DK156775B - Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt - Google Patents

Description

1 DK 156775 B

Opfindelsen angâr en fremgangsmâde til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt.

Anvendelse af oploselige enzymer h0rer til kendt tek-nik, idet fordelen hovedsageligt er en simpel drift, eftersom man 5 ikke behover nogen s0jle med ledsagende tryktab og tilstopning (Fo 1), og idet ulempen hovedsageligt er det forhold, at enzymet (aktivt eller inaktiveret) foreligger i det udgâede materiale, som er det onskede reaktionsprodukt (Uo 1).

Anvendelsen af immobiliserede enzymer h0rer ogsâ til 10 kendt teknik, hvorved fordelen hovedsageligt er den gode okonomi, der hidr0rer fra den gentagne anvendelse (i modsætning til anvendelsen af opl0selige enzymer, som kun anvendes en gang) (Fu 1) ; pâ den anden side er enzymudbyttet i det immobiliserede produkt relativt lavt, og det immobilliserede produkt er relativt 15 dyrt (Uu 1), hvortil kommer, som tidligere anf0rt, at s0jlepro-cessen er ret vanskelig at udfore, især over lange tidsrum (Uu 2) .

Det er muligt at kombinere de to anvendelser ved at g0re brug af en meget billig immobilisering (billig bâde hvad 20 angâr immobiliseringsudbytte og immobiliseringsparametre), hvorved det immobiliserede enzym ikke n0dvendigvis foreligger som i fysisk henseende stabile partikler, men f.eks. som en filterkage eller en flydende suspension, hvorved de eneste krav ud over en minimal enzymlækage fra det immobiliserede enzym under drift er 25 evnen af det immobiliserede enzym til at blive suspenderet i og kunne filtreres fra substratet; herved opnâs en simpel drift, god okonomi og udelukkelse af enzymet i det udgâede materiale, hvis det immobiliserede enzym fjernes (ved filtrering eller centrifugering) efter den enzymatiske reaktion.

30 Pâ denne mâde tilvejebringes der et produkt, som ud- viser aile de angivne fordele (Fo 1, Fu 1), og som ikke udviser nogen af de angivne ulemper (Uo 1, Uu 1, Uu 2). Et produkt af denne art er beskrevet i DE offentligg0relsesskrift nr. 2522484, selv om det ikke definitivt fremgâr af dette offentliggprelses-35 skrift, at det immobiliserede enzym skulle være meget billigt og at det skulle være tilsigtet, at det kun blev anvendt en gang.

2 DK 156775B

En ulempe, der knytter sig til immobiliserede enzympro-dukter af denne art, er den kendsgerning, at sùspenderbarheden og filtrerbarheden deraf ikke er tilfredsstillende, sâledes at der foreligger et behov for forbedring deraf.

5 Opfindelsens formai er sâledes tilvejebringelsen af en fremgangsmâde til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt, der skal anvendes i en enzymatisk procès, hvorved enzymproduktet suspenderes i substratet, hvorefter den enzymatiske procès gennemfores og enzymproduktet fjernes fra substratet ved væske-10 torstof-separation, hvilket enzymprodukt skal være yderst billigt og ikke-lækkende samt udvise en overlegen filtrerbarhed og suspenderbarhed.

Fremgangsmâden ifolge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne.

15 Det ma forstâs, at det er tilsigtet, at betegnelsen "enzym" skal dække aile arter af enzymer, herunder enzympulver, levende, enzymholdige celler og homogeniserede celler. Opfindelsen er principielt heller ikke begrænset til nogen specifikke enzymgrupper; ikke begrænsende eksempler pâ enzymer, som kan 20 anvendes i fremgangsmâden ifolge opfindelsen, er glucose-isomeraser, glucoseoxidaser, amyloglycosidaser, proteaser, amylaser, især termostabile α-amylaser, lipaser, pullulanaser, invertaser, inulinaser, α-acetolactat-decarbpxylaser (ALDC), fructosyl-transferaser og nitrilaser.

25 Betegnelsen "polyamin" omfatter i denne beskrivelse med krav aile polymère, der indeholder et stOrre antal aminogrupper, enten primære, sekundære, tertiære eller quarternære, enten i deres frie form eller som salte. Ikke begrænsende eksempler er chitosan, polyethyleniminer, polyvinylaminer og cationiske 30 flokkuleringsmidler.

Ikke begrænsende eksempler pâ salte, der har en anion med 3-6 ioniserbare grupper, er folgende: phosphater, herunder hypo- og pyrophosphater, tripolyphosphater, thiophosphater, trimetaphosphater, polymetaphosphater, phosphomolybdater, 35 citrater, ferri- og ferro-cyanider, silicater og EDTA.

Det har overraskende vist sig, at bâde suspenderbarhed og filtrerbarhed af enzymproduktet i hoj grad foroges ved til-sætning af saltet med en anion med 3-6 ioniserbare grupper til

3 DK 156775 B

den flokkulerede masse omfattende polyamin og enzym. Hvis saltet med en anion med 3-6 ioniserbare grupper erstattes med et sait med mere end 6 ioniserbare grupper (f.eks. alginater eller poly-acrylater) eller et sait med en anion med mindre end 3 ioniser-5 bare grupper, bliver suspenderbarheden og filtrerbarheden af enzymproduktet ikke forbedret væsentligt.

I europæisk patentansogning med publikationsnummer 35121 er der beskrevet et immobiliseret enzym omfattende chitosan og et polyphosphat. Dette kendte immobiliserede enzym er ikke let 10 suspenderbart som det immobiliserede enzym ifolge opfindelsen, og det ville ogsâ frembyde hoj diffusionsmodstand, ligeledes i modsætning til det immobiliserede enzym ifolge opfindelsen.

En foretrukket udforelsesform for fremgangsmâden ifolge opfindelsen til fremstilling af det immobiliserede enzymprodukt 15 er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 2 angivne. Det har vist sig, at denne selektion af chitosan og tripolyphosphat ër særlig velegnet for AMG hvad angâr den for-bedrede suspenderbarhed og filtrerbarhed. Hvis chitosan anvendes som polyaminen og enzymet er AMG, har det vist sig, at 20 enzymudbyttet udviser et optimum for et vist forhold chitosan/AMG.

En foretrukket udforelsesform for fremgangsmâden til fremstilling af det immobiliserede enzymprodukt ifolge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 3 25 angivne. Herved opnâs et meget billigt, men alligevel effektivt produkt.

Opfindelsen skal illustreres yderligere ved de folgende eksempler. Eksempel 1 illustrerer fremstillingen af det immobiliserede enzympræparat ved fremgangsmâden ifolge opfindelsen, 30 eksempel 2 illustrerer anvendelsen af det immobiliserede enzympræparat fremstillet ved fremgangsmâden ifplge opfindelsen, og i eksempel 3 pâvises virkningen pâ lækagen af saltet med en anion med 3-6 ioniserbare grupper.

35

4 DK 156775B

Eksempel 1 100 ml kommercielt AMG-præparat 200 L blev fortyndet med afioniseret vand til 400 ml og derpâ koncentreret i en Amicon 5 ultrafiltreringscelle model 402 til 60 ml. Der skal henvises til NOVO publikation AMG (B 020Î-GB 2500 April 1984). 4 ml af dette koncentrat blev fortyndet til 100 ml med afioniseret vand, 8 g kaolin, 4 ml 10% w/v glutaraldehyd, hvis pH var indstillet pâ 6,0 med KOH, og 50 ml 0,5% chitosan i 0,1% eddikesyre blev tilsat i 10 den angivne rækkefolge, aile komponenter under konstant omroring, og man lod blandingen omrore i to timer. 60 ml 1% natriumtripoly-phosphat blev derpâ tilsat, og omroringen blev fortsat i yderli-gere en time, hvorefter partiklerne blev opsamlet ved vacuumfil-trering, hvorved der opnâedes 30,8 g vâdt præparat. Til olbehand-15 ling (se eksempel 2) anvendte man ca. 75 mg af det vâde præparat (svarende til ca. 3 oprindelige enheder enzym, se NOVO publikation AMG (B 020Ï-GB 2500 April 1984)) per 100 ml urt.

20 Eksempel 2 ürtkoncentrat af typen stærk pilsner blev k0bt fra MATAS. Det blev fortyndet med afioniseret vand, filtreret, og indstillet pâ 12° Balling. Derpâ blev det afkolet til 15°C i et 25 bad, og presset Sacch. carlsbergensis gær blev tilsat med en hastighed af 2 g per 100 ml urt, sammen med enten oploseligt enzym (kommerciel AMG 200 L, 0,005 ml/100 ml urt) eller det immo-biliserede enzymprodukt fra eksempel 1 (en mængde svarende til 3 oprindelige enheder per 100 ml urt). Man gennemforte parallelle 30 forsog bâde med beholdere, hvori der ikke fandt nogen omrdring sted, og med beholdere, hvori der fandt omr0ring sted. Der blev udtaget pr0ver med regelmæssige interval1er, der blev kogt, filtreret og analyseret for indholdet af kulhydrater. Som det fremgâr af tabel 1, kunne det immobiliserede enzymprodukt konkur-35 rere rimeligt godt med det oploselige enzym.

, DK 156775 ί 5

Tabel 1 % nedbrydning af DP4+ fraktioner 160 timer 320 timer 5 enzym ikke omrdrt omr0rt ikke omrort omr0rt opl0seligt 54 56 74 77 immobiliseret 50 59 66 79

Ved DP4+ forstâs kulhydrater med en polymerisationsgrad over 4.

10

Ved slutningen af gæringen blev der udtaget pr0ver, der blev filtreret uden kogning, og der blev analyseret for AMG-aktivitet. Man fandt ca. 100% af den oprindelige aktivitet i 15 fors0gene med det opl0selige enzym, medens man ikke kunne konsta-tere nogen aktivitet i fors0gene med det immobiliserede enzym.

Eksempel 3 20

For at pâvise virkningen af visse salte pâ lækagen gentog man metoden i eksempel 1 med et antal præparater, hvor man anvendte andre medier end polyphosphatoplOsninger til behandling af de med chitosan flokkulerede masser. Hvert af præparaterne 25 blev derpâ undersogt for aktivitet og lækage, som beskrevet i eksempel 2, med folgende resultater:

6 DK 156775 B

' Tabel 2 % aktivitets- % aktivitets-medium udbytte lækage - 5 - H20 72 2,1 Ο,06M NaH2P04 2H20 72 0,6 0,06M Na2HP04 2H20 73 0,5 0,05M Na^ citrat 72 0,4 0,03M Na5°10P3* 72 0,2 10 0,03M Nac0lnPo** 73 0,2 5 10 3 * natriumtripolyphosphat ** natriumtripolyphosphat indstillet til pH 6 med HCl

Claims (3)

7 DK 156775 E 5

1. Fremgangsmâde til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt til brug ved en enzymatisk procès, hvori enzym- 10 produktet suspenderes i substratet, hvorefter den enzymatiske procès gennemf0res og enzymproduktet fjernes fra substratet ved væske-torstof-separation, kendetegnet ved, at man til en oplosning af enzymet tilsætter et fyldstof, et tværbindingsmiddel og en polyamin, hvorpâ man under omroring tilsætter et sait med 15 en anion med 3-6 ioniserbare grupper, hvorefter det immobili-serede enzymprodukt isoleres som en flokkuleret masse.

2. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at enzymet er AMG, at polyaminen er chitosan og at saltet med en 20 anion med 3-6 ioniserbare grupper er et tripolyphosphat.

3. Fremgangsmâde if0lge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at tværbindingsmidlet er glutaraldehyd og/eller at fyldstof f et er kaolin. 25 1