DK156524B - Proevemiddel til paavisning af tilstedevaerelsen af en komponent i en analyseproeve samt fremgangsmaade og proevemiddelkomposition til fremstilling af samme - Google Patents

Description

DK 156524B

Opfindelsen angàr et prpvemiddel til pâvisning af tilstedeværelsen af en komponent i en analyseprpve, hvilket prpvemiddel tillige omfatter et inhibitorsystem, som efter prpvemidlets kontakt med analyseprpven afbryder den herved pâbegyndte reaktion efter en pâ 5 forhând fastlagt tid.

Diagnosticeringsfysikken og -kemien er ekspanderet med fantastisk hastighed i de sidste 25 âr, sâledes at diagnosticering af systempa-rametre nu kan gennemfpres med utrolig lethed og hurtighed.

10

En sâdan ekspansion har blandt andet fundet sted inden for omrâdet medicinsk diagnosticering, hvor talrige legemsfunktioner nu kan underspges blot ved at dyppe en reagensbelagt strimmel i en prpve af en legemsvæske, sâsom urin, og iagttage et detekterbart respons, 15 sâsom farvefremkomst eller -skift eller en forandring i den mængde lys, som reflekteres fra eller absorberes af strimmelen.

Sammen med sâdanne "dyp-og-aflaes"-metoder er der fremkommet talrige kemiske remedier til pâvisning af legemsvæskekomponenter. De fleste 20 af disse giver et detekterbart respons, som er kvantitativt eller i det mindste semi-kvantitativt. Ved at mâle responset efter en pâ forhând fastlagt tid, kan analysekemikeren derfor ikke blot fâ en positiv indikation pâ tilstedeværelsen af en nærmere bestemt be-standdel i en legemsvæske men ogsâ en vurdering af, hvor meget der 25 er til stede af den pâgældende bestanddel. Sâdanne strimler udgpr derfor et let diagnosticeringsværktpj for lægen og gpr det muligt at bestemme omfanget af en lidelse eller graden af en funktionsfor-styrrelse. Eksempler pâ sâdanne strimler, som for tiden benyttes, er de produkter, der kan fâs fra The Ames Company Division of Miles 30 Laboratories, Inc. under varemærkerne CLINISTIX®, MULTISTIX®, KETOSTIX®, N-MULTISTIX®, DIASTIX®, PHENISTIX®, DEXTROSTIX® og andre. Prpvemidler som disse omfatter sædvanligvis én eller flere bærerma-tricer, sâsom absorberende papir, der i sig har absorberet et nærmere bestemt reaktantsystem, som giver et farveskift eller en 35 farvefremkomst i nærvær af en bestemt komponent i analyseprpven.

Afhængig af det særlige reaktantsystem, som er inkorporeret i en nærmere bestemt matrix, kan disse midler pâvise tilstedeværelsen af glucose, albumin, ketoner, bilirubin, ikke-synligt blod, nitrit og urobilinogen, bestemme hydrogenionkoncentrationen (pH) eller lign-ende. Den nærmere bestemte farvefremkomst oa dens intensitet, som

DK 156524 B

2 kan observeres inden for et nærmere angivet tidsrum efter at strim-melen er bragt i ber0ring med analysepr0ven, indicerer tilste-deværelse af en nærmere bestemt komponent og dens koncentration i prpven. Prpvemidler af denne type og deres reaktantsystemer kendes 5 fra beskrivelserne til US patenterne nr. 3.123.443 (CLINISTIX®), 3.212.855 (KETOSTIX®), 3.814.668, 3.164.534 og 2.981.606 (DIASTIX®), og 3.092.465, 3.298.789, 3.164.534 og 2.981.606 (DEXTROSTIX®).

Sædvanligvis ledsages diagnosticeringsreagensmidler, sâsom "dyp-og-10 aflæs"-reagensstrimler, af detaljerede trykte instruktioner, som man ma f0lge omhyggeligt for at sikre npjagtige resultater. Nâr det detekterbare respons er et farveskift, er særlig omhu npdvendig. Der leveres et kort med forskellige farver til sammenligning med strim-melen, og som fplge af, at midlets anvendelse til kvantitativ 15 bestemmelse i de fl este tilfælde afhænger af, at farvedannelsesgra-den er afhængig af den forlpbne tid, er det pàkrævet, at farveskif-tet sammenlignés med kortet i Ipbet af et foreskrevet tidsrum efter dypning i analyseprpven. Venteperioderne mà overholdes npjagtigt, idet for tidlig aflæsning resulterer i for svag farvedannelse, og 20 for sen aflæsning resulterer i for kraftig farvedannelse eller endog i, at der fremkommer en ekstra, forstyrrende farve. Hvis farvedannel sen sâledes sammenlignés med farvekortet pâ et for tidligt eller for sent tidspunkt bliver resultatet un0jagtigt.

25 I forspg pâ at g0re den npjagtige overholdelse af tidspunkt for aflæsningen mindre kritisk, idet denne tidspunktbestemmelse bâde er ubekvem og potentielt unpjagtig, er der blevet iværksat store forskningsprogrammer for at finde mâder, hvorved det ville blive un0dvendigt at fiksere aflæsningen af de kendte prpvemidler til et 30 bestemt tidspunkt. Primært spgtes en mâde, hvorved dannelsen af en detekterbar forbindelse automatisk ville ophpre efter et pâ forhând fastlagt tidsrum, og hvor reaktionsgraden ville forblive konstant under forholdsvis lange opbevaringsperioder. Farvekortsammenligning-en kunne da ske, nâr det passede brugeren, eller pâ et tidspunkt 35 længe efter, at prpvemidlet faktisk var bragt i ber0ring med analy-seprpven. I lang tid har der inden for diagnosticeringsreagenskemi-ens fagomrâde været enighed om, at sàdanne prpvemidler ville forbed-re teknikkens stade kraftigt, men hidtil er der ikke blevet fores!â-et noget, som tilvejebringer den længe ventede Ipsning.

DK 156524 B

3

Med den foreliggende opfindelse er ovennævnte opgave imidlertid nu blevet Ipst pâ tilfredsstillende mâde. Dette opnâs ved, at prpvemid-1 et med de indledningsvis angivne karakteristika er ejendommmelig ved, at det tillige omfatter et inhibitorsystem, som efter prpvemid-5 lets kontakt med analyseprpven afbryder den herved pâbegyndte reaktion efter en pâ forhând fastlagt tid.

Prpvemidlets anvendelse til bestemmelse af tilstedeværelsen af en komponent i en analyseprpve omfatter, at en analyseprpve, som 10 mistænkes for at indeholde komponenten, bringes i kontakt med prpvemidlet, at prpvemidlet og analyseprpven inkuberes i et pâ forhând fastlagt tidsrum, og at det detekterbare respons bedpmmes.

Opfindelsen angâr ogsâ en fremgangsmâde til fremstilling af et 15 prpvemiddel ifdlge opfindelsen til pâvisning af tilstedeværelsen af en komponent i en prpve, ved hvilken fremgangsmâde der i en bærer-matrix inkorporeres et reaktantssystem, som nâr det bringes i kontakt med en analyseprpve, der indeholder komponenten, reagerer med denne under dannelse af et detekterbart respons, og er ejen-20 dommelig ved, at der tillige inkorporeres et inhibitorsystem, som efter prpvemidlets kontakt med analyseprpven afbryder den herved pâbegyndte reaktion efter en pâ forhând fastlagt tid.

Opfindelsen angâr endvidere en prpvemiddelkomposition til fremstil-25 ling af et prpvemiddel ifplge opfindelsen til pâvisning af tilstedeværelsen af en komponent i en analyseprpve, hvilket prpvemiddel omfatter et reaktantsystem, som ved kontakt med analyseprpven reagerer med komponenten under dannelse af et detekterbart respons, og er ejendommeligt ved, at den tillige omfatter et inhibitorsystem, 30 som ved kontakt med analyseprpven hindrer reaktantsystemet i at reagere med komponenten efter en pâ forhând fastlagt tid.

Prpvemidlet ifplge opfindelsen kan omfatte mange former for diag-nosticeringskemi, herunder kendte reaktantsystemer, som for tiden 35 benyttes som pH-indikatorer eller indikatorer for andre ionkon- centrationer og mere komplekse reagenssystemer, sâsom de, der benyttes til bestemmelse af legemsvæskekomponenter. Disse reagenssystemer er i særlig grad egnede til og forenelige med den heri beskrevne opfindelsesidé. Sâledes kan kendte diagnosticeringsprpve-midler til ikke-synligt blod, glucose, bilirubin, blodurinstofnitro- 4

DK 156524B

gen, bakterieurinstof, urobilinogen, cholestérol, protein og andet, aile modificeres ifplge den foreliggende opfindelses lære.

Anvendelsen af kendte eller nye reaktantsystemer i prpvemidlet 5 ifplge opfindelsen indebærer sâledes, at reaktionen mellem komponen-ten i analyseprpven og reaktantsystemet, efter at prpvemidlet er blevet bragt i kontakt med analyseprpven, hprer op efter et pâ forhând fastlagt tidsrum. Herved vil omfanget af et detekterbart respons for et givet reaktantsystem blive fikseret efter udlpbet af 10 den fastlagte tid, og en ved reaktionen dannet farve vil herefter hverken blive forstærket eller svækket, og mængden af ved reaktionen dannet eller forbrugt produkt vil forblive konstant.

De her beskrevne virkninger kan opnâs pâ talrige mâder. En fore-15 trukket mâde er at tilvejebringe et inhibitorsystem, som fysisk hindrer yderligere reaktion ved dannelse af en gel, en polymer eller en hærdnet overflade, hvorved fysisk kontakt mellem reaktantsystemet og komponenten udelukkes, efter at det pâ forhând fastlagte tidsin-terval er forlpbet.

20

En anden mâde er at forsyne pr0vemidlet med et inhibitorsystem, som deaktiverer reaktantsystemet. I det tilfælde, hvor et varmelabilt enzym er kritisk for reaktantsystemets virkemâde, kan inhibitorsy-stemet sâledes omfatte et varmefrembringende middel, som 0ger 25 prpvemidlets temperatur til det punkt, hvor enzymet bliver deaktive-ret, efter at det pâ forhând fastlagte tidsrum er forlpbet.

En yderligere mâde er at anvende et inhibitorsystem, som forgifter eller kemisk interfererer med en eller flere komponenter i reaktant-30 systemet efter det pâ forhând fastlagte tidsrum for derved at undertrykke reaktionen med komponenten i analyseprpven. Anvendelse af disse og andre inhibitorsystemer ligger inden for den foreliggende opfindelses rammer, idet den afgprende faktor er inhibitorsyste-mets evne til at tillade reaktion mellem reaktantsystemet og kompo-35 nenten pâ det tidspunkt, hvor analyseprpven og prdvemidlet kontak-tes, men udelukke denne reaktion pâ et senere pâ forhând fastsat tidspunkt.

Nâr et inhibitorsystem, som fysisk hindrer reaktion mellem reaktant-

DK 156524 B

5

System og komponent, d.v.s. et inhibitorsystem, som hærdner eller danner gel, pnskes anvendt, star der mange muligheder til râdighed. Blandt de gel-dannende eller hærdnende materialer, som kan benyttes, er sâdanne, som er stærkt reaktive ved stuetemperatur, og som 5 begynder at reagere eller initieres ved kontakt med analyseprpven.

Disse inhibitormidler mâ hærdne eller danne gel med tilstrækkelig hastighed til at inhibere dannelse af et detekterbart respons efter forholdsvis kort tids forlpb. Det er npdvendigt, at inhibitoren efter geldannelsen eller hærdningen hindrer yderligere farvefor-10 andringer eller anden ændring af det detekterbare respons.

Typiske eksempler pâ sâdanne inhibitorsystemer er polymeriserbare eller tværbindelige, vandoplpselige polymerer, epoxid/polyaminblan-dinger, vandreaktive polyisocyanater, hydroxylionpolymeriserbare 15 acrylatestere og substituerede acrylatestere, polyvinylal koholblan-dinger med forskellige métalforbindelser (f.eks. borater, vanadater, Cr(III) og Ti(IV)), natriumcarboxymethylcellulose og Al(III), polyvinylalkoholblandinger med polyphenolforbindelser (f.eks. resorcinol, catechol, phloroglucinol og farvestoffer, og diazonium-20 salte) en blanding af polyvinylalkohol og dimethylolurinstof med en ammoniumchloridkatalysator, dimethylolurinstofblandinger med hydro-xyalkylcellulose og hydrolyserede maleinsyreanhydridcopolymerer eller polyacrylsyre, polyvinylal kohol/polyaldehydforbindelse-bland-inger, polyvinylpyrrolidonkomplekser (nemlig med stoffer som poly-25 carboxylsyrer, en methylvinylether/maleinsyreanhydrid-copolymer, der leveres af GAF Corporation, eller en polyacrylsyre), sur copolymer/-polyethylenglycolblandinger og polyvinylalkoholblandinger med udfældningsmidler (f.eks. Na2C0^, eller KgSO^).

30 En udsættelse af polymerisationen eller tværbindingen af den vand-oploselige polymer kan opnâs ved at isolere initiatoren fra den vandoplpselige polymer, indtil prpvemidlet er blevet kontaktet med analyseprpven. En mâde, hvorpâ denne adskillelse af polymer og initiator kan opnâs, er at indkapsle initiatoren i vandoplpselige 35 mikrokapsler eller i mikrokapsler, som sprænges ved befugtning. Gelatinemikrokapsler indeholdende initiatoren vil sâledes oplpses ved kontakt med en vandig analyseprpve, hvorved initiatoren frigpr-es, sâledes at den kan initiere polymeriseringen.

DK 156524 B

6

Mikrokapsler, som sprænges ved befugtning, omfatter osmotisk fdlsomme, skpre, semi-permeable membranvægge, som indkapsler en vandig fase indeholdende initiatoren. Den vandige fase har en forholdsvis h0j massefylde i forhold til analyseprpven. Nâr kapslerne bringes i 5 kontakt med analyseprpven, opstàr en osmotisk gradient over membran-en, som skaber en fordgelse af trykket i kapslen, der er tilstrække-ligt til at sprænge dens vægge og derved frigive initiatoren.

Fysisk inhibering ved séparation af reaktantsystemet fra komponenten 10 kan ogsâ opnâs med et inhibitorsystem omfattende et epoxid og en deaktiveret polyaminkilde, som giver polyaminer ved kontakt med vand. Typiske eksempler pâ sâdanne polyaminkilder er ketiminer og molekylsier imprægneret med polyamin. I fprstnævnte tilfælde reage-rer ketiminen med vand under dannelse af polyamin og en keton. I 15 sidstnævnte tilfælde er vand i stand til at trænge ind i molekylsi-gitteret og fortrænge polyaminen.

Alternativt kan prpvemidlet forenes med et vandopskummeligt poly-isocyanat, sâsom Hypol®, som leveres af The Dewey and Almy Chemical 20 Division i W.R. Grâce & Co.

Af base- eller hydroxylionkatalyserede acrylatinhibitorsystemer er 2-cyanacrylatestere særligt egnede til den foreliggende opfindelse.

Disse estere er npdvendige bestanddele i klæbestoffer fremstillet af 25 The Eastman Kodak Company og er hurtigt polymeriserbare i nærvær af vand til dannelse af hârde polymerer. Methyl- og ethylesterne er sâdanne, som prîmært er tilgængelige i kommercielle klæbestofsammen-sætninger, sâsom dem fra Kodak, hvilke klæbestoffer indeholder stabilisatorer og fortykkelsesmidler ud over esterne. Methyl-2-30 cyanacrylat er indeholdt i Eastman® 910 og ethyl-2-cyanacrylat er den primære ester i Eastman® 910 EM.

Nâr polyvinylal kohol blandes med borsyre, danner det hurtigt geler i nærvær af base, sâsom natriumhydroxid, og den er derfor egnet i et 35 inhibitorsystem. En foretrukket fremgangsmâde til anvendelse af dette alternativ er at indlemme basen i prpvemidlet i form af vandoplpselige eller osmotisk, f0lsomme, sk0re mikrokapsler. Ved kontakt med analyseprpven forenes da aile reagenserne i inhibitor-systemet og gel-dannelsen standser analysen. Ud over at polyvinylal-

DK 156524 B

7 kohol er anvendeligt i forbindelse med borax (borsyre og base), danner det ogsâ geler med en række andre métalioner og sa!te, heriblandt vanadater, trivalent chrom og tetravalent titan. For eksempel gpr kaliumtitanoxalat (Ti0(C2O4K)2*2H2O) og andre organiske 5 titanater hurtigt polyvinylal kohol uoplpseligt ved stuetemperatur ved en pH-værdi pâ over ca. 7. Herudover danner polyvinylal kohol termisk réversible geler med polyphenolforbindelser, sâsom resorci-nol, catechol, phloroglucinol og visse farvestoffer og diazoniumsal-te.

10

Polyvinylal kohol er endvidere anvendeligt i forbindelse med den foreliggende opfindelse som fplge af dets evne til at tværbinde via acetaldannelse med 1,3-bis-hydroxymethylurinstof (dimethylolurin-stof) og beslægtede forbindelser i nærvær af ammoniumchlorid. Som i 15 mange af de foregâende systemer kan katalysatoren eller initiatoren (NH^Cl) isoleres ved metoder sâsom mikroindkapsling.

Polyfunktionelle aldehyder reagerer ogsâ med polyvinylal kohol under dannelse af acetaltværbindingsgrupper. Ved denne teknik indlemmes en 20 sur katalysator, sâsom oxalsyre eller en anden syre, som er forlige-1 i g med reaktantsystemet, i prpvemidlet, og aldehydet isoleres fra polyvinylal kohol, f.eks. ved mikroindkapsling. Naturligvis kan syren isoleres istedet for aldehydet, forudsat at sidstnævnte er tilstræk-keligt ikke-reaktivt over for polyvinylal kohol uden katalysatoren.

25

Polymerudfældninger har vist sig anvendelige i forbindelse med den foreliggende opfindelse som inhibitorsystem. Sâdanne eksemplificeres af udfældningerne af polyvinylal kohol fra oplpsning med salte, sâsom Na2C03, Na2S04 og K2S04· Endvidere kan polymère syrer, sâsom poly-30 acrylsyre, udfældes fra opldsning eller danne geler ved hjælp af acetatsalte af tungmetaller eller andre vandoplpselige kilder til divalente ioner og af polyethylenglycol.

Hydroxypropylcellulose (KLUCEL®, som leveres af Hercules, Inc.) er 35 en anden polymer, som lader sig bruge til inhibitorsystemet ifdlge den foreliggende opfindelse. Dette materiale kan tværbindes.med sure polymerer, sâsom hydrolyserede maleinsyreanhydridcopolymerer eller polyacrylsyre, ved brug af forbindelser, sâsom dimethylolurinstof, fortrinsvis ved en lav pH-værdi.

DK 156524 B

8

Et andet gel-dannende System, som er anvendeligt i prpvemidlet, er natriumcarboxymethylcellulose og Al(III)-ionen.

GANTREZ® AN, En methylvinylether/maleinsyreanhydridcopolymer, som 5 leveres af GAF Corporation, er anvendelig til prpvemidlet pâ adskil-lige mâder. Den danner et uoplpseligt kompleks med polyvinylpyrroli-don ved en pH-værdi under ca. 5. Polyacryl syre optræder pâ samme màde som GANTREZ® AN med polyvinylpyrrolidon. GANTREZ® AN Danner ogsâ et uoplpseligt kompleks med gélatine i sur opl0sning. I lighed 10 hermed udfældes GANTREZ® AN og andre sure polymère og copolymere forbindelser, sâsom glycoler, polyvinylal kohol, hydroxalkylcellulose og diaminer.

Som angivet ovenfor ligger andre inhibitorsystemer inden for den 15 foreliggende opfindelses rammer. Sâledes kan der benyttes andre inhibitorsystemer end de, der fysisk adskiller reaktantsystemt og analysatkomponenten. F.eks. vil et enzym, som er varmelabilt, ikke virke i et reaktantsystem, hvis systemets temperatur bliver til -strækkelig h0j til at deaktivere det. Fplgelig kan et prpvemiddel, 20 der indeholder et sâdant enzym, udelukkes fra at give noget detek-terbart respons efter et pâ forhând fastlagt tidsrum ved anvendelse af et varmefrembringende inhibitorsystem. Tilsvarende kan inhibitor-systemet omfatte en gift for reaktantsystemt. F.eks. deaktiveres enzymer, der indeholder mercaptogrupper (-SH), af Hg (II), og 25 enzymer deaktiveres generelt i nærvær af stærke syrer og baser, sâsom HCl og NaOH. Eksempler pâ enzymer, som inhiberes af Hg (II), er glutamatdecarboxylase, lactatdehydrogenase, malatdehydrogenase, myokinase, alkalisk phosphatase, sur phosphatase (pH 5,2), aldehyd-oxidase, diaminosyreoxidase, /J-amylase, carbonsyreanhydrase, cholin-30 esterase, α-glukosidase, /J-glukuronidase, homogentisatoxidase, 3-hydroxyanthranilatoxidase og invertase. Den foreliggende opfin-delse omfatter sâledes inkorporering af sâdanne inhibitorsystemer i prpvemidlet.

35 Varmelabile enzymer, sâsom salicylathydroxylase, ligger ligeledes inden for den foreliggende opfindelses ramme. Materialer, som frembringer varme ved kontakt med en vandig analyseprpve, omfatter NaOH, Al Cl3, TiClg, aluminiumalkyler og andre.

En mâde, hvorpâ denatureringen eller forgiftningen af et enzym kan

DK 156524 B

9 udsættes, er at isolere det varmedannende eller giftige inhibitorsy-stem ved hjælp af mikrokapsler. Sâledes kan der vælges vandoplpseli-ge indkapslingsmaterialer, sâledes at de varmefrembringende materi-aler ikke udsættes for prpven, for efter indkapslingsmaterialet er 5 blevet opldst. Vandoplpselige materialer, sâsom gélatine, acryl-amider, styren/maleinsyrecopolymerer og hydroxypropylcellulose samt blandinger, sâsom et coacervat af gélatine og naturlige eller syntetiske polymerer, er egnede til indkapsling.

10 Som angivet ovenfor lader mikrokaplser af forskellig art sig især benytte i forbindelse med den foreliggende opfindelse, nâr bestand-delene skal adskilles midlertidigt. De kan fremstilles ved en række velkendte metoder. Et eksempel herpâ er den i Angew. Chem. Internat.

Edit. 14:539 (1975) beskrevne fremgangsmâde og de deri angivne 15 referencer. Metoder som grænsefladepolykondensation, coacervation og lignende vil frembringe mikrokapsler. André metoder, sâsom centifu-gering, spraytdrring og andre mekanisk-fysiske metoder, vil pâ samme mâde kunne anvendes til fremstilling af mikrokapslerne.

20 Grænsefladepolykondensation er en foretrukket fremgangsmâde til fremstilling af mikrokapslerne som fplge af dens forholdsvise lethed. Ved denne teknik bringes to reaktive materialer (comonomere eller oligomere) til at reagere ved et flerfasesystems grænseflade.

Der indtræder polykondensation under dannelse af en tynd polymer-25 film, som er uoplpselig i de medier, der indeholder monomererne.

Egnede mikrokapsler af den osmotisk f0lsomme, skore type er frem-stillet ved oplpsning af en fprste comonomerkomponent, sâsom en polyfunktionel amin, i en vandig fase indeholdende det stof, der skal isoleres. Denne vandige fase er fortrinsvis en fase med en h0j 30 massefylde eller osmolalitet i forhold til det forventede osmolali-tetsomrâde for den prpve, der skal analyseres. Den vandige fase dispergeres eller emulgérés derefter i en med vand ikke-blandbar fase, sâsom mineralolie. En anden comonomer, sâsom et polyfunkti-onelt acylhalogenid, sættes derefter til suspension eller émulsion.

35 Nâr comonomererne er polyfunktionelle aminer og acylhalogenider, dannes der polyamidmikrokapsler, som aile indeholder en de! af den vandige fase, d.v.s. det isolerede materiale.

Egnet polymermateriale til dannelse af den osmotisk f0lsomme, skdre

DK 156524 B

10 semipermeable membranvæg i mikrokapsTerne omfatter ud over polyamid, polyester, polyurethan, polyurinstof og lignende.

En anden màde til adskillelse af bestanddelene i et inhibitorsystem, 5 hvor den ene af bestanddelene er oplpselig i vand og den anden i organiske opldsningsmidler, er at benytte en "dobbelt-dypningsn-pro-ces. Derved inkorporeres fprst en vandig oplpsning af den ene bestanddel i prpvemidlets bærermatrix, der tprres, og derefter inkorporeres en anden oplpsning af den anden bestanddel i et orga-10 nisk oplpsningsmiddel.

I visse af de ovenfor beskrevne inhibitorsystemer, som ikke kræver isolering af bestanddelen, sâsom de, der benytter 2-cyanacrylater, vand-opskummelige isocyanater og epoxidreagenser, hvor man sprger 15 for at udelukke fugtighed, sâvel under fremstilling af prpvemidlet og prpvemiddelkompositionen som under opbevaringen inden den ende-lige brug. Polymérisation af inhibitorsystemet er da udelukket, fpr det kommer i berpring med analyseprpven.

20 Gel-dannende eller hærdnende inhibitorsystemer, der er eksemplifice-ret ved nogle af de ovenfor nævnte systemer, kan sammen med et 0nsket reaktantsystem inkorporeres i en bærermatrix ved hjælp af et hvilket som helst egnet middel under dannelse af prpvemidlet ifplge den foreliggende opfindelse. Sâledes kan en bærermatrix dyppes i en 25 enkelt oplpsning af aile bestanddelene i reaktant- og inhibitorsystemet. Nâr en "dobbelt-dypnings"-metode er npvendig som fplge af npdvendigheden af at isolere bestanddelene, dyppes matricen, tprres og dyppes îgen som beskrevet ovenfor. I det tilfælde, hvor der benyttes mikrokapsler, kan de fastgpres til matricen ved hjælp af 30 bindemidler. Blandt de bindemidler, der har vist sig at være særligt egnede, er celluloseacetat, celluloseacetatbutyrat, hydroxypropyl-cellulose og polyvinylpyrrolidon. Bindemidlerne bpr være ikke-bland-bare med analyseprpven og tillade absorption af prpven i bærermatri-cen.

35

Egnede materialer, der kan benyttes som bærermatrix i prpvemidlet, er bl.a. papir, cellulose, træ, flager af syntetisk harpiks, glas-fibre og andre syntetiske papirer, polypropylenfilm, ikke-vævede og vævede stoffer og lignende. Matricen fastgpres med fordel ved hjælp af et eller andet hensigtsmæssigt middel til et sædvanligt bæreror- DK 156524 B π gan, sâsom en polymerstrimmel, for at lette brugen.

Ved anvende!se af prpvemidlet neddykkes matricen indeholdende reaktant- og inhibitorsystemerne i analyseprpven. Det pâ forhànd 5 fastlagte tidsrum, som er passende for prpvemidlet, fâr lov at forlpbe, og det detekterbare respons pâ pmemidlet underspges derefter. Nâr responset er en farvedannal se eller en farveforand-ring, kan udstyret sammenlignés med et standardfarvekort. Hvis responset omfatter en lysreflektansforandring, undersdges udstyret i 10 et passende lysmâleinstrument, sâsom de inden for fagomrâdet vel-kendte.

Nedenstâende eksempler meddeles til yderligere illustration og belysning af den foreliggende opfindelse. Det skal imidlertid 15 bemærkes, at disse kun tjener til at eksemplificere de for tiden foretrukne udforelsesformer, og at de pâ ingen mâde mà fortolkes som begrænsende for opfindelsens rækkevidde.

Eksempel I

20

En 10 vægtprocent oplpsning i chloroform af Eastman® 910® klæbestof indeholdende methyl.-2-cyanoacrylat (Eastman Chemical· Products, Inc., Kingsport, Tennessee, et datterselskab af Eastman Kodak Company) blev fremstillet og opbevaret i en tætlukket glasbeholder. Et 25 prpvemiddel til pâvisning af glucose i urin (svarende til CLINIS-TIX®) blev fremstillet pâ fplgende mâde:

Whatman® 3MM filterpapir imprægneredes med en prpvereagensopldsning som beskrevet i beskrivelserne til US patenterne nr. 2.981.606 og 30 nr. 3.154.534, og tprredes derefter. Nærmere bestemt var sammensæt-ningen fdlgende: CLINISTIX®-sammensætninq 35 Destilleret vand 758,1 ml

Ethanol-95% 205,0 ml

Carageenan Viscarin, fremstillet af Marine Colloids, Inc. 2,5 g

DK 156524B

12

Polyvinylpyrrolidon 25,0 g

Farvestoffer (FD&C 3&4) 0,29 g o-Tolidin*2HCl 5,0 g

Citronsyre (vandfrit) 15,42 g 5 Natriumcitrat 67,92 g GANTREZ®AN-139 7,5 g

Overfladeaktivt middel 2,5 g

Glucoseoxidase 76,0 ml

Peroxidase 0,5 g 10

Portioner af det impraegnerede papir imprægneredes yderligere med de ovenfor beskrevne opl0sninger. André behandledes kun med chloroform som kontrol. Imprægneringsbeholderen var udformet sâledes, at papiret kunne komme ind og ud, men var tildækket for at nedsætte 15 fordampning af chloroform, samtidig med, at overskydende imprægne-ringsoplpsning kunne afdrænes papiret i en oplpsningsmiddelrig atmosfære i beholderen. Efter fjernelse af papiret fra badet fik oplpsningmidlet lov ti1 at dampe af i 10-30 minutter ved omgivelses-temperatur i en atmosfære med kontrol!eret lav fugtighed (mindre end 20 10¾ RH). Det monomer impraegnerede papir opbevaredes i en mprk, t0r atmosfære og blev derefter monteret pâ en plastunderstitning og opskâret i det sædvanlige reagensstrimmelformat. De fremstillede strimler blev derefter opbevaret i m0rke glasflasker i nærvaer af fugtighedadsorberende silicagel.

25

De sâledes fremstillede strimler blev bedpmt ved at dyppe dem hver for sig i tre sekunder i urinprpver med kendt glucosekoncentration (0, 50, 100, 200 og 500 mg/dl), fjerne overskydende pr0ve og indf0re dem i et reflektansmâleapparat. Reflektansaflæsninger ved 680 nm 30 registreredes som funktion af tiden fra t = 15 sekunder inklusive dyppetiden i 3,5 minutter. I Tabel I er ændringerne af reflektans-værdierne mellem intervallerne og slutreflektansværdierne anfdrt for det impraegnerede med 10% Eastman® 910 glucosespecifikke papir ved de forskellige glucosekoncentrationer. Ændringen af reflektansen ved 15 35 sekunder er forskellen fra reflektansværdien, nâr der ikke er noget glucose ti 1 stede. Det fremgâr, at der ikke sker nogen aendring af reflektansværdien efter to minutter. Disse slutfarver kan let skelnes visuelt og fortsætter med at være stabile i perioder pâ mellem adskillige dage og adskillige uger afhængigt af opbevarings-

DK 156524 B

13 betingelserne.

De prpvestrimler, som kun imprægneredes med chloroform (kontrol-strimler), udviklede meget kraftige farver ti sekunder efter dyp-5 ningen, men farveudviklingen fortsatte med stor hastighed, og efter to minutter var strimlerne sorte, og ingen skelnen var mulig.

Tabel 1 10 Ændring af reflektans med tiden efter kontakt med analyseprdve.

Glucose- 15sek 40sek 65sek 90sek 115sek 140sek 165sek 215sek Slut-

koncen- A % A % A % A % A % A % A % A % % R

tration R* R+ R+ R+ R+ R+ R+ R + 15 (mg %) 50 6,8 8,5 3,5 0,1 0 0 0 0 59,0 100 13,8 13,8 5,6 2,0 0,1 0 0 0 43,0 20 200 22,6 15,3 6,2 2,7 0,7 0 0 0 31,0 500 30,8 15,7 6,5 2,7 0,7 0 0 0 22,0 * %R ved t = 15 sek = %R(mg% glucosej - %R(n mg% giucose) + %R ved t = 1 sek = %R(foregâende t) “ %R(t) 25

Eksempel II

I forvejen fremstillet glucosefplsomt reagenspapir imprægneredes som i eksempel I med en chloroformoplosning indeholdende 10 vægtprocent 30 "Eastman® 910 EM" (ethyl-2-cyanacrylat), 1% (w/v) fast ikke-ionisk detergent og 0,01% (w/v) fast dicarboxylsyre. Strimler fremstillet af dette imprægnerede papir havde egenskaber svarende ti1 egenskab-erne ifdlge eksempel I, og de farvede brugte strimler havde et særligt glat, ensartet udseende.

35

Eksempel III

Keton-f0lsomt reagenspapir fremstilledes ifplge beskrivelsen til US patent nr. 3.202.855 ved neddykning af Whatman® 3 MM filterpapir i

DK 156524 B

14 nedenstâende fprstedyps-blanding, tdrring og efterf0lgende nedsænk-ning i andetdyps-blandingen.

Forstedvps-blandi na 5 H20 722 ml

Tribasisk natriumphosphat 202,2 g

Dibasisk natriumphosphat (vandfrit) 86,7 g 10 Aminoeddikesyre 180,6 g

Andetdyps-blandi ng

Overfladeaktive stoffer 1,64 g 15 Polyvinylpyrrolidon/vinyl- acetatcopolymer E-535 67 ml

Natriumnitroferricyanid 8,24 g

Dimethylsulfoxid 401 ml

Chloroform 350 ml 20 Ethanol (vandfrit) 200 ml Sâledes fremstillede strimler imprægneredes derefter med en chloro-formoplpsning indeholdende 10 vægtprocent Eastman® 910 EM som i eksempel I. Strimler fremstillet af dette imprægnerede papir og 25 anvendt pâ urin indeholdende forskellige koncentrationer af acetoed- dikesyre udviste særdeles gode farveudviklingsegenskaber, og de farveintensiteter, som angav acetoeddikesyre-koncentrationen i den underspgte urin, forblev stabile.

30 Eksempel IV

Glucose-folsomt reagenspapir imprægneredes med en benzenoplpsning af 10% Eastman® 910 indeholdende methyl-2-cyanacrylat. Strimler af dette papir udviste tilsvarende særdeles gode egenskaber som strim-35 Terne ifolge de foregàende eksempler.

Eksempel V

Et "enkeltdyps"-System blev fremstillet af fplgende sammensætning:

DK 156524 B

15

Reaaens A

Tribasisk natriumphosphat 2,02 g

Dibasisk natriumphosphat 5 (vandfrit) 0,87 g

Glycin (aminoeddikesyre) 1,81 g

Natriumnitroferricyanid (formaiet og tprret) 82,4 mg

10 Reaaens B

Dioctylnatriumsulfosuccinat 8,4 mg GAFAC® overfladeaktivt middel RE-610 15 (leveret af GAF Corp.) 8,0 mg

Chloroform 16,7 ml

Hypol® ® 2000 (polyurethan-præpolymer) blandet indtil op-lpst 0,9 g 20

Aile bestanddelene i "Reagens A" formaiedes i morter med st0der til et fint pu!ver og suspenderedes i "Reagens B". T0rt Whatman® 3 MM filterpapir (som leveres af 3M Co., St. Paul. Minn.) imprægneredes med denne suspension, og strimler fremstillet af dette imprægnerede 25 papir bedpmtes ved anvendelse af urin indeholdende en række forskel-lige koncentrationer af acetoeddikesyre. Farveintensiteterne af de brugte strimler var stabile og var en funktion af acetoeddikesyre-koncentrationen i den unders0gte urin.

30 Eksempel VI

Et glucose-indikatorreagens af en enzymopl0sning med f0lgende sammensætninger blev fremstillet: 35 G1ucosei ndi katorreaaens

Destilleret vand 16,6 ml

Polyvinylpyrrolidon (PVP) 9,5 ml

Kaliumiodid 1,5 g

DK 156524 B

16 D&C Blue No. 1® 5,3 mg

Citronsyre 0,497 g

Trinatriumcitrat 2,182 g

Tetranatriumsalt af (ethylen-5 dinitriloj-tetraeddikesyre 1,67 g GANTREZ® AN 10% opldsning 5 ml

Enzymopldsning 16,7 ml

Enzvmopl0sning 10 225 ml glucoseoxidase 0,842 g peroxidase.

Aile ovennævnte reagenser blandedes, indtil de var oplpst. Samme 15 rumfang af denne reagensindikatoroplpsning, urin indeholdende glucose og Hypol® 2000 blev anbragt i en spot-pladefordybning og blandedes med en spatel, indtil det begyndte at skumme (ca. 1 minut). Præpolymeren dannede et farvet fast skum i Ipbet af 3-5 minutter.

20 Nâr systemet bedpmtes ved anvendelse af urin indeholdende 0, 100, 250, 500, 1000 og 2000 mg glucose/del udvikledes der en stabil farve efter kort tid, og farveintensiteterne var et mal for glucosekon-centrationen. Slutfarverne lâ fra blât til grdnt til brunt ait efter 25 glucosekoncentrationen og blev sammenlignet med farvestandarder.

Som fplge af, at en drâbe Hypol® 2000 danner skum nok til at fylde hele fordybningen i spotpladen, kan prpven gennemfpres pâ én drâbe urinpr0ve og vil stadig kunne aflæses visuelt.

30

Eksempel VII

Keton-specifikt reagenspapir fremstillet if0lge beskrivelsen til ÜS patent nr. 3.212.855 imprægneredes med en 10% chloroformopldsning af 35 Hypol® 2000, en vand-op-skummelig urethanpræpolymer, som leveres af Dewey and Almy Chemical Division of W.R. Grâce Co. Denne opl0sning kan yderligere indeholde et hvilket som helst af en række ioniske detergenter i en koncentration mellem 1 og 5% af præpolymerens vægt. Strimler fremstillet under anvendelse af dette imprægnerede papir

DK 156524B

17 bed0mtes ved anvendelse af urin indeholdende forskellige mængder acetoeddikesyre og nâede de endelige farveintensiteter i l0bet af 2-4 minutter. Disse farveintensiteter var stabile og var en tydelig visuelt skelnelig funktion af acetoeddikesyrekoncentrationen.

5

Ud fra ovenstàende er det kl art, at udnyttelse af den foreliggende opfindelses idé ikke blot kan finde sted i forbindelse med fremstil-lingen af prpvestrimler eller -midler af "dyp-og-aflæs"-typen, men ogsâ i forbindelse med andre former for prpver, heri indbefattet 10 pr0ver i form af væskesystemer.

Eksempel VIII

Et provemiddel til bestemmelse af urobilinogen i urin blev fremstil-15 let ved f0rst at imprægnere Whatman® 3 MM filterpapir med folgende blanding:

Destilleret vand 70,5 g GANTREZ® AN-139 5,6 g 20 Sulfosalicylsyre 9,16 g

Coffein 7,05 g

Sulfaminsyre 1,41 g p-Dimethylaminobenzaldehyd 0,53 g

Tetranatriumsalt af ethylen-25 dinitrilo-tetraeddikesyre 0,14 g

Ascorbinsyre 3,52 g

Natriumlaurylsulfat 0,70 g

Papiret torredes derefter og imprægneredes yderligere med en 4 30 vægtprocent oplpsning af polyvinylpyrrolidon i chloroform. Det fremkomne papir tdrredes derefter og monteredes pâ polystyrenstrim-ler for afprovning. Reagensstrimlerne blev bedomt ved at dyppe dem i tre sekunder i urinprpver med kendte urobilinogenkoncentrationer (0, 4, 8 og 12 Ehrlich-enheder). Farverne udvikledes i lobet af to 35 minutter og viste sig at være et mal for urobilinogenkoncentratio-nen. Denne effekt opnâedes som f0lge af den hurtige kompleksdannelse mellem hydrolyseret methylvinylether/maleinsyreanhydrid-copolymer og polyvinylpyrrolidon ved lav pH-værdi.

DK 156524 B

18

Eksempel IX

En strimmel til pâvisning af ikke-synligt blod i urin blev fremstil-let ved at imprægnere Whatman® 3MM filterpapir med fplgende oplds-5 ning:

Natriumlaurylsulfat 0,84 g

Cumenhydroperoxid 1,67 g 6-Methoxyquinolin 0,39 g 10 Natriumcitrat»2H20 1,79 g

Citronsyre 2,32 g 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin 0,45 g

Triethanolarainborat 5,58 g

Tetranatriumsalt af ethylen-15 dinitrilo-tetraeddikesyre 0,06 g

Dimethylsulfon 5,58 g

Vand 40,67 g

Dimethylformid 40,67 g 20 Efter tprring imprægneredes papiret yderligere med en 1 vægtprocent oplpsning af Eastman® 910 EM i chloroforni. Strimler fremstillet af dette papir gav ved bedpmmelse med urinprpver indeholdende kendte mængder hæmoglobin (0, 0,016, 0,064, 0,16, 0,80 mg/dl) i Ipbet af to minutter bemærkelsesværdigt stabile farver, hvis intensitet var en 25 funktion af hæmoglobinkoncentration.

30 35

Claims (30)

1. Pr0vemiddel til pâvisning af tilstedeværelsen af en komponent i en analyseprpve, hvilket prpvemiddel omfatter en bærermatrix, hvori 5 der er inkorporeret et reaktantSystem, som ved kontakt med analyse-pr0ven reagerer med komponenten heri under dannelse af et detekter-bart respons, kendetegnet ved, at det tillige omfatter et inhibitorsystem, som efter prpvemidlets kontakt med analyseprpven afbryder den herved pâbegyndte reaktion efter en pâ forhând fastlagt 10 tid.

2. Prpvemiddel ifplge krav 1, kendetegnet ved, at inhibitorsystemet er i stand til at frembringe varme ved kontakt med pr0ven, hvorved prpvemidlets temperatur hæves efter en pâ forhând 15 fastlagt tid, sâledes at reaktionen herved afbrydes.

3. Prpvemiddel ifplge krav 1, kendetegnet ved, at inhibitorsystemet er i stand til at forgifte reaktantsystemet efter en pâ forhând fastlagt tid, hvorved reaktionen afbrydes. 20

4. Prpvemiddel ifplge krav 1, kendetegnet ved, at inhibitorsystemet omfatter et materiale, som hærdner eller danner en gel ved kontakt med prpven.

5. Prpvemiddel ifplge krav 1, kendetegnet ved, at komponenten, der skal bestemmes i prpven, er glucose, en fysiologisk forekommende keton, ikke-synligt blod, bilirubin, urobilinogen, cholestérol, hydrogenion, protein eller nitrit.

6. Prpvemiddel ifplge krav 1, kendetegnet ved, at det detekterbare respons er en farveændring.

7. Prpvemiddel ifplge krav 1, kendetegnet ved, at dannelseshastigheden for det detekterbare respons afhænger af 35 mængden af komponenten i prpven.

8. Prpvemiddel ifplge krav 4, kendetegnet ved, at materialet danner en gel eller hærdner med tilstrækkelig hastighed til at hæmme dannelsen af det detekterbare respons efter en pâ DK 156524 B forhând fastlagt tid.

9. Provemiddel ifdlge krav 4, kendetegnet ved, at materialet er 2-cyanacrylsyre eller en ester heraf. 5

10. Prpvemiddel if0lge krav 4, kendetegnet ved, at materialet omfatter polyvinylal kohol.

11. Pr0vemiddel ifdlge krav 4, kendetegnet ved, at 10 geldannelsen eller hærdningen af materialet initieres ved kontakt med vand.

12. Fremgangsmâde til fremstilling af et pr0vemiddel til pâvisning af tilstedeværelsen af en komponent i en prpve, ved hvilken frem- 15 gangsmâde der i en bærermatrix inkorporeres et reaktantssystem, som nâr det bringes i kontakt med en analyseprove, der indeholder komponenten, reagerer med denne under dannelse af et detekterbart respons, kendetegnet ved, at der tillige inkorporeres et inhibitorsystem, som efter provemidlets kontakt med analyseprpven 20 afbryder den herved pâbegyndte reaktion efter pâ en forhând fastlagt tid.

13. Fremgangsmâde ifplge krav 12, kendetegnet ved, at der inkorporeres et reaktantsystem med en dannelseshastighed for det 25 detekterbare respons, som afhænger af mængden af komponenten i proven.

14. Fremgangsmâde ifdlge krav 12, kendetegnet ved, at inhibitorsystemet omfatter et materiale, som danner en gel eller 30 hærdner ved kontakt med analyseprdven.

15. Fremgangsmâde ifdlge krav 12, kendetegnet ved, at reaktantsystemet og inhibitorsystemet inkorporeres sekventielt i bæreren. 35

16. Fremgangsmâde ifplge krav 12, kendetegnet ved, at det i bærermatrixen inkorporerede reaktantsystem er et, som ved kontakt med en analyseprpve, der indeholder en komponent, hvis tilstedeværelse skal bestemmes, reagerer med denne under dannelse af DK 156524 B en farveændring, og at der inkorporeres et inhibitorsystem, som efter prpvemidlets kontakt med analyseprpven afbryder den herved pâbegyndte reaktion efter en pà forhând fastlagt tid.

17. Fremgangsmâde ifplge krav 16, kendetegnet ved, at der inkorporeres et reaktantsystem, for hvilket hastigheden for farveændringsdannelsen afhænger af mængden af komponenten i analyse-prpven.

18. Prpvemiddelkomposition til fremstilling af et prpvemiddel til pâvisning af tilstedeværelsen af en komponent i en analyseprpve, hvilket prpvemiddel omfatter et reaktantsystem, som ved kontakt med analyseprpven reagerer med komponenten under dannelse af et detek-terbart respons, kendetegnet ved, at den til lige omfatter 15 et inhibitorsystem, som ved kontakt med analyseprpven afbryder den hermed pâbegyndte reaktion efter en pâ forhând fastlagt tid.

19. Prpvemiddelkomposition if0lge krav 18, kendetegnet ved, at reaktantsystemet tilvejebringer et detekterbart respons i 20 form af en farveændring.

20. Prpvemiddelkomposition ifplge krav 18, kendetegnet ved, at inhibitorsystemet omfatter et materiale, som danner en gel eller hærdner ved kontakt med prpven. 25

21. Pr0vemiddelkomposition if0lge krav 20, kendetegnet ved, at matériel et hærdner eller danner gel med tilstrækkelig hastighed til at inhibere yderligere reaktion mellem reaktantsystemet og komponenten. 30

22. Prpvemiddelkomposition ifplge krav 18, kendetegnet ved, at inhibitorsystemet omfatter en ester af 2-cyanacrylsyre.

23. Prpvemiddelkomposition ifplge krav 18, kendetegnet 35 ved, at inhibitorsystemet omfatter polyvinylal kohol.

24. Prdvemiddelkomposition ifplge krav 18, kendetegnet ved, at komponenten, der skal bestemmes i prpven, er glucose, en DK 156524 B fysiologisk forekommende keton, ikke-synligt blod, bilirubin, urobilinogen, cholestérol, hydrogenion, protein eller nitrit.

25. Prpvemiddelkomposition if Pige krav 18, kendetegnet 5 ved, at den hastighed, hvormed det detekterbare respons frembringes, afhænger af mængden af komponenten i analysepr0ven.

26. Prpvemiddelkomposition if0lge krav 18, kendetegnet ved, at inhibitorsystemet er et, der bringer dannelsen af det 10 detekterbare respons til ophpr ved at undergâ en hærdningsreaktion eller en geldannende reaktion i konkurrence med dannelse af det detekterbare respons.

27. Prpvemiddelkomposition if0lge krav 18, kendetegnet 15 ved, at inhibitorsystemet indeholder et stof, soin er i stand til at frembringe varme ved berpring med analyseprpven, hvorved temperatur-en efter en pâ forhând fastlagt tid hæves, sâledes at reaktionen herved afbrydes.

28. Prdvemiddelkomposition ifdlge krav 18, kendetegnet ved, at inhibitorsystemet er en gift, der forgifter reaktantsystemet efter en pà forhând fastlagt tid, hvorved reaktionen afbrydes.

29. Prdvemiddelkomposition ifdlge krav 20, kendetegnet 25 ved, at geldannelsen eller hærdningen initieres ved kontakt med vand.

30 35