RS55501B1 - Oftalmološki hirurški uređaj - Google Patents

Description

Proces za izolaciju pseudomonične kiseline A iz kompleksa pseudomonične kiseline sadržanog u kulturnom buljonu

OBLAST PRONALASKA

Predmetini pronalazak odnosi se na proces za izolaciju pseudomonične kiseline A (mupirocin) iz kompleksa pseudomonične kiseline sadržanog u kulturnom buljonu.

STANJE TEHNIKE

Pseudomonična kiselina A, takođe poznata kao mupirocin, je antibiotik koji ima formulu (I):

Poznato je da su sojeviPseudomonas fluorescenssposobni da biosintetizuju, u dodatku na pseudomoničnu kiselinu A, druge srodne antibiotike označene slovima B-D u malim količinama [E.B. Chain, G. Mellows, J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 318 (1977); J.P. Clayton i sar., Tetrahedron Lett., 21, 881 (1980); P.J.O. Hanlon, N.H. Rogers, J. Chem. Soc. Perkin Trans I. 2665 (1983)] predstavljene formulama (ll)-(IV), respektivno:

Među antibioticima pseudomonične kiseline, sa terapeutske tačke gledišta, najvrednija je pseudomonična kiselina A koja ima efekat inhibicije rasta uglavnom protiv gram pozitivnih bakterija (npr.,Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogens, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae)i nekih gram negativnih bakterija (npr.,Haemophilus influenzae, Neisieria gonorrhoeae)i njegova minimalna inhibirajuća koncentracija je u rasponu od 0.02-0.5 mg/dm<3>. Pseudomonična kiselina A, putem inhibiranja enzima izoleucin-tRNK sintaze, ima efekat na sintezu peptida patogenih bakterija [J. Hughes i G. Mellovvs, Biochem, J. 191,209-219, (1980) ]. Korisna karakteristika tog antibiotika je da je manje toksičan i za ljude i za životinje i negativan je na Ames-ovom testu. Pseudomonična kiselina A se danas koristi u humanoj terapiji, u različitim formulacijama, za tretman kožnih infekcija (npr., impetigo, pioderma), infekcija nosa i spoljašnjeg uha, akni, opekotina, ekcema, psorijaze, u slučaju čira za tretman sekundarnih infekcija i za prevenciju bolničkih infekcija.

Jedan metod za izolaciju pseudomonične kiseline A iz antibiotičkog kompleksa sadržanog u kulturnom buljonu je tečnost-tečnost ekstrakcija. U skladu sa nemačkim patentom br. 2,227,739 i U.S. patentom br. 4,289,703, dodane su rastvorljive barijumove soli u fermentacioni buljon, zatim su ćelije mikroorganizama sa nerastvorljivim inaktivnim agensima razdvojene centrifugiranjem i konačno antibiotici su ekstrahovani metil izobutil ketonom. Antibiotici su zatim uklonjeni iz ekstrakta metil izobutil ketona pomoću alkalne vode i rezultirajući vodeni alkalni ekstrakt je očišćen reekstrakcijom sa metil izobutil ketonom. Dobijen sirov produkt je podvrgnut hromatografiji i estarski derivat je pripremljen is kompleksa antibiotika pseudomonične kiseline i prečišćen sa preparativnom tankoslojnom hromatografijom. Kiseli oblik čistog antibiotika je dobijen hidrolizom.

Belgijski patent br. 870,855 odnosi se na proces u kojem je kulturni buljon ekstrahovan sa metil izobutil ketonom i iz ekstrakta je aktivna supstanca izdvojena rastvorom natrijum hidrogen karbonata. Materijali ne rstvorljivi u alkalnoj vodi razdvojeni su filtriranjem, zatim je pH filtrata zakišeljen i ekstrahovan pomoću metil izobutil ketona. Konačno je pseudomonična kiselina A dobijena koncentrisanjem ekstrakta i kristalizacijom iz mešavine metil izobutil keton-n-heptana.

Japanski patent br. 52-70083 odnosi se na dva metoda za obnavljanje pseudomonične kiseline A iz kulturnog buljona. Prema jednom od tih metoda, ćelije bakterija se razdvajaju iz kulturnog buljona centrifugiranjem, zatim se ativna supstanca ekstrahuje iz supernatanta etil acetatom. Kompleks pseudomonične kiseline se reekstrahuje iz faze etil acetata putem rastvora natrijum hidrogen karbonata i nakon zakišeljavanja ponovo je ekstrahovana sa etil acetatom. Nakon isparavanja ostatak je prečišćen na silikagel koloni primenom rastvarača hloroform-metanol i konačno čista pseudomonična kiselina A dostignuta je kristalizacijom iz diizopropil etra. U drugom procesu sirovi produkt .dobijen gornjim metodom je podvrgnut hromatografiji na DEAE-Sepadex koloni anjonske razmene primenom rastvarača metanol-amonijum i razdvojene su frakcije koje su sadržale pseudomoničnu kiselinu A.

A.D. Curzons je opisao obnavljanje pseudomonične kiseline A iz kulturnog buljona putem formiranja litijum soli (Evropski patent br. 0 005 614). Akltivni sastojak koji je sadržao ekstrakt metil izobutil ketona, dobijen na pH 4.5 je reagovan sa litijum 2-etil-heksanoatom rastvorenim u metanolu. Istaložena litijumova so pseudomonične kiseline A je razdvojena, rastvorena u vodi i oslobođena je pseudomonična kiselina A na pH 4.5 i ekstrahovana u metil izobutil ketonu i istaložena u prisustvu n-heptana.

U gore diskutovanim metodima, polarni rastvarači i oni koji se ne mešaju sa vodom (metil izobutil keton, etil acetat, n-butanol) upotrebljeni su za obnavljanje kompleksa pseudomonične kiseline iz kulturnog buljona. Prema našem iskustvu, selektivna ekstrakcija ne može se uspešno obaviti korišćenjem tih procesa, pošto sem kompleksa pseudomonične kiseline ekstrahuju se takođe i druge polarne i nepolarne nečistoće u velikim količinama. Pseudomonična kiselina A može se obnoviti u čistoj formi samo sa niskim prinosom (17-34%) alkalnom ekstrakcijom organskog rastvarača koji sadrži nečistoće u velikim količinama, zatim reekstrakcijom organskog rastvarača na kiselom pH i zatim putem kristalizacije sirovog produkta. Upotreba procesa hromatografije za prečišćavanje nije preporučljiva u proizvodnoj razmeri zbog njeni visokih radnih troškova i zahteva rastvarača. Sem toga, u prisustvu hromatografskog apsorbenta i tokom procesa hromatografije odigravaju se intramolekularne transformacije u aktivnoj supstabnci, što vodi formiranju biološki inaktivnog bio'cikličnog jedinjenja 9-{4-[1 S,6R-8R(1 S,3S-dihidroksi-2S-metil-butil)-5S-hidroksi-3,7dioksabiciklo[4.30] nononan-4S-il]-3-metil-but-2(E)-enoiloksifn'anoične kiseline (formula V). i jedinjenja 9-{4-[1R,6S-4S,10S-dihidroksi-3R-(2S-hidroksi-1S-metil-propil)-2,8-dioksabiciklo[4.4. 0]dekan-9S-il]-3-metilbut-2(E)-enoiloksi}^nanoične kiseline (formula VI).

Formiranje tih jedinjenja i njihova eliminacija putem rekristalizacije značajno redukuje obnavljanje pseudomonične kiseline A.

I ako proces izolacije preko intermedijera soli litijuma pseudomonične kiseline A ne sadrži ni jedan korak hromatografije, on nije prigodan za proces produkcije na veliko, zato što litijumova so koja se koristi u procesu čini proces komplikovanim i skupim da se koristi na veliko.

Prema tome ostaje potreba u praksi za novim procesom za izolaciju antibiotika pseudomonične kiseline A, koji je oslobođen nedostataka poznatih procesa i čija primena u produkciji na veliko rezultira u visokim prinosom obnavljanja prethodno spomenutog antibiotika.

SADRŽAJ PRONALASKA

Predmetni pronalazak je usmeren na procese za izolaciju antibiotika pseudomonične kiseline A formule (I)

sadržeći korake ekstrakcije pseudomonične kiseline A iz kulture vrsta bakterijePseudomonaskoje produkuju pseudomoničnu kiselinu A, na kiselom pH, koristeći hlorinirane alifatične ugljovodonike ili izobutil acetat, tako da je dobijen ekstrakt koji sadrži pseudomoničnu kiselinu A; i prečišćavanja pseudomonične kiseline A iz navedenog ekstrakta. Po potrebi prečišćena pseudomonična kiselina je kristalizovana.

U jednom obliku predmetnog pronalaska, korak prečišćavanja sadrži distribuciju isparenog ostatka ekstrakta između voda-alkohol i manje polarnih rastvarača sa ciljem da se uklone nečistoće, rastvaranje voda-alkohol faze sa vodom; i ekstrakciju više polarnog rastvarača da se ukloni prečišćena pseudomonična kiselina A.

uklone nečistoće, rastvaranje voda-alkohol faze sa vodom; i ekstrakciju više polarnog rastvarača da se ukloni prečišćena pseudomonična kiselina A.

U drugom obliku predmetnog pronalaska, korak prečišćavanja sadrži obnavljanje pseudomonične kiseline A iz ekstrakta sa vodenim rastvorom amonijum hidrogen karbonata, alkalnog metil hidroksida ili amonijum hidroksida, tako da se formira alkalni rastvor; zakišeljavanje alkalnog rastvora tako da se formira kiseli rastvor; ekstrakciju kiselog rastvora sa hlorinizovanim alifatičnim ugljovodonikom ili izobutil acetatom.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Na iznenađenje bilo je otkriveno da se pseudomonična kiselina A efikasno i selektivno može ekstrahovati nakon zakišeljavanja buljona i iz mikrobijalnih ćelija koje sadrže ceo buljon, i iz supernatanta dobijenog nakon razdvajanja ćelija pomoću hlorinisanih alifatičnih ugljovodonika, zatim se većina neaktivnih nečistoća koje prate pseudomoničnu kiselinu A mogu eliminisati iz sirovog produkta nakon isparavanja gornjeg ekstrakta putem distribucije isparenog ostatka između rastvora voda-alkohol i alifatičnih ugljovodonika, zatim između vodenog alkohola i aromatičnog ugljovodonika. Poželjno je da je alkohol metanol. Koristeći taj metod, iz sirovog produkta, pseudomonična kiseline A može se dobiti u kvalitetu medikamenta nakon rekristalizacije iz izobutil acetata, acetonitrila ili mešavine voda-acetonitril.

Prema preferiranom metodu predmetnog pronalaska, tokom izolacije antibiotika pseudomonične kiseline A ćelije mikoorganizama se razdvajaju na gotovo neutralnom pH centrifugiranjem. Nakon centrifugiranja kulturnog buljona na gotovo neutralnom pH glavni deo pseudomonične kiseline A je u supernatantu i može se obnoviti ekstrakcijom iz supernatanta, preferentno na pH 4.5. Preferentno, ekstrakcija antibiotika radi se sa hlorinisanim alifatičnim ugljovodonikom, još poželjnije sa metilen hloridom.

Primarno prečišćavanje pseudomonične kiseline A u ekstraktu metilen hlorida može se izvesti primenom distribucione separacije. Moguće pigmentne i lipidne nečistoće sirovog produkta mogu' se razdvojiti distribucijom između 10% vode koja sadrži mešavinu voda-metanol i alifatičnog ugljovodonika kao što je n-heksan ili n-heptan. Glavni deo lipidnog tipa nepolarnih inaktivnih nečistoća prenesen je u n-heksan ili n-heptansku fazu. Povećavajući sadržaj vode faze voda-metanol sve do 25% i ekstrahujući je koristeći aromatični ugljovodonik, preferentno koristeći toluen, mogu se eliminisati polarno aktivnije nečistoće iz sirovog produkta.

Povećavajući sadržaj faze voda-metanol do 50% i ekstrahovanjem pomoću rastvarača koji se ne meša sa vodom, preferentno pomoću metilen hlorida, etil acetata, metil izobutil ketona, n-butil-acetata, ili izobutil acetata i isparavajući organski rastvarač, dobijen je sirov produkt pseudomonične kiseline A.

Pseudomonična kiselina A može se radvojiti od drugih komponenti kompleksa pseudomonične kiseline koje su se formirale tokom biosinteze putem kristalizacije, preferentno koristeći mešavinu rastvarača metil izobutil keton-n-heptan.

U drugom obliki predmetnog pronalaska, ekstrakcija celog buljona može se obaviti u prisustvu ćelija mikroorganizama na pH 4.5 pomoću hlorinisanog alifatičnog ugljovodonika, preferentno pomoću metilen -hlorida. Kompleks pseudomonične kiseline ekstrahovan je iz ekstrakta metilen hlorida pomoću 2% rastvora natrijum hidrogen karbonata i kompleks pseudomonične kiseline je dobijen u kiseloj formi iz vodene faze, poželjno na pH 4.5,

pomoću metilen hlorida.

Dalje, takođe je shvaćeno da nakon zakišeljavanja pseudomonična kiselina A rastvorena u buljonu i vezana za ćelije biomase može efikasno i selektivno biti ekstrahovana koristeći za ekstrakciju izobutil acetat. Takođe je nađeno da nakon ekstrakcije kulturnog buljona pseudomonična kiselina A može biti obnovljena iz ekstrakta izobutil acetata poželjnije pomoću amonijum hidrogen karbonata, amonijum hidroksida ili alkalnog metal hidroksida. Preferirani alkalni metal hidroksid je natrijum hidroksid. Nakon zakišeljavanja gornjih ekstrakata, i njihovog ekstrahovanja sa izobutil acetatom, može biti dobijen ekstrakt koncentrovanog organskog rastvarača iz kojeg se može isparavanjem pripremiti kristalni sirov produkt. Nakon rekristalizacije ovog poslednjeg iz izobutil acetata, mešavina acetonitrila i/ili voda-acetonitril može se dobiti pseudomonične kiseline A u medikamentnom kvalitetu.

Prema poželjnom obliku predmetnog pronalaska, ekstrakcija antibiotika iz ukupnog buljona obavljena je izobutil acetatom, preferentno na pH od oko 4.5. Sa ciljem da se eliminiše formiranje emulzije, može se upotrebiti deemulzifikator, poželjno Armogard D5397 (AKZO Chemicals Ltd., Lancashire, Velika Britanija). Poželjno deemulzifikator sadrži oko 0.1% u 10 vol.% rastvora izobutil acetata. Iz ekstrakta izobutil acetata razdvojenog na separatom tipa VVestfalia kompleks pseudomonične kiseline je obnovljen sa vodenim rastvorom natrijum hidroksida i sirov produkt dobijem nakon ekstrakcije na kiselom pH je kristalizovan iz petroleum etra (raspon ključanja: 60-95 °C) i mešavine rastvarača izobutil acetata. Dobijem' produkt je rekristalizovan, preferentno iz acetonitrila; zatim je vodeni rastvor ostavljen na miru i zatim obnovljen nakon filtriranja.

Kulturni buljon bilo kog soja mikroorganizma bakterija rodaPseudomonassposoban za biosintezu pseudomonične kiseline A je pogodan za upotrebu kao polazni materijal za metod predmetnog pronalaska.

Za kiseli tretman ćelija mikroorganizama, mogu biti upotrebljene i mineralne kiseline kao što su hlorovodonična kiselina, sulfurična kiselinai fosforna kiselina i organske kiseline kao što su sirćetna kiselina i oksalna kiselina. Za tu svrhu oksalna kiselina i sulfurična kiselina su posebno korisne.

Na kraju fermentacije, određen je egzaktni sadržaj pseudomonične kiseline A i srodnih jedinjenja tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom. Kulturni buljon je dva puta razblažen etanolom, tretiran ultrasonično i centrifugiran i supernatant je korišćen za analizu. Utvrđeno je da pseudomonična kiselina A i srodna jedinjenja pripremljena koristeći metod predmetnog pronalaska imaju sledeće vremena retencije: pseudomonična kiselina A (I) 8.34 min, pseudomonična kiselina B formule (II) 6.83 min, pseudomonična kiselina C formule (III) 16.8 min, pseudomonična kiselina D formule (IV) 6.8 min, minor komponenta formule (V) 6.55 min, minor komponenta formule (VI) 6.9min [mašina, LKB 2248 pumpa, LKB 2157 autosampler, LKB 2155 kolonska pećnica, LKB 2141 UV detektor, analiza na 222 nm, kolona: Nucleosil C1810um (BST), rastvarač: mešavina (35:65) acetonitrila i vodenog rastvora 0.1 M NaH2P04(pH=4.2), stopa protoka 1.0 ml/min].

Struktura izolovane pseudomonične kiseline A je određen pomoću UV, IR,<1>H-NMR,,<3>C-NMR i masenim spektroskopskim ispitivanjem. Pseudomonična kiselina A pripremljena u skladu sa predmetnim pronalaskom bila je identična polimorfnom obliku I publikovanom u internacionalnom patentu br. VVO92/10493.

Proces prema predmetnom pronalasku ilustrovan je sledećim primerima. Međutim,

predmetni pronalazak nebi trebalo da bude protumačen kao ograničen njima.

PRIMERI

Primer 1

pH 5 litara kulturnog buljona sa 1200//g/ml mupirocina je doterano uz stalno mešanje na 4.5 pomoću 20% sumporne kiseline (60ml). Zakišeljena tečnost ekstrahovana je pomoću 2.5 litara metilen hlorida. Faze su zatim razdvojene i gruba faza je preparirana iz emulzifikovane organske faze centrifugiranjem. Prema prethodnom koraku kulturni buljon je dva puta ponovo ekstrahovan sa 1.25 litara metilen hlorida. Kombinovani ekstrakti metilen hlorida isprani su sa 1.25 litara dejonizovane vode. Faze su razdvojene na ispod 20 °C, metilen hlorid je prvo ekstrahovabn sa 0.5 litara i zatim sa 0.25 litara 2% rastvora natrijum hidrogen karbonata. Faze su razdvojene i ekstrakti su kombinovani. Kombinovani ekstrakt je ohlađen do ispod 20 °C i pH ekstrakta je doteran uz kontinuirano mešanje na 4.5 pomoću 20% sumporne kiseline. Dobijeni kiseli rastvor je ekstrahovan jednom sa 0.38 litara i jednom sa 0.19 litara metilen hlorida. Kombinovani ejkstrakti metilen hlorida su isprani sa 0.19 litara dejonizovane vode, zatim je ekstrakt metilen hlorida izbistren na sobnoj temperaturi sa ćumurom (0.42 g). Nakon izbistravanja ekstrakt metilen hlorida je isparen. Ostatak isparavanja (oko 8 g) je.rastvoren u 16 ml izobutil acetata na sobnoj temperaturi. Rastvor je ohlađen uz mešanje na 0-5<C>C i mešanje je produženo sve do početka kristalizacije. Zatim je izvedena kristalizacija na toj temperaturi preko noći. Istaloženi mupirocin je filtriran, zatim je obavljeno naknadno ispiaranje pomoću 2x4 ml hladnog (ispod 5 °C) izobutil acetata i pomoću 6 ml mešavine (1:2) izobutil acetat-petroleum etra. Nakon toga antibiotik je ispran suspenzijom u 2x25 ml petroleum etra (raspon ključanja: 60-95 °C) i osušen na 50 °C u vakumu. Dobijeni mupirocin je rastvoren na 40-45 °C u 60 ml izobutil acetata. Rastvor je ohlađen do sobne temperature i 60 ml petroleum etra (raspon ključanja: 60-95 °C) je unesen kap po kap u rastvor. Zatim je obavljena kristalizacija na 0-5 °C preko noći. Istaloženi kristali , bili su filtrirani i obavljeno je naknadno ispiranje sa 2x4 ml hladne (ispod 5 °C) mešavine izobutil acetat-petroleum etra (1:2). Zatim je produkt ispran suspendovanjem u 3x20 ml petroleum etra. Mupirocin je sušen u vakukmu na temperaturi 50 °C sve do konstantne težine. Na taj način dobijeno je 3.3 g čistog mupirocina koji je imao sledeće karakteristike:

Primer 2

pH 5 litara kulturnog buljona sa 1500//g/ml mupirocina je doterano uz stalno mešanje na 4.5 pomoću 20% sumporne kiseline. Zakišeljena tečnost ekstrahovana je pomoću 2.5 litara izobutil acetata. Faze su zatim razdvojene i gruba faza je preparirana iz emulzifikovane organske faze centrifugiranjem. Prema prethodnom koraku kulturni buljon je ponovo ekstrahovan sa 1.25 litara izobutil acetata. Kombinovani ekstrakti izobutil acetata isprani su sa 1.25 litara dejonizovane vode. Faze su razdvojene i dodano je 0.5 litara dejonizovane vode u ekstrakt izobutil acetata. pH mešane faze je doteran do 8.0±0.2 pomoću 5% amonijum hidroksida. Faze su razdvojene i izobutil acetat je ponovo ekstrahovan sa 0.5 litara dejonizovane vode na pH 8.0±0.2. Kombinovani alkalni ekstrakt je ohlađen do ispod 20 °C i pH ekstrakta je doteran uz kontinuirano mešanje na 4.5 pomoću 20% sumporne kiseline. Dobijeni kiseli rastvor je ekstrahovan jednom sa 0.5 litara i zatim jednom sa 0.25 litara izobutil acetata. Kombinovani ekstrakti izobutil acetata su isprani sa 0.25 litara dejonizovane vode, zatim je ekstrakt izobutil acetata izbistren na sobnoj temperaturi sa 0.52 g ćumura. Nakon izbistravanja ekstrakt izobutil acetata je koncentrisan u vakumu do konačne zapremine od 13 ml. Zatim je obavljena kristalizacija i rekristalizacija mupirocina kao i u primeru 1. Na taj način dobijeno je 3.75 g mupirocina koji je imao iste fizičke karakteristike kao one opisane u primeru 1.

Primer 3

80 litara kulturnog buljona sa koncentracijom od 1000//g/ml mupirocina je centrifugirano sa super centrifugom tipa F-100 (proizvođač: Budapesti Vegvipari Gepgvar), zatim je pH supernatanta doteran do 4.5 sa oksalnom kiselinom (oko 0.69 litara). Zakišeljeni rastvor je dva puta ekstrahovan pomoću 24 litra metilen hlorida i kombinovani ekstrakti su ispareni u vakumu. Uljani ostatak (oko 0.14 kg) je rastvoren u 0.56 litara 10% metanola sa vodom i zatim je rastvor dva puta ekstrahovan sa 0.56 litara n-heksana. Metanolični rastvor je razblažen dejonizovanom vodom do 25% sadržaja vode i rastvor je ekstrahovan dva puta sa 0.56 litara toluena.

Nakon toga metanolični rastvor je razblažen sa dejonizovanom vodom do 50% sadržaja vode i rastvor je ekstrahovan jedan put sa 0.56 litara metilen hlorida, zatim jedan put sa 0.28 litara metilen hlorida. Kombinovani ekstrakti metilen hlorida su ispareni u vakumu. Dobijeni ostatak isparavanja (oko 0.11 kg) je procesovan u skladu sa primerom 1, rezultirajući sa 44 g mupirocina, koji je imao iste fizičke karakteristike kao u primeru 1.

Primer 4

pH 160 litara kulturnog buljona koji je sadržo mupirocin u koncentraciji od 1200//g/ml je doterano uz stalno mešanje na 4.5±0.2 pomoću 20% sumporne kiseline (oko 2.7 litara). Nakon toga zakišeljena tečnost ekstrahovana je pomoću 80 litra izobutil acetata. Nakon 30 min. mešanja dodano je 0.1% demulzifikatora u nju (1g Armogard D539/litar buljona u rastvoru izobutil acetata). Faze su zatim razdvojene pomoću separatora tipa SA1-01-175 VVestfalia (VVestfalia Separator A.G., Oelde, Germanv). Kulturni buljon je ponovo ekstrahovan sa 40 litara izobutil acetata i razdvojen u skladu sa prethodnim korakom. Ekstrakt izobutil acetata je ispran sa 40 litara dejonizovane vode. Isprani ekstrakt izobutil acetata je zatim pomešan sa 20 litara dejonizovane vode i zatim je 400 ml masenog % rastvora magnezijum

sulfata dodano u mešavinu kao deemulzifikator. Dalje je pH mešavine vodenog izobutil acetata doteran sa natrijum hidroksidom do 8.010.2. Nakon 20 min. mešanja faze su razdvojene i ekstrakt izobutil acetata je ponovo ekstrahovan na pH 8.2±0.2. Kombinovani vodeni alkalni rastvor je ekstrahovan sa 12 litara izobutil acetata u prisustvu 800 ml 10 masenih % magnezijum sulfata. Nakon separacije faza dodano je 8 litara izobutil acetata vodenoj fazi, zatim je pH mešavine vodenog izobutil acetata doteran do 4.5+0.2 pomoću 20% rastvora sumporne kiseline. Nakon 20 minuta mešanja faze su razdvojene i kiseli rastvor je ponovo ekstrahovan kao što je prethodno napisano. Kombinovani ekstrakti izobutil acetata su isprani sa 5 litara dejonizovane vode u prisustvu 100 ml 10 masenih % rastvora magnezijum sulfata. Faze su razdvojene i ekstrakt izobutil acetata je isparen u vakumu do 1.1 litar konačne zapremine. Koncentrat izobutil acetata je pomešan sa 110 ml petroleum etra (raspon ključanja: 60-95 °C) i kristalizacija je obavljena na 0-5 °C tokom 24 časa. Istaloženi kristali bili su filtrirani i isprani sa hladnim (ispod 5 °C ) izobutil acetatom. Zatim je vlažni sirovi produkt suspendovan u 600 ml petroleum etra, filtriran i osušen u vakumu na 40 °C. Dobijenu mupirocin je rastvoren u 550 ml acetonitrila na 40-50 °C, i izbistren na prethodnoj temperaturi sa ćumurom (5.5 g). nakon izbistravanja rastvor je ohlađen na sobnu temperaturu, zatim je držan na 0-5 °C toko 24 časa. Iztaloženi mupirocin je filtriran, zatim je obavljeno dodatno ispiranje sa 50 ml hladnog (ispod 5 °C) acetonitrila. Vlažni kristali su suspendovani u 200 ml dejonizovane vode, zatin je dodana druga količina od 200 ml dejonizovane vode u suspenziju. Tada je obavljena kristalizacija na 0-5 °C tokom 24 časa. Kristali su filtrirani i obavljeno je dodatno ispiranje sa 2x50 ml dejonizovane vode. Produkt je osušen u vakumu na 40 °C tokom 72 časa. Na taj način dobijeno je 80.6 g mupirocina koji je imao iste fizičke karakteristike kao u primeru 1.

I ako su određeni trenutno preferirani oblici pronalaska opisani ovde onima sa iskustvom u praksi na koje se pronalazak odnosi biće očigledno da se mogu napraviti varijacije i modifikacije opisanog oblika bez odstupanja od duha i okvira pronalaska. Shodno tome namera je da se pronalazak ograniči samo na obim zahtevan priključenim patentnim zahtevima i primenjivim pravilima zakona.

Claims (17)

1. Proces za izolaciju antibiotika pseudomonične kiseline A formule (I) naznačen time što sadrži korake: ekstrahovanja pseudomonične kiseline A iz kulture vrsta bakterijskog rodaPseudomonaskoje produkuju pseudomoničnu kiselinu A, na kiselom pH, koristeći hlorinisani alifatični ugljovodonik ili izobutil acetat, tako da se dobija pseudomonična kiselina A koja sadrži ekstrakt; i prečišćavanja pseudomonične kiseline A iz pomenutog ekstrakta.

2. Proces iz zahteva 1, naznačen time što korak prečišćavanja sadrži distribuiranje ekstrakta između faze voda-alkohol i organske faze koja sadrži najmanje jedan organski rastvarač; i isparavanja organskog rastvarača.

3. Proces iz zahteva 2, naznačen time što je pomenuti alkohol metanol.

4. Proces iz zahteva 3, naznačen time što je ekstrakt distribuiran između 10% rastvora voda-metanol i alifatičnog ugljovodonika.

5. Proces iz zahteva 4, naznačen time što je alifatični ugljovodonik heksan ili heptan.

6. Proces iz zahteva 5, naznačen time što je alifatični ugljovodonik n-heksan.

7. Proces iz zahteva 3, naznačen time što je ekstrakt distribuiran između 25% rastvora voda-metanol i aromatičnog ugljovodonika.

8. Proces iz zahteva 7, naznačen time što je aromatični ugljovodonik toluen.

9. Proces iz zahteva 3, naznačen time što je ekstrakt distribuiran između 50% rastvora voda-metanol i rastvarača koji se ne meša sa vodom.

10. Proces iz zahteva 9, naznačen time što je rastvarač koji se ne meša sa vodom selekcionisan iz grupe koja se sastoji od metilen hlorida, etil acetata, metil izobutil ketona, n-butil acetata i izobutil acetata.

11. Proces iz zahteva 1, naznačen time što korak prečišćavanja sadrži obnavljanje pseudomonične kiseline A iz ekstrakta sa vodenim rastvorom amonijum hidrogen karbonata, alkalnog metal hidroksida ili amonijum hidroksida. tako da se formira alkalni rastvor; zakišeljavanja alkalnog rastvora tako da se formira kiseli rastvor; i ekstrakcije kiselog rastvora sa izobutil acetatom.

12. Proces iz zahteva 11, naznačen time što je pseudomonična kiselina A obnovljena iz ekstrakta sa vodenim rastvorom natrijum hidroksida.

13. Proces iz zahteva 11, naznačen time što je pseudomonična kiselina A obnovljena iz ekstrakta sa vodenim rastvorom amonijum hidroksida.

14. Proces iz zahteva 11, naznačen time što je pseudomonična kiselina A obnovljena iz ekstrakta sa vodenim rastvorom amonijum hidrogen karbonata.

15. Proces iz zahteva 1, naznačen time što dalje sadrži korake isparavanja i kristalizacije prečišćene pseudomonične kiselina A.

16. Proces iz zahteva 15, naznačen time što je sirova pseudomonična kiselina A kristalizovana iz izobutil acetata ili mešavine izobutil acetat-petroleum etra.

17. Proces iz zahteva 15, naznačen time što je sirova pseudomonična kiselina A kristalizovana iz acetonitrila, vode ili mešavine acetonitrila i vode.