DK154253B - Perfusat til opbevaring af organer til transplantation, fremgangsmaade til fremstilling af perfusatet og fremgangsmaade til opbevaring af et organ under anvendelse af perfusatet - Google Patents

Description

DK 154253 B

Den foreliggende opfindelse angår et perfusat til brug ved opbevaring af organer til transplantation, hvilket perfusat indeholder en Ringer's opløsning, hvori der er opløst albumin, og mindst en emulgeret, flydende, 5 eventuelt substitueret perfluorcarbonforbindelse og mindst et emulgeringsmiddel. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af perfusatet og en opbevaringsmetode, ved hvilken man anvender det omhandlede perfusat, og nærmere bestemt en fremgangsmåde til opbe-10 varing af et organ, der skal transplanteres,.hvorved man som perfusat anvender en blanding bestående af en modificeret Ringer's opløsning, der tjener som primær saltopløsning, albumin og en emulsion i form af en per-fluorcarbonforbindelse.

15 I de senere år er der sket mærkbare tekniske fremskridt med hensyn til at kunne opbevare et organ, der skal benyttes til transplantation. Specielt er der sket tekniske fremskridt med hensyn til opbevaring af nyrer, og dette har medført en udbredelse af 20 nyretransplantationer, ved hvilke der anvendes nyrer fra afdøde personer. Dette fremskridt skyldes i høj grad forbedringer af de anvendte perfusater. F. eks. kan de kliniske metoder til opbevaring af nyrer til transplantationsformål i store træk klassificeres i 25 to kategorier, hvoraf den ene er hypotermisk opbevaring (ved nedsænkning) (Lancet, 2, 1219 - 1222 (1969)), mens den anden er hypotermisk kontinuerlig per fusion (Lancet, 2, 536 (1967)). I praksis anvender man den førstnævnte metode til kortvarige opbevaringer, mens 30 den sidstnævnte metode anvendes til opbevaringer af længere varighed. Når der sker en stadig udbredelse af nyretransplantationer med nyrer fra afdøde personer, vil langvarige opbevaringer, dvs. opbevaringer ved perfusion, få stadig større betydning.

35 Ued nyretransplantationer, hvor der anvendes nyrer fra afdøde personer, stammer disse nyrer fortrinsvis 2

DK 154253 B

fra personer, som har været udsat for ulykkestilfælde.

De nødvendige foranstaltninger, som skal træffes i det tidsrum, der forløber fra en sådan nyre stilles til rådighed og indtil transplantationen kan finde 5 sted, omfatter undersøgelser af histokompatibiliteten imellem nyren og patienten, udvælgelse af en egnet recipient, transport af nyren samt forberedelser til transplantationen af denne. Af disse årsager er det nødvendigt at opbevare den afgivne nyre så længe ID som muligt. Der har foreløbig været udført mange forsøg på at opbevare nyrer fra afdøde personer i længere tidsrum. Disse forsøg har primært drejet sig om udvikling og forbedring af perfusater.

Den stadig mere udbredte kliniske anvendelse af den 15 hypotermiske kontinuerte perfusion kan føres til bage til det forskningsarbejde, som udførtes af Belzer et al. (Lancet 536, 2, (1967)). Det lykkedes for disse forskere at opbevare en hundenyre i 72 timer ved som perfusat at anvende et plasma, der var befriet 20 for fibrinogen i så stor udstrækning som muligt, og som var fremstillet ved frysning og efterfølgende smeltning af et kryoudfældet plasma. Siden offentliggørelsen af deres forskningsrapport har man først og fremmest anvendt kryoudfældet plasma som perfusat til opbevaring 25 af nyrer.

I 1974 udviklede Toledo-Pereyra et al. (Surg, Gynecol.

Obstet, 138, 901 - 905 (1974)) et nyt perfusat bestående af silicagel-behandlet kryoudfældet plasma. Dette plasma er befriet for (3-lipoprotein hidrørende fra 30 det fibrinogen, som stadig findes i det konventionelle kryoudfældede plasma. I det nye perfusat er niveauet af uopløselige fedtstoffer, dvs. triglycerider, endvi- 3

DK 154253 B

dere reduceret til en tredjedel. Med det konventionelle kryoudfældede plasma er der stor risiko for forekomst af emboli under perfusionen, hvilket skyldes det residuelle fibrinogen, lipoprotein eller neutra- 5 le fedtdråber. Denne risiko reduceres væsentligt, når man anvender det ovennævnte kryoudfældede plasma, der er behandlet med silicagel. Imidlertid er der andre problemer knyttet til anvendelsen af dette kryoudfældede plasma. For det første er den præparative procedure 10 ikke fuldstændig fastlagt, og sammensætningen af det fremstillede plasma udviser tendens til variation, hvilket gør det vanskeligt at opnå præparater med konstant proteinindhold og konstant elektrolytsammensætning. For det andet er der stadig en vis risiko for 15 dannelse af emboli under perfusionen på grund af en ufuldstændig fjernelse af den uopløselige fedtfraktion. For at reducere denne risiko er det nødvendigt at benytte en kostbar membran-oxygenator. For det tredje mangler man en egnet inaktiveringsbehandling over 20 for hepatitis-virus, hvilket indebærer risiko for en infektion med dette virus, og manglen på en sådan behandling er et væsentligt problem. Selv om det kryoudfældede plasma er et fremragende perfusat til opbevaring af nyrer, er der således visse ulemper forbun-25 det med anvendelsen af dette plasma.

Det anførtes, at man for at overvinde de ovennævnte vanskeligheder, som er forbundet med det kryoudfældede plasma, gjorde et forsøg på at anvende en albuminopløsning som perfusat, og herved opnåede man heldige re-30 sultater ved dyreforsøg. Grundman et al. (Transpi., 17, 299 - 305 (1974)) perfuserede en hundenyre med en 6?ό albuminopløsning, og det lykkedes at opbevare nyren i 96 timer. Det benyttede perfusat var en Krebs Ringer's opløsning indeholdende 6% (ω/ν) humant albumin.

35 Hundenyren undergik perfusion i 96 timer ved lav tem peratur, hvorefter den blev autotransplanteret,og over- 4

DK 154253 B

levelsesprocenten ved transplantationen var over 80, hvilket viste, at albuminopløsningen er et fremragende perfusat, som i sammenligning med det kryoudfældede plasma er meget fordelagtigt.

5 Opbevaring af en nyre i længere tid kræver et perfusat, der har et vist kolloidt osmotisk tryk ved lave temperaturer såvel som en passende, elektrolytsammensætning, og det skal desuden indeholde en vis mængde oxygen. Når nyren opbevares ved lave temperaturer, 10 forbruger den en væsentligt mindre mængde oxygen,

end når den opbevares ved stuetemperatur, men den kræver dog en vis mængde oxygen for at kunne opretholde sin'funktion. Ifølge en klassisk undersøgelse foretaget af Levy (American Journal of Physiology 197, 1111 -15 1114, (1959)) er en nyres oxygenforbrug ved 8 - 10 °C

omkring 3 ^ul/g/minut, hvilket svarer til omkring 20¾ af forbruget ved stuetemperatur. Ved opbevaring af en nyre er det således generel praksis, at man perfuserer den med et perfusat, mens den oxygeneres.

20 En mættet organisk perfluorforbindelse (i det følgende forkortet PFC) er en væske, som er i stand til at opløse et betragteligt volumen oxygen, og som virker som en bærer for oxygen, når den anvendes i form af en emulsion. Der udføres en del forskning vedrørende 25 kunstigt blod, som gør brug af den ovennævnte karak-teriske egenskab ved PFC-emulsionen. Denne PFC-emul-sion fungerer udmærket som bærer for oxygen såvel in vivo som in vitro (i et system, der befinder sig udenfor legemet, såsom et perfusionssystem). En sådan egen-50 skab muliggør, at PFC-emulsionen med fordel kan anvendes som en bærer for oxygen ved opbevaring af nyrer.

Foruden at være et godt opløsningsmiddel for oxygen er den udvalgte PFC biologisk inert og frembyder ikke nogen problemer med hensyn til direkte toxicitet over-55 for vævet. Når man derfor anvender PFC som perfusat 5

DK 154253 B

ved opbevaring af nyrer, optræder der ikke nogen problemer med hensyn til toxicitet.

Undersøgelser over opbevaring af en nyre ved anvendelse af en PFC-emulsion er påbegyndt inden for de senere 5 år og kan føres tilbage til et forskningsarbejde af

Nakaya et al. (Proceedings of Symposium on Perfluorochemical Artificial Blood, Kyoto 1976, 187 - 201).

Disse forskere undersøgte levedygtigheden af en nyre ad biologisk vej ved at perfusere en kaninnyre med 10 en FC-43-emulsion (en perfluortributylaminemulsion) i 9 timer ved stuetemperatur. Sammenlignet med en kontrolgruppe perfuseret med Ringer’s opløsning opretholdt nyren, der var perfuseret med FC-43-emulsionen, en udmærket mitochondriefunktion og højere aktivitetsni-15 veauer med hensyn til glycolytiske og gluconeogene- tiske nøgleenzymer, hvilket viste, at oxygentransporten ved hjælp af FC-43 har en effektiv indflydelse på opretholdelsen af den perfuserede nyres funktioner. Imidlertid koncentrerede de ovennævnte forskere 20 sig fortrinsvis om det biologiske aspekt og ikke om transplantation af en opbevaret nyre. Resultaterne af en transplantation af en hundenyre, der var opbevaret ved perfusion ved hjælp af en PFC-emulsion, blev rapporteret af Bercowitz (J. Surg. Res., 2£, 595 - 600 25 (1976)). Han perfuserede en hundenyre i 24 timer ved lav temperatur med en PFC-emulsion indeholdende albumin og et kryoudfældet plasma. Den opbevarede nyre blev derefter autotransplanteret, og overlevelses-graden i forbindelse med transplantationen blev un-30 dersøgt. Overlevelsesgraden viste sig at være 100¾ i alle fem tilfælde, hvorimod den var 62¾ i fem kontroltilfælde ud af otte, hvor perfusatet ikke indeholdt nogen FC-43-emulsion. Dette illustrerer klart fordelene ved FC-43-systemet.

35 De to ovennævnte rapporter viser, at PFC-emulsionen er et effektivt perfusat til opbevaring af en nyre

DK 154253B

6 ved såvel lave temperaturer som ved stuetemperatur.

De opbevaringsperioder, som er beskrevet i de ovennævnte to rapporter, er imidlertid ikke tilstrækkeligt lange til at sikre, at de omtalte opbevaringsmetoder kan an-5 vendes i praksis. Specielt er FC-43-emulsionen, der indeholder albumin, ikke tilstrækkeligt stabil til at tilvejebringe et normaliseret præparat.

På grundlag af de ovennævnte forhold har man derfor foretaget studier af et PFC-43-holdigt perfusat til 10 langvarig opbevaring af et organ, specielt en nyre, til brug ved transplantation. Resultaterne af disse studier danner baggrund for den foreliggende opfindelse.

Det er således et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe et PFC-perfusat samt en metode til effek-15 tiv langvarig opbevaring af organer til transplantation.

Opfindelsen består nærmere bestemt af et perfusat til opbevaring af et organ til transplantation, hvilket perfusat indeholder en Ringer's opløsning, hvori der er opløst albumin og mindst en emulgeret, flydende, eventuelt substitue-20 ret perfluorcarbonforbindelse og mindst et emulgeringsmiddel, og perfusatet ifølge opfin-delsen er ejendommeligt ved, at den anvendte Ringer's opløsning er modificeret på en sådan måde, at den indeholder kaliumioner i en koncentration på mellem 8 og 20 m.ækv./liter.

25 Den Ringer's opløsning, som er udgangspunktet for den modificerede Ringer's opløsning, er ikke underkastet nogen specielle begrænsninger, men kan være en sædvanlig opløsning eller en opløsning modificeret af Locke,

Tyrode, Earle, Hanks eller Krebs. Modifikationen består 30 i, at koncentrationen af kaliumioner forøges fra det normale niveau på 4 -6 m.ækv./liter til mellem 8 og 20, fortrinsvis mellem 8 og 15 m.ækv./liter. Denne forøgede koncentration er valgt med det formål at opnå 7

DK 154253 B

en nærmere approximering af kaliumion-niveauet i den ekstracellulære væske. Ued at vælge en sådan koncentration af kaliumioner bliver det muligt at opnå en kraftig forøgelse af overlevelsesgraden for et organ, 5 specielt en nyre, som er opbevaret i længere tid ved perfusion. Den modificerede Ringer's opløsning har en osmolaritet på 290 - 300 mOsm/liter og en pH-værdi på mellem 7,1 og 7,7 ved 20 °C. I den efterfølgende tabel 1 er vist saltsammensætningen af nogle typiske modifi-10 cerede opløsninger, og til sammenligning er vist salt sammensætningen af et normalt plasma, som er en prototype på en normal Ringer's opløsning.

8

DK 154253 B

TABEL 1

Eksempler på elektrolytsammensætningen af en modificeret Ringer's opløsning. Enhed: m.ækv./liter

Modificeret Ringer's opløsning til anvendelse i perfusatet ifølge opfindelsen Normalt N. plasma

Ion _1__2__3___

Na+ 112 142 llé 142 K+ 11 8 10 5

Mg++ 7 2 6 2

Ca++ 3

Cl" 118 103 13 103 HC03" 3 27 10 27 HP04" 2 2 101 2 S04“ 7 6

Glucose 33 139

Lactose 5 5 9

DK 154253 B

Perfusionsvæsken til opbevaring af et organ fremstilles ifølge opfindelsen ved, at man blander en Ringer's opløsning, som er modificeret med hensyn til mængden af kaliumioner ved forøgelse af denne mængde til mellem 5 8 og 20 m.ækv./liter, en opløsning af albumin i den modificerede Ringer's opløsning og en stabil emulsion af en perfluorcarbonforbindelse i den modificerede Ringer's opløsning, således at koncentrationen af albumin er mellem 1 og 8 So (w/v), og således at koncentrationen 10 af perfliuorcarbonforbindelsen er mellem 7,5 og 12,5 % (w/v).

PFC-emulsionen, som anvendes i perfusionsvæsken ifølge den foreliggende opfindelse, fremstilles ud fra en flydende perfluorcarbonforbindelse, som er i stand til 15 at absorbere oxygen. Fremstillingsmetoden er kendt og er f.eks. beskrevet i US patentskrifterne nr. 3 958 014, 3 911 138 og nr. 3 962 439 i tysk offentliggørelsesskrift nr. 2 630 586. Det anføres i disse skrifter, at man kan fremstille en stabil emulsion, som er egnet 20 til anvendelse som kunstigt blod, ved at emulgere en perfluorcarbonforbindelse ved hjælp af et phosphorlipid som emulgeringsmiddel (US patentskrift nr. 3 958 014), med et phosphorlipid og en fedtsyre med 8-22 carbona-atomer som hjælpemiddel (US patentskrift nr. 3 962 439) 25 eller ved at anvende en polyoxyethylen-polyoxypropylen- copolymer (molekylvægt 2000-20000) som ikke-ionisk emulgeringsmiddel (US patentskrift nr. 3 911 138). Man kan også anvende en polyoxyethylen-alkylether eller poly-oxyalkyl-allylether, eller man kan samtidigt anvende 30 de ovenfor anførte fedtsyrer, de ikke-ioniske emulge ringsmidler og den ovennævnte fedtsyre, der tjener som hjælpemiddel ved emulgeringen (tysk offentliggørelses-skrift nr. 2 630 586).

Perfluorcarbonforbindelserne, der skal emulgeres, er 10

DK 154253 B

sådanne, som ikke giver uheldige bivirkninger på organer eller væv, og der er tale om perfluoralkaner, mættede perfluorcarbonforbindelser, der fortrinsvis indeholder 9-12 carbonatomer, hvoraf i det mindste en del danner 5 mindst en mættet alicyclisk ring, en heterocyclisk ring sammen med et nitrogen og/eller et oxygenatom, en ali-fatisk tertiær amin sammen med et nitrogenatom eller en alifatisk ether sammen med et eller flere oxygen-atomer.

10 Den første gruppe af perfluorcarbonforbindelser anvendt i den foreliggende opfindelse omfatter perfluoralkaner, perfluorcycloalkaner og perfluoralkylcycloalkaner, hvilken gruppe eksempelvis omfatter perfluor (Cg_^2-al|<a-ner) såsom perfluordecan og perfluordodecan, perfluor 15 alkylcycloalkaner) såsom perfluor(methylpropylcyclo- hexaner), perfluor(butylcyclohexaner), perfluor-(trimethylcyclohexaner), perfluor(ethylpropylcyclo-hexaner) og perfluor(pentylcyclohexaner), perfluorde-calin, perfluor(methyldecaliner) og perfluor(dimethyl-20 decaliner).

Den anden gruppe omfatter perfluor(alkyl-mættet heterocyclisk ) -forbindelser , der f. eks. kan være perfluor-(alkyltetrahydropyraner) såsom perfluor(butyltetrahy-dropyraner), perfluor(pentyltetrahydropyraner) og per-25 fluor(hexyltetrahydropyraner), perfluor(alkyltetra- hydrofuraner) såsom perfluor(pentyltetrahydrofuraner), perfluor(hexyltetrahydrofuraner) og per fluor(heptyl-tetrahydrofuraner), perfluor(N-alkylpiperidiner) såsom perfluor(N-pentylpiperidiner), perfluor(N-hexyl-30 piperidiner) og perfluor(N-butylpiperidiner) samt per- fluor(N-alkylmorpholiner) såsom perfluor(N-pentyl-morpholiner), perfluor(N-hexylmorpholiner) og perfluor-(N-heptylmorpholiner).

Den tredje gruppe omfatter perfluor(tert-aminer), 35 som eksempelvis kan være per fluor(tributylamin), 11

DK 154253 B

perfluor(diethylhexylamin), perfluor(dipropylbutyl-amin) og perfluor(diethylcyclohexylamin), og per-fluor (dioxaalkaner), dvs. perfluor(alkylenglycol-dialkylethere), såsom perfluor(3,8-dioxa-2,9-dimethyl-5 decan) eller perfluor(tetramethylenglycol-diiso- propylether), perfluor(3,7-dioxa-2,8-dimethylnonan) eller perfluor(trimethylenglycol-diisopropylether) og perfluor(4,6-dioxa-5,5-dimethylnonan) eller per-fluor ( isopropylenglycol-di-n-propylether).

10 Den således fremstillede emulsion af PFC i den modificerede Ringer's opløsning har en partikelstørrelse på mellem 0,05 og 0,3 ^um, den indeholder fra 10 - 50¾ (w/v) PFC, 2-5¾ (vi//v) af et emulgeringsmiddel og om nødvendigt 0,1 - 1,0¾ (w/v) af et emulgerende hjælpe-15 middel, og den kan opbevares i stabil tilstand i en længere periode.

Det omhandlede perfusat til opbevaring af et organ til transplantation fremstilles inden anvendelsen ved blanding af den ovennævnte PFC-emulsion med et kommercielt oksealbu-20 min eller humant albumin opløst i den modificerede Ringer's opløsning og den ovennævnte modificerede Ringer's opløsning, saledes at den resulterende væske kan indeholde fra 7,5 - 12,5¾ (w/v) PFC og fra 1 - 8¾ (w/v) albumin. Om nødvendigt kan man tilsætte farmaceutiske midler såsom procain, 25 hydrochlorid, heparin, phenoxybenzamin, insulin, dexamethason ("Decadron"), methylprednisolon, antibiotika og urokinase . De ovenfor givne grænser for PFC-kon-centrationen er opstillet med henblik på at sikre overlevelse efter transplantation af organet, der har været 30 opbevaret ved perfusion af væsken. Koncentrationen af albumin inden for de ovenfor angivne grænser er passende til justering af det kolloide osmotiske tryk, således at perfusionsvæsken kan holdes fysiologisk iso-tonisk.

DK 154253 B

u

Opbevaring af et organ, der skal transplanteres, gennemføres på sædvanlig måde under iltning med oxygen ved hjælp af et velkendt udstyr. Eksempelvis blander man 400 ml af en 25 % (w/v) PFC-emulsion i den modificerede 5 Ringer's opløsning, 360 ml af den modificerede Ringer's opløsning og 240 ml af en 25 % (w/v) opløsning af humant albumin i den modificerede Ringer's opløsning, således at der opnås et totalt volumen på 1 liter. Den resulterende blanding ledes til en perfusatbeholder og perfu-10 seres igennem organet, der skal transplanteres, mens der sker en oxygenering med en blandet gas (95-98 % oxygen og 5-2 % carbondioxid) eller oxygen alene ved hjælp af en oxygena-tor af membrantypen eller gennem-boblingstypen. Cirkulationshastigheden af perfusatet 15 er 15-50 ml/g nyre,time, og perfusatet oxygeneres med 95 % 0^ og 5 % CO2 med en gennemstrømningshastighed på 30-1500 ml/minut. Om nødvendigt kan man sætte de '>> / ovennævnte farmaceutiske midler til perfusatet, uden at der sker nogen forringelse af dette. Ved opbevaring 20 ved perfusion er det også muligt ved hjælp af en pulserende pumpe at recirkulere perfusatet, som ledes til beholderen på arteriesiden af. et udstyr til organopbevaring. Ved opbevaring over længere tidsperioder er det ønskeligt, at man nve.d.. pa-ssende mellemrum kan ud-25 skifte perfusatet.

Med den foreliggende opfindelse er det blevet muligt at opbevare et organ meget sikkert i en lang tidsperiode, indtil organet skal bruges til transplantation.

Eftersom overlevelsesgraden er meget høj, vil den omhand-30 lede metode sikre en kommercielt succesfuld organtrans plantation inden for praktisk medicinsk behandling.

I det følgende gives nogle illustrative eksempler på fremgangsmåden til fremstilling af hver af de indgående komponenter i det omhandlede perfusat, ligesom fremstil- 13

DK 154253 B

lingsproceduren til fremstilling af selve perfusatet beskrives. Symbolet "% (w/v) angiver den vægtmængde af et materiale i gram, der indgår i 100 ml af den resulterende væske.

5 Præparation 1

Fremstilling af en fluorcarbon-emulsion I 8 liter af en modificeret Ringer's opløsning (beskrives senere) opløstes 300 g af en polyoxyethylen-polyoxy-propylen-copolymer (molekylvægt 8350). Efter tilsætning 10 af 3 kg perfluordecalin blev den resulterende blanding omrørt i en mixer til dannelse af en grov emulsion.

Denne grove emulsion overførtes til beholderen i en emulgator af stråletypen (homogenisator af Monton-Gaulin-type) for cirkulation af emulsionen. Emulgeringen gen-15 nemførtes ved en temperatur på 35 - 5 °C under et tryk på 200 - 500 kg/cm . Koncentrationen af perfluordecalin i den resulterende fine emulsion var 31,3% (\i//v), og den gennemsnitlige partikeldiameter var mellem 0,09 og 0,1 ium målt ved centrifugal sedimentation. Efter 6 må-20 neders opbevaring af emulsionen ved 4 °C kunne der ikke iagttages nogen sammenvoksning af partiklerne, og den gennemsnitlige partikeldiameter forblev i det væsentlige uforandret.

Fremstilling af albuminopløsningen 25 Et kommercielt præparat af humant serumalbumin blev opløst i en koncentration på 25% (w/v) i den modificerede Ringer's opløsning, som beskrives i det følgende .

Fremstilling af en modificeret Ringer's opløsning 30 Man fremstillede en modificeret Ringer's opløsning ved i destilleret vand at opløse følgende forbindelser 14

DK 154253 B

(angivet i g/liter): 6,51 NaCl, 0,4 MgSO^, 0,8 KC1, 0,24 NaHCO^, 0,14 Na2HP0^ og 6,0 glucose. Herved opnåedes en opløsning med følgende elektrolytsammensætning (angivet i m-ækv./liter): 112 Na+, 11 K+, 7 Mg++, 118 5 Cl-, 3 HCO^-, 2 HPO^--, 7 SO^-- og 33 glucose. De ovenfor beskrevne procedurer repræsenterer kendt teknik.

Blanding af de indgående væsker til dannelse af perfu-satet ifølge opfindelsen_ 570 ml af den modificerede Ringer's opløsning og 330 10 ml af fluorcarbon-emulsionen blev blandet og omrørt grundigt. Blandingen blev steriliseret ved opvarmning i et sterilisationsapparatur til 115 °C i 12 minutter.

Den steriliserede alanding blev blandet med 100 ml af albuminopløsning, som forinden var ledt igennem et bak-15 teriefilter. Den resulterende blanding blev opbevaret koldt (ved 1-10 °C) og anvendt efter behov som perfusionsvæske til opbevaring af et organ til transplantation.

Præparation 2

Fremstilling af en perfluorcarbon-emulsion 20 330 g polyoxyethylen-octylether med en gennemsnitlig molekylvægt på 3500 blev opløst i 8 liter af den modificerede Ringer's opløsning·. Til opløsningen sattes 40 g sojabønne-phosphorlipid og 2 g kaliumoleat. Blandingen blev omrørt i en mixer til dannelse af en sus-25 pension. Denne suspension blev blandet med 3 kg per-fluortributylamin og omrørt i en mixer til dannelse af en grov emulsion. Denne grove emulsion blev yderligere emulgeret på samme måde som i præparation 1. Den herved opnåede fine emulsion blev fyldt på hættefla-3Ό sker og steriliseret ved opvarmning i et roterende sterilisationsapparatur ved 115 °C i 12 minutter.

15

DK 154253 B

Koncentrationen af perfluorcarbonforbindelsen i den steriliserede emulsion var 29,7 % (w/v). Efter opbevaring ved 4 °C i 6 måneder viste emulsionen ingen tegn på sammenhobning af partiklerne. Denne procedure repræsente-5 rer kendt teknik.

Blanding af de indgående væsker til dannelse af perfu-atet ifølge opfindelsen____

Man blandede 550 ml af den modificerede Ringer's opløsning, som anvendtes i præparation 1, 100 ml albu-10 minopløsning og 350 ml af den ovenfor beskrevne fluor-carbon-emulsion. Den blandede væske blev opbevaret pa et køligt sted ved en temperatur på 1 - 10 °C og anvendt efter behov som perfusionsvæske til opbevaring af et organ, der skal transplanteres.

15 Præparation 3

De i præparation 1 beskrevne procedurer blev gentaget med den undtagelse, at man anvendte perfluormethylpropyl-cyclohexan i stedet for perfluordecalin. Den opnåede per fusionsvæske havde egenskaber, der svarede til egen-20 skaberne af den i præparation 1 opnåede væske.

Præparation 4

De i præparation 1 beskrevne procedurer blev gentaget med den undtagelse, at man i stedet for perfluordecalin anvendte henholdsvis perfluorbutylcyclohexan, perfluor-25 trimethylcyclohexan, perfluorethylpropylcyclohexan, perfluormethyldecalin, perfluorhexyltetrahydropyran, perfluorpentyltetrahydrofuran, perfluorheptyltetra-hydrofuran og perfluordecan. De opnåede perfusionsvæsker havde egenskaber, der svarede til egenskaberne 30 af væsken fra præparation 1.

16

DK 154253 B

Præparation 5

De i præparation 1 beskrevne procedurer blev gentaget med den undtagelse, at man i stedet for perfluordeca- lin anvendte henholdsvis perfluor-N,N-dibutylmonome-5 thylamin, perfluor-N,N-diethylpentylamin, perfluor- N,N-dipropylbutylamin, perfluortripropylamin, perfluor-N,N-diethylcyclohexylamin, perfluor-N-pentylpiperidin, perfluor-N-hexylpiperidin, perfluor-N-butylpiperidin, perfluor-N-pentylmorpholin, perfluor-N-hexylmorpholin 10 og perfluor-N-heptylmorpholin. De opnåede perfusions væsker havde egenskaber, der svarede til egenskaberne af perfusionsvæsken fra præparation 1.

Præparation 6

De i præparartion 1 beskrevne procedurer blev gentaget 15 med den undtagelse, at man i stedet for perfluordeca- lin anvendte perfluortributylamin. Den opnåede perfusionsvæske svarede til den i præparation 1 opnåede perfusionsvæske.

Præparation 7 20 Den i præparation 1 beskrevne procedure blev gentaget med den undtagelse, at man i stedet for at anvende en copolymer med en molekylvægt på 8350 anvendte en poly-oxyethylen-polyoxypropylen-copolymer med en molekylvægt på 15800. Den opnåede per fusionsvæske havde egen-25 skaber, der svarede til egenskaberne af perfusions væsken fra præparation 1.

I det følgende er vist eksempler på komparative eksperimenter, ved hvilke man ved dyreforsøg efterviser effektiviteten af perfusionsvæskerne ifølge opfindel-30 sen ved transplantation af nyrer.

DK 154253B

17

Overlevelsesgraden eller dødeligheden ved transplantationerne blev bestemt ved at observere funktionen af den transplanterede nyTe efter at den kontralaterale normale nyre var blevet fjernet. I tabellerne ‘betyder 5 symbolet "E.F." (early function), at der kunne observeres vandladning to dage efter den kontralaterale næphrek-tomi. Symbolet "L.F." (late function) betyder, at der ikke kunne iagttages nogen vandladning to dage efter den kontralaterale nephrektomi, men at nyrens -funktion 10 derefter gradvis blev bedre, indtil der kunne iagttages en vandladning hos forsøgsdyret, som oveilevede forsøget. Symbolet "N" (necrose) angiver dødt væv i 'f lokaliserede områder omkring den transplanterede nyre inden den kontralaterale nephrektomi (eksperimentet 15 blev afbrudt). Ved symbolet "A.T.N. (A)" [acute tubular necrosis (anuria)] forstås, at dyret efter den kontra-laterale nephrektomi led af anuri, appetitløshed og hyppige opkastninger, indtil døden indtrådte som følge af akut nyreinsufficiens. Endelig betyder symbolet 20 "A.T.N. (H)" [acute tubular necrosis (Hematuria)], at forsøgsdyret døde som følge af anuri, som.medførte hæmatori. Symbolet "N.F." (no-function) angiver, at der ikke kunne iagttages nogen funktion.

Optimal PFC-koncentration i opbevaringsvæsken 25 Det er afgørende nødvendigt at bestemme den PFC-koncentration, som er mest egnet til perfusion, hvilket skyldes, at en forøgelse i PFC-koncentrationen i en PFC-emulsion vil bevirke en forøgelse af den oxygenbærende kapacitet af emulsionen, mens viskositen sam-30 tidig forøges væsentligt ved lave temperaturer. Med henblik på at bestemme den optimale PFC-koncentration under perfusionen fremstillede man et antal perfusionsvæsker med varierende PFC-koncentrationer, idet man som primær saltopløsning anvendte en modificeret Collin's op-35 løsning (M.C.S.) [The Lancet, 2, 1219 - 1222 (1969)], som hævdes at være den mest favorable opløsning til hypo- DK 154253Β Λ 18 termisk opbevaring af organer, og som har en elektro-lytsammensætning, der minder om elektrolytsammensætningen i den intracellulære væske. Man satte forskellige mængder af de fluorcarbon-emulsioner, som 5 opnåedes i præparation 2, til M.C.S., således at de endelige PFC-koncentrationer i perfusionsvæskerne blev 5, 7,5, 10, 12,5 og 15% (w/v). Man gennemførte forsøg på at opbevare hundenyrer til transplantation ved perfusion ved hjælp af de ovennævnte væsker ved temperatu-10 rer på 5 - 8 °C og ved perfusionsstrømningshastigheder på 15 - 18 ml/g/time i 24 timer under oxygenering med en oxygenholdig gas (95% 0^, 5% CO2) med en strømningshastighed på 300 - 500 ml/minut. Idet man anvendte 5 hunde pr. gruppe, gennemførte man en autotransplanta-15 tion af de opbevarede nyrer. På den syvende dag efter autotransplantationen blev den kontralaterale normale nyre hos hver hund udtaget, og man noterede de efterfølgende overlevelsesdage for hver hund. Hvis en hund overlevede i 4 uger eller derover, skønnede man, at over-20 leveisen var positiv, eftersom niveauerne for såvel BUN (blod-urinstof-nitrogen) som creatin forblev normale hos hunden, ligesom der observeredes vandladning. Ud fra de opnåede data bestemtes den optimale PFC-koncentra-tion i perfusatet.

25 Eksperimentet gennemførtes på sædvanlig vis i overensstemmelse med den efterfølgende procedurerækkefølge: 19

DK 154253 B

Anæstesi: Natriumpentobarbital (30 mg/kg i.v. injektion) Endotratracheal indgivelse af halothan og oxygen

Indsnit langs midten af bugen

Kirurgisk isolation af venstre nyre Cannulation (ureter, nyrearterie og vene) Første udvaskning med kold M.C.S. eller kold finger's opløsning

Tilslutning til perfusionskredsløb.

Perfusionel opbevaring med oxygeneret per-fusat ved 3 - 8 °C i 24 timer elleT 72 timer.

V

Udvaskning (M.C.S. eller Ringer's lactatopløsning) i

Autotransplantation i femoral fossa i

Forsinket kontralateral .nephrektomi TABEL 2 20 DK 1542538

Virkning af PFC-koncentrationen i perfusatet på overlevelsesgraden

Hund Perfusater Overlevelsestid Overlevelses- bemærk- nr. (dage) grad ninger 1 ^ levende E.F.

2 N.

3 M.C.S. 5 2/5 A.T.N.Ca: ^ levende E.F.

5 4 A.T.N.CA! 6 - N· η levende L.F.

8 5« PFC 5 3/5 A.T.N.(A) i M.C.S.

^ levende E.F.

2Q levende L.F.

11 levende E.F.

12 levende E.F.

13 7,5¾ PFC levende 4/5 E.F.

i M.C.S.

14 7 A.T.N.CA) 15 levende E.F.

16 levende E.F.

17 5 A.T.N.CA) 18 10¾ PFC levende , E.F.

4/5 i M.C.S.

19 levende E.F.

20 . levende E.F.

21

DK 154253 B

21 levende E.F.

22 levende E.F.

23 12,5¾ PFC levende 4/5 E.F.

i M.C.5.

24 '5 A.T.N.(A) 25 lev end e E.F.

26 b' A.T.N,. (H) 27 levende E.F.(H) 28 15¾ PFC 4 A.T.N.(A) i M.C.S.

29 levende 2/5 E.F.(H) 30 7 A.T.N.(A) * levende: Overlevede mere end 4 uger.

DK 154253B

22

De opnåede resultater fremgår tabel 2. Som det fremgår af tabel 2, opnåedes en høj overlevelsesgrad ved en PFC-koncentration på mellem 7,5 og 12,5% (vi//v). Hvis PFC-koncentrationen overstiger 12,5¾ (\i//v) og når op 5 på 15¾ (u//v) observeres hæmatori i alle tilfælde ved genoptagelse af blodcirkulationen efter transplantio-nen. To hunde, som overlevede i mere end 2 uger, udviste tegn på hæmatori i flere dage efter den kontra-laterale nephrektomi, hvorefter deres tilstand forbed-10 redes, og de overlevede. På basis af de ovenfor angivne resultater kunne det konkluderes, at en perfusionsvæske justeret til en PFC-koncentration på 10¾ (\i//v) er den mest effektive væske til perfusionsopbevaring af en udtaget nyre.

15 EKSEMPEL 1

Primær saltopløsning

Man gennemførte eksperimenter med perfusionsopbevaring i længere perioder ved lav temperatur med henblik på at udvælge en egnet primær saltopløsning. De under-20 søgte saltopløsninger var M.C.S. (beskrevet i det foregående) Ringer's opløsning og en modificeret Ringer's opløsning (M.R.S.) fremstillet som beskrevet i præparation 1. Perfusionsvæskerne til opbevaringen blev fremstillet ved at sætte perfluorcarbon-emulsionen fra 25 præparation 2 og okseserumalbumin til en saltopløsning, således at den endelige koncentration eksempelvis bliver 10¾ (w/v) med hensyn til PFC og 6% (w/v) med hensyn til albumin. Perfusionen blev gennemført på hunde-nyrer (5 i hver gruppe) ved 5 - 8 °C i 72 timer, idet 30 man fulgte proceduren beskrevet.ovenfor. Efter transplantation og genoptagelse af blodcirkulationen foretog man undersøgelser af blodets bevægelse igennem nyren, og man iagttog nyrens farve og nuance, vandladningen og symp- 23

DK 154253 B

tomer hidrørende fra den kontralaterale nephrektomi, som blev foretaget på den syvende dag efter transplantationen. Perfusatet (med et totalt volumen på :Z000 ml) blev ikke udskiftet under de 72 timers perfusion, men der-5 imod recirkuleret med en hastighed på 15 - 18 ml/g/time.

Med undtagelse af de tilfælde, hvor der som primær saltopløsning anvendtes M.R.S., var transplantations-resultaterne særdeles ufavorable, og stort set alle forsøgsdyrene døde på grund af akut nyreinsufficiens i lø-10 bet af de første 10 dage efter den kontralaterale nephrektomi. Når man. derimod anvendte M.R.S. som primær saltopløsning, blev samtlige forsøgsdyr raske uden komplikationer.

EKSEMPEL 2 15 Indvirkning af perfusafcets albuminkoncentratioon på hundenyre_

De i dette forsøg anvendte perfusater bestod -af 10% emulsion af PFC i en modificeret Ringer's opløsning, der fremstilledes ved anvendelse af den i præparation 6 20 fremstillede PFC-emulsion, og som indeholdt forskellige koncentrationer af humant albumin. Nyrerne blev per-fuseret i 72 timer ved 5 - 8 °C under oxygenering, idet man anvendte den i eksempel 1 anvendte oxygenholdige gas med en strømningshastighed på 300 - 500 ml/minut.

25 Derefter foretog man en autotransplantation som beskrevet ovenfor. Strømningshastigheden under perfusionen blev holdt på mellem 15 og 18 ml/g/time. Den kontralate-rale nephrektomi blev gennemført en uge efter autotransplantationen .

30 De opnåede resultater fremgår af tabel 3.

TABEL 3 24

DK 154253 B

Hund Koncentration Vægtstigning af Efter kontralateral nr. af albumin nyren under per- nephrektomi_ (¾) fusionen (%) Funktion Overlevelse 1 73,5 Inaktiv Døde 2 0 49,4 N.F. Døde 3 53,1 L.F. Overlevede ____(2 dage)__ 4 38,4 L.F. Overlevede (2 dage) 5 2 52,9 N.F. Døde 6 49,8 N.F. Døde 7 37,6 N.F. Døde 8 4 20,3 E.F. Overlevede 9 41,6 E.F. Overlevede 10 13,7 E.F. Overlevede 11 6 30,6 E.F. Overlevede .12 34,.4 E.F. Overlevede 13 11,9 E.F. Overlevede 14 8 22,8 E.F. Overlevede 15 30,5 N.F. Døde

DK 154253B

25 EKSEMPEL 3

Langvarig perfusion ved lav temperatur af nyre til trans-plantation_______

Man gennemførte transplantationsforsøg med hundenyre 5 ved en metode svarende til den ovenfor beskrevne. Hver nyre blev opbevaret i ten uge ved perfusion ved 5-8 °C og ved en strømningshastighed på 15-18 mg/g/time under oxygenering med en oxygenholdig gas ved en stirømningshastighed på 300-500 ml/minut. Perfusionsvæsken frem-10 stilledes ved anvendelse af M.R.S. fra præparation 1 som primær saltopløsning, hvortil der satte.s okseserum-albumin samt PFC-emulsionen fra præparation 2 eller en PFC-emulsion fremstillet på samme måde som i præparation 2 med den undtagelse, at der anvendtes perfluor-15 decalin i stedet for perfluortributylamin. Koncentra tionerne af albumin og PFC i perfusionsvæsken var henholdsvis 6 % og 10 % (w/v). Efter en uges opbevaring under perfusion blev nyrerne autotransplanteret som beskrevet ovenfor. Den kontralaterale nephrektomi blev 20 gennemført en uge efter autotransplantationen, og symp tomerne observeredes. Resultaterne er angivet i tabel 4. Plasmaniveauerne for creatinin og BUN hos de overlevende dyr blev normale i løbet af 3 uger.

TABEL 4 26

DK 154253 B

Eksempel Perfusat Vægtstigning af nyren Efter kontralateral nr under perfusionen nephrektomi_ ___(¾)__Funktion Overlevelse 1 34,3 E.F. Overlevede 2 M.R.S. 46,9 N.F. Døde _albumin ___ 3 6% (\i//v) 20,1 L.F. Overlevede

Perfluor-__(2 dage)_ 4 tributyl- 18,7 L.F. Døde amin 5 10¾ (w/v) 33,5 E.F. Overlevede 6 _19,3__E.F.__Overlevede 7 M.R.S. 40,1 L.F. Døde , albumin__(3 dage)_ _8 _ Perfluor- 40j9_ E . F.__Overlevede 9 decalin —_23,5__E.F.__Overlevede 10 10¾ (w/v) 21,6 N.F. Døde L__ 27 EKSEMPEL 5

DK 154253 B

Under anvendelse af hu.ndenyrer gennemførte man transplantationsforsøg. på lignende måde som beskrevet i det foregående . Hver nyre 'blev opbevaret ved 18 - 22 °C 5 i 12 eller 24 timer ved perfusion med en strømnings hastighed på 40 - 50 ml/g/time under oxygenering med en blandet gas (95¾. 0^,, 5% C02), der gennemblffi.st.es med en hastighed på 300 - 500 ml/minut. Perfusionsvæsken blev fremstillet ved afvendelse af M.R.S. fra præpara-10 tion 1 som primær saltopløsning, hvortil der sattes den i præparation 2 fremstillede PFC-emulsion ag okseserumalbumin. Koncentrationerne af PFC og albumin i per fusionsvæsken var henholdsvis 10¾ og 6% (w/v). Efter 12 eller 24 timers opbevaring bl©v nyrer-15 ne autotransplanteret- Den kontralaterale nephrek- tomi blev genenmført en uge efter autotransplanta-tionen, og symptomerne 'blev iagttaget. I tabel 5 er anført resultaterne af de ovenfor beskrevne eksperimenter sammen med resultaterne af et kontrol— 20 eksperiment, ved hvilket der ikke tilsattes RFC,, og et sammenlignende eksperiment, hvori man anvendte M.C.S. som primær saltopløsning.

28

DK 154253 B

TABEL 5

Eksempel Perfusat Perfusion Efter kontralateral nr. (antal nephrektomi__ timer) Funktion Overlevelse 1 M.R.S. N.F. Døde albumin 2 6¾ (w/v) 12 " "

3 Π II

4 ii ii 5 N.F. Døde 6 M.C.S. 12 7 albumin " " 8 6% (w/v) PFC 10¾ (w/v) 9 M.R.S. E.F. Overlevede albumin 10 6% (w/v) 12 " " 11 PFC 10¾ " 12 (w/ν') " " 13 M.R.S. E.F. Overlevede ^ albumin N.F. Døde 6% (w/v) 24 15 PFC 10¾ E.F. Overlevede 16 (w/v) L.F. Overlevede (2 dage)

Claims (9)

1. Perfusat til opbevaring af organer til transplantation, hvilket perfusat indeholder en Ringer's opløsning, hvori der er opløst albumin, og mindst en emul-5 geret, flydende, eventuelt substitueret perfluorcarbon- forbindelse og mindst et emulgeringsmiddel, kendetegnet ved, at' den anvendte Ringer's opløsning er modificeret på en sådan måde, at koncentrationen af kaliumioner er mellem 8 og 20 m. ækv . /liter..

2. Perfusat ifølge krav 1, kendetegn æt ved, at det indeholder albumin i en koncentration på mellem 1 og 8 % (w/v) .

3. Perfusat ifølge krav 1, kendetegnæt ved, at det indeholder en eventuelt substitueret perfluor- 15 carbonforbindelse i en koncentration på mellam 7.,5 og 12,5 % (w/v).

4. Perfusat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at perfluorcarbonforbindelsen indeholder mellem 9 og 12 carbonatomer.

5. Perfusat ifølge krav 4, kendetegnet ved, at perfluorcarbonforbindelsen er mindst en forbindelse valgt blandt perfluoralkylcyclohexan med 3-5 carbonatomer i alkyldelen, .perfluordecalin, perfluormethyl-decalin, perfluoralkyltetrahydropyran med 4-6 carbon-25 atomer i alkyldelen, perfluoralkylpiperidin med 4-6 carbonatomer i alkyldelen, perfluoralkyltetrahydrofuran med 5-7 carbonatomer i alkyldelen, perfluroalkylmorpho-lin med 5-7 carbonatomer i alkyldelen, perfluortrialky1-amin, per fluor(diethylcyclohexylamin) og perfluor(dioxa-30 alkan). DK 154253 B

6. Perfusat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at emulgeringsmidlet er en polyoxyethylen-polyoxypropy-len-copolymer, en polyoxyethylen-alkylether eller en polyoxyalkyl-allylether, der hver har en molekylvægt 5 på mellem 2000 og 20000, eller en af disse forbindelser blandet med et phosphorlipid.

7. Perfusat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det som hjælpestof for emulgeringen indeholder en fedtsyre med 8-21 carbonatomer.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af et perfusat til opbevaring af et organ til transplantation, kendetegnet ved, at man blander en Ringer's opløsning, som er modificeret med hensyn til mængden af kalium-ioner ved forøgelse af denne mængde til mellem 8 og 15 20 m.ækv./liter, en opløsning af albumin i den modifi cerede Ringer's opløsning og en stabil emulsion af en perfluorcarbonforbindelse i den modificerede Ringer's opløsning, således at koncentrationen af albumin er mellem 1 og 8 % (w/v), og således at koncentrationen 20 af perfluorcarbonforbindelsen er mellem 7,5 og 12,5 % (w/v).

9. Fremgangsmåde til opbevaring af et organ, der skal transplanteres, hvorved organet perfuseres med en perfusionsvæske indeholdende en perfluorcarbonforbindelse 25 under samtidig oxygenering, kendetegnet ved, at perfusionsvæsken indeholder en Ringer's opløsning, hvori der er opløst albumin, og mindst en emulgeret, flydende, eventuelt substitueret perfluorcarbonforbindelse og mindst et emulgeringsmiddel, idet opløsningen 30 er modificeret med hensyn til indholdet af kaliumioner ved forøgelse af dette indhold til mellem 8 og 20 m.ækv./ liter, og idet koncentrationerne af albumin og perfluor-carbonforbindelse er henholdsvis 1-8 % og 7,5-12 % (w/v) baseret på perfusionsvæsken.