DK157560B - Enzymatisk detergentadditiv, detergent indeholdende det enzymatiske detergentadditiv og fremgangsmaade til vask af tekstiler. - Google Patents

Description

DK 157560 B

Opfindelsen angår et enzymatisk detergentadditiv, hvis aktive bestanddel er en mikrobielt fremstillet lipase, et detergent indeholdende sådanne additiver og en fremgangsmåde til vask af tekstiler, ved hvilken et sådan detergent 5 anvendes.

Det område, som omfatter enzymatiske additiver i detergenter, har været i hastig vækst i de sidste årtier. Der kan f.eks. henvises til artiklen "How Enzymes Got into Detergents", bd. 12, Developments in Industrial Microbiology, en 10 publikation fra Society for Industrial Microbiology, American Institute of Biological Sciences, Washington D.C. 1971, af Claus Dambmann, Poul Holm, Villy Jensen og Mogens Hilmer Nielsen, og til P.N. Christensen, K. Thomsen og S. Branner: "Development of Detergent Enzymes", foredrag holdt den 9.

15 oktober 1986 på "The 2nd World Conference on Detergents" i Montreux, Schweiz.

Proteolytisk detergentadditiv anvendes i udstrakt grad i Europa, USA og Japan. I flere lande indeholder størstedelen af detergenterne, både flydende og i pulverform, 20 protease.

Anvendelsen af lipase som et detergentadditiv er kendt. En omfattende oversigt findes i H. Andree et al.: "Lipases as Detergent Components", Journal of Applied Biochemistry, bind 2, 218-229 (1980). Flere eksempler findes i US 25 patentskrift nr. 4,011,169 (spalte 4, linie 65 til spalte 5, linie 68) i GB patentskrift nr. 1,293,613 (side 2, linie 6-29) og i et foredrag af T. Fujii med titlen "Washing of Oil Stains with Lipase" (på japansk), der blev holdt på det 16. Symposium on Washing, der blev afholdt i Tokyo den 17.-18. september 30 1984.

Blandt kendte lipaser, der er anvendt som detergentadditiver, har Fusarium oxysporum lipase så vidt vi ved de bedste lipolytiske egenskaber, betragtet ud fra et detergentanvendelsessynspunkt, jfr. europæisk patentansøgning med 35 publikåtionsnummer 0 130 064, især sammenligningstabellen på side 27.

2 DK 157560 B

Hvis vaskeprocessen gennemføres ved høj temperatur og høj alkalinitet, vil størstedelen af det fedtholdige snavs under alle omstændigheder blive fjernet. Vaskeprocesser ved lav eller middel temperatur (ca. 60°C og derunder) anvendes 5 dog nu sædvanligvis, og ved disse lave temperaturer er de kendte lipaser kun i stand til at opløse en del af det fedtholdige smuds.

Hidtil er effektiviteten af lipolytiske detergentadditiver sædvanligvis blevet målt ved hjælp af EMPA-lapper 10 (EMPA er en forkortelse for Eidgenossische Materialprufungsund Versuchsanstalt, St. Gallen, Schweiz) nr. 101 (oliven-olie/bomuld) og 102 (olivenolie/uld) ved tillempning af den metode, der er beskrevet i engelsk patentskrift nr. 1.361.386 (især side 4 og 7) og US patentskrift nr. 3.723.250 (især 15 spalte 15-19). På denne måde kan den lipolytiske rensevirkning udtrykkes som forskellen i remissionsværdi delta R. Imidlertid blev her anvendt to direkte mål for den lipolytiske rensevirkning. For det første blev mængden af restfedt bestemt.

Derved vises den kombinerede virkning af detergent og lipase. For 20 det andet blev restfedtet analyseret for tilstedeværelsen af olie (triglycerid) og ned-brydningsprodukter (mono- og digly-cerid og fedtsyre), og antallet af ikke-hydrolyserede glyce-ridbindinger i olien blev beregnet; dette viser lipasevirk-ningen mere direkte. Ved anvendelse af disse metoder har det 25 vist sig, at selv den bedst kendte detergentlipase udviser en lipolytisk vaskevirkning, som kunne ønskes forbedret.

Endvidere er det kendt, at lipaser, eftersom de er proteiner, har tendens til at blive angrebet af proteaser, og som tidligere nævnt indeholder mange detergenter i dag prote-30 aser. Der er intet publiceret, som fortæller om detergent-lipaser, der har tilfredsstillende stabilitet i tilstedeværelsen af protease. Tværtimod har det vist sig, at nogle kendte detergentlipaser har ringe stabilitet i detergentopløsninger i tilstedeværelsen af almindeligt anvendte deter-35 gentproteaser.

DK 157560 B

3

Der er således behov for et lipolytisk detergentadditiv, der udviser en betydeligt bedre lipolytisk detergentvirkning ved økonomisk rimelige lipaseaktiviteter i vaske-flotten, og som er stabil i detergentopløsninger, der inde-5 holder detergentprotease.

Opfindelsen angår et lipolytisk detergentadditiv, der er ejendommelig ved, at lipasen kan fremstilles ved hjælp af en stamme af slægten Humicola, inklusive slægten Thermomyces.

10 Opfindelsen angår endvidere et detergent omfattende ovennævnte lipolytiske detergentadditiv og en fremgangsmåde til vask af tekstiler, der anvender dette detergent ved pH 7-12.

Detergentlipaserne som anvendes ifølge opfindelsen 15 udviser en vaskevirkning, der er langt bedre sammenlignet med tidligere kendte detergentlipaser. Endvidere er de lipaser, som er anvendt i opfindelsen, stabile i detergentopløsning ved tilstedeværelsen af almindeligt anvendte detergentproteaser, modsat kendte detergentlipaser.

20 Det er beskrevet i japansk patentpublikation nr.

48-62990 (ikke prøvet), at Humicola lanuginosa er en lipase-producent. Imidlertid nævnes det ikke i denne japanske patentansøgning, at Humicola lanuginosa lipasen er velegnet som aktiv komponent i et enzymatisk detergentadditiv. Tværtimod 25 fremgår det af fig. 1 i den japanske patentansøgning, at Humicola lanuginosa S-38 lipasens pH optimum ligger på ca. 8, og at aktiviteten falder hurtigt når pH-værdien stiger til over 8. Det måtte således forventes, at denne lipase ville være uegnet som detergentadditiv, da pH i vaskeflotter sædvanligvis 30 er langt over 8. Det har dog overraskende vist sig, at

Humicola lanuginosa S-38 lipasen har et pH optimum langt over 8, se eksempel 1 senere i denne beskrivelse.

Det er endvidere beskrevet i Current Science, aug.

5, 1981, bind 50, nr. 15, s. 680, at Humicola lanuginosa lipa-35 sen kan anvendes til kemisk rensning. Da pH optimummet, der udelukkende vedrører vandige medier, er helt uden betydning

DK 157560 B

4 for en lipase til kemisk rensning, betyder ovenstående redegørelse intet for egnetheden af Humicola lanuginosa lipasen som et lipolytisk detergentadditiv.

Desuden ses det af Agr.Biol.Chem. 37 (11), side 2488 5 (1973), at H. lanuginosa lipasen hæmmes meget ved tilsætning af visse anioniske overfladeaktive stoffer. Ifølge vore opdagelser er H. lanuginosa lipasen dog overraskende fortrinligt kompatibel med LAS, der er et almindeligt anvendt anionisk overfladeaktivt stof.

10 Fig. 1-4 viser pH-aktivitetskurverne, fig. 1-2 i er for DSM 3819 lipase, og fig. 3-4 for DSM 1800 lipase.

Fig. 1 og 3 er ved tributyrinmetoden, og fig. 2 og 4 ved olivenolie/PVC-metoden. j

Lipaser som anvendes ifølge opfindelsen opnås j 15 fortrinsvis fra stammer af thermofil Humicola sp., inklusive thermophil Thermomyces sp., såsom H. lanuginosa (Griffon and Maublanc) Bunce, H. stellata Bunce, H. grisea var, thermoidea,

Cooney & Emerson, H. insolens, Cooney & Emerson, Thermomyces ibadanensis, Apinis & Eggins, H. hyalothermophila Moubasher, 20 Mazen og Abdel-Hafez, H. grisea var, indica Subrahmanyam, H. brevis var, thermoidea Subrahmanyam og Thirumalachar og H. brevispora Subrahmanyam og Thirumalachar. j I en særligt foretrukket udførelsesform for det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen kan lipasen fremstilles | 25 fra H. lanuginosa (Griffon og Maublanc) Bunce, H. brevispora i

Subrahmanyam og Thirumalachar, H. brevis var, thermoidea Subrahmanyam og Thirumalachar eller H. insolens Cooney & Emerson.

H. lanuginosa er endvidere beskrevet under synonymerne Thermomyces lanuginosus Tsiklinsky, Sepedonium lanuginosum 30 Griffon og Maublanc, Sepedonium thermaphilum cyclosporum og S. thermaphilum ovosporum Velich, Acremoniella sp. Rege,

Acremoniella thermophila Curzi og Monotospora lanuginosa (Griffon og Maublanc) Mason.

DK 157560 B

5

Ydermere blev arten Scytalidium thermophilum (Cooney 4 Emerson) Austwich af Hedger (1975, "The Ecology of thermophilic Fungi in Indonesia", i "Biodegradation et Humification", "Rapport du ler colloque International" - Nancy 1974 (ed. G. Kilbertius, 5 0. Reisinger, A. Mourey 4 J. A. Cancela Da Fonseca),

Sarreguemines: Pierron Editeur - 57206) anset for at tilhøre Humicola insolens.

Lipasen som anvendes ifølge opfindelsen kan fremstilles af en af følgende stammer: 10 taxonomisk deponerings- benævnelse internt Nr. deponeringsnr. dato H. lanuginosa A 1231 DSM 3819 13. aug 1986 H. lanuginosa H 126 DSM 4109 4. maj 1987 H. brevispora A 2121 DSM 4110 4. maj 1987 15 H. brevis var.

thermoidea A 2106 DSM 4111 4. maj 1987 H. insolens C 579 DSM 1800 1. okt 1981 DSM står for Deutsche Sammlung von Mikroorganismen. Stammerne er deponeret under Budapesttraktatens bestemmelser.

20 Lipase til brug i opfindelsen kan fremstilles ved aerob dyrkning af en af ovenstående stammer i henhold til de i teknikken kendte retningslinier, f.eks. som i de senere angivne eksempler.

pH-afhængigheden af lipaseaktiviteten blev bestemt 25 ved en traditionel metode, hvor tributyrin blev anvendt som substrat ved 30°C i en pH-stat og med gummi arabicum som emulgeringsmiddel. Aktiviteten ved forskellige pH-værdier blev fundet udfra forbruget af alkali overfor tid.

pH-afhængigheden blev også checket med et mere 30 realistisk substrat, nemlig olivenolie, der var adsorberet på PVC (i-henhold til US patentskrift 4,284,719).

pH-aktivitetskurverne for lipase fra H. lanuginosa DSM 3819 fremgår af fig. 1 (tributyrin) og fig. 2 (oliven-olie/PVC). Kurverne for DSM 4109, DSM 4110 og DSM 4111 var

DK 157560 B

6 tilsvarende, idet de viste optimum ved pH 10,0 - 10,5 ved begge metoder. pH-aktivitetskurverne for lipase fra H. insolens DSM 1800 fremgår af fig. 3 (tributyrin) og fig. 4 (olivenolie/PVC): 5 Isoelektrisk fokusering blev udført på de fem lipaser, hvorefter et lag med tributyrin blev lagt ovenpå for at påvise lipaseaktiviteten. Det viste sig, at DSM 3819, DSM 4109, DSM 4110 og DSM 4111 alle har lipaseaktiviteter med pi omkring 4,5, mens DSM 1800 har størstedelen af dets lipase-10 aktivitet med pi omkring 9,0 - 9,5 og kun en ubetydelig mængde lipaseaktivitet med pi omkring 4,5.

Ved en foretrukket udførelsesform tilvejebringes det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen som et ikke-støvende granulat eller som en væske. Disse er egnede til 15 anvendelse i henholdsvis pulverdetergenter og flydende deter-génter. Granulater kan fremstilles på flere forskellige måder.

Der kan henvises til britisk patentskrift nr. 1,362,365, som beskriver fremstillingen af enzymholdigt granulat til anvendelse som detergentadditiver ved hjælp af et apparat omfattende 20 en ekstruder og en sfæronisator (solgt som MAMUMERIZER®), og til US patentskrift nr. 4,106,991, som beskriver fremstillingen af enzymholdigt granulat til anvendelse som detergentaddi-tiver ved hjælp af en tromlegranulator.

Hvad angår en flydende formulering har lagerstabili-25 teten en tendens til at være utilstrækkelig, og en væske med et enzymstabiliseringsmiddel er derfor foretrukket. Stabiliseringsmidler kan være propylenglycol eller andre midler, der er kendt som stabiliseringsmidler til enzymopløsninger. Som det fremgår senere i denne beskrivelse har en ren vandig op-30 løsning af lipasen som anvendes ifølge opfindelsen en ringe lagerstabilitet, men den kan forbedres betydeligt ved at inkludere stabiliseringsmidler, f.eks. propylenglycol.

I en særligt foretrukket udførelsesform for det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen er lipase-35 aktiviteten over ca. 10.000 LU/g additiv. Lipaseenhed (LU) bliver defineret senere i denne beskrivelse. På denne måde dannes en passende lipaseaktivitet i vaskeflotten, når deter-

DK 157560 B

7 gentadditivet tilsættes til detergentet i en mængde af 0,1 til 5,0 g/100 g detergent, og når detergentet tilsættes til vaske-flotten i en mængde af 0,5 - 20 g detergent/1 vaskeflotte.

I en særligt foretrukket udførelsesform indeholder 5 det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen andre detergentenzymer udover lipasen, såsom protease, amylase eller cellulase. Alkaliske Bacillus-proteaser er foretrukket på grund af deres velkendte virkning som detergentproteaser. Som sådanne enzymer kan det proteolytiske enzym ALCALASE® fra Novo 10 Industri A/S, fremstillet mikrobielt ved dyrkning af Bacillus licheniformis, eller de proteolytiske enzymer SAVINASE® og ESPERASE®, også fra Novo Industri A/S, fremstillet i henhold til US patentskrift nr. 3,723,250, anvendes. Det blandede enzymatiske additiv kan fremstilles enten ved at blande et 15 tidligere fremstillet granulat af proteinase med et tidligere fremstillet granulat af lipase, eller ved at blande et koncentrat af proteinase med et koncentrat af lipase og derefter indføre blandingen i et granuleringsapparat, sammen med de sædvanlige granuleringshjælpemidler.

20 Nutildags er protease en almindelig detergent- bestanddel, og som det vil fremgå senere, er lipaser som anvendes ifølge opfindelsen i udstrakt grad kompatible i detergentopløsninger med vigtige detergentproteaser, såsom de ovenfor angivne. Hvis både lipase og protease skal tilsættes 25 til et detergent kan det være passende at anvende dem i form af et blandet additiv.

I en særligt foretrukket udførelsesform for det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen er den proteolytiske aktivitet mellem ca. 0,5 og ca. 3,0 Ansonenheder/g 30 additiv. På denne måde tilvejebringes en passende proteolytisk aktivitet i vaskeflotten når detergentadditivet tilsættes til detergentet i en mængde af 0,2 - 2 g/100 g detergent, og når detergentet tilsættes til vaskeflotten i en mængde af 0,5 - 20 g detergent/1 vaskeflotte. Den velkendte Anson hæmoglobin-35 metode-for proteolytisk aktivitet er beskrevet i Journal of General Physiology, 22, 79-89 (1959).

8

DK 157560 B

I overensstemmelse med den tidligere nævnte udførelsesform for additivet ifølge opfindelsen kan detergentet ifølge opfindelsen være et pulver eller et flydende detergent, og kan om ønsket omfatte andre detergentenzymer, såsom protea-5 se, amylase eller cellulase, enten i det samme additiv eller som separate additiver.

I en særligt foretrukket udførelsesform for detergentet ifølge opfindelsen indeholder detergentet det enzymatiske _ detergentadditiv ifølge opfindelsen i en mængde af mel- / 10 lem 0,1 og 5% w/w, mere fortrinsvis i en mængde af 0,2 - 2% w/w. På denne måde tilvejebringes en passende balance mellem énzymvirkningen og virkningen af andre detergentbestanddele.

/

Detergentet anvendes typisk i koncentrationer på 0,5 - 20 g/1 vaskeflotte, og passende lipaseaktivitet i vaskeflot-15 ten er 1.000 - 10.000 LU/l, mere fortrinsvis 1.000 - 5.000 LU/1. Således er lipaseaktiviteten i detergentet i en foretrukket udførelsesform 50 - 20.000 LU/g, fortrinsvis 50 - 10.000 LU/g, mere fortrinsvis 250 - 2.000 LU/g og mest fortrinsvis 500 - 2.000 LU/g detergent.

20 Som ovenfor nævnt er den foretrukne lipase i additi vet over 10.000 LU/g, og denne tilsættes til detergenterne i mængder af fortrinsvis 0,1 - 5% w/w og mere fortrinsvis 0,2 -2% w/w. Følgelig er lipaseaktiviteten i detergenterne ifølge en anden foretrukket udførelsesform 10 -500 LU/g, mere for-25 trinsvis 20 - 200 LU/g detergent.

'I en særligt foretrukket udførelsesform omfatter detergentet ifølge opfindelsen andre detergentenzymer foruden lipasen, mest fortrinsvis en protease. Foretrukne detergent-proteaser er de, der allerede er nævnt. Lipase og protease kan 30 tilsættes^til detergentet enten separat eller i form af et blandet additiv. Som allerede nævnt anvendes proteaser almindeligvis i detergenter, og lipa^er som anvendes ifølge opfindelsen udviser en bemærkelsesværdig stabilitet i detergentopløsning med de kommercielt vigtige proteaser. I 35 overensstemmelse med ovennævnte foretrukne værdier for proteaseaktivitet foretrækkes en i 9

DK 1 b 7 5 6 O B

proteaseaktivitet i detergentet på 0,0005 - 0,15 AU/g, mere fortrinsvis 0,001 - 0,060 AU/g, endnu mere fortrinsvis 0,003 -0,025 AU/g og mest fortrinsvis 0,006 - 0,010 AU/g detergent.

I en særligt foretrukket udførelsesform for deter-5 gentet ifølge opfindelsen omfatter det overfladeaktive materiale 30-100% anionisk og 0-70% ikke-ionisk overfladeaktivt stof, mest fortrinsvis 50-100% anionisk og 0-50% ikke-ionisk overfladeaktivt stof. Vaskevirkning af lipase som anvendes ifølge opfindelsen er særlig udtalt i detergenter med et højt^ 10 indhold af anioniske midler, såsom LAS (lineær i alkylbenzensulfonat).

I en særligt foretrukket udførelsesform i vaske-processen ifølge opfindelsen indeholder vaskeflotten detergentet ifølge opfindelsen i en mænge af mellem 0,5 og 20 g/1 15 vaskeflotte. På denne måde tilvejebringes en passende lipase-aktivitet i vaskeflotten, nemlig typisk mellem 1.000 og 10.000 LU/1 vaskeflotte, fortrinsvis mellem 1.000 og 5.000 LU/1 vaskeflotte.

EKSEMPLER

20 Lipaseaktivitet

Fremgangsmåden er baseret på hydrolyse af tributyrin i en pH-stat. 1 LU (Lipase Unit - lipaseenhed) er mængden .af enzym, som frigør 1 μπιοί titrerbar smørsyre pr. minut ved 30°C, pH 7.0 med gummi arabicum som et emulgeringsmiddel.

25 Yderligere detaljer gives i Novo Analytical Method AF 95/5, som efter anmodning kan rekvireres.

10

DK 167560 B

EKSEMPEL 1 ' Lipase fra H. lanuginosa DSM 3819

Fyrre 500 ml rystekolber hver med 200 ml PL-lc medium (sammensætning følger) blev hver podet med 0,2 ml af en 5 opslemning af sporer, fremstillet ud fra skrårør med H. lanuginosa DSM 3819, voksende på YPG-agar (sammensætning følger) i 5 dage ved 45°C. De således podede rystekolber blev rystet i 3 dage ved 45°C med en hastighed på 240 omdrejninger pr. minut.

På dette tidspunkt var lipaseaktiviteten i den opsamlede væske 10 (6,7 liter).104 LU/ml. Cellerne blev fjernet ved centrifugering ved en hastighed på 4000 omdrejninger pr. minut i 25 minutter. Derved fik man 5,9 liter supernatant. Supernatanten blev filtreret gennem et 10 μ nylonfilterstof og derefter koncentreret 8 gange ved ultrafiltrering på Pellicon UF Cassette system 15 (membraner med en nominel molekylevægtsgrænse på 10.000).

UF-koncentratet (endeligt volumen på 740 ml) blev omdannet til råpulver ved frysetørring. Dette råpulver udviste en lipaseaktivitet på 13.310 LU/g.

Sammensætningen af YPG-agar var som følger: 20 Gærekstrakt, Difco 4 g/1

Glucose 15 g/1 ’ K2HP04 1 g//1

MgS04, 7H20 0,5 g/1

Agar 20 g/1 r 25 Autoklavering ved 121°C i 40 minutter

Sammensætningen af PL-lc medium var som følger:

DK 157560 B

11

Pepton 15 g/1

Tween-80 18 g/1

MgSC>4, 7H O 2 g/1

CaCl2, 2H20 0,1 g/1 5 Nalco-10 2 g/1 pH før autoklavering 6,0

Autoklavering ved 121°C i 40 minutter EKSEMPEL 2

Lipase fra andre Humicola-stammer 10 Stamme DSM 4111 blev gæret på medium PL-lc, stamme DSM 4109 på medium GT, stamme DSM 4110 på medium GTS-1, og Stamme DSM 1800 på medium LR-8ST, hovedsageligt som beskrevet i eksempel 1.

Sammensætning af gæringsmedium

15 I GT GTS-1 LR-8ST

Gærekstrakt g/1 | 22,5 15 0

(65% tørstof) I

20 Pharmamedia | 0 0 50

Tween 80 — | 18 5 5

Span 80 - I 0 5 5 25 " j

MgS04,7H20 - I 2 2 0,5

CaCl2,2H20 - I 0,1 0,1 0 30 K2HP04 - I 0 0 5

NaNO^ - I 0 0 1

Nalco-10 I 5 2 0

35 I

pH før · autoklavering j ca. 6,5 ca. 6,0_ ca. 7,0

DK 157560 B

12

Udvinding fra kulturvæskerne blev hovedsageligt udført som beskrevet for DSM 3819 i eksempel 1. I tilfældet med lipase fra DSM 4109 blev et ekstra oprensningstrin udført forud for frysetørring, idet UF-concentratet blev udfældet med acetone, 5 hvorefter det udfældede blev opløst igen i vand og frysetørret.

De endelige frysetørrede pulvere udviste følgende lipaseaktivi-teter:

Stamme DSM 4111 DSM 4109_DSM 4110 DSM 1800 LU/g 32.000 211.000 6.600 1.800 10 Vaskemetode

Det prøvemateriale, der blev anvendt i vaskeforsøg, var bomuldsstof (med en overfladevægt svarende til ca. 1,2 g/50 2 cm ) imprægneret med olivenolie (Sigma 0—1500). Lapperne blev fremstillet ved at påføre 50 eller 85 μΐ (som angivet) 15 olivenolie, opvarmet til 50-60°C, i midten af hver prøvelap (7 x 7 cm) ved hjælp af en mikropipette. Efter oliepåføringen blev lapperne ældet ved stuetemperatur i 2 dage.

Lipasepræparaterne fra eksempel 1 og 2 blev anvendt og identificeret ved stammenumrene.

20 Til sammenligning anvendtes endvidere i dette eksem pel et lipolytisk pulver på basis af Fusarium oxysporum, fremkommet som beskrevet i eksempel 23 i europæisk patentansøgning med publikationsnummer 0 130 064, som repræsenterende det mest effektive kendte lipolytiske detergentadditiv. Fusarium oxy-25 sporum lipasepræparatets aktivitet var 90.000 LU/g.

Lipaserne blev bedømt ved vaskeforsøg i en Terg-0-Tometer forsøgsvaskemaskine. Terg-O-Tometer forsøgsvaske-maskinen er beskrevet hos Jay C. Harris, Detergency evaluation and testing, Interscience Publishers Ltd., 1954, side 60 - 61.

30 Vaskeforsøgene udførtes under følgende betingelser:

DK 157560 B

13

Omrøring 100 omdrejninger pr. minut

Vandets hårdhedsgrad 18°dH (fra hanen), hvis andet ikke er angivet stof/væske forhold 7 lapper/1000 ml 5 skylning 15 min under løbende hane Mængden af olie, der var indeholdt i 7 lapper med 85 μΐ hver er ca. 535 m.j (vægtfylde 0,90).

Efter skylning blev lapperne lufttørret. Restindholdet af olie i lapperne blev bestemt ved Soxhlet ekstration 10 med n-hexan i 5 timer efterfulgt af gravimetrisk bestemmelse af restmængden.

Sammensætningen af restolien blev analyseret ved hjælp af TLC-FID (TLC-FID er en forkortelse af "thin layer chromatography/flame ionization detector", og fremgangsmåden er 15 beskrevet i Lipids, vol. 18, nr. 10 (1983), side 732) metoden, hvor der anvendes en Iatroscan TH-10 (Iatron Lab. Inc., Tokyo) kombineret med en Chromatocorder II (System Instruments Co.,

Ltd., Tokyo) integrator ved følgende betingelser: fast fase Chromarod S-II (Iatron) 20 mobil fase Hexan/ethylæter/eddikesyre (60:50:2 v/v/v) hydrogentilførsel 160 ml/min lufttilførsel 2000 ml/min scanningshastighed 30 sek. pr. scanning 25 Prøver til TLC-FID analysen blev fremstillet som følger. Efter gravimetrisk bestemmelse af restmængden blev det tørrede ekstrakt opløst igen i 20 ml hexan, og 5 ml intern standard (lithocholsyre, 12,5 mg/ml) opløst i ethanol blev tilsat. Til hver analyse brugtes 1 μΐ af prøven.

30 Baseret på standardkurver for triolein, diolein, monoolein og olies'yre blev restoliens relative sammensætning (% w/w) beregnet.

Antallet af uhydrolyserede glyceridbindinger i restolien blev beregnet ved følgende formel:

DK 157560 B

14 3 2 1 n = 10 x M (885 X Xm_ + 621 x X^ + 357 x X ) (μ mol)

1G UG MG

hvor X = procent triglycerid (% w/w) i G

Xn_ = procent diglycerid (% w/w)

UG

5 X = procent monoglycerid (% w/w)

MG

M = restmængden af olie (mg) 885, 621 og 357 er molekylevægten for henholdsvis triolein, diolein og monolein.

EKSEMPEL 3 10 Virkningen af vasketemperatur

Dette eksempel demonstrerer virkningen af Humicola lanuginosa lipasen (DSM 3819) i et anionisk detergent ved forskellige vasketemperaturer.

Detergentsammensætning: LAS (0,5 g/1), Na2C0^ (1/0 g/1) 15 Vasketid: 20 minutter

Lipasedosering: 3000 LU/1 pH: 9,5

Besmudsning: 85 μΐ olivenolie LAS er lineær alkylbenzensulfonat (Nansa HS80/S, Albright & 20 Wilson), et anionisk overfladeaktivt stof.

Uden Fusarium Humicola

Temp._lipase_oxysporum lanuginosa

Restolie (mg) 185 187 165 30°C η (μ mole) 590__571__360_ 25 Restolie (mg) 187 192 157 50°C η (μ mol)_606_628_432_ 15

DK 157 560 B

EKSEMPEL 4

Virkning af vasketid I dette eksempel vises virkningen af Humicola lanuginosa lipasen (DSM 3819) ved at anvende forskellige vasketider.

5 Detergentsammensætning: LAS (0,5 g/1), Na^CO^ (1,0 g/1)

Temperatur: 30°C

Lipasedosering: 3000 LU/1 pH (initial): 9,5

Besmudsning: 85 μΐ olivenolie 10 Vasketid Uden Fusarium Humicola (min. )_lipase_oxysporum lanuginosa 20 Restolie (mg) 185 187 165 η (μ mol) 590 571 360 40 Restolie (mg) 177 167 128 15 η (μ mol) 568 526 246 60 Restolie (mg) 141 147 93 η (μ mol) 465 454 153 90 Restolie (mg) 139 135 78 η (μ mol) 431 419 111 20 EKSEMPEL 5

Virkning af vandets hårdhedsgrad ved vask

Dette eksempel viser indflydelsen af vandets hårdhedsgrad på vaskevirkningen af Humicola lanuginosa lipase (DSM 3819). Hårdhedsgraden (°dH = tysk hårdhed) blev indstillet ved 25 at blande vand fra hanen med destilleret vand.

16

DK i57560 B

Detergentsammensætning:. LAS (0,5 g/1), Na2C03 (1,0 g/1)

Temperatur: 30°C

Vasketid: 20 minutter

Lipasedosering: 3000 LU/1 5 pH (initial): 9,5

Besmudsning: 85 μΐ olivenolie

Hardhedsgrad Uden Fusarium Humicola °dH lipase oxysporum lanuginosa 0 Restolie (mg) 254 244 242 10 η (μ mol) 820 752 627 6 Restolie (mg) 210 192 173 η (μ mol) 670 595 415 12 Restolie (mg) 182 179 170 η (μ mol) 579 548 405 15 18 Restolie (mg) 185 187 165 η (μ mol) 590 571 360 EKSEMPEL 6

Virkning af lipasedosering ved vask

Dette eksempel viser, hvilken betydning dosering af H.

20 lanuginosa lipase har ved vaskeudførelser under anvendelse af acetonefraktioneret lipasepulver fra DSM 3819.

Detergentsammensætning: LAS (0,5 g/1), Na2C03 (1,0 g/1)

Vasketid ‘ 20 minutter

Temperatur 30°C

25 pH (initial): 9,5

Besmudsning: 85 μΐ olivenolie

De besmudsede lapper, der anvendtes, var fra en anden portion end i eksemplerne 2-5, så resultaterne kan ikke sammenlignes direkte.

DK 157560 B

17

Lipasedosering, LU/ml 0 500 1500 3000 6000 10,000

Restolie (mg) 232 209 202 202 194 176 η (μ mol) 761 558 521 471 437 363 EKSEMPEL 7 5 Sammenligning af Humicola lipaser ved vask

Dette eksempel sammenligner den vaskevirkning, der blev opnået med lipase fra H. lanuginosa (DSM 4109), H. brevis var, thermoidea (DSM 4111), H. brevispora (DSM 4110) og H. insolens (DSM 1800).

10 Detergentsammensætning: LAS 0,50 g/1

Talgsæbe 0,05 -

Alkoholethoxylat (C^.^r^EO) 0,10 -

Alkoholethoxylat (C^g_^g,30EO) 0,02 -

Zeolite 1,20 - 15 Na2C03 . 0,50 -

Natriummetasilicat 0,10 - EDTA (titriplex III) 0,01 -

Na2S04 2,00 -

Temperatur: 30°C

20 Vasketid: 20 minutter

Lipasedosering: 6000 LU/1 pH: 9,5

Besmudsning: 50μ1 olivenolie

DK 157560B

18

Lipasepræparat_η (μ mol) intet 546 H. lanuginosa 454 H. brevis var. thermoidea 468 5 H. brevispora 484 H. insolens 350 EKSEMPEL 8

Stabilitet af Humicola lipase overfor protease

Den udmærkede stabilitet af Humicola lipaser i deter-10 gentopløsninger indeholdende proteolytiske enzymer vises i nedenstående.

Et Humicola lanuginosa præparat (DSM 4109) sammenlignes med den Fusarium oxysporum lipase, der blev anvendt i de foregående eksempler og med det kommercielle lipasepræparat, 15 Amano P (Amano Pharmaceutical co. Ltd., Nagoya, Japan), som er fremstillet af Pseudomonas fluorescens.

De alkaliske Bacillus proteaser ALCALASE®, SAVINASE® og ESPERASE® anvendtes. Disse er kommercielle detergentproteaser fra Novo Industri A/S, Danmark.

20 Den proteolytiske aktivitet blev bestemt med kasein som substratet. En Kasein proteaseenhed (CPU) blev defineret som mængden af enzym, der frigør 1 mM af primære aminogrupper (bestemt ved sammenligning med en serinstandard) pr. minut under standardbetingelser, dvs inkubation i 30 minutter ved 25°C og pH 25 9,5. En 2% (w/v) opløsning af kasein (Hammersten, solgt af Merck A.G., Vesttyskland) blev fremstillet med Universalpufferen, der er beskrevet i Britton og Robinson (Journ.Chem.Soc. 1931, s.

1451) indstillet til pH 9,5.

DK 157560 B

19

Detergent: 1,3 g/1 af et fosfat-frit pulver indeholdende 25% overfladeaktivt stof (alfa-olefin sulfonate (AOS) og lineær alkylbenzensulfonat 5 (LAS)), natriumsulfat, zeolite, natriumsilicat og optisk hvidt.

Vandets hårdhedsgrad: 4,5°dH

pH: 10,0 (indstillet)

Temperatur: 25°C

10 Lipaseaktivitet (initial): 3000 LU/1

Proteaseaktivitet: 0 eller 0,05 CPU/1

Resterende lipaseaktivitet (%): 1) Protease: SAVINASE® [ Inkubationstid (min)

Lipd.se 15 I 0 15 I 30 I 60 90 , I I -

Humicola lanuginosa | 100 99 | 94 | 91 89

Fusarium oxysporum j 100 32 | 14 j 3 -

Pseudomonas j j | 20 fluorescens_| 100_1 j_0 |_-_ - 2) Protease: Ingen T . I Inkubationstid (min)

Lipase ' I 0 I 15 I 30 I 60 I 90 -i-1-1-1-1- 25 Humicola lanuginosa | 100 | 101 j 99 | 102 | 96

Fusarium oxysporum | 100 1 57 | 42 | 18 ( 6

Pseudomonas ί I I I I

fluorescens_j 100 j 94 j 94 j 88 j 90 20

DK 1S7560B

Detergent: LAS 0,40 g/1

Alkoholethoxylat (Berol 065) 0,15 g/1

Talgsæbe 0,15 g/1

Natriumtripolyfosfat 1,50 g/1 5 Natriummetasilicat 0,40 g/1 CMC 0,05 g/1

Na2S04 2,10 g/1

Vandets hårdhedsgrad: 18°dH pH: 9,5

10 Temperatur: 30°C

Lipaseaktivitet: 3000 LU/1

Proteaseaktivitet: 0 eller 0,05 CPU/1 1) Protease: SAVINASE® I Inkubationstid (min)

Lipase 15 ( 0 I 15 ( 30 I 60 ( 90 j | i-1-1-

Humicola lanuginosa | 100 | 99 | 98 | 97 | 97

Fusarium oxysporum | 100 j 5 j 0 j |

Pseudomonas I I I I I

20 fluorescens_j 100 j_0 |_ j_ j_- 2) Protease: ALCALASE® _. I Inkubationstid (min)

Lipase ' ( 0 I 15 I 30 I 60 J 90 -1-1-1-1-1- 25 Humicola lanuginosa | 100 [ 98 | 97 | 95 j 95

Fusarium oxysporum | 100 | 24 j 4 j 0 j

Pseudomonas I j I I I

fluorescens_| 100 j 18 j_0 j_ (_-

DK 157560 B

21 3) Protease: ESPERASE® I Inkubationstid (min)

Lipase ' _0 15 30 60 90 5 Humicola lanuginosa 100 97 96 96 98

Fusarium oxysporum 100 20 0

Pseudomonas fluorescens_100_0_-_"_~ 4) Protease: Ingen 10 I Inkubationstid (min)

Lipase (0 I 15 I 30 I 60 I 90

1 I 1 I I

Humicola lanuginosa | 100 j 96 | 95 | 96 | 94

Fusarium oxysporum j 100 [ 30 | 10 j 0 j

15 Pseudomonas j | III

fluorescens_j 100 j 101 j 102 | 102 j 99

Det ses, at Humicola lipasen ifølge opfindelsen er meget stabil i detergentopløsninger med protease i modsætningen til kendte détergentlipaser (Fusarium og Pseudomonas).

20 EKSEMPEL 9

Stabiliseret flydende Humicola lipasepræparat

Lipasestabilitet i opløsninger med forskellige stabiliseringmidler blev undersøgt.

Lipase: Humicola lanuginosa (DSM 4109)

25 Lagringstemp: 30°C

pH: 7,0

Rodalon blev tilsat til alle præparaterne som konserveringsmiddel (0,2 mg aktivt stof pr. ml).

DK 157560 B

22

Resultater: I III INITIAL || Restaktivitet (%), I 1,2-propandiol ,Sorbitol|C^l2.2H20|AmOTIET|, ^ I (ml/ml) I (cx/ml) I (mq/ml) I (LU/ml) II 0 I 2 I 13 I 29 I 49

5 I || I II I I I I

1 I 0_I 0 I 0 I 4520 || 100 I 17 I 2 | 1 | 1

I II I II I I I I

2 I 0,50_I 0 I 0 I 4520 11 100 | 93 | 63 | 35 | 34

I II I II I I I I

10 3 I 0,50_I 0 I 3 | 4720 11 100 | 86 | 76 | 54 | 48

I II I II I I I I

4 I 0_1 0.30 I 0 I 4880 11 100 | 57 | 10 | 1 [ 1

Disse resultater viser, at 1.2-propandiol (MPG = mono-propylenglycol) er et udmærket stabiliseringsmiddel for Humicola 15 lipase. Lagerstabiliteten blev yderligere forbedret ved tilsætning af Ca salt. Sorbitol har en svagt stabiliserende virkning.

Et vaskeforsøg blev udført med stabiliseret flydende lipasepræparat med følgende sammensætning:

Humicola lanuginosa DSM 4109 lipase 5000 LU/ml 20 1.2-propandiol 50% v/v

Deioniseret vand 50% v/v

CaC^^^O 3 mg/ml

Detergentsammensætning: LAS (0,5 g/1), Na2CC>2 (1,0 g/1)

Temperatur: 30°C

25 Vasketid: 20 minutter pH: 9,5

Besmudsning: 50 μΐ olivenolie

Lipasedosering: 1 ml stabiliseret flydende præparat pr.

liter vaskeflotte.

23 DK 157560 B

Resultater:________

Lipasedosering Restolie (mg) η (μπιοί) LU/1___ 0 157 507 5 5000 145 418 EKSEMPEL 10

Humicola lipase som støvfrit granulat

En granulatbærer uden enzym blev hovedsageligt fremstillet i henhold til US patentskrift nr. 4,106,991 med følgende 10 sammensætning: 15% cellulosefibre 4% titaniumdioxid 5% gult dextrin 10% saccharose 15 64% natriumsulfat

Dette granulat blev sigtet for at opnå en partikelstørrelse på 300-710 μπι.

30,8 g of dette blev befugtet med 6,2 g af en 30% opløsning i ethanol af polyvinylpyrrolidon (PVP K30, produkt af 20 GAF Corp., USA). Efter grundig blanding blev 12,3 frysetørret H. lanuginosa DSM 4109 lipase (92.700 LU/g, hovedsageligt fremstillet som i eksempel 2) tilsat, og blev grundigt blandet. Granulatet blev tørret (fordampning af ethanol) ved gennemblæsning (fluidisering) ved ca. 50°C. Partikler med partikelstørrelser på 25 300-850 μπι blev opsamlet ved sigtning.

Granulatet blev derefter overtrukket i tre trin som følger:

DK 157560 B

24 - 5% polyethylenglycol (MW 600) - 11,25% TiC^/Mg silicat (4:1) - 4% polyethylenglycol (MW 600)

Det overtrukkede granulat blev gennemblæst ved 0,8 5 m/sekund i 10 minutter for at fjerne fine partikler af overtræksmateriale. Endelig blev materialet igen sigtet, og partikler med partikelstørrelser fra 300 til 850 pm blev opsamlet. Et støvfrit, offwhite granulat blev opnået.

Udbytte og aktivitet blev som følger: 10 frysetørret pulver 92.700 LU/g 12,3 g uovertrukket granulat 21.100- 45,0 - overtrukket granulat 18.200 -

Et vaskeforsøg blev udført med det frysetørrede pulver og granulatet som følger: 15 Detergentsammensætning: LAS (0,5 g/1), Na^CO^ (1/0 g/1)

Temperatur: 30°C

Vasketid: 20 minutter

Lipasedosering: 6000 LU/1 pH: 10,0 20 Besmudsning: 50 μΐ olivenolie

Resultater:_

Lipasepræparat_η (μ mol)_ intet 515 frysetørret pulver 386 25 granulat 415

Claims (10)

1. Enzymatisk detergentadditiv, hvori den aktive bestanddel er en mikrobielt fremstillet lipase, kendetegnet ved, at lipasen kan fremstilles ved hjælp af en stamme af slægten Humi- 5 cola, inklusive slægten Thermomyces.

2. Enzymatisk detergentadditiv ifølge krav 1, kendetegnet ved, at stammen tilhører H. lanuginosa, H. brevispora, H. brevis var. thermoidea eller H. insolens.

3. Enzymatisk detergentadditiv ifølge krav 2, kendetegnet 10 ved, at stammen er Humicola lanuginosa DSM 3819 eller 4109, Humicola brevispora DSM 4110, Humicola brevis var. thermoidea DSM 4111 eller Humicola insolens DSM 1800.

4. Enzymatisk detergentadditiv ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at additivet er tilvejebragt som et ikke-støvende 15 granulat eller en væske.

5. Enzymatisk detergentadditiv ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at additivet udover lipasen indeholder et proteo-lytisk enzym.

6. Enzymatisk detergentadditiv ifølge krav 5, kendetegnet 20 ved, at det proteolytiske enzym er en alkalisk Bacillus protease. DK 157560 B

7. Detergent indeholdende et enzymatisk additiv, hvis aktive bestanddel er en mikrobielt fremstillet lipase, kendetegnet ved, at det enzymatiske detergentadditiv er det enzymatiske additiv ifølge krav 1-6.

8. Detergent ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det yderligere indeholder overfladeaktivt stof omfattende fra 30 til 100 vægt-% anionisk overfladeaktivt stof og fra 0 til 70 vægt-% ikke-ionisk overfladeaktivt stof.

9. Detergent ifølge krav 7 og 8, kendetegnet ved, at 10 detergentet yderligere indeholder en protease.

10. Fremgangsmåde til vask af tekstiler, kendetegnet ved, at den foretages ved en pH-værdi, der ligger mellem 7 og 12, og at der som detergent anvendes detergentet ifølge krav 7 til 9. Λ