DK156071B - Fremgangsmaade til fremstilling af 3,3'',4''-triacyltylosinderivater - Google Patents

Description

- 1 -

DK 156071 B

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte 3, 3", 4" triacyltylosinderivater med den i kravets indledning angivne almene formel 1 eller salte deraf med antibiotisk virkning.

5

Ved salte skal forstås fysiologisk acceptable salte. Foretrukne eksempler på salte er uorganiske salte såsom hydro-chlorid, sulfat eller phosphat eller organiske salte såsom acetat, propionat, tartrat, citrat, succinat, malat, aspa-10 raginat eller glutiminat. Andre ikke-toksiske salte kan medtages.

De hidtil ukendte forbindelser (1) har de ækvivalente niveauer for antibakteriel aktivitet for det hidtil kendte 15 antibiotiske tylosin og har også forøget antibakteriel virkning mod alle macrolidantibiotikumresistente stammer såsom macrolidresistent A-gruppestammer (kliniske isolater af erythromycin-, oleandomycin- og 16-led-macrolidantibio-tikumresistente stammer), B-gruppestammer og C-gruppestam-20 mer. Navnlig har de hidtil ukendte forbindelser overlegen antibakteriel aktivitet mod resistente stammer i sammenligning med det kendte 4"-acyltylosin eller 3-acetyl- eller -propionyl-4"-acyltylosin, som er effektive mod de stammer, som er resistente over for macrolidantibiotika.Desuden ned-25 sættes den stærke vedvarende bitre smag, som er en generel egenskab hos macrolidantibiotika, og således fremstilles der fortrinsvis sirup til børn, som man ikke kan give tabletter eller kapsler. De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede antibiotika (1) forventes at vise en ud-30 mærket klinisk infektionsterapeutisk virkning. Desuden er disse antibiotika egnede til veterinære formål og som foderadditiver.

Tylosin har fem hydroxylgrupper i stillingerne 3,2', 3",4" 35 og 4"'. Blandt disse acyleres hydroxylgrupperne i stilling erne 3,2",4" og 4"' let, medens hydroxylgruppen i 3"-stil- - 2 -

DK 156071 B

lingen er mere inaktiv. Hvis hydroxylgruppen i 3"-stillin-gen acyleres, så acyleres de andre stillinger med højaktive hydroxylgrupper også, og derfor har en selektiv acylering af begge stillingerne 3" og 4" været umulig ved den kendte 5 tekniks acyleringsmetoder.

Ved en acylering af hydroxylgruppen i 3"-stillingen acyleres andre hydroxy1grupper, nemlig i stillingerne 2' og 4"', med beskyttelsesgrupper, som selektivt fjernes efter acyle-10 ringen af hydroxylgruppen i 3"-stillingen. Disse beskyttel sesgrupper er lavmolekylære alkanoylgrupper for hydroxyl-gruppen i 2'-stillingen og lavmolekylære alkanoylgrupper eller halogenerede acetylgrupper for hydroxylgruppen i 4"-stillingen.

15

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Der dannes i det første tilfælde som slutprodukt en for-20 bindelse med formlen(1c) 19 20 JTCHO H0_N(CH3); S"PR2 25 > H,C-< 0—( o —< CH3 CHj 30 HsS-0 Yj\>0

ΗΟχ/-0 X

HjCCI 1OCHj tlc] 35 - 3 -

DK 156071 B

hvor R^, 1*2 og har samme betydning som i kravet. I det andet tilfælde fås som slutprodukt en forbindelse med formlen (ld) 5 19 20 tr“CHf) H0_N(CH3)2 3"or < 'o—( o -C*" 3^> ORl CH3 CH3 J)’— o 0/ Ild] \—( ' CH,

HjCO OCHj 20 hvor R^, R2 og R^ har samme betydning som i kravet.

Udgangsmaterialet 5 er normalt et kendt 2'-acyltylosin. Acylgruppen fjernes i en efterfølgende reaktion og er en C2_g-alkanoylgruppe, fortrinsvis acetyl, propionyl eller 25 butyryl.

Hydroxylgruppen i 4"'-stillingen i ovennævnte 2'-acyltylosin kan valgfrit beskyttes med en C2_g-alkanoyl-gruppe eller en lavmolekylær halogenalkanoylgruppe, især 30 sidstnævnte såsom chloracetyl, dichloracetyl eller trichloracetyl, men den skal ikke nødvendigvis beskyttes før fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Ovennævnte 2'-acyltylosin underkastes 3,4"-acylering ved 35 hjælp af tilsvarende aliphatiske carboxylsyrehalogenider.

Acyleringen udføres ved omsætning med tilsvarende carboxylsyrehalogenider i et indifferent organisk opløs - 4 -

DK 156071 B

ningsmiddel i nærværelse af tertiær organisk amin. Eksempler på tertiære organiske aminer er pyridinforbindelser såsom pyridin, picolin eller collidin. Andre kendte tertiære organiske aminer såsom triethylamin, dimethylanilin, 5 diethylanilin, N-methylpiperidin, N-methylmorpholin, quino- lin eller isoquinolin kan benyttes. Eksempler på alipha-tiske carboxylsyrehalogenider er aliphatiske C2_g-carboxyl-syrehalogenider såsom acetylchlorid, propionylchlorid,buty-rylchlorid, isobutyrylchlorid, valerylchlorid, isovaleryl-10 chlorid eller hexanoylchlorid. Acylgrupper til 3-stillingen er lavmolekylære grupper såsom acetylchlorid eller propionylchlorid. Reaktionen kan foretages ved stuetemperatur, og det ér derfor ikke nødvendigt at opvarme, eller man kan opvarme til højst 30-50°C. Reaktionsproces-15 sen kan kontrolleres ved tyndtlagschromatografi på sili- cagel, og den er afsluttet i løbet af 1-10 timer.

Ved ovenstående acyleringsreaktion acyleres ikke blot hy-droxylgrupperne i stillingerne 3 og 4", men også en fri 20 hydroxylgruppe i 4"'-stillingen acyleres. Derfor kan mæng den af aliphatisk carboxylsyrehalogenid bestemmes ved det antal hydroxylgrupper, som skal acyleres.

Hvis endvidere stillingerne 3 og 4" skal acyleres med for-25 skellige acylgrupper, benyttes en lidt mindre mængde aliphatisk carboxylsyrehalogenid til opnåelse af først den 4"-acylerede forbindelse, og derefter acyleres denne forbindelse i 3-stillingen ved hjælp af det ønskede aliphatiske carboxylsyrehalogenid.

30

Den således opnåede forbindelse (6) kan isoleres på den måde, at når reaktionsopløsningsmidlet er et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, så indstilles reaktionsblandingen ved hjælp af alkali til en pH-værdi på 8-10 i 35 vand til udfældning og filtrering, og når reaktionsopløs ningsmidlet er et med vand ikke blandbart organisk opløsningsmiddel, så hældes reaktionsblandingen i vand og ind- - 5 -

DK 156071 B

stilles til en pH-værdi på 8-10 og ekstraheres derpå med et passende med vand ikke blandbart organisk opløsningsmiddel. Yderligere rensning kan foretages ved chromatografi under anvendelse af silicagel, aktivt aluminiumoxid eller adsorp-5 tionsharpiks under eluering med f.eks. benzen og acetone.

Acylering af forbindelsen (6) i 3"-stillingen kan foretages ved omsætning med et tilsvarende aliphatisk carboxylsyrean-hydrid i nærværelse af base under opvarmning. Eksempler på 10 base er alkalimetalcarbonat såsom kaliumcarbonat eller na- triumcarbonat og tertiære organiske aminer som f.eks. pyri-dinforbindelser såsom pyridin, picolin eller collidin, men dette udgør ikke nogen begrænsning, og alle kendte alkalimetalcarbonater, alkalimetalhydrogencarbonater eller 15 tertiære organiske aminer kan benyttes.

Opvarmningstemperaturen er f.eks. 50-120°C, fortrinsvis 80-100°C. Reaktionstiden varierer afhængende af reaktionstemperaturen, og da reaktionen kan kontrolleres ved tyndt-lagschromatografi på silicagel, kan slutpunktet for reak-20 tionen bestemmes ved forsvinden af forbindelse (6) i reak tionsblandingen, og tidsrummet er af størrelsesordenen 1-100 timer.

Ved ovennævnte reaktion omarrangeres den hidtidige acyl-2 25 gruppe R i 4"-stillingen til 3"-stillingen, og acylgruppen 3 .

R indføres i 4"-stillmgen.

Den således opnåede forbindelse (7) kan isoleres på den måde, at når reaktionsopløsningsmidlet er et med vand bland-30 bar organisk opløsningsmiddel, indstilles reaktionsblan dingen ved hjælp af alkali til en pH-værdi på 8-10 i vand til udfældning og filtrering, og når reaktionsopløsningsmidlet er et med vand ikke-blandbart organisk opløsningsmiddel, hældes reaktionsblandingen i vand, og man indstil-35 ler pH-værdien på 8-10, og man ekstraherer med et med vand ublandbart organisk opløsningsmiddel. Yderligere rensning kan foretages ved chromatografi under anvendelse af sili- - 6 -

DK 156071 B

cagel, aktivt aluminiumoxid eller adsorptionsharpiks under eluering med f.eks. benzen og acetone.

Fjernelse af beskyttelsesgrupperne i forbindelsen (7) ud-5 føres ved behandling med methanol eller ethanol indehold ende ammoniak til fjernelse af beskyttelsesgruppen i 4"'-stillingen. Reaktionen forløber ved stuetemperatur og kan afsluttes ved forsvinden af forbindelsen (7) ved kontrol ved tyndtlagschromatografi på silicagel. Ammoniak 10 og alkohol afdestilleres fra den således opnåede reaktions blanding, og blandingen opvarmes i methanol, som kan indeholde vand, til fjernelse af acylgruppen i 2'-stillingen.

Der foretages opvarmning under tilbagesvaling af methanol. Reaktionsprocessen kan kontrolleres ved tyndtlagschromato-15 grafi på silicagel til afslutning af reaktionen.

Forbindelsen (lc) kan fås ved isolation og rensning af reaktionsblandingen efter afdestillation af methanol.

20 Forbindelsen (6) kan også acyleres i 3"-sti11ingen ved hjælp af et tilsvarende aliphatisk carboxylsyrehalogenid. Acyleringen udføres ved omsætning med tilsvarende aliphatisk carboxylsyrehalogenid i nærværelse af tertiær organisk amin i et indifferent organisk opløsningsmiddel under op-25 varmning. Eksempler på indifferente organiske opløsnings midler er acetone, methylethylketon, ethylacetat, dime-thoxyethan, tetrahydrofuran, dioxan, dichlorethan, benzen eller toluen. Eksempler på tertiære organiske aminer er py-ridinforbindelser såsom pyridin, picolin eller collidin, '30 men de øvrige kendte tertiære organiske aminer såsom tri- ethylamin, dimethylanilin, diethylanilin, N-methylpiperi-din, N-methylmorpholin, quinolin, isoquinolin eller triben-zylamin kan benyttes selektivt. Tilsvarende carboxylsyre-halogenider er aliphatiske C2_g-carboxylsyrehalogenider så-35 som acetylchlorid, propionylchlorid, butyrylchlorid, isobu- tyrylchlorid, valerylchlorid, isovalerylchlorid eller hex-anoylchlorid.

- 7 -

DK 156071 B

Opvarmningstemperaturen kan være 50-120°C. Reaktionstiden kan variere afhængende af reaktionstemperaturen, og da processens fremadskriden kan kontrolleres ved tyndtlagschroma-tografi på silicagel, kan afslutningen bestemmes inden for 5 området 1-150 timer.

Den opnåede forbindelse (8) kan isoleres på samme måde som forbindelse (7).

10 Derefter fjernes beskyttelsesgrupperne i stillingerne 2' og 4"' i forbindelsen (8) til opnåelse af forbindelsen (ld). Denne fjernelse kan udføres ved den samme fjernelsesreaktion for beskyttelsesgrupperne som ved forbindelse (7) ovenfor. Forbindelsen (ld) kan fås ved 15 isolation og rensning som beskrevet nedenfor fra produktet efter fjernelse af methanol.

Isolation af den ønskede forbindelse (1) kan udføres ved kendt isolation og rensning af macrolidantibiotika, f.eks.

20 inddampning, ekstraktion, vaskning, overføring og krystallisation samt chromatografi under anvendelse af silicagel, aktivt aluminiumoxid eller adsorbent såsom adsorbent harpiks.

25 I tabel I er anført de minimale inhiberende koncentrationer (MIC) på mikroorganismer for en af forbindelserne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Det fremgår, at forbindelsen (1) er effektiv mod macrolidresistente A-gruppemikroorganismer.

30

Nedenstående eksempler illustrerer fremstillingen af forbindelserne (1) ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Rf-værdierne i eksemplerne er målt ved følgende tyndtlags-35 chromatografi: Bærer: Silicagel 60 (Merck Co.)

DK 156071 B

- 8 -

Fremkalder: A: n-hexan: acetone: benzen: ethylacetat: methanol, 30:10:25:20:10 B: benzen: acetone, 3:1 5 C: benzen: acetone, 4:1 MIC ug/ml Forbindelse.efter frem- gangsmagen ltl.opfindelsen Kontrol 10 ^forbindelse 4"-stilling Bu H Bu

Forsøgsorganisme^ 3-stilling ac HH

Staph.aureus ATCC6538P 0,8 0,8 0,8

Staph, aureus MS353 1,6 lf6 3,1

Staph, aureus MS353AO* 50 ^100 50

Staph, aureus 0116* 25 ^100 25

Staph, aureus 0119* 100 J^IOO 50

Staph, aureus 0127* 100 ^>100 100

Strept. pyogenes N.Y.5 0,2 0,2 0,2

Strept. pyogenes 1022* 25 ^>100 12,5 20

Ac: acetyl, Bu: butyryl.

* Erythromycin-, oleandomycin- og 16-led-macrolidresistente stammer af kliniske iso-later (macrolidresistente A-gruppe-^ stammer).

30 35 - 9 -

DK 156071 B

Eksempel 1 3,311-diacetyl-4''-butyryltylosin

Eddikesyreanhydrid (8,5 ml) sættes til tylosin (10 g) 5 opløst i tør acetone (50 ml) og omrøres i 4 timer ved stue temperatur. Reaktionsblandingen hældes i vand (200 ml), indstilles til pH 9,5 ved tilsætning af ammoniakvand og ekstraheres 2 gange med chloroform (200 ml). Ekstrakten tørres ved tilsætning af vandfrit magnesiumsulfat og tørres 10 i vakuum til opnåelse af 21-acetyltylosin (10,2 g). Tyndt- lagschromatografi: Rfg = 0,12, Rf^ = 0,06 (tylosin: Rf^ = 0,20, Rfg = 0,01, Rfc = 0,01).

Tørt pyridin (8,05 ml) og acetylchlorid (6,4 ml) sættes til 15 ovennævnte stof (10 g) opløst i tør acetone (50 ml) og omrøres i 150 min. ved 45°C. Reaktionsblandingen hældes i vand (200 ml), indstilles til pH 9,5 ved tilsætning af ammoniakvand, og udfældningen filtreres til opnåelse af 3,2', 4'1, 411'-tetraacetyltylosin (8,44 g). Tyndtlags- 20 chromatografi: Rfg = 0,40, Rf^ = 0,22.

Smørsyreanhydrid (1 ml) sættes til ovennævnte stof (2,0 g) opløst i tørt pyridin (10 ml) og omrøres i 4 dage ved 100°C. Reaktionsblandingen hældes i vand (50 ml), 25 indstilles til pH 9,5 ved tilsætning af ammoniakvand og ekstraheres med chloroform (50 ml). Ekstrakten vaskes 2 gange med 0,1 N HC1 (50 ml) og 1 gang med fortyndet ammoniakvand, tørres med vandfrit magnesiumsulfat og tørres i vakuum til opnåelse af råt 3,2', 3'', 4,,,-tetra- 30 acety1-411-butyryl-tylosin. Tyndtlagschromatografi: Rf0 = 0,81, Rf^, = 0,66.

Methanol mættet med ammoniak (10 ml) sættes til dette råprodukt opløst i methanol og omrøres 3 timer under is-35 afkøling. Reaktionsblandingen hældes i vand (100 ml) og ekstraheres med chloroform (100 ml). Ekstrakten tørres ved tilsætning af vandfrit magnesiumsulfat og tørres i vakuum.

DK 156071B

- 10 -

Resten opløses i methanol (50 ml), tilbagesvales i 17 timer og tørres i vakuum til opnåelse af råt 3,3''-diacetyl-41'-butyryltylosin, som renses ved silicagelsøjlechromatografi under eluering med benzen og 5 acetone (10:1), hvorved man får den rensede forbindelse (1,2 g). Tyndtlagschromatografi: RF^ = 0,73.

Eksempel 2 3,311-diacetyl-41'-isovaleryltylosin 10 I eksempel 1 erstattes smørsyreanhydrid med isovaleriane-syreanhydrid, hvorved man får 3,3' '-diacetyl-4'1-isovaleryltylosin. Tyndtlagschromatografi: Rf^ = 0,76.

15 Eksempel 3 3,3'', 411-triacetyltylosin

Eddikesyreanhydrid (0,5 ml) sættes til 3,2', 4'', 4,,'-te- traacetyltylosin fra eksempel 1 opløst i tørt pyridin (5 20 ml) og omrøres 2 dage ved 100°C. Reaktionsblandingen hældes i vand (30 ml), indstilles til en pH-værdi på 9,5 ved tilsætning af ammoniakvand og ekstraheres med chloroform (30 ml). Ekstrakten tørres ved hjælp af vandfrit magnesium-sulfat og tørres til sidst i vakuum. Resten opløses i 25 methanol (10 ml) og tilsættes methanol mættet med ammoniak (5 ml), hvorpå man omrører 3 timer under isafkøling. Reaktionsblandingen hældes i vand (100 ml) og ekstraheres med chloroform (100 ml). Ekstrakten tørres ved tilsætning af vandfrit magnesiumsulfat, hvorpå der foretages en tør-30 ring i vakuum. Resten opløses i methanol (30 ml), tilbage svales i 17 timer og tørres i vakuum til opnåelse af råt 3,3'', 4·1-triacetyltylosin.

Denne forbindelse renses ved chromatografi på silicagel-35 søjle under eluering med en blanding af benzen og acetone i forholdet 7:1, hvorved man får den rene forbindelse (700 mg).

DK 156071 B

- 11 -

Tyndtlagschromatografi: Rf^ = 0,54

Masse: 982 (M 60), 922, 753, 563, 391, 372, 174, 169.

5 10 15 e 20 25 30 35

Claims (3)

1. 5 A3 rCH0 Rs°_,N(CH3) _.OH 0 =<^ \— ο —ζ V- 0 —VoH y H,C< o—< 0-( J>0H CHj 5 1° ^ 3 \ H3C, \Af\n / °
2. 15 H3C0 OCHj hvor betegner alkanoyl med 2-6 carbonatomer, og betegner hydrogen, alkanoyl med 2-6 carbonatomer eller lavmolekylært halogenalkanoyl, med tilsvarende aliphatiske 20 carboxylsyrehalogenider i nærværelse af en tertiær organisk amin i et indifferent organisk opløsningsmiddel til opnåelse af en forbindelse med formlen(6) CHj r—CHO R50 N(CHj) 2 ,oh oAVoljoAo, > '<«, "«. A 30 >CH3 <C H,C, \/Nn / 35 l3C0 OCHj hvor Ry betegner alkanoyl med 2-6 carbonatomer eller lavmolekylært halogenalkanoyl, og R^, R£ og R,- har samme be- DK 156071 B - 14 - tydning som ovenfor, hvorpå man 3"-acylerer ved en af følgende fremgangsmåder, hvor man (a) enten omsætter forbindelsen med formlen(6)med et tilsvarende aliphatisk carboxylsyreanhydrid under opvarmning i 5 nærværelse af base til opnåelse af en forbindelse med form lent 7 ) CHj j—CHO rso N C CH3) 2_,0R2 10 0 \ —0 \ V° \3C/0R3 J> H,C*\ 0-HVu CH CHj CHj VcH, \ H3V-°. YK R’°V/° X H,C0 OCH, [7] 20 Δ * hvor R^, R2, R 3, R5 og R? har samme betydning som ovenfor, eller 25 (b) man omsætter forbindelsen med formlen ( 6) med et tilsva rende aliphatisk carboxylsyrehalogenid under opvarmning i nærværelse af en tertiær amin i et indifferent organisk opløsningsmiddel til opnåelse af en forbindelse med formlent 8) 30 35 DK 156071 B - 15 -5 Jj^j JTCH0 Rs°)_(N(CH3)2 or3 0s\^y— o-\ Vo-M-ob2 > h3c< o—< o-<
3. 10 X ^\-0Rt CH3 CHj )>-ch3 \ nj-V J^0 15 xy_/"°. \h3 l3C0 och3 [83 20 hvor R^, R2, R^, R5 og R^ har samme betydning som ovenfor, hvorefter man behandler forbindelsen med formlen (7 ) eller forbindelsen med formlen(8)med en methanol- eller ethanol-opløsning af ammoniak, hvorpå man behandler i methanol un-der opvarmning. 30 35