DK164461B - Hidtil ukendt alfa-amylase-pullulanaseenzym og fremgangsmaade til fremstilling af samme - Google Patents

Description

i

DK 164461 B

Opfindelsen angår et hidtil ukendt a-amylase-pul lulanaseenzym og en fremgangsmåde til fremstilling heraf.

Glucoseenhederne i stivelse er hovedsagelig bundet til hinanden ved 5 hjælp af a-l,4-glucosidbindinger og danner lange kæder. Ydermere har stivelse a-l,6-glucosidbindinger, og der findes en sådan binding ved hvert forgreningssted på kæderne.

a-Amylaser spalter 1,4-bindinger i stivelse tilfældigt langs kæder-10 ne, hvorimod /J-amylaser spalter de samme bindinger ved de ikke-re-ducerende ender af kæderne. Hvad angår pullulanaser, er de "afgre-nings"-enzymer, som spalter 1,6-bindinger ved forgreningsstederne.

Maltosesirupper fremstilles ved hydrolysering af stivelse ved hjælp 15 af plante-Ø-amylaser eller ved at tillade en sukkerdannende skimmel-svampe-a-amylase yderligere hydrolysering af en stivelse, som er blevet gjort flydende ved anvendelse af bakteriel a-amylase. Ved begge procedurer opnås der en maltosesirup, som indeholder ca. 60% maltose. Maltoseudbytter, som er højere end disse, opnås under 20 anvendelse af /?-amylase sammen med pullulanase. Maltosesirupper anvendes hovedsagelig inden for slik- og bageri industri er på grund af deres typiske, milde, søde smag, lave viskositet, lave hygrosko-picitet og høje termiske stabilitet.

25 Det er fordelagtigt for stivelseshydrolyseprocessen, hvis det anvendte enzym er aktivt og stabilt ved høje temperaturer. /J-Amyla-ser, skimmelsvampe-a-amylaser og kommercielt opnåelige pullulanaser fra Klebsielle pneumoniae og Bacillus sp. kan imidlertid ikke anvendes ved tempereturer over 60°C. Det vil således være fordelag-30 tigt at have et mal togent enzym med højere termostabilitet til fremstilling af maltosesirup.

Hvis der anvendes flere enzymer ved hydrolyse af stivelse er det almindeligvis nødvendigt at foretage kompromiser med hensyn til 35 aktivitetskravene til enzymerne eller alternativt at anvende enzymerne efter hinanden og at justere processen derimellem. Under hensyntagen til enkelthed og økonomi ville det være bedre, hvis et enkelt enzym var tilstrækkeligt ved fremgangsmåden. Af denne grund bør det ideelle enzym, som anvendes ved fremstilling af

DK 164461 B

2 mal tosesirup, have flydendegørende, sukkerdannende og sti velsesafgreni ngsakti vi tet.

Hyun og Zeikus (1985, J. Bacteriol. 49, 1168) undersøgte nedbryd-5 ningen af stivelse med Clostridium thermohvdrosulfuricum-stamme E39 (ATCC 33223) isoleret fra den varme Octopus-kilde i Yellowstone National Park i USA. Denne stamme producerede cellebundet pullula-nase og glukoamylase, men ikke a-amylase. De præparater, som blev opnået fra stamme E39, hydrolyserede stivelse under dannelse af 10 glucose, uden at der blev observeret maltose, mal totriose eller maltotetraose som mellemprodukter.

Det enzym, som er beskrevet i nærværende beskrivelse, er forskellig fra de hidtil beskrevne amylaser, idet dette enzym er en amylase af 15 en helt ny type, a-amylase-pullulanase, hvori to adskilte enzymaktiviteter, α-amylaseaktivitet og pullulanaseaktivitet, er til stede i samme proteinmolekyle. α-Amylase-pullulanaseenzymet, som er beskrevet i den foreliggende beskrivelse, nedbryder stivelse til maltose og maltotriose.

20

Fra beskrivelsen til EP patentansøgning nr. 188.049 kendes et pullulanaselignende enzym, som besidder α-amylaseaktivitet, til hydrolyse af stivelse til maltose og maltotriose. Enzymet produceres ud fra en stamme af slægten Bacillus subtil is.

25

Enzymet ifølge nærværende opfindelse er bl.a. forskelligt fra det kendte pullanaselignende enzym ved at besidde et højere temperaturoptimum og bedre termostabilitet. Dette er fordelagtigt ved hydrolyse af stivelse, idet processen forenkles og der opnås et mere 30 økonomisk resultat ved at anvende et enzym, der har flydendegørende, sukkerdannende og stivelsesafgreningsaktivitet samt høj termostabilitet.

Opfindelsen angår således et α-amylase-pullulanaseenzym, der er 35 ejendommeligt ved, at dets relative molekylvægt, som bestemt ved polyacrylamidgelgradientelektroforese, er 185.000 ± 40.000 i nærværelse af natriumdodecylsul fat, at ét og samme proteinmolekyle har både α-amylaseaktivitet og pullulanaseaktivitet, og under hvis indvirkning stivelse nedbrydes til maltose og maltotriose, at

DK 164461 B

3 temperaturoptimum for begge enzymaktiviteter ligger på mellem ca. 80 og 90eC, fortrinsvis på ca. 85eC, at pH-optimum ved 85“C er 5-6, fortrinsvis ca. 5,6, og ved 60*C 4,5-5,5, fortrinsvis ca. 5,2, at enzymet eller DNA-sekvensen, som koder for dette, hidrører fra en 5 stamme af slægten Clostridium, og at enzymet kan fremstilles ved dyrkning af en stamme af Clostridium thermohvdrosulfuricum.

Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til fremstilling af enzymet, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en stamme af 10 Clostridium thermohvdrosulfuricum dyrkes på et substrat indeholdende stivelse eller et stivelsehydrolysat ved en temperatur på 42-78eC, fortrinsvis 55-75eC og ved et pH på 6-8, fortrinsvis ca. pH 7, og at det dannede enzym indvindes.

15 Dannelse af α-amylase-pullulanasen ifølge den foreliggende opfindelse er blevet observeret i forbindelse med Clostridium thermohydro-sulfuricum -stamme E 101-69 (DSM 3783) og E 100-69 (DSM 567), som blev isoleret i østrigske roesukkerfabrikker i 1969 (Hollaus & Klaushofer, 1973, Int. Sugar J., 75, 237-241 og 271-275). Stamme E 20 100-69 er en neotypestamme af bakterien Clostridium thermohvdrosul- furicum. C^. thermodvdrosulfuricum-stamme E 101-69 blev deponeret i overensstemmelse med Budapest Traktaten den 3. juni 1986 hos "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen" under ovennævnte deponeringsnr.

DSM 3783. Stamme E 100-69 var tidligere blevet deponeret af dens 25 opdager hos samme deponeringsmyndighed. C. thermohydrosulfuricum-stammer kan skelnes fra andre thermofile Clostridium-stammer på grundlag af deres ca. 10eC højere maksimale væksttemperatur og deres hexagonalt arrangerede celleoverfladeproteiner. Desuden kan C. thermohydrosulfuricum-stammerne DSM 3783 og DSM 567 skelnes fra 30 andre C. thermohydrosulfuricum-stammer på grundlag af DNA-homologi og fermenteringsforsøg med stivelse, amygdalin, raffinose og lactose. Stammerne DSM 3783 og DSM 567 kan skelnes fra hinanden på grundlag af DNA-homologi (Matteuzzi, Hollaus & Biauati, 1978, Int.

J. Syst. Bacteriol., 28, 528-531; Hollaus & Klaushofer, 1973, Int.

35 Sugar J., 75, 237-241 og 71-275).

Adskillige stammer af gæren Saccharomvces cerevisiae er i stand til at anvende maltose og mal totriose som deres carbonkilde ved fremstilling af ethanol (Stewart & Russel, 1983, i Yeast Genetics,

DK 164461 B

4

Fundamental and Applied Aspects, side 461, eds. J. Spencer, D. Spencer og A. Smith, Springer-Veri ag, New York). Idet a-amylase-pullulanase specifikt nedbryder stivelse til en blanding af disse sukkerarter, kan ethanol fremstilles ud fra stivelse ved hjælp af 5 gær under anvendelse af α-amylase-pullulanase som mæskeenzym.

Eksempi er På de tilhørende tegninger, som angår eksemplerne, er der på figur-10 erne afbildet egenskaberne for α-amylase-pullulanasen ifølge den foreliggende opfindelse som følger:

Figur 1 viser temperaturens indflydelse på aktiviteten af a-amyla-se-pullulanase.

15

Figur 2 viser pH's indflydelse på aktiviteten af a-amylase-pullula-nase ved 85°C (A) og 60°C (B).

Figur 3 viser inaktiveringen af α-amylase-pullulanase ved forskel-20 lige temperaturer i en puffer uden substrat og calcium.

Figur 4 viser stabiliseringen af α-amylase-pullulanase med calcium ved høje temperaturer.

25 Figur 5 viser stivelseshydrolyse med oprenset a-amylase-pullulanase ved forskellige temperaturer.

Figur 6 viser tyndtlagskromatografi af de endelige produkter, som dannes af a-amylase-pullulanase.

30

Bestemmelse af enzymaktiviteter a-Amylase- og pullulanaseaktiviteterne blev bestemt ved at måle omfanget af reducerende sukkerarter, som blev frigjort ved hjælp af 35 disse fra ren amylose (type III: fra kartoffel, Sigma Chemical Co. Ltd., St. Louis, MO 63178, USA) og fra pullul an (Sigma). 25 μΐ Enzym blev sat til 1 ml 0,5% substrat i en 100 mM natriumacetatpuffer justeret til pH 5,6 indeholdende 2 mM CaCl^, 0,1 mM Na2-EDTA og 50mM NaCl. De reducerende sukkerarter blev bestemt ved hjælp af Nelson-

DK 164461 B

5

Somogyi-fremgangsmåden (Nelson, 1944, J. Biol. Chem., 153, 375, Somogyi, 1952, J. Biol. Chem., 195, 19) efter at rørene var blevet inkuberet i 15 min ved 85°C. I ovennævnte analyse svarede den reducerende sukker, som blev frigjort af en a-amylase- eller pullu-5 lanaseenzymenhed, til et nanomol vandfri glucose. Amyl osen blev bragt i opløsning med 1 M NaOH, som var neutraliseret med HC1, der blev tilsat puffer, og til slut blev opløsningen filtreret under anvendelse af et 1,2 fim RAWP membranfilter (Mi 11 i pore Corp., Ashby Road, Bedform, MA 01730, USA).

10

Protein blev bestemt ved fremgangsmåden ifølge Lowry (Lowry et al., 1952, J. Biol. Chem., 193, 256) med ægalbumin (fraktion V, Sigma) som standard.

15 Sammensætning af det anvendte medium

Bestanddel g, 1~*

Opløselig stivelse (ifølge Zulkowsky), 20 (e. Merck, Darmstadt, Vesttyskland) 20,0 Gærekstrakt (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) 5,0 25 Trypton (Difco) 10,0 Kødekstrakt (Lab-Lemco), (Oxoid ltd., Basingstoke, Hampshire, England) 5,0 30 KH2P04 6,8 K2HP04.3H20 11,4

FeS04.7H20 0,02 35

MgS04.7H20 0,01

CaCl2»2H20 0,01

DK 164461 B

6 pH 6,8

Karakterisering af råenzvm 5 Stamme E 101-69 blev dyrket i en 2-liter kolbe uden omrøring i 30 timer under anaerobe forhold ved 68°C på ovennævnte medium, hvortil der var blevet sat resazurin 1 mg/1 og thioglycolsyre 200 /il/l. Cellerne blev fjernet ved centrifugering, hvorefter råpræparatet af α-amylase-pullulanase blev præcipiteret fra dyrkningsmediesuper-10 natanten, hvis α-amylaseaktivitet var 520 U/ml og pullulanase-aktivitet var 1550 U/ml, ved at gøre den 70% mættet med hensyn til ammoniumsulfat. Nogle af de væsentligste egenskaber ved enzymet blev karakteriseret under anvendelse af dette råpræparat med en a-amyla-seaktivitet på 12.000 U/ml og en pullulanaseaktivitet på 37.000 15 U/ml.

Begge aktiviteter af enzymet havde deres temperaturoptimum ved 85°C (figur 1), når α-amylase- og pullulanase-aktiviteterne af det fortyndede råenzym (1.200 U/ml α-amylase og 3.700 U/ml pullulanase) 20 blev bestemt ved ovennævnte fremgamgsmåde (side 3), men ved anvendelse af forskellige temperaturer.

pH-optimum for begge aktiviteter var 5,6, når bestemmelserne blev udført ved 85eC (figur 2A), og 5,2, når bestemmelserne blev udført 25 ved 60eC (figur 2B). I figuren er der anført en værdi på 100 for de højeste aktiviteter ved begge temperaturer. 25 /il Fortyndet råenzym (30 U α-amylase og 90 U pullulanase) blev sat til 1 ml af en 100 mM natriumcitratpuffer justeret til forskellige pH-værdier og indeholdende 0,5% amylose eller pullulan, 50 mM NaCl og 10 mM CaCl2- Rørene 30 blev derefter inkuberet i 15 minutter ved 85eC eller 60°C, og de reducerende sukkerarter, som var blevet frigjort, blev bestemt.

Begge aktiviteterne var stabile ved 60°, men de blev inaktiveret på samme måde ved højere temperaturer, når de blev inkuberet i en 100 35 mM natriumacetatbuffer, pH 5,6, ved forskellige temperaturer, hvorunder den endelige koncentration af α-amylase var 800 U/ml og pullulanase 2.400 U/ml. De resterende α-amylase- og pullulanaseakti-viteter blev bestemt ved ovennævnte fremgangsmåde under anvendelse af 50 /il prøver, som blev udtaget på de tidspunkter, der er anført

DK 164461 B

7 på figuren.

Calciumioner stabiliserede begge aktiviteter på samme måde ved høje temperaturer (figur 4). Der blev tilsat råenzym til opnåelse af en 5 endelig koncentration på 800 U/ml α-amylase og 2.400 U/ml pullula-nase i en 100 millimolær natriumacetatpuffer, pH 5,6, indeholdende forskellige calciummængder. Disse blev inkuberet i 2 timer ved temperaturer på 85eC, 90*C og 95eC. De resterende α-amylase- og pullulanase-aktiviteter blev bestemt ved ovennævnte fremgangsmåde 10 (side 3) under anvendelse af 50 /fl prøver.

Oprensning af enzymet

Det opløselige α-amylase-pullulanaseenzym blev oprenset fra dyrk* 15 ningsboullionen af stamme E 101-69 som følger. Stammen blev dyrket anaerobt i 40 timer ved 68’C i en 22-1 iters kolbe uden omrøring i det.medium, som er beskrevet på side 4. Efter at cellerne var blevet fjernet ved centrifugering, blev der sat 15 g hvedesti vel se/1 (BDH Chemicals Ltd., Broom Road, Poole BH12 4NN, England) og 200 mg/1 20 natriumacid til den kolde supernatant, som blev omrørt under afkøling i 90 timer til absorption af enzymet i stivelsen. Derefter fik stivelsen lov til at bundfælde i 24 timer, supernatanten blev fjernet, og stivelseskagen, som var bundfældet, blev vasket ved at opslæmme den i 2 1 iskoldt vand og centrifugering. Det adsorberede 25 enzym blev skilt fra stivelsen ved ekstraktion af det i et varmt bad ved at blande det med to 0,5 1 portioner 60eC vand og centrifugering.

Ekstrakterne blev gjort 20 millimolær under anvendelse af stærk 30 natriumacetat justeret til pH 5,6 og blev derpå sat på en 2,6 x 15 cm DEAE cellulosesøjle (DE 52, Whatman Ltd., Springfield Mill, Maid stone, Kent, England), der var ækvilibreret under anvendelse af samme puffer. Søjlen blev vasket med ækvilibreringspufferen og derpå først elueret med 100 mM og derefter med 200 mM natriumchlorid i 35 samme puffer. De eluater, som blev opnået under anvendelse af det stærkere salt, blev forenet og koncentreret til 21 ml ved anvendelse af et ultrafiltreringskammer (Amicon Corp., Damvers, Massachusetts, USA) forsynet med en PM 10 membran.

DK 164461B

8

Prøven blev dialyseret mod en 10 mM kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, og blev derpå sat på en 2,6 x 13 cm hydroxyapatitsøjle (Bio Gel HT, Bio Rad, 1414 Harbour Way South, Richmond, California 94804, USA), der var ækvilibreret under anvendelse af samme puffer. Søjlen blev først 5 vasket med ækvilibreringspufferen og derpå elueret under anvendelse af en 10-400 mM kaliumphosphatgradient, pH 7,0. Enzymet blev elueret som en top, der blev fulgt af en skulder med en tydeligt lavere specifik aktivitet. De fraktioner, som blev elueret i toppen, blev forenet og koncentreret, som nævnt ovenfor, til et volumen på 1 ml.

10

De koncentrerede prøver blev i 200 /il-portioner ført gennem kombinerede Superose® 12 og 6 gelfiltreringssøjler (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) i en 50 mM ammoniumacetatpuffer, pH

6,5, ved en hastighed på 6 ml/time. Enzymet blev elueret som to 15 nærliggende toppe, og materialet (I og II), som var indeholdt i disse, blev frysetørret. Den specifikke α-amylaseaktivitet af præparat I var på dette trin 39 kU/mg og den specifikke pul lul a-naseaktivitet var 101 kU/mg, hvor de respektive specifikke aktiviteter af præparat II var 36 kU/mg og 90 kU/mg.

20

Begge præparater blev derefter gel filtreret under anvendelse af en Superose® 6 søjle under denaturerende forhold i nærværelse af 6 M guanidinhydrochlorid og Ø-mercaptoethanol. Det er blevet observeret, at under disse forhold mister proteiner almindeligvis hele deres 25 ikke-kovalente struktur og dissocierer til deres underenheder (Tanford, 1968, Advan. Protein Chem., 23, 121). Før gel filtreringen blev prøverne opløst i en prøvepuffer med følgende sammensætning: 7,3 M guanidinhydrochlorid, 0,1 M natriumacetat, 0,02 M EDTA, 0,5 M /}-mercaptoethanol og et pH på 8,1. Prøverne blev inkuberet ved 50°C 30 i 4 timer, pH blev justeret til 5,0, og prøverne blev derpå ført igenmem i 200/tl portioner ved en strømningshastighed på 1 ml/time, hvor pufferen bestod af 6 M guanidinhydrochlorid, 100 mM natriuc-acetat, 20 mM Ø-mercaptoethanol og med et pH på 5,0. De fraktioner, hvori enzymet blev elueret, blev forenet og omhyggeligt dialyseret 35 mod en 20 mM ammoniumhydrogencarbonatpuffer, pH 7,9. De således opnåede renaturerede enzympræperater (I og II), som var homogene ifølge både SDS-polyacrylamidgelgradientelektroforese (jvf. brochuren, "Calibration kits for molecular weight determination using electrophoresis" , Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige, 1982)

DK 164461 B

9 og gel filtrering udført i guanidinhydrochlorid, blev anvendt til yderligere karakterisering af enzymet.

Carbohvdrat bundet til enzymet 5

Det oprensede α-amylase-pullulanase indeholdt carbohydrat. Efter hydrolyse frigjorde enzymet sukkerarter med samme mobilitet som mannose, glucose, galactose og ramnose ved tyndtlagskromatografi på en Silicagel 60 plade (nr. 5553, E. Merck) mættet med 0,2 M NaHgPO^, 10 med en blanding af n-butanol, acetone og vand (4:5:1, volumen/volu-men) som elueringsmiddel. Mængden af neutrale hexoser blev bedømt til 10% af den totale mængde af protein og neutrale hexoser, når de neutrale hexoser blev bestemt ved Antron-fremgangsmåden (Spiro, 1965, Methods in Enzymology, vol. 8, side 3) med mannose som stan-15 dard.

Molekvievæat af enzymet SDS-polyacrylamidgel gradientelektoforese med PAA 4/30 geler (Phar-20 macia Fine Chemicals) viste, at α-amylase-pullulanase bestod af underenheder af kun en type med en eksceptionel høj molekylevægt.

Den relative molekylevægt, som blev observeret for enzymunderenhe-den, var 190.000 ± 30.000 ved anvendelse af præparat I og 180.000 ± 30.000 ved anvendelse af præparat II. Under naturlige funktions- 25 forhold med samme geler var den relative molekylevægt, som blev opnået for det renaturerede a-arnylase-pullulanaseenzym 370.000 ± 85.000 ved anvendelse af præparat I og 330.000 + 85.000 ved anvendelse af præparat II. De bånd, som blev opnået fra enzymet ved gelgradientelektroforese, var meget diffuse. På den anden side blev 30 der ved guanidinhydrochloridgelfiltrering opnået en skarp, symmetrisk top på et punkt, der svarer til en relativ molekylvægt på 275.000 + 50.000. Denne fremgangsmåde skelnede ikke mellem præparaterne I og II i en prøve, som indeholdt begge.

35 Hvdrolvse af stivelse ved forskellige temperaturer

Tilstedeværelse af substrat stabiliserede a-amylase-pullulanase således, at det var muligt at anvende enzymet til hydrolyse af stivelse ved 80eC såvel som ved 60T (figur 5). Oprenset a-amylase-

DK 164461 B

10 pullulanase med 480 U ml"* α-amylase og 1.100 U ml"* pullulanase . blev fyldt i rør, i en 100 mM natriumacetatpuffer, som indeholdt 0,5% majsstivelse (Sigma), 2 mM CaCl2, 0,1 mM Na2~EDTA, 50 mM NaCl og med et pH på 5,6. Rørene blev inkuberet ved temperaturer på 60eC, 5 70°C og 80°C og deres indhold af reducerende sukkerarter blev bestemt ud fra prøver, som blev udtaget ved de på figuren anviste tidspunkter. Hydrolyseprocentdelen blev beregnet ved at sammenligne mængden af reducerende sukkerarter, som var til stede i prøverne, med mængden af reducerende sukkerarter, som var til stede i et 10 substrat, der var hydrolyseret til glucose ved anvendelse af fortyndet syre (0,5 N HC1, 100’C, 3 timer).

Slutprodukter, som dannes ved h.iælo af enzymet 15 De slutprodukter, som dannes ved hjælp af α-amylase-pullulanase, blev bestemt som følger. Der blev fremstillet 0,5% opløsninger ud fra amylose (type III: fra kartoffel), pullulan og majsstivelse (alle fra Sigma) i en puffer (100 mM natriumacetat, 2 mM CaCl2, 0,1 mM Na2"EDTA, 50 mM NaCl, pH 5,6), der blev sat oprenset a-amylase-20 pullulanasepræparat I eller II til opløsningerne, og de blev inkuberet ved 80eC. Enzymet blev anvendt i 2 koncentrationer, 480 U ml"* α-amylase og 1.100 U ml'* pullulanase (= 1 X) og 10 gange stærkere (= 10 X). Prøver, der blev udtaget fra hydrolysaterne efter 24 timer og 48 timer, blev afpipeteret på silicagel 60-plader (nr. 5553, E.

25 Merck) og elueret med en blanding af 2-propanol, acetone og vand (2:2:1, vol umen/vol umen).

Oprenset α-amylase-pullulanase (1 X) nedbrød pullulan til maltotri-ose, hvorimod måde kartoffelamylose og majsstivelse blev nedbrudt 30 til maltose og maltotriose (figur 6). Når den højere enzymkoncentration blev anvendt (10 X), blev det observeret, at maltotriose blev nedbrudt yderligere (figur 6). I dette tilfælde blev der produceret 77% maltose, 15% glucose og 4% maltotriose af majsstivelse ved en 48 timers hydrolyse. Maltosen og maltotri osen blev kvantificeret ved 35 væskekromatografi i en søjle, der var pakket med Nucleosil 5 C18 omvendt-fasemateriale (Macherey-Nagel, D-5160 Duren, Vesttyskland), med vand som elueringsmiddel, og glucosen blev kvantificeret enzymatisk (UV-forsøgskit nr. 716.251, Boehringer-Mannheim, Mannheim, Vesttyskland). Procentdelene af hydrolyseprodukterne blev beregnet

DK 164461 B

11 ved at sammenligne deres mængder med den substratmængde, der blev hydrolyseret til glucose ved anvendelse af fortyndet syre (0,5 N HC1, 100eC, 3 timer).

5 Sammenligning af enzympræparater fra stammerne E 101-69 οα E 100-69

Stammerne E 101-69 og E 100-69 blev dyrket anaerobt uden rystning ved 68’C i 24 timer på ovennævnte medium, hvortil der var blevet sat 1 mg resazurin pr. 1 og 200 μΐ thioglycolsyre pr. 1. Cellerne blev 10 fjernet ved centrifugering, og fra supernatanten blev der med stammen E 101-69 frembragt delvis oprenset a-amylase-pullulanase-præparater med en specifik α-amylaseaktivitet på 21 kU mg"* og en specifik pullulanaseaktivitet på 63 kU mg"* og respektive specifikke aktivi ter på 20 kU mg’* og 56 kU mg’* med stammen E 100-69. Efter at 15 have ført disse præparater gennem SDS-polyacrylamidgel er viste begge kun nogle få meget svage bånd ud over et stærkt diffust bånd, som bevægede sig med samme mobilitet som a-amylase-pullulanase fra stamme E 101-69, som tidligere var blevet oprenset i homogen form.

20 25 30 35

Claims (2)

12 DK 164461 B 1. α-Amylase-pullulanaseenzym, kendetegnet ved, at dets relative molekylvægt, som bestemt ved polyaery1 amidgelgradient- 5 elektroforese, er 185.000 ± 40.000 i nærværelse af natriumdodecyl-sulfat, at ét og samme proteinmolekyle har både a-amylaseaktivitet og pullulanaseaktivitet, og under hvis indvirkning stivelse nedbrydes til maltose og maltotriose, at temperaturoptimum for begge enzymaktiviteter ligger på mellem ca. 80 og 90°C, fortrinsvis på ca. 10 85eC, at pH-optimum ved 85eC er 5-6, fortrinsvis ca. 5,6, og ved 60eC 4,5-5,5, fortrinsvis ca. 5,2, at enzymet eller DNA-sekvensen, som koder for dette, hidrører fra en stamme af slægten Clostridium, og at enzymet kan fremstilles ved dyrkning af en stamme af Clostridium thermohvdrosulfuricum. 15

2. Fremgangsmåde til fremstilling af et a-amylase-pullulanaseenzym ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en stamme af Clostridium thermohvdrosulfuricum dyrkes på et substrat indeholdende stivelse eller et stivelsehydrolysat ved en temperatur på 42-78®C, 20 fortrinsvis 55-75®C og ved et pH på 6-8, fortrinsvis ca. pH 7, og at det dannede enzym indvindes. 25 30 35