DK155011B

DK155011B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af et nonapeptid med immunstimulerende virkning samt beskyttet peptid til anvendelse som udgangsforbindelse

Info

Publication number: DK155011B
Application number: DK300083A
Authority: DK
Inventors: Wolfgang Koenig; Rolf Geiger; Rainer Obermeier; Hubert Muellner
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1982-06-30
Filing date: 1983-06-29
Publication date: 1989-01-23
Also published as: DE3224379A1; IL69101A0; US4478828A; EP0097936A3; GR78608B; ATE16810T1; ES8403859A1; DK300083A; FI832354A7; AU1639383A; PT76940B; DK300083D0; KR840005082A; ZA834739B; JPS5913753A; DK155011C; DE3361410D1; ES523637A0; EP0097936B1; PT76940A

Description

i

DK 15501 1 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt nonapeptid med formlen

5 C^lu-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn-OH I

(L-pyroglutamyl-L-aspartyl-L-seryl-L-seryl-L-seryl-L-threo-nylglycyl-L-tryptophyl-L-asparagin), eller fysiologisk acceptable salte heraf med organiske baser, alkalimetal- og 10 jordalkalimetalioner, der finder anvendelse i farmaceutiske præparater.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at et beskyttet peptid med formlen 15 CGlu-Asp(OBut)-Ser(But)-Ser(But)-Ser(But)-

Thr (Bu*·) -Gly-Trp-Asn-OBu*· II

hvori Bu*- betyder en tertiær butylgruppe eller en anden beskyttelsesgruppe af tert.butyltypen, ved hjælp af i pep- 20 tidkemien ved tryptophanholdige peptider gængse metoder befries for beskyttelsesgrupperne, og det opnåede nonapeptid eventuelt omdannes til et fysiologisk acceptabelt salt (jfr. f.eks. R. Geiger og W. Konig i E. Gross og J. Meienhofer,

The Peptides, Academic Press, New York 1981, side 82).

25 Opfindelsen angår endvidere et hidtil ukendt, beskyt

tet peptid til anvendelse som udgangsforbindelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Dette peptid er ejendommeligt ved, at det har formlen II

30 Cciu-Asp(OBut) -Ser (B^) -Ser (But) -Ser (But) _

Thr(But)-Gly-Trp-Asn-OBut II

hvori But betyder tert.butyl eller en anden beskyttelsesgruppe af tert.butyltypen.

35 Foruden antiviral aktivitet er interferoner også i besiddelse af en immunmodulerende aktivitet (W.E. Stewart,

DK 15501 1 B

2

The Interferon System, Springer, New York, 1979).

Overraskende udviser allerede nonapeptidet med formlen I

5 CGlu-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn-OH I

der svarer til en delsekvens af human-fibroblastinterferon (Nature 285, 542-547, 1980) ved in-vitro-prøver en stærkt immunstimulerende virkning.

10 Syntesen af peptidet med formlen II sker ved hjælp af segmentkobling ud fra tre dipeptider og et tripeptid (se reaktionsskema). Til peptidkondensation anvendes (med undtagelse af syntesen af ^lu-Asp(OBu^) -OH) dicyclohexylcar-bodiimid-L-hydroxybenzotriazol-metoden (DCC/HOBt).

15 Qilu-Asp (OBu*-) -OH fremstilles ved med 1-hydroxyben- zotriazol katalyseret omsætning af pyroglytaminsyre-2,4,5-trichlorphenylester (Rilu-OTcp) med Asp (OBu*-) . Sidekædefurik-tionerne og den C-endestillede carboxylgruppe blokeres som tert. butyl ether (Bu*-) eller som tert. buty lester (OBut).

20 Benzyloxycarbonylgruppen (Z), som kan fraspaltes selektivt ved katalytisk hydrogenering i nærvær af tert.butylestere eller tert.butylethere, tjener som midlertidig beskyttelse af aminofunktionerne. Carboxylgrupperne i andet segment beskyttes i mellemtiden med methyl- (OMe) eller ethylestere 25 (OEt). Disse estere er stabile ved den katalytiske hydrogenering, men kan fraspaltes selektivt med alkali i nærvær af beskyttelsesgrupper af tert.butyltypen.

Beskyttelsesgrupperne i peptidet med formlen II fraspaltes ved opløsning af stoffet i 90%'s trifluoreddikesyre.

30 For at modvirke en tert.butylering af tryptophanen tilsættes formålstjenligt en thiol. 1,2-Dimercaptoethan har vist sig særlig fordelagtig.

3 DK 15501 1 B

+* . +* +» +» 3 +* +* +* 3 +» 3 3 m

mm CQ D CQ tn O

CD tom o CD O o CO o o o ir, -1--- .--

< X

-+» CD T3

O CL

i S

>S fN

O X

X O O- O O

Li -1—-------- —*---------

b- M .NI X

+>

CD

O

+» 'V.

uj o o +> o

1 LU X O

x I o o r-l -1--1----------—

O X

+» . X

CD o

o O

X 2 "D

\ O- +> +» -H +» +» O +* +> +» 3 3 3 3 .

Li D X U 2 3 3 CM CO CD CD CD

£—-a|_£_ \->-i___4_

1¾ Kl N$ NJ X 4J

CQ

O

X

+» 4¾ O O O O

D S XX X X O

CO o +>0+>0 +J O 4-> o +> +> +» \ / => 3 3 3 3 3 3

Li\j CO CO CO CO CO CO CD

tO X +»

CO TJ

O CL

X \ X

S CM O 4* +» ·+* +> +> O +» X+> HJ 0 3 3..3 .3

Li 3X 0 3 3 3 2 CO CO CO CQ

O CD.O O CO. CD. tn. V V v \ to---—η—~N-—----— ————— ————-

Μ Μ X

+»

CD

O

X -O

\ OL

+» o +» +* +» v, +» +» 3X03 3 3 CM 3 3

Lf CO O O CQ DX ID .1 U. CQ

O----1------—1 "S --i ---1--*-

tO NJ NI NI NJ X

+»

CD

O

X

+> +» s -H

3 3 0 3

_ cn X CD X O CD

£__;_ ox> cyo o o,_

< X

m e 0) ω w +>

G CD

o o. o

•Η O X

M 3 o s r«-1--1---—J-*—-

DK 155011 B

4

O

Nonapepridet, aer fremstilles ved fremgangsmaden ifølge opfinaelsen,afprøves ved "Plaqueforming Celle--prøve (PFC-prøvej og ved phytonæmaggiutmin-stimulationsprøven (PHA-prøve; med hensyn til den lymphocyt-stimulerende virkning.

5 Ved PFC-prøven fremstilles cellekulturer af frisk- præparerede milte fra mus (2 x 10^ miltcelier pr. ml ) i RPMI 1640 og 3u,ul kaivetosterserum (FKS) pr. ml cellekultur.

7 in-vitro-immuniseringen sjcer med b x 10 fåreefythrocyter/ml. Prøve-cellekulturerne inkuberes daglig med den tilsvarende 10 dosis prøveforbindelse.

Efter et tidsrum på 5 dage fracentrifugeres cellerne, vaskes med mediet RPMI 1640,og den direkte PFC-prøve gennemføres. Hertil blandes cellerne sammen med en 10%'s fåreery-throcyt-suspension i en agaroseopløsning og udhældes på en .

15 jævn flade. I det opståede gellag afgiver de stimulerede lym-phocyter under den følgende inkubation antistof, som diffunderer ind i omgivelserne og ner knytter sig til de fåreerythro-cytter, der findes her. Efter tilsætning af marsvinekompie-ment lyserer de røde blodlegemer. Der opstår lyse, med det 20 blotte øje synlige runde pletter i den rødligbrune gel, nemlig plaquernes hæmolyseområder. I centrum af sådanne hæmo-lyseområder findes en antistofproducerende celle. Antallet af lymphoide celler, der danner specifikke immungiobuliner, kan derfor sidestilies med det opnåede plaque-antai.

25 Ved PHA-prøven opnås konklusioner vedrørende antal- ·· let af modne, dvs. stimulerbare lymphocyter ved hjælp af funktionsprøven med nensyn til stimulerbarhed med piantelekti-net PhA. lymphocyterne stimuleres med lektinet, lige som af bakterielle eller virale antigener, til en blasttransfor-30 mation. Dette fører enten direkte eller ved udrystning af lymphokiner til en proliferation.

indbygning af radioaktivt thymidin inden for en bestemt tid er så målet for antallet af stimulerede celler.

Kun modne eller iirmunologisk potente T-celler stimuleres.

35 Derfor kan et stofs indflydelse på lymphocytmodningen efterspores med denne prøve. Ganske vist skal stimuleringen være sub-optimal, idet også andre subpopulationer ved højere koncentrationer stimuleres af lymphocyter, og virkningen kan ikke mere iagttages. Det omhandlede peptid tilsættes til

DK 155011B

5

O

dyrkningsmediet i forskellige koncentrationer.

ved begge prøvesystemer iagttages en dosisafhængig stimulation af lymphocyter med aet omhandlede nonapeptid i form af en kiokicekurve (jfr. tabel I og II) .

5

Forsøgsresultater med det omhandlede nonapeptid

Tabel I PFC-prøve 10 _kontrol 1 ng 10 ng luO ng l^g 5^ug/ml

Piaquer/ 76y 90s lll2 1024 817 802 10° celler_

Tabel II

15 PHA-prøve (Tilsætning af 2u^ug PHA/ml, prøvevarighed: /2 timer)

Koncentration af Indbygning af Stimulations- 3

nonapeptid Lug/ml/_H-thymidm, cpm_indeks SI

20 Kontrol Il4 311 b,0 107 670 0,94 1,0 113 978 1,00 0,5 143 831 1,26 0,125 137 519 1,20 25 0,0125 101 594 0,89

Den her omhandlede forbindelse kan tjene til behandling af immunmangelsygdomme, virale og fungoide, samt kroniske bakterielle infektioner, autoimmunsygdomme samt til terapi af 30 sygdomstilfælde, der forårsages af celler med immunologisk reievante forandringer af cellemembrandata (f.eks. tumorceller) .

Det her omhandlede peptid kan også anvendes helt alment til påvirkning af T-lymphocyters modning samt til mid-35 ler med indhold af peptidet som aktivt stof.

DK 155011B

6 o

Anvendelse af det omhandlede peptid kan foregå intravenøst, subcutant eller intranasalt. Doseringen ved parenteral indgivelse ligger på 0,01-10 mg (ca. 0,l-100^ug/ kg/dag), ved intranasal indgivelse på 0,1-100 mg pr. enkelt-5 dosis. Ved parenteral indgivelser er det foretrukne dosisinterval 0,1-10, fortrinsvis 0,2-5^ug/kg/dag. Denne kan i alvorlige tilfælde også forhøjes, da der hidtil ikke er blevet observeret toksiske egenskaber. En nedsættelse af dosis er ligeledes mulig.

to Den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstil lede forbindelse kan indgives intranasalt eller parenteralt i en tilsvarende pharmaceutisk præparatform. Til intranasale anvendelsesformer blandes forbindelsen med de dertil nødvengie tilsætningsstoffer såsom stabilisatorer eller inaktive 15 fortyndingsmidler og bringes ved hjælp af gængse metoder på egnede indgivelsesformer såsom vandige, alkoholiske eller olie-agtige opløsninger. Som olieagtige bærestoffer eller opløsningsmidler kan kan f.eks. anvendes plante- eller animalske olier såsom solsikkeolie eller levertran.

20 Til subcutan eller intravenøs indgivelse formule res de aktive forbindelser eller disses fysiologisk acceptable salte, eventuelt med de dertil gængse stoffer såsom opløsningsformidlere, emulgatorer og andre hjælpestoffer i form af opløsning, suspension eller emulsion.

25 Som opløsningsmidler til de her omhandlede aktive forbindelser og deres tilsvarende fysiologisk acceptable salte kan f.eks.'anvendes vand, fysiologiske kogsaltopløsninger eller alkoholer, f.eks. ethanolrpropandiol eller glycerol og desuden sukkeropløsninger såsom glukose- eller mannitopløsnin- 30 ger eller en blanding af de forskellige nævnte opløsningsmidler.

Opfindelsen vil i det· følgende blive nærmere forklaret ved hjælp af et eksempel.

35 7

DK 15501 1 B

O

Eksempel 1. Almindelig anvisning på peptidkoblinq (tabel III)

Til en opløsning af 10 mmol af en Z-aminosyre eller et Z-peptid og lf35 g l-hydroxybenzotriazol i 10-100 ml 5 dimethylformamid eller dimethylacetamid tilsættes 10 mmol af en aminosyre- éller peptidester-hydrochlorid, 1,3 ml N-ethyl-morpholin og ved 0°C 2,2 g dicyclohexylcarbodiimid. Der omrøres i 2-3 timer ved 0°C, hvorefter reaktionen henstår ved stuetemperatur natten over.

10 Oparbejdning I: Det udfældede bundfald (dicyclohexylurinstof) suges fra, og filtratet inddampes. Remanensen fordeles mellem vand og eddikesyreester. Eddikesyreesterfasen udrystes først med mættet NaHCO^-opløsning, derefter KHSO^/I^SO^-puffer og endelig mættet NaHCO^-opløsning, tørres med magnesium-15 sulfat og inddampes. Remanensen udrives derefter for det meste med petroleumsether eller omkrystalliseres ud fra ethylace-tat/petroleumsether.

Oparbejdning II: (Stoffet udfældes ved siden af dicyclohexyl-urinstoffet) : Bundfaldet omrøres med 10 ml mættet NaHCO^-opløs-20 ning og omtrent den 5-dobbelte vandmængde (beregnet på opløsningsmiddelmængden) , suges fra, vaskes med vand og tørres over P2°5 * 25 30 35

DK 155011B

8

Tabel III

Beskyttede peptider, fremstillet analocrt med almindelig anvisning 1 og reaktionsskema 5 Peptid Udbytte Smp. °C [a]^3 (c=l) Z-Trp-Asn-OBut (krystl. I -23,1° ud fra isopropanol/petr.- 76% 138-139 (i methanol) 10 ether) Z-Thr(But)-Gly-OEt (krystl. I 76 +7,2" ud fra petroleumsether) 74% (i methanol) 15 __ Z-Thr(But) -Gly-Trp-Asn-OBut I 111 -19,9° (omfældet ud fra ethylace- 89% (i methanol) tat/petroleumsether) 20____ Z-Ser (Bu1-) -Ser (Bu*-) -Ser- II 234 +7,0" (Bu-1-) -Thr(But) -Gly-Trp- 81% (i trifluor-

Asn-OBut (ekstrh. med ethanol) 25 methanol) ^Lu-Asp (OBu*·) -Ser(But) - II 209-214 +5,1"

Ser (Bu1^-Ser (Bu11)-Thr (Bu1^- 38% (i trifluor- 30 Gly-Trp-Asn-OBut (chrom. på ethanol) kiselgel i methylenchlorid/-methanol 9:1) 35 Z-Ser(But)-ser(But)-OMe I olie 85% Z-Ser(But)-ser(But)-Ser- j 113-115 +22,4° 40 (But)-OMe (ud fra petro- 76% (i methanol) leumsether)

O

DK 155011 B

9 2. Almindelig anvisning på selektiv fraspaltning af benzyl-oxycarbonylgruppen (tabel IV) 2,5-10 g peptid opløses eller suspenderes alt efter opløselighed i ca. 150 ml methanol eller trifluorethanol.

5 Under skylrling med N2 tilsættes Pd/carbon-katalysator, og derefter ledes under omrøring og tilsætning af ca. 1-2N me-thanolisk saltsyre ved pH 4,5 (Autotitrator) hydrogen gennem opløsningen. Når der ikke mere optages saltsyre, skylles igen med N2, katalysatoren filtreres fra, og filtratet inddampes.

10 Remanensen udrives i reglen med ether og suges fra.

Tabel IV

Peptidester-hydrochlorid, fremstillet analogt med almindelig anvisning 2 23 15 Peptidester-hydrochlorid_udbytte Smp> oc [a] p (c=l) H-Trp-Asn-OBu*" *HC1, hydroge- 96% 108-110 + 7,1°

Bering i methanol_(i methanol) H-Thr(But)-Gly-Trp-Asn-OBut-HCl 93% 144-146 - 9,2° hydrogenering i methanol_(i methanol) 20 Η-Ser (But) -Ser (But) -OMe* HC1 98% olie hydrpgenering i methanol_ Η-Ser (But)-Ser(But)-ser (But)- 93% 176 +4,6

Thr(Bu^)-Gly-Trp-Asn-OBu^'HCl (dekomp.) (i 80% eddi- hydrogenering i trifluorethanol_kesyre)_ 25 3. Almindelig anvisning til hydrolysering af peptid-methyl-estere (tabel V) 10 mmol peptid opløses i 50 ml dioxan/vand (8:2).

Hertil tilsættes under omrøring 11 ml IN NaOH, hvorefter der 30 omrøres en time ved stuetemperatur. Herefter neutraliseres med 1-2 ml IN H2S04, og bundfaldet inddampes. Remanensen fordeles under isafkøling mellem 10 ml IN H2S04 og 50 ml ethyl-acetat. Ethylacetatfasen vaskes først med 10 ml KHSO4/K2SO4--puffer og derefter med vand, tørres med magnesiumsulfat 35 og inddampes. Ud fra remanensen kan dicyclohexylaminsaltene fremstilles i ether.

o 10

DK 15501 1 B

Tabel V

Z-peptider fremstillet analogt med almindelig anvisning 3 Peptid Udbytte Smp. °C [a]^ (c=l) Z-Thr(But)-Gly-QH_99%_olie_ 5 Z-Thr-(But)-Gly-OH·dicyclo- 87% 142 +5,6° hexylamin_(i methanol) Z-Ser(But)-Ser (But)-Ser(But)- 69% amorf + 29,5° OH (i methanol) 10

^lu-Asp (OBut) -OH

Til en suspension af 1,9 g (10 mmol) Η-Asp(OBu^)-OH og 1,35 g HOBt i 20 ml dimethylformamid tilsættes 3,4 g Rsiu-OTcp, og der omrøres i flere timer ved stuetemperatur, 15 hvorefter blandingen henstår natten over. Den næste dag inddampes under højvakuum, og remanensen udrives med ether. Bundfaldet suges fra og vaskes med ether. Udbytte 2,7 g.

Stoffet indeholder stadig noget HOBt og chromatograferes derr for i 70%'s methanol på "Sephadex"®LH 20 (søjledimensioner: 2o 100 x 4 cm). Udbytte: 2,55 g (85%), smeltepunkt 114-159°C, [a]^3 = + 1,9° (c=l, methanol).

Ojlu—Asp—Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn-OH

850 mg (6,9 mmol) Oalu-Asp(0But)-Ser (Bu^)-Ser (Bu*“) -t t t -Ser(Bu )-Thr(Bu )-Gly-Trp-Asn-OBu opløses i en blanding af 25 trifluoreddikesyre/vand/1,2-dimercaptoethan (i forholdet 9:1:1). Blandingen henstår en time ved stuetemperatur, inddampes og remanensen udrives med ether. Udbytte: 650 mg.

Med henblik på rensning koges stoffet i 30 ml méthanol og suges efter afkøling til stuetemperatur fra. Udbytte: 430 mg 30 (65%). Aminosyreanalyse (hydrolyse: 24 timer ved 120°C i 6N HCl):

Asp_Thr_Ser_Glu_Gly Trp

Beregnet: 2 13111

Fundet: 1,94 0,86 2,61 1,00 1,04 35

DK 15501 1 B

11

Ved hydrolysebetingelserne ødelægges tryptophan fuldstændig, serin og threonin delvis. På grund heraf kan den fuldstændige mangel på tryptophan forklares tillige med de reducerede værdier for serin og threonin.

5 UV-spektrum: karakteristiske absorptionsbånd for Trp ved 2700 Å. Indhold af peptid ifølge aminosyreanalyse og UV-spektrum: 95%. [a]p3 = -34,9° (C = l, i mættet NaHC03- opløsning).

Claims

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af et nona-peptid med formlen I 5 ^lu-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn-OH (I) (L-pyroglutamyl-L-aspartyl-L-seryl-L-seryl-L-seryl-L-threo-nylglycyl-L-tryptophyl-L-asparagin), eller fysiologisk acceptable salte heraf med organiske baser, alkalimetal- og 10 jordalkalimetal ioner, kendetegnet ved, at et beskyttet peptid med formlen ^Glu-Asp (OBu*-) -Ser (Bu1-) -Ser (Bu*-) -Ser (Bu*-) -Thr (Bu11) -Gly-Trp-Asn-OBut (II) 15 hvori Bu*- betyder en tertiær butylgruppe eller en anden beskyttelsesgruppe af tert.butyltypen, ved hjælp af i peptidkemien ved tryptophanholdige peptider gængse metoder befries for beskyttelsesgrupperne, og det opnåede nonapeptid 20 eventuelt omdannes til et fysiologisk acceptabelt salt.

2. Beskyttet peptid til anvendelse som udgangs forbindelse ved fremgangsmåden ifølge krav l, kendetegnet ved, at peptidet har formlen II 25 ^Glu-Asp (OBu^) -Ser (Bu*-) -Ser (Bu*·) -Ser (Bu'1') - Thr (But) -Gly-Trp-Asn-OBu*- (II) hvori Bu*- betyder tert.butyl eller en anden beskyttelsesgruppe af tert.butyltypen.