af følgende substrat: 15 Trypton (Difco) 10 g

Glucose 10 -

Kaliumhydrogenphosphat 3 -

Vand 1000 ml 20 Inkuberingen blev udført i 1 - 2 døgn ved 50 - 55°C.

a) Batchgæring 500 ml rystekolber blev forsynet med 100 ml af et 25 substrat med følgende sammensætning:

Trypsinnedbrudt casein (Sheffield) 10 g Gærekstrakt (Bacto) 5 -

Kaliumhydrogenphosphat 3 - 30 Maltodextrin 10 g

Vand 1000 ml

Rystekolberne blev podet med 1 - 5 ml af den ovennævnte forkultur. Der blev inkuberet ved 50°C i 2 - 3 døgn.

35 Den resulterende kulturvæske indeholdt ca. 10 - 20 E/ml.

Opformering fra rystekolber til 550 liter ståltanke kan udføres trinvis ved at forøge rumfanget af kulturvæs-

W DK 153799B

ken med en faktor fra 3 - 5 i hvert trin. I en 550 liter skala var udbyttet ca. 5 E per ml.

b) Kontinuerlig gæring 5 Kontinuerlig gæring blev udført med TMP- og SMP- substrater med følgende sammensætning: TMP-substrat: Trypton (Difco) 30 g

Maltodextrin (MC03L, amylase-10 hydrolyseret majsstivelse) 20 -

Kaliumhydrogenphosphat 3 -

Pluronic® 0,5-

Vand 1000 ml 15 SMP-substrat: Hydrolyseret sojaprotein (Difco) 20 g

Maltodextrin 10 -

Kaliumhydrogenphosphat 3 -

Pluronic® 0,5- 20 Vand 1000 ml Gæringen blev udført i en Eschweiler gæringstank af typen S 10 med et arbejdsvolumen på 1 liter.

Gæringer blev startet op med 100 ml af den oven-25 nævnte forkultur, og substratdoseringen blev startet efter 24 timer ved 55°C. pH-værdien blev indstillet til 6,5 med 3% svovlsyre, og temperaturen blev holdt ved 55°C.

Beluftning: 1 liter/liter substrat/minut 30 Omrøring: 1000 rpm

Fortyndingshastighed: D = 0,05 hr ^

Under de ovenfor nævnte betingelser var aktivitetsudbyttet 50 - 75 E per ml på TMP og 40 - 50 E per ml på 35 SMP.

Eksempel 2

20 DK 153799 B

Kloning af det maltogene amylasegen fra Bacillus NCIB 11837 til B. subtilis 5 A. Mikroorganismer og plasmider

Alle Bacillus subtilisstammerne var derivater af B. subtilis 168, (Spizizen, Proc.Natl.Acad.Sci. 44, 1072 -78, 1958).

10 DN304: aroI906 sacA321 amy er en Met"1" transfor mant af QB1133 (Steinmetz et al., Mol. Gen. Genet 148, 281 -85, 1976) og er blevet deponeret ved National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station Aberdeen,

Scotland, d. 7. marts 1984 med referencenummeret NCIB 11957.

15 DN314 er DN304 pUBllO og DN311 er DN304 pBD64. Plasmiderne pUBHO og pBD64 (Gryczan et al., J. Bacteriol. 134, 318 -329, 1978 og Gryczan et al., J. Bacteriol. 141, 246 - 53, 1980) blev isoleret henholdsvis fra B. subtilis stammerne BD366 og BD624. pUBllO og pBD64 udviser begge resistens mod 20 kanamycin og pBD64 også mod chloramphenicol. B. subtilis stammerne 168, QB1133, BD366 og BD624 kan fås fra Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, Ohio, USA (stammedeponeringsnummer henholdsvis, BGSC1A1, 1A289, 1E6 og 1E22).

Alle Escherichia coli stammer var derivater af E.

25 coli K-12. E. coli nr. 802 met r- m+ gal lac (Wood, J.Mol.Biol. 16, 118-33, 1966) og E. coli MC1000: (ara- leu) 7697 ara D139 lac x 74 gal K gal U StrA (Casadaban et al., J.Mol.Biol., 138, 179 - 207, 1980) indeholdende plasmid pACYCl84 (Chang et al., J.Bacteriol. 134, 1141 - 56, 30 1958) er begge blevet deponeret d. 7. marts, 1984 og fik deponeringsnumrene NCIB 11958 henholdsvis NCIB 11956.

B. Transformering af E. coli

En kultur af E. coli K-12 stamme nr. 802, der var 35 opbevaret natten over i LB (10 g Bactotrypton, 5 g Bacto gærekstrakt og 10 g NaCl per liter vand, pH 7,0) blev fortyndet 100 gange i 500 ml LB og dyrket ved 37°C til OD^q

2i DK 153799 B

= 0,4. Kulturen blev afkølet, anbragt 15 minutter på is, centrifugeret i 15 minutter ved 3000 rpm (i en Sorvall GS3 rotor), resuspenderet i 200 ml kold 0,1 M CaCl2, anbragt på is i 20 minutter, centrifugeret i 10 minutter ved 3000 rpm, 5 resuspenderet i 5 ml kold 0,1 M CaCl2 og anbragt på is i 20 timer. Derpå blev der tilsat kold glycerol til et indhold på 10%, og prøver blev frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -70°C. Frosne celler blev optøet på is, DNA blev tilsat, blandingen blev inkuberet i 45 minutter på is, i 2 minutter 10 ved 37°C og blev derpå udspredt på et egnet selektionsmedium.

C. Transformering af Bacillus subtilis

Kompetente Bacillus subtilis-celler blev fremstil-15 let ifølge Yasbin et al. (J. Bacteriol. 121, 296 - 304, 1975). Cellerne blev høstet ved centrifugering (7000 rpm, 3 minutter), resuspenderet i en tiendedel rumfang af superna-tanten omfattende 20% glycerol, frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -70°C. Til transformering blev cellerne 20 optøet ved 42°C og blandet med et rumfang puffer (Spizizen's minimal medium (Spizizen, Proe. Haiti. Acad. Sci. USA 10, 72 - 78, 1958) med 0,4% glucose, 0,04 M MgCl2 og 0,002 M EGTA). DNA blev tilsat, og blandingen blev inkuberet under omrystning ved 37°C i 20 minutter. Cellerne blev derpå 25 udspredt på et egnet selektionsmedium.

D. Fremstilling af plasmid pACYCl84 fra E. coli E. coli K-12 stamme MC1000, der indeholder plasmid PACYC184, blev dyrket natten over i 250 ml LB, 0,4% glucose 30 og 20 μg/ml chloramphenicol. Cellerne blev høstet ved centrifugering og resuspenderet i 4 ml puffer 1 (0,025 M Tris HC1, pH = 8,0, 0,01 M EDTA, 0,05 M glucose, 2 mg/ml lysozyme). Suspensionen blev inkuberet ved 0°C i 15 minutter og derpå blandet med 8 ml puffer 2 (0,2 M NaOH, 1% SDS).

35 Derpå blev der tilsat 6 ml puffer 3 (3M Naacetat, pH = 4,8), blandingen blev henstillet ved 0°C i 60 minutter og derpå centrifugeret i 20 minutter ved 19.000 rpm (ca. 45.000 g i

22 DK 153799B

en Sorvall SS34 rotor). Supernatanten blev udfældet med 0,6 rumfang kold isopropanol og resuspenderet i 1,2 ml 5TE (0,05 M Tris HCl, pH = 8,0, 0,005 M EDTA)og 20 μΐ kogt RNase A (Boehringer) (2 mg/ml). 30 minutter senere blev opløsningen 5 anbragt ovenpå 4,0 ml puffer 4 (80 g CsCl plus 56 ml 5TE) og 0,1 ml EtBr (ethidiumbromid) i et VTi65 glas. Blandingen blev centrifugeret ved 45.000 rpm i 20 timer. Plasmidet blev derpå udvundet fra glasset, dialyseret og ekstraheret som beskrevet i sektion G.

10 E. Fremstilling af plasmid pBD64 fra Bacillus subtilis DN311

Plasmidet blev fremstillet som beskrevet for E. coli stammer (se sektion D), men med følgende modifikatio-15 ner. Vækst blev foretaget i LB indeholdende 0,01 M kalium-phosphat, pH = 7,0 og 6 pg/ml chloramphenicol. Efter høst, blev cellerne inkuberet ved 37°C med lysozym. Puffer 2 blev erstattet en blanding af 1 rumfang puffer 2 og tre rumfang puffer 5 (0,2 M glycin, 0,2 M NaCl og 1% SDS). De følgende 20 trin var de samme som i D.

F. Fremstilling af plasmider fra B. subtilis i lille skala

Plasmidet fra 5 ml B. subtilis i LB (indeholdende 0,01 M phosphat pH = 7,0 og passende antibiotika) blev frem-25 stillet som i sektion E med undtagelse af: pufferrumfang blev reduceret fire gange, 0,5 ml phenol og 0,5 ml chloroform blev tilsat efter puffer 3, efter centrifugering ved 19.000 rpm blev supernatanten fældet med ethanol, resuspenderet i 400 μΐ puffer 6 (0,05 M Tris HCl pH = 8,0, 0,1 M 30 Naacetat), plasmidet blev genudfældet, resuspenderet i 400 μΐ puffer 6, fældet, vasket og resuspenderet i 100 μΐ TE med 1 μg/ml kogt RNase A (Boehringer).

G. Fremstilling af kromosomalt DNA fra Bacillus NCIB 11837 35 En pille af frosne celler fra ca. 50 ml kultur blev resuspenderet i 1,1 ml puffer (0,05 M Tris HCl, pH = 7,4, 0,1 M NaCl, 25% sucrose). 100 μΐ lyzosym (25 mg/ml) og

23 DK 153799 B

150 μΐ EDTA (0,5 M, pH = 8,0) blev tilsat. Blandingen blev inkuberet ved 37°C i 30 minutter, 2 ml 0,2% SDS blev tilsat efterfulgt af inkuberingen i 30 minutter ved 37°C. Derpå blev der tilsat 1 g CsCl og 0,05 ml EtBr (10 mg/ml) per 0,95 5 ml blanding, og blandingen blev centrifugeret ved 45.000 rpm ved 15°C i 20 timer i en VTi65 rotor (Beckman).

DNA blev lokaliseret under en langbølge UV-lampe og fjernet ved punktering af glasset med en sprøjte. EtBr blev ekstraheret med isopropanol og opløsningen blev dialy-10 seret i 2 timer mod TEE (0,01 M Tris HC1, pH = 8,0, 0,01 M EDTA). Opløsningen blev derpå indstillet til 8 ml med TEE og ekstraheret to gange med phenol og en gang med chloroform.

DNA blev udfældet med 0,1 M NaCl og kold ethanol og blev opløst i 1 ml TE (0,01 M Tris HCl, pH = 8,0, 0,001 M EDTA).

15 Opløsningen af kromosomalt DNA (chr DNA) blev opbevaret ved 4 °C.

H. Partiel spaltning og fraktionering af chr DNA fra Bacillus NCIB 11837 20 60 μg chr DNA fra Bacillus NCIB 11837 (se sektion G) blev spaltet i 900 μΐ puffer (0,01 M Tris HCl, pH = 7,4, 0,075 M NaCl, 0,01 M MgCl^, 0,006 M mercaptoethanol, 100 μg/ml gelatine) med 10 enheder Mbol (Biolabs Cat. nr. 147) ved 37°C. Efter 10 minutter og 40 minutter blev prøver på 25 450 μΐ ekstraheret med phenol og fældet med 0,1 M NaCl og kold ethanol. Hver prøve blev opløst i 100 μΐ TEE. 100 μΐ DNA blev påført per 12 ml sucrose gradient (Maniatis T. et al., Cell 15, 687 - 701, 1978) og centrifugeret ved 27.000 rpm i 22 timer ved 20°C i en SW41 rotor (Beckman).

30 0,5 ml fraktioner blev aftappet efter punktering af bunden af glasset og udfældet med kold ethanol. DNA blev opløt i 50 μΐ TE, og størrelsen af DNA i hver fraktion blev bestemt på en 0,7% agarosegel farvet med 0,5 μg/ml EtBr. De fraktioner, der indeholdt DNA fra ca. 4 - 12 kb, blev sam-35 let, ekstraheret med phenol, fældet med ethanol og opløst i TE.

DK 153799B

24 I. Isolering af rekombinantplasmid indeholdende et amylase-gen 4 μ9 pACYCl84 (se sektion D) blev spaltet med 8 U BamHl (Biolabs Cat. nr. 136) i 1 time ved 37°C i 50 μΐ 5 puffer (0,006 M Tris HCl, pH = 8,0, 0,15 M NaCl, 0,006 M MgC^, 0,006 M mercaptoethanol, 100 μg/ml gelatine). Det lineære DNA blev behandlet med kalvetarm alkalisk phosphatase (Sigma P 4502), (Goodman et al.. Methods in Enzymology, 68, 75 - 90, 1979). pACYC184 behandlet med 0,4 μg BamHl og 10 phosphatase blev derpå sammenføjet med ca. 1 μg Bacillus NCIB 11837 chr DNA fra sucrose gradienter med ca. 100 U DNA-ligase (Biolabs Cat. nr. 202) i 4 timer ved 16°C i 100 μΐ puffer (0,066 M Tris HCl, pH = 7,5, 0,01 M MgC^* 25 μg/ml gelatine, 0,001 M ATP, 0,01 M DTT). Det sammenføjede 15 DNA blev transformeret ind i en kompetent E. coli stamme nr. 802 som beskrevet i sektion B.

Cellerne blev udspredt på frisk udhældt agarplader bestående af to lag: Bundlaget var 10 ml LB agar med 0,5% opløselig stivelse og 60 μg/ml chloramphenicol, og toplaget 20 var 25 ml af den samme agar, men uden chloramphenicol. Efter inkuberingen natten over ved 37°C fremkom der ca. 1200 chloramphenicol-resistente transformanter. Omtrent 600 af disse var tetracyclinsensitive, hvilket indicerede, at plasmid fra disse transformanter indeholdt et klonet fragment i 25 BamHl-stedet. Blandt disse 600 kolonier (repræsenterende en genbank af Bacillus NCIB 11837) udviste en, stamme DN400, amylaseaktivitet, hvilket fremgik af den blege zone rundt om denne koloni efter udsætning af den stivelsesholdige agar for joddampe. Stamme DN400 viste sig at indeholde et 30 plasmid, benævnt pDN400, på ca. 14.000 basepar inkluderende det amylasekodende gen.

J. Subkloning af pDN400 i Bacillus subtilis

Ca. 1 μg pDN400 (konstrueret som beskrevet i sek-35 tion I og fremstillet ud fra E. coli stamme DN400 som beskrevet for pACYC184 i sektion D) blev spaltet ved 37°C i 100 μΐ puffer (0,006 M Tris HCl, pH = 7,5, 0,05 M NaCl,

25 DK 153799 B

0,005 M magnesiumchlorid, 100 μg/ml gelatine) med 0,06 U Sau3Al (Biolabs Cat nr. 169). Prøver på 25 μΐ blev overført til phenol efter 10, 20, 30 og 40 minutters forløb og phe-nolekstraheret og udfældet med 0,1 M NaCl og kold ethanol.

5 Halvdelen af DNA blev sammenføjet (se sektion H) med 0,4 μg plasmid pBD64 (se sektion E), der var blevet spaltet med BamHl (som beskrevet for pACYCl84 i sektion I).

Bacillus subtilis stamme DN314 blev derpå transformeret (se sektion C) med ligeringsblandingen og blev 10 udspredt på LB agarplader indeholdende 0,01 M kaliumphosphat pH = 7,0, 0,5% opløselig stivelse og 6 μg/ml chloramphenicol. Blandt ca. 6000 transformanter blev der identificeret 1 -f

Amy (stivelsesnedbrydende ifølge prøven med jod).

Plasmid fra denne stamme blev isoleret (som 15 beskrevet i sektion F) og transformeret ind i Bacillus subtilis stammen DN304 (som beskrevet i sektion C). En Amy+ transformant, stamme DN463 indeholdende plasmid pDN452 blev isoleret. Som det fremgår af det følgende eksempel 3, giver dyrkning af DN463 forøgede udbytter af den hidtil ukendte, 20 termostabile amylase ifølge den foreliggende opfindelse.

Eksempel 3 25 Fremstilling af thermostabil, maltogen amylase fra Bacillus subtilis stamme DN463

En kultur af den ovennævnte klonede mikroorganisme DN463 blev podet i 500 ml rystekolber på 100 ml af følgende substrat: 30

Forflydiget stivelse 12,5% w/v (ledningsvand)

Sojamel 7,5%

Na2HP04 1 % 35 Til det ovennævnte substrat blev der sat 5 μg/ml chloramphenicol før podningen. Inkuberingen blev udført ved 30°C i 3 - 4 dage. Kulturvæsken blev centrifugeret i 20

26 DK 153799 B

minutter ved 6000 g. Centrifugatet indeholdende ca. 200 E/ml blev anvendt direkte i følgende eksempel.

5 Eksempel 4

Substrater til forsukring blev fremstillet ved genopløsning af 7DE sprøjtetørret maltodextrin i afioniseret vand til opnåelse af ca. 30% tørstof. Forsukringsforsøgene blev udført i standardlaboratorie-batchreaktorer på 500 ml.

10 Prøver af disse substratet blev opvarmet til 60°C og pH blev indstillet til 5,5, hvorpå 50 amylaseenheder/g tørstof blev tilsat. Efter 72 timer ved 60°C var indholdet af glucose, maltose og maltotriose i siruppen som følger: 15 glucose: 5% maltose: 67% maltotriose: 0%

Forsukring med 25 beta-amylase enheder/g tørstof 20 af Biozym Mil (sojabønnebetaamylase, 20.000 beta-amylase/g) under de samme betingelser gav en sirup indeholdende 0,3% glucose, 61% maltose og 7% maltotriose.

Claims (8)

27 DK 153799B 5

1. Maltogen amylase kendetegnet ved, at den har et temperaturoptimum ved pH 5,5 på ca. 60°C, et 10 pH-optimum ved 60°C i området fra 4,5 til 6 og en restaktivitet efter 60 minutter ved 70°C på mindst 75%, spalter maltotriose kvantitativt i ækvimolære mængder maltose og glucose, og kan fremstilles ved dyrkning af Bacillus NCIB 11837 i et egnet næringsmedium, der indeholder 15 carbon- og nitrogenkilder og uorganiske salte, og påfølgende isolering af den dannede amylase med de ovennævnte egenskaber fra kulturvæsken.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af den maltogene amylase ifølge krav 1, kendetegnet 20 ved, at en Bacillusstamme NCIB 11837 eller varianter eller mutanter heraf med væsentlig samme egenskaber som denne dyrkes i et passende næringsmedium, der indeholder carbon-og nitrogenkilder og uorganiske salte, hvorpå den maltogene amylase udvindes fra kulturvæsken.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af den maltogene amylase ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en transformeret værtsstamme fra slægten Bacillus, til hvilken det gen, der koder for den termostabile, maltogene amylase ifølge krav 1, er overført fra 30 Bacillusstamme NCIB 11837, dyrkes i et passende næringsmedium, der indeholder carbon- og nitrogenkilder og uorganiske salte, hvorpå den maltogene amylase udvindes fra kulturvæsken.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendete g-35 n e t ved, at værtsstammen hører til arten Bacillus subtilis.

28 DK 153799B

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at værtsstammen er Bacillus subtilis 168 eller en variant eller mutant deraf.

6. Plasmid til anvendelse i en Bacillusstamme ved 5 fremstilling af den maltogene amylase ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er et rekombinant plasmid, der indeholder det fra Bacillusstamme NCIB 11837 overførte gen, der koder for den termostabile, maltogene amylase ifølge krav 1, samt en nucleotid sekvens, der sikrer replikation i 10 en Bacillus subtilis vært.

7. Plasmid ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den nucleotide sekvens, der sikrer replikation i en Bacillus subtilis vært, er plasmid pBD64 eller pUBllO eller derivater deraf med i det væsentlige samme egenskaber.

8. Plasmid ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det er plasmid pDN452 med det på tegningens figur 3 viste restriktionsendonucleasespaltningskort.