JPH03108482A - α―アミラーゼ活性を有する新規なアルカリプルラナーゼＹ、これを産生する微生物及び新規なアルカリプルラナーゼＹの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はα−アミラーゼ活性を有する新規なアルカリプ
ルラナーゼＹ及びこれを産生ずる微生物並びに該アルカ
リプルラナーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

プルラナーゼは、プルラン分子中に存するα−１，６グ
ルコシド結合のみを切断し、最終的にマルトトリオース
を生成する酵素で、１９６１年ＲｅｎｄｅｒとＷａｌｌ
ｅｎｆｅｌｓ　［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｚ、、　　３３
４．　７９（１９６１）］により、アエロバタター　ア
エロゲネス（＾ｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅ
ｓ）の−菌株から初めて発見されたものである。近年、
バチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　［
Ｊ、　Ｊｐｎ、　Ｓａｃ、　５ｔａｒｃｈ　５ｃｉ１３
０゜２００　（１９８３Ｌバチルス　アシドグルリティ
クス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔ
ｉｃｕｓ）　［＾ｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　５２．２２９３　（１９８４）］　、バ
チルス　ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）［Ｏｕｒ、　
Ｊ、＾ｐｐ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏ１０．１７゜２４　（１９８３）］　、ストレプトコ
ッカス　ミナイス粉科学、　２８．７２　（１９８１）
］　、クロストリジウムエスピー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ　ｓｐ、）　［静ｐ１．ＢｎｖＩｒａｎ。

Ｍｉｃｒｏｂ、、　５３．７　（１９８７））　、クロ
ストリジウムサーモヒドロスルフリカム（Ｃｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕ
ｍ）　　（八ｐｐｌ、　　Ｅｎｖｉｒｏｎ。

Ｍｉｃｒｏｂ、、　４９．５　（１９８５）、Ｊ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、、　１６４゜３　（１９８５）　、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　Ｊｏ、　２４６　（１９８７））　、
サームス　アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｇｓ　ａｑｕａ
ｔｉｃｕｓ）［Ｂｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、Ｔｅｃｈ
ｎｏｌ、、　８　（１９８６））　、サームス　エスピ
ー（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｓｐ、）　［Ｊ、　Ｊｐｎ、　Ｓ
ｏｃ。

５ｔａｒｃｈ　Ｓｃｉ、、　３４．１　（１９８７）Ｅ
等の微生物がプルラナーゼを生産することが報告されて
いる。

また、プルラナーゼはプルランのみならず、澱粉、グリ
コーゲン、アミロペクチンやこれらの部分分解により生
じた分岐オリゴ糠中のα−１，６グルコシド結合に対し
ても氷解活性を有することが知られており、「枝切り酵
素」と呼ばれている。

一方、プルラナーゼは、エンド型アミラーゼ及びエキソ
型アミラーゼと併用することにより、澱粉からグルコー
スやマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオースなどのオ
ルトオリゴ糖を高収量で生産することも、見出されてお
り、近年注目されつつある。

更に、斯かる２種以上の酵素を用いた糖の製造工程を簡
略化するために、α−１，４グルコシド結合に対しても
反応する、すなわちα−アミラーゼ活性を有するプルラ
ナーゼの探索が行れてきているが、バチルス　ズブチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）刊［：Ａｇｒ
ｉｃ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　５１．９（１９８７
）、特公平１−１８７１７号公報〕の生産するプルラナ
ーゼ−アミラーゼ複合酵素及びバチルス　サーキュラン
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）　Ｃ特開
昭６４−６０３７６号公報〕の生産するプルラナーゼ活
性を有するアミラーゼが報告されているにすぎない。

一方、上述のプルラナーゼの性質を利用して、プルラナ
ーゼをα−アミラーゼと共に食器用洗浄剤及び衣料用洗
浄剤に配合する事により、主に澱粉汚れに対して洗浄力
が爪面的に向上する事が明らかとなり、その利用が期待
されている（特願昭６３−２８５４２４号）。

しかしながら、自然界に於いて従来見出されているプル
ラナーゼのほとんどが、中性乃至酸性領域に於いて最大
且つ安定な酵素活性を示す、所謂中性若しくは酸性プル
ラナーゼに分類されるものであるため、食器用洗浄剤及
び衣料用洗浄剤組成物の必要条件である、アルカリ領域
において最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐性を有
するプルラナーゼ、所謂アルカリプルラナーゼ及びアル
カリ耐性プルラナーゼの存在は、極めて少ない。

更に、α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナー
ゼに至っては全く見出されていないのが実情である。尚
、ここでアルカリプルラナーゼとは、至適ｐＨをアルカ
リ領域に有するものを言い、アルカリ耐性プルラナーゼ
とは、至適ｐＨは中性から酸性領域に有するが、アルカ
リ領域に於いても至適ｐ）Ｉに於ける活性に比較して充
分な活性を有し且つ安定性を保持するものを言う。また
、中性とはｐＨ６〜８の範囲を言い、アルカリ性とはそ
れ以上のｐＨ範囲を言う。

従来、知られているアルカリプルラナーゼ及びアルカリ
耐性プルラナーゼの生産方法としては、好アルカリ性バ
チルス属細菌の培養によってアルカリプルラナーゼを生
産する方法が堀越等により報告されているのみである［
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

＾員ａ、　３９７．１８８（１９７５）、特公昭５３−
２７７８６号公報〕。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、堀越等によって得られたプルラナーゼは
、アルカリ領域に至適ｐＨを有する酵素であり、従来知
られているプルラナーゼより基質特異性が広い等の特徴
を有しているが、α−アミラーゼ活性はなく、至適ｐＨ
が８〜９と弱アルカリ領域にあるため、洗浄剤用組成物
として使用するには適さないという問題があった。また
、酵素が不安定であると同時に酵素の生産性が悪いとい
う欠点も有しており、工業発酵生産に適うものではなか
った。そこで更に高アルカリ領域に至適ｐＨを有し、か
つα−アミラーゼ活性を有するプルラナーゼの開発が望
まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

一般に、食器及び衣類の洗浄は中性から高アルカリ性の
広範なｐＨ条件下で行われる為、高アルカリ性側に至適
ｐ＋＋を有し、且つ食器洗浄用並びに衣料洗浄用酵素と
しての機能を有するα−アミラーゼ活性を有するアルカ
リプルラナーゼを生産する微生物を自然界から探索し、
取得することは極めて意義のあることである。

斯かる実情において、本発明者は、α−アミラーゼ活性
を有するアルカリプルラナーゼを生産する微生物を自然
界に求め、鋭意探索を続けたところ、栃木県栃木市の土
壌より採取した好アルカリ微生物の一種であるバチルス
　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）ＫＳＭ−ＡＰ
１３７８（ＦＢＲＭ　Ｐ−１０８８６）が、自動食器洗
浄機用洗浄剤組成物並びに衣料用洗浄組成物の添加成分
として有効な、α−アミラーゼ活性を有するアルカリプ
ルラナーゼＹを生産することを見出し、本発明を完成し
た。

したがって、本発明は、α−アミラーゼ活性を有する新
規なアルカリプルラナーゼＹ１これを産生ずる微生物及
び新規なアルカリプルラナーゼの製造法を提供するもの
である。

本発明のアルカリプルラナーゼＹを生産する微生物は、
次のような菌学的性質を示す。尚、以下において菌株の
分類に用いた培地は次の培地１〜２１の２１種類であり
、これらは何れも別滅菌した炭酸ナトリウム（Ｎａａｃ
ｏ３）を０．５重量％（以下、単に％という）含有する
。

使用した培地の組成（表示は％）： 培地１．　ニュートリエンドブロス、　０．８；　（寒
天束（和光純薬製）、１．５ 培地２．　　ユニートリエンドブロス。０．８培地３．
　　ユニートリエンドブロス。０．８；ゼラチン。

２０．０；寒天束（和光純薬製）、１．５培地４．　バ
タトリトマスミルク、　　１０．５培地５．　ニュート
リエンドブロス、　０．８；ＫＮＯ，。

０．１ 培地６．ハクトヘブＦ　ン、ｏ、　７：ＮａＣｊ？　、
ｏ、　５ニブドウ糖、０．５ 培地７．　３４Ｍ寒天培地（栄研化学製）、指示量培地
８．　　ＴＳＩ寒天培地（栄研化学製）、指示量培地９
．　酵母エキス、０．５；バクトペプートン、１．５゜
ＫＪＰＯ４，０，１；Ｍｇ５Ｏ＊’７ＨｚＯ，０，０２
；可溶性澱粉、２，０；寒天末（和光紬薬製）。

１．５ 培地１０．コーサー培地（栄研化学製）、指示量培地１
１．クリステンセン培地（栄研化学製）、指示量 培地１２．■酵母エキス、　０．０５：ＮａｚＳ０４．
０．１；Ｋ）Ｉ２ＰＯ，、０，１；ブドウ糖、１．０■
酵母エキス、　０．０５；ＮａｚＳＬ、　０．１；ＫＨ
，ＰＯ，、０，１；ブドウ糖、　　１．０；ＣａＣｆ　
、　・２Ｈ２０，０，０５；Ｍｎ５Ｏ，’　４〜６　Ｌ
ｏ、　０．０１；Ｆｅ５０．　”　７Ｈ２０，０，００
１；Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，０゜０．０２ 窒素源としては、硝酸ナトリウム、亜 硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム及びリン酸アンモニ
ウムをそれぞれ０，２５％、０、２０２５％、０．１５
８％、０．１９５％となるように上記■及び■の培地に
加えて用いた。

培地１３．キングＡ培地“栄研”　（栄研化学製）。

指示量 培地１４．キングＢ培地“栄研”　（栄研化学製）。

指示量 培地１５．尿素培地“栄研”　（栄研化学製）、指示量 培地１６．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日
永製薬製） 培地１７．３％過酸化水素水 培地１８．バクトペブトン、０．５．酵母エキス、０．
５；に２ＨＰＯ，、０，１；ブドウ糖、　　１．０；Ｍ
ｇ５Ｏ，・７Ｈ２０，０，０２ 培地１９．バクトペプトン、　２．７；ＮａＣｊ２　、
５．５；に２ＨＰＯ，、０，３；ブドウ糖、０．５；ブ
ロモチモールブルー、　０．０６；寒天末（和光紬薬製
）、１．５ 培地２０．　　（ＮＨ，）２ＨＰＯ４，０，１；ＫＣＣ
Ｏ，０２：　Ｍｇ５Ｏ＊’７ＨｚＯ，０，０２；酵母エ
キス、　０．０５；糖。

１．０ 培地２１．カゼイン、０．５．酵母エキス、０．５．ブ
ドウ糖、　１．０；ＫＪＰＯｌ、　０．１；ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２０゜０．０２；寒天末（和光紬薬製）、１．５
〔菌学的性質〕 （ａ）　　顕微鏡的観察結果 菌体の大きサバ、０．８〜２．４μｍ　ｘ　１．８〜４
．０μｍの桿菌であり、菌体の一端に楕円形の内生胞子
（１，０〜１，２μｍ　Ｘｌ、２〜１．４μｍ　）を作
る。

また、周鞭毛を有し運動性がある。ダラム染色は不定。

抗酸性はない。

（ハ）各種培地に於ける生育状態 ■　肉汁寒天平板培養（培地１．） 生育状態は良い。集落の形状は円形であり、表面は円滑
、周縁は円滑である。又集落の色調は黄色半透明で光沢
がある。

■　肉汁寒天斜面培養（培地１．） 生育する。その状態は拡布状で光沢が有り、黄色半透明
である。

■　肉汁液体培養（培地２．） 生育する。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３．）生育状態は良い
。ゼラチン液化が認められる。

■　リドマスミルク培地（培地４．） ミルクの凝固、ペプトン化は認められない。

リドマスの変色は培地がアルカリの為判定できない。

（Ｃ）　　生理学的性質 ■　硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５．）硝酸塩の還
元は陽性。脱窒反応は陰性。

■　ＭＲテスト（培地６．） 培地がアルカリ性のため、陰性、陽性は判定できない。

■　ｖｐテスト　（培地６．） 陰性。

■　インドールの生成（培地７．） 陰性。

■　硫化水素の生成（培地８．） 陰性。

■　澱粉の加水分解（培地９．） 陽性。

■　クエン酸の利用 コーサー培地（培地１０．）で陰性。クリステンセン培
地（培地１１．）では陽性か陰性か判定できない。

■　無機窒素源の利用（培地１２．） 硝酸塩、アンモニウム塩、亜硝酸塩ともに利用する。

■　色素の生成（培地１３．　、１４．）陰性。

■　ウレアーゼ（培地１５．） 陰性。

■　オキシダーゼ（培地１６．） 陰性。

■　カタラーゼ（培地１７．） 陽性。

■　生育の範囲（培地１８．） 生育の温度範囲は２０〜４０℃、生育最適温度範囲は３
０〜３５℃である。

生育のｐＨ範囲はｐＨ７〜ｌ０９５、生育最適＋１８は
ｐＨ１Ｏである。

■　酸素に対する態度 好気的。

■　０−Ｆテスト（培地１９．） アルカリ性のため、変色は判定できない。

好気状態でのみ生育する。

［相］　糖の利用性（培地２０．） Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース
、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビッ
ト、Ｄ−マンニット、イノジット、グリセリン、デンプ
ン、ラフィノース、サリシン、Ｄ−リボース及びデキス
トリンを利用する。

■　食塩含有培地に於ける生育（培地１．を改変） 食塩濃度７％では生育するが、１０％では生育できない
。

■　カゼインの分解（培地２１．） 陽性。

以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バーシーズ・
マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロ
ジ−（Ｂｅｒｇｅｙ　ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第
８版及びザージーナス・バチルｘ　（”Ｔｈｅ　Ｇｅｎ
ｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ”　Ｒｕｔｈ。

Ｂ、　Ｇｏｒｄｏｎ、　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ　Ｎ（Ｌ　４２７゜八ｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　５ｅｒｖｉｃｅ、　　Ｕ
、　　Ｓ。

Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒｅ　　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　　Ｄ、　　Ｃ１（１９
７３））を参照し、比較検索した結果、本菌株は有胞子
桿菌であるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の一種であ
ると認められる。しかし、本菌株は中性領域では生育で
きず、専ら高アルカリ領域で良好な生育を示すことから
、最近、）ｌｏｒｉｋｏｓｈｉとＡｋｉｂａ〔Ａｌｋａ
ｌｏｐｈｉｌｉｃ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　、　
ＪａｐａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｐ
ｒｅｓｓ　（Ｔｏｋｙｏ）、　　１９８２年刊〕の主張
している、所謂好アルカリ性 （＾ｉｔ＜ａｌｏｐｈｉｌｉｃ）微生物として暫定的に
、従来の中性で生育するバチルス属細菌とは区別される
。

更に、本菌株の菌学的性質は公知の好アルカリ性バチル
スのいずれとも一致しないので、これを新規菌株と判断
してバチルス　エスピーＫＳＭ−＾Ｐ１３７８と命名し
、微工研菌寄第１０８８６号として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託した。

上記の菌株を用いて本発明のα−アミラーゼ活性を有す
るアルカリプルラナーゼＹを得るには、培地に菌株を接
種し、常法に従って培養すればよい。培養に用いる培地
中には、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有せし
めておくことが好ましい。この炭素源及び窒素源は特に
制限されないが、その例としては、窒素源としてコーン
グルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザ
ミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、肉エキス、ト
リプトン、ソイトン、バイブロ、アジパワ、綿実油粕、
カルチベーター、アジブロン、ゼストなど有機窒素源及
び硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、酢酸アン
モニウム等の無機窒素源が挙げられる。また炭素源とし
ては、可溶性澱粉、不溶性澱粉、アミロペクチン、グリ
コーゲン、プルラン及びこれらの部分分解により生じた
分岐オリゴ糖に加え、資化し得る炭素源、例えばグルコ
ース、マルトース、アラビノース、キシロース、リボー
ス、マンノース、フラクトース、ガラクトース、麦芽糖
、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニット、ソルビッ
ト、グリセリンや資化し得る有機酸、例えばクエン酸や
酢酸などが挙げられる。またその他、リン酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバル
ト塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要で
あれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加する
こともできる。

また、培養における温度は２０〜４０℃、特に３０〜３
５℃が好ましく、ｐＨは８〜１０．５、特に１０が好ま
しく、この条件下において通常２〜３日間で培養は完了
する。

斯くして得られた培養物中からの目的物質である、α−
アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹの採取
及び精製は、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて
行うことができる。即ち、培養後、遠心分離又は濾過等
の通常の固液分離手段により菌体を培養液から除去して
粗酵素液を得ることができる。この粗酵素液は、そのま
ま使用することもできるが、必要に応じて、塩析法、沈
澱法、限外濾過法等の分離手段により粗酵素を得、更に
公知の方法により精製結晶化し、精製酵素として使用す
ることも可能である。

以下に、本発明アルカリプルラナーゼＹの好ましい製造
法の一例を説明する。アルカリ性細菌バチルス属に属す
る例えばＫＳＭ−ＡＰ１３７８株を１％プルラン、１％
ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．１％に１ｉ２
ＰＯ，，０，２５％Ｎａ２１’ｌＰＯ，”　１２＋（２
０，０，０２％Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２０，０，５％炭酸ナ
トリウムを含む培地で３０℃にて３日間好気的に振盪培
養して得られる培養液から菌体を除き、上澄液を得る。

次いで、■ＤＢＡＢセルロース吸着、■α−シクロデキ
ストリン　アフィニティ　りロマトグラフィー、■ＤＥ
ＡＲトヨバール（東洋曹達社製）クロマトグラフィー■
セファクリル（ファルマシア社製）クロマトグラフィー
を行うことによって精製される。斯くして得られる精製
酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１５
％）及びソディウムドデシルサルフェー）　（ＳＤＳ）
電気泳動で単一のバンドを与え、またプルラナーゼの活
性収率は約２％であった。

斯くして得られる、本発明アルカリプルラナーゼＹの酵
素化学的性質について、以下に説明する。

尚、酵素活性の測定は次の緩衝液（各々５０ｍＭ宛）を
用い、以下の方法に従って行った。

ｐＨ４〜６　　酢酸緩衝液 ｐＨ６〜８　　リン酸緩衝液（プルラナーゼ活性測定に
使用） ｐＨ６〜８　　トリスマレイド緩衝液（α−アミラーゼ
活性測定に使用） ｐＨ８〜１１　　　グリシン−食塩−水酸化ナトリウム
緩衝液 ｐＨ１１〜１２　　　塩化カリウム−水酸化ナトリウム
緩衝液 酵素活性測定法： ■　プルラナーゼ活性 各種緩衝液中にプルラン（反応系に於ける最終濃度は、
０．２５％）を溶解させた基質溶液０．９ｄに、酵素液
０．　ｂｄを加え、４０℃で、３００分間反応せた。反
応後、３，５−ジニトロ−サリチル酸（３，５−ｄｉｎ
ｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮＳ）
）法にて、還元糖の定量を行った。即ち、反応液１．０
ｍｊ！１、：ＤＮｓ試薬１．０−を加え、５分間、１０
０ｔで加熱発色させ、冷却後、４．　Ｏｄの脱イオン水
を加えて希釈し、波長５３５ｎｍで比色定量した。酵素
の力価は、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する
還元糖を生成する酵素量を１単位（ＩＵ）とした。

■　α−アミラーゼ活性 各種Ｍ衡液中に可溶性澱粉（反応系に於ける最終濃度は
、０．２５％）を溶解させた基質溶液０．９ｍｌに、酵
素液０．１１ｎ！、を加え、５０ｔ’で、１５分間反応
させた。

反応後、（ＤＮＳ）法にて、還元糖の定量を行った。

即ち、反応液１．０−にＤＮＳ試薬１．０−を加え、５
分間、１００℃で加熱発色させ、冷却後、４．０ｍｌ’
の脱イオン水を加えて希釈し、波長５３５ｎｍで比色定
量した。酵素の力価は、１分間に１μｍｏｌのグルコー
スに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位（ＩＵ）
とした。

（酵素化学的性質） ■　作用 プルラン及び可溶性澱粉に作用し、前者からは主として
マルトトリオースを、後者からは主としてマルトテトラ
オース及びマルトペンタオースを生成する。また、グリ
コーゲンにも作用しマルトテトラオース及びマルトペン
タオースを生成する（第１図）。

■　基質特異性 プルラン、可溶性澱粉及びグリコーゲンに作用する（第
１表）。

以下余白 ■　作用ｐ）Ｉ及び最適作用＋１Ｈ 本酵素のプルランに対する作用ｐｌは５〜１２の範囲に
あり、最適作用ｐＨは８．５〜１ｏの範囲に認められる
。

尚、各ｐｌにおけるプルラナーゼ活性を０．２５％プル
ラン、１０ｍ１４酢酸緩衝液ＣｐＨ４〜５）、リン酸緩
衝液（ｐＨ〜８）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ９〜１０．５）及び塩化カリウム水酸化ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ１１〜１２）の反応系を用い、４
０℃、３０分間反応させて測定した結果を第２図（ａ）
に示す。

また、可溶性澱粉に対する作用＋１８は４〜１２の範囲
にあり、最適作用ｐＨはｐＨ７〜９．５の範囲に認めら
れる。

尚、各ｐＨに右けるα−アミラーゼ活性を０．２５％可
溶性澱粉、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４〜５）、トリス
マレイド緩衝液（ｐＨ６〜８）、グリシン−食塩−水酸
化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９〜１０．５）　、炭酸緩衝
液（ｐＨ１１〜１２）の反応系を用い５０℃、１５分間
反応させて測定した結果を第２図（ｂ）に示す。

■　ｐＨ安定性 本酵素のプルランに対するｐＨ安定性は、ｐＨ６〜１０
．５の範囲に認められる。

尚、各ｐＨにおけるプルラナーゼ活性を０．２５％プル
ラン、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４〜５）、リン酸緩衝
液（ｐＨ６〜８）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ９〜１０．５）及び塩化カリウム−水酸化
ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１〜１２）の反応系を用い４
５℃、１０分間反応させて測定した結果を第３図（ａ）
に示す。

また、可溶性澱粉に対するｐＨ安定性は、ｐＨ４〜１２
の範囲に認められる。

尚、各ｐ■におけるα−アミラーゼ活性を０．２５％プ
ルラン、１０ｍＭ酢酸緩衝液＜ｐＨ４〜５）、トリスマ
レイド緩衝液（ｐＨ６〜８）、グリシン−食塩−水酸化
す）　ＩＪウム緩衝液（ｐＨ９〜１０．５）及び炭酸緩
衝液（ｐｌ−１１１〜１２）の反応系を用い５０℃、１
５分間反応させて測定した結果を第３図（ｂ）に示す。

■　作用温度範囲及び最適作用温度 本酵素のプルラン及び可溶性澱粉に対する活性は、１０
℃〜６５℃の範囲で認められ最適作用温度は約５０℃に
認められる（第４図（ａ）及びら））。

■　温度安定性 本酵素についてｐｌ（９，５の条件で温度を変化させ、
各温度で３０分間処理することにより失活の条件を調べ
たところ４５℃までは極めて安定である（第５図（ａ）
及びＱ）））。

■　分子量 ＳＯ８電気泳動法（ゲル濃度７．５％）による分子量は
約２００．０００±５．０００である。

■　金属イオンの影響 プルラナーゼ活性はＨｇ２＋、　Ｍｎ２＋、　ｐｂ２＋
で阻害される。また、α−アミラーゼ活性はＨｇ２＋、
　Ｍｎ２＋Ｐｂ”、　Ｃｄ”中Ｘｎ　２＋で阻害される
。（第２表）。

下記第２表より明らかな如く、本発明アルカリプルラナ
ーゼＹのプルラナーゼ活性とα−アミラーゼ活性とでは
、阻害を受ける金属イオンの種類が異なっている。

■　界面活性剤の影響 線状アルキルベンゼンスルフオン酸ナトリウム、ポリオ
キシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩、α−
オレフィンスルフオン酸ナトリウム、α−スルフォン化
脂肪酸エステルナトリウム、アルキルスルフオン酸ナト
リウム、ＳＯＳ、石鹸及びソフタノール等の各種界面活
性剤の０．０５％溶液で４０℃にて１５分間処理しても
殆ど活性阻害を受けない。

■　キレート剤の影響 キレート剤であるＢＤＴＡ　（１０ｍＭ）及びＢＧＴ＾
（１０ｍＭ）でプルラナーゼ活性は殆ど阻害を受けない
が、α−アミラーゼ活性は著しい阻害を受ける。また、
キレート剤により阻害を受けたα−アミラーゼ活性は再
びＣａ’＋を加えると復活する（第２表）。

■　プロテアーゼ耐性 マクサターゼ（ＩＢＩＳ製）及びサビナーゼ（ノボ製）
等のアルカリプロテアーゼを活性測定時に共存（０，２
＾Ｕ／　Ａ　）させても、いずれのプロテアーゼに対し
ても強い耐性を有する。

以上の酵素化学的性質から明らかなように、本発明アル
カリプルラナーゼＹは、従来のα−アミラーゼ活性を有
するプルラナーゼとは理化学的性質の異なる新規な酵素
である。

更に、ここで、本発明の酵素の新規な点を更に明らかに
するために、従来報告されているα−アミラーゼ活性を
有するプルラナーゼとの理化学的性質を比較した結果を
下記第３表に示す。

以下余白 第３表から明らかな如く、本発明のアルカリプルラナー
ゼＹはバチルス　ズブチリス　ＴＲＩ由来のプルラナー
ゼ−アミラーゼ複合酵素及びバチルスサーキュランス　
Ｆ−２由来のプルラナーゼ活性を有するアミラーゼとは
、その理化学的性質が明らかに異なるものである。

〔発明の効果〕

本発明のアルカリプルラナーゼＹは、α−アミラーゼ活
性を有し、従来のプルラナーゼに比較して、最適作用ｐ
Ｈが高アルカリ側にある。また、広いｐＨ範囲において
極めて安定性も良好である。更に、界面活性剤、キレー
ト剤、洗剤用プロテアーゼ等の洗浄剤配合成分によって
も殆ど阻害を受けない。

従って、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分として、有利
に使用することができるものであり、工業的に極めて大
きな意義を有するものである。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて本発明を更に説明する。

実施例１ 栃木県栃木市の土壌を薬匙−杯（約０．５ｇ）　、滅菌
生理食塩水に懸濁し、８０℃で１５分間熱処理した。こ
の熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培地（
培地Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３日間
培養し、集落を形成させた。

集落の周囲に着色プルラン及び着色澱粉の溶解に基づく
透明帯を形成するものを選出し、α−アミラーゼ活性を
有するプルラナーゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を
培地Ｂの液体培地に接種し、３０℃で３日間振盪培養し
た。培養後、遠心分離した上清液についてプルラナーゼ
活性及びアミラーゼ活性を、ｐＨ１０にて測定し、α−
アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼ生産菌を
スクリーニングした。

上述の方法により、本発明のα−アミラーゼ活性を有す
るアルカリプルラナーゼＹ生産菌バチルス　エスピー　
ＫＳＭ−ＡＰＩ３７８　（ＦＢＲＭ　Ｐ−１０８８６）
を取得することが出来た。

培地Ａ、プルラン　　　　　０．５％ 可溶性澱粉　　　　０．５％ 着色プルラン 着色澱粉 ポリペプチド 酵母エキス にｌ（、ＰＯ。

（ＮＩｌ、）２ＳＯ。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ＣａＣＪ！　２・２８２０ Ｆ［！ＳＯ４・７８−Ｏ ＭｎＣｊ！　２−４）１２０ 寒天 ａｚＣＯｓ ｐｔ＋ 培地Ｂ、プルラン 可溶性澱粉 ト　リ　ブト　ン 酵母エキス ＫＩＩ２ＰＯ。

（Ｎ１１４）２ＳＯ４ ＭｇＳ０４・７Ｈ２０ ０，２％ ０．２％ ０．２％ ０．１％ ０．０３％ ０．１％ ０．０２％ ０．０２％ ０．００１％ ０．０００１％ １．５％ ０．５％ １０．０ ０．５％ ０．５％ ０．２％ ０．１％ ０．０３％ ０．１％ ０．０２％ ＣａＣｊ’　、　・２Ｈ−００，０２％Ｆｅ５Ｏ＝　・
７８２０　　　　　０，００１％ＭｎＣ１２”　４）＋
２０　　　　０．０００１％Ｎａ２ＣＯ３０，５％ ｐＨ１０，０ 実施例２ α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹ生
産菌、バチルス　エスピー　ＫＳＭ−ＡＰＩ３７８株を
実施例１の液体培地Ｂに接種し、３０℃で３日間振盪培
養した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素液と
した。更に、通常の方法に従って、１００％エタノール
を６加してエタノール乾煙粉末とし、以下の第４表に示
すα−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹ
酵素標品を得ることが出来た（酵素活性はｐＨ９に於け
る測定値である）。

以下余白 第４表 実施例３ 実施例１の液体培地Ｂに於いて、プルラン及び可溶性澱
粉に代えてマルトースを１％添加した培地に、α−アミ
ラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹ生産菌、バ
チルス　エスピーＫＳＭ−へＰ１３７８株を接種し、３
０℃で２乃至３日間振盪培養した。遠心分離上清につい
てプルラナーゼ活性を測定した結果、２１１　Ｕ／ｊ！
の活性が得られた。

実施例４ 実施例２で得られた粗酵素液について、以下の手順に従
って精製を行い、α−アミラーゼ活性を有するアルカリ
プルラナーゼＹを得た。すなわち、粗酵素液の上澄液に
ＤＢＡＢセルロース粉末を加え、上澄液中のプルラナー
ゼを完全にＤＲＡＢセルロースに吸着させた。次いで、
１０１０１ＩＩ！Ｊスー塩酸緩衝液（ｐＨ８）で樹脂を
洗浄した後、０．６Ｍの食塩を含む１０＋＋＋Ｍ）ｊＪ
スス−酸緩衝液（ｐＨ）で酵素を溶出した。次に、１０
ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で透析後、１０ｍＭ
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したα−シクロ
デキストリン　アフィニティー　カラムに吸着させ、β
−シクロデキストリン含有１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８）により溶出し、その活性画分を集めた。集め
られた活性画分は、透析後、１０ｍＭ）！Ｉスス−酸緩
衝液（ｐＨ８）テ平衡化したＤＢＡＲ）　ヨハ−ル６５
０Ｓｌ：吸着させた。吸着した酵素を１０ｍＭ）ＩＪス
ス−酸緩衝液（ｐＨ８）中、０．１からＩＭの食塩の濃
度勾配により溶出し、その活性画分を集めた。集められ
た活性画分は、透析後、次いで０，１Ｍ食塩を含む１０
ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したセファ
クリルＳ−２００カラムに充填し、０．１Ｍ食塩を含む
同緩衝液で溶出し、その活性画分を集めた。

集められた活性画分は、限外濾過膜を用いて濃縮した後
、１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて一夜
透析した。得られたα−アミラーゼ活性を有するアルカ
リプルラナーゼＹについてデービス［Ｄａｖｉｓ　Ｄ、
　Ｊ、、　Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、
、　１２１゜４０４　（１９６４）　］の方法に従って
電気泳動を行った後、コマシー・ブリリアント・ブルー
で染色して単一のバンドを与える事を確認した（第６図
）。

実施例５ 実施例４で得られたα−アミラーゼ活性を有するアルカ
リプルラナーゼＹについて、常法に従い、ソディウム・
ドデシル・硫酸（ＳＯＳ）電気泳動を行った。この結果
を第７図に示す。この結果から、本酵素は分子１２００
．０００±５．０００であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のα−アミラーゼ活性を有するアルカ
リプルラナーゼＹを用いてプルラン、アミロペクチン、
アミロース、グリコーゲンを基質として酵素反応を行っ
たときの、マルトオリゴ糖の精製を示すペーパークロマ
トグラフィーである。 第２図（ａ）及び閲は本発明のα−アミラーゼ活性を有
するアルカリプルラナーゼＹの反応ｐＨと相対活性との
関係を示す図面である。 第３図（ａ）及び（ｂ）は、本発明のα−アミラーゼ活
性を有するアルカリプルラナーゼＹの処理ｐＨと残存活
性との関係を示す図面である。 第４図（ａ）及び（ｂ）は、本発明のα−アミラーゼ活
性を有するアルカリプルラナーゼＹの反応温度（ｐＨ９
，５）と相対活性との関係を示す図面である。 第５図（ａ）及びら）は、本発明のα−アミラーゼ活性
を有するアルカリプルラナーゼＹの処理温度（ｐＨ９，
５）と残存活性との関係を示す図面である。 第６図は、本発明のα−アミラーゼ活性を有するアルカ
リプルラナーゼＹをデービスの方法に従って電気泳動を
行った結果を示す図面である。 第７図は本発明のα−アミラーゼ活性を有するアルカリ
プルラナーゼＹのＳＯ８電気泳動の結果を示す図面であ
る。 以上 ブルラナ ゼ 、！屓（°Ｃ） α−アミラーゼ １度Ｃ″″Ｃ） 第 ６図 分子量マーカー ブルラナ ゼＹ （分子量） 手 続 補 正 書（自発） 補正の対象 平成 元年１０月２０日 明細書の 「発明の詳細な説明」 の欄

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プルランに対する最適作用ｐＨが８．５〜１０の範
   囲であり、可溶性澱粉に対する最適作用ｐＨが７〜９．
   ５の範囲である、α−アミラーゼ活性を有するアルカリ
   プルラナーゼＹ。 ２、次の酵素化学的性質を有する請求項１記載のα−ア
   ミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹ。 １）作用 プルラン及び可溶性澱粉に作用し、プルランからは主と
   してマルトトリオース、可溶性澱粉からは主としてマル
   トテトラオース及びマルトペンタオースを生成する。ま
   た、グリコーゲンにも作用し、マルトテトラオース及び
   マルトペンタオースを生成する。 ２）基質特異性 プルラン、可溶性澱粉及びグリコーゲンに作用する。 ３）作用ｐＨ及び最適作用ｐＨ プルランに対する作用ｐＨは５〜１２の範囲であり、最
   適作用ｐＨは８．５〜１０の範囲である。また、可溶性
   澱粉に対する作用ｐＨは４〜１２の範囲であり、最適作
   用ｐＨは７〜９．５の範囲である。 ４）ｐＨ安定性 プルランに対してはｐＨ６〜１０．５の範囲で安定であ
   り、可溶性澱粉に対してはｐＨ４〜１２の範囲で安定で
   ある（４５℃、１０分間処理による）。 ５）作用温度範囲及び最適作用温度 プルラン及び可溶性澱粉に対して１０〜６５℃の範囲で
   作用し、その最適作用温度は約５０℃である。 ６）温度安定性 ４５℃までは極めて安定である（ｐＨ９．５の１０ｍＭ
   グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、３０分間
   処理による）。 ７）分子量 ソディウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動法による分
   子量は２００，０００±５，０００である。 ８）金属イオンの影響 プルラナーゼ活性はＨｇ＾２＾＋、Ｍｎ＾２＾＋、Ｐｂ
   ＾２＾＋で阻害される。また、α−アミラーゼ活性はＨ
   ｇ＾２＾＋、Ｍｎ＾２＾＋、Ｐｂ＾２＾＋、Ｚｎ＾２＾
   ＋、Ｃｄ＾２＾＋で阻害される。 ３、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属し、α−アミ
   ラーゼ活性を有する新規なアルカリプルラナーゼ生産能
   を有する微生物。 ４、バチルスエスピー（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ｓｐ．）
   ＫＳＭ−ＡＰ１３７８と命名され、微工研菌寄第１０８
   ８６号として寄託された、請求項１又は２記載のα−ア
   ミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼＹ生産能を
   有する微生物。 ５、請求項３記載の微生物を培養し、その培養物からα
   −アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼを採取
   することを特徴とする、アルカリプルラナーゼの製造法
   。 ６、請求項４記載の微生物を培養し、その培養物から請
   求項１又は２記載のα−アミラーゼ活性を有するアルカ
   リプルラナーゼＹを採取することを特徴とする、アルカ
   リプルラナーゼＹの製造法。