DK153882B - Fremgangsmaade til fremstilling af pseudomonsyre - Google Patents

Description

i

DK 153882 B

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af pseudomonsyre.

Pseudomonsyre er forbindelsen med formlen I

OH

OH

Det beskrives i britisk patentskrift nr. 1.395.907, at denne forbind-5 else har antibakteriel virkning, og at den derfor er værdifuld i behandlingen af bakterielle infektioner i mennesker og dyr. Den fremgangsmåde, der beskrives i britisk patentskrift nr. 1.395.907 til fremstilling af pseudomonsyre, omfatter isolering af en blanding, der indeholder de principielle aktive syrebestanddele' fra et dyrknings-10 medium, hvorpå eller hvori Pseudomonas flourescens er dyrket under aerobe betingelser. Det første trin i fler-trinsfremgangsmåden består i, at urenheder udfældes fra kulturopløsningen ved tilsætning af bariumioner. Dette trin er ifølge det i det britiske patentskift beskrevne et væsentligt trin. Pseudomonsyren forbliver i opløsningen og 15 renses derefter yderligere ved ekstraktion i et organisk opløsningsmiddel. Efter tilbageekstraktion med vand kan der fås salte af pseudomonsyre, og i det britiske patentskrift nævnes specifikt natriumsaltet. Pseudomonsyre kan derefter dannes ud fra saltet.

Den foreliggende opfindelse bygger på den erkendelse, at anvendelse 20 af bariumioner kan udelades, når der anvendes lithiumsalt. Denne fordelagtige udeladelse skyldes lithiumsaltets uventede egenskaber, idet lithiumpseudomonat udfældes i en meget ren, stabil krystallinsk

DK 153882 B

2 form. Pseudomonsyre fremstilles ifølge opfindelsen ved hydrolyse af lithiumpseudomonsyre.

Lithiumsaltet af pseudomonsyre (i det efterfølgende benævnt lithiumpseudomonat) er en hidtil ukendt forbindelse. Selv om natriumsaltet af 5 pseudomonsyre beskrives i britisk patentskrift nr. 1.395.907, er anvendelsen af lithiumsaltet hverken beskrevet eller gjort nærliggende derved. Medens natriumsaltet, som er det nærmest beslægtede alkalimetalsalt, er en amorf og hygroskopisk forbindelse, er lithiumpseu-domonat overraskende stabilt, krystallinsk og ikke-hygroskopisk.

10 Desuden er lithiumsaltet langt mindre opløseligt end natriumsaltet.

Disse egenskaber kunne ikke forudsiges på grundlag af britisk patentskrift nr. 1.395.907 og gør lithiumpseudomonat til et nyttigt mellemprodukt til isoleringen eller rensningen af pseudomonsyre.

Lithiumpseudomonat kan fremstilles ved, at et råpræparat, der inde-15 holder pseudomonsyre, ekstraheres med et polært, organisk, med vand ikke-blandbart opløsningsmiddel, hvori pseudomonsyre er opløselig, ekstrakten behandles med et lithiumsalt, som er i det mindste lidt opløseligt i det med vand ikke-blandbare opløsningsmiddel, og det resulterende lithiumpseudomonat isoleres.

20 Lithiumpseudomonatet kan derpå hydrolyseres til den fri syre, pseudomonsyre, eller det kan omdannes til et andet salt deraf ved konventionelle teknikker.

Det er særlig hensigtsmæssigt at isolere pseudomonsyre i form af sit lithiumsalt fra et dyrkningsmedium, hvorpå eller hvori pseudomon-25 syreproducerende bakteriestammer er dyrket. I dette tilfælde gås der mest hensigtsmæssigt frem på den nedenfor beskrevne måde.

En pseudomonsyreproducerende bakterie, i almindelighed en bakteriestamme af slægten Pseudomonas, dyrkes ved en standardmetode under aerobe betingelser i eller på et egnet dyrkningsmedium. Sådanne 30 dyrkningsmedier er almindeligt kendte og indeholder uorganiske salte og kilder for assimilerbart nitrogen og carbon. Det er mest hensigtsmæssigt at anvende bakterien Pseudomonas fluorescens. En egnet

DK 153882 B

3 offentlig tilgængelig stamme er Pseudomonas fluorescens NCIB 10586. Mikroorganismen lades vokse, indtil der er en passende mængde pseudomonsyre til stede i dyrkningsmediet. Faste partikler kan derpå fjernes fra mediet ved filtrering eller centrifugering, hvorved fås en 5 klar væske. Den klare væskes pH-værdi indstilles til 3,0-5,0, hen sigtsmæssigt ca. pH-værdi 4,5.

Denne syrnede vandige opløsning ekstraheres derpå med et polært, organisk, med vand ikke-blandbart opløsningsmiddel. Der foretrækkes aprote opløsningsmidler. Opløsningsmidlet bør have en tilstrækkelig 10 polaritet til at opløse pseudomonsyren i tilstrækkelig grad. Egnede opløsningsmidler er f.eks. ethylacetat, butanol, methyl isobuty I keton (MIBK) eller methylendichlorid. Der kan alternativt anvendes blandede opløsningsmidler, f.eks. ether, der indeholder ca. 5% ethanol.

Et foretrukket opløsningsmiddel er methyl i sobuty I keton.

15 Det volumen opløsningsmiddel, der anvendes til ekstraktionen, bør holdes på et minimum, medens der sikres god fysisk adskillelse mellem de to faser. Når der ekstraheres en dyrkningsvæske, er et passende volumen fra 1/2 til 1/6, fortrinsvis 1/4 af volumenet af den væske, der skal ekstraheres.

20 Det er ofte fordelagtigt at vaske ekstrakten med saltopløsning, f.eks. under anvendelse af et volumen på 1/10 af ekstraktvolumenet for at reducere vandmængden i ekstrakten.

Det næste trin i fremgangsmåden er at behandle ekstrakten med et lithiumsalt. Det anvendte lithiumsalt bør ideelt være mere opløseligt i 25 opløsningsmidlet end lithiumpseudomonat. Det er fortrinsvis lithium-saltet af en organisk carboxylsyre, f.eks. et salt af en alkansyre med den almene formel II

- +

R - COOLi II

hvor R betegner en alkylgruppe, der f.eks. indeholder fra 1 til 20 30 carbonatomer, fortrinsvis fra 1 til 8 carbonatomer.

DK 153882B

4

Eksempler på egnede lithiumsalte er acetatet, propionatet og hexa-noatet, idet et foretrukket salt er lithium-2-ethylhexanoat.

Lithiumsaltet kan sættes til ekstrakten i fast form, men det foretrækkes at tilsætte det som en koncentreret opløsning i et co-opløs-5 ningsmiddel, som opløser lithiumsaltet, men som i det væsentlige ikke solubiliserer lithiumpseudomonat. Sådanne co-opløsningsmidler er f.eks. ethanol og, fortrinsvis, methanol.

Det foretrækkes almindeligvis at anvende ca. 10%’s overskud af lithiumsalt og langsomt at tilsætte en opløsning af saltet til ekstrak-10 ten. I de fleste tilfælde vil lithiumpseudomonatet krystallisere ud, en proces, som lettes ved at afkøle til ca. 0-5°C. Lithiumpseudomonatet kan isoleres ved konventionelle teknikker. Det kan være fordelagtigt, efter isoleringen af den første mængde lithiumpseudomonat, at koncentrere og isolere et yderligere udbytte.

15 Da lithiumpseudomonat ikke er hygroskopisk, kan det tørres i en luftovn. Dette er ikke muligt med natriumpseudomonat og heller ikke med pseudomonsyre selv, som det er vanskeligt at tørre på anden måde end i en vakuumovn eller meget forsigtigt ved lav temperatur.

Lithiumpseudomonatet hydrofyseres til den fri syre selv ved konven-20 tionelle teknikker, f.eks. ved syrning og ekstraktion med et organisk opløsningsmiddel.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse belyses nærmere ved nedenstående eksempel.

EKSEMPEL

25 Isolering af lithiumpseudomonat.

Et dyrkningsmedium, der indeholder pseudomonsyre, syrnes til pH-værdi 4,5 under anvendelse af 20%'s saltsyre og ekstraheres med 1/4 af sit eget volumen methylisobutylketon. Methylisobutylketonekstrakten vaskes med 1/10 af sit eget volumen mættet saltopløsning. Pseudomon-30 syreindholdet er i dette trin 2500 yg/ml og vandindholdet er 1,0%.

Claims (2)

10 Der tilsættes 85 ml methylisobutyl keton, og pH-værdien indstilles til 4,0 med 4N saltsyre. Den øvre methylisobutyl ketonfase fraskilles og tørres over vandfrit natriumsulfat, og den frie syre udfældes ved tilsætning af 130 ml heptan. Efter afkøling til 5°C isoleres pseudomonsyre ved filtrering.

15 Herved fås 8,0 g (85% af det teoretiske), smeltepunkt 77-78°C, renhed 90%. Fremgangsmåde til fremstilling af pseudomonsyre, kendetegnet ved, at lithiumpseudomonat hydrolyseres.