ES2168236T3 - Utilizacion de lipasa para mejorar las pastas de pan y los productos de panaderia. - Google Patents

Abstract

Polipéptido que presenta actividad lipásica, en el que dicho polipéptido es una enzima triacilglicerol hidrolizante y en el que dicho polipéptido es capaz de separar ácidos grasos que tienen una longitud de cadena corta, media o larga, y en el que dicho polipéptido es capaz de hidrolizar galactolípidos, normalmente presentes en una harina, en los galactosil monogliceridos correspondientes, en el que dicho polipéptido es capaz de hidrolizar por lo menos el 10% de los galactosil digliceridos, normalmente presentes en una masa preparada con harina, en monogliceridos.

Description

Utilización de lipasa para mejorar las pastas de pan y los productos de panadería.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la fabricación alimenticia, en particular a la preparación de productos mejorados de panadería. Específicamente, la invención proporciona la utilización de un polipéptido que tiene actividad lipásica, que es capaz de mejorar las características de los productos alimenticios, incluyendo los productos de panadería.

Antecedentes de la invención y técnica anterior

Las lipasas (EC 3.1.1.3), que pueden definirse como carboxiesterasas que catalizan la hidrólisis de los acilgliceroles, son enzimas muy importantes fisiológicamente, uno de los tres grupos más importantes de enzimas digestivos, junto con las amilasas y las proteasas. Hidrolizan lípidos a glicerol y ácidos grasos, pero pueden también funcionar en las reacciones de esterificación o de transesterificación.

Varios estudios informan sobre la purificación y caracterización de las lipasas a partir de Aspergillus niger. Así, Tombs y Blake (Biochim. Biophys., 1982, 700:81-89) purificaron una lipasa a partir de un concentrado comercial en bruto de un medio de Aspergillus. La lipasa pura consistió en un dímero glicosilado que contenía dos cadenas, cada una con un peso molecular de 25 kDa.

Iwai y Tsujisaka (en Lipases, Borgström y Brockman, (eds), Elsevier, Amsterdam, 1984, páginas 443-468), purificaron también una lipasa secretada extracelularmente a partir de Aspergillus niger y obtuvieron cristales de ella. Determinaron que el peso molecular de la lipasa era de 38 kDa y encontraron que el enzima era monomérico. Se determinó que el pI era 4,3. El pH óptimo sobre aceite de oliva era de 5,6 y la temperatura óptima sobre el mismo substrato fue de 25ºC. La lipasa era estable en un intervalo del pH de entre 2,2 y 6,8 (30ºC, 24 horas y hasta una temperatura de 50ºC (pH 5,6, 15 min). La lipasa mostró una intensa actividad respecto a los triglicéridos de ácidos grasos con una cadena de longitud media.

Höfelmann et al. (J. Food Sci., 1985, 50:1721-1731) utilizaron un producto comercial de lipasa de Aspergillus niger (Lipasa 2212, Röhm) como material de partida para la purificación de la lipasa. Se obtuvieron dos lipasas con pesos moleculares de 19 kDa y 31 kDa y un pI de 3,5 y 4,0, respectivamente. Ambos enzimas estaban glicosi-
lados.

Torossian y Bell (Biotechnol. Appl Biochem., 1991, 13:205-211) utilizaron una preparación comercial en bruto de lipasa a partir de Aspergillus niger de Amano (Japón). Determinaron que el peso molecular era de 37 kDa y el pI de 4,0. Se determinó que el extremo N era XVSTSTLDELQFALQ. Sugihara et al. (Agric. Biol. Chem., 1988, 52:1591-1592) encontraron que el extremo N era SVT y que el peso molecular era de 35 kDa para una lipasa purificada a partir de una preparación de lipasa de Aspergillus niger de Amano (Japón).

A pesar de las discrepancias en el peso molecular para las lipasas mencionadas, se informó que todas ellas eran 1,3-específicas respecto a la hidrólisis de los triglicéridos.

En la industria panadera, es bien conocida la utilización de enzimas tales como amilasas, xilinasas, oxidasas y proteasas, para que las pastas y sus características mejoren, y/o para que el producto de panadería consiga un aumento de volumen, un retraso en su degradación (porque se eche a perder) y una mayor blandura. También es conocida la utilización de las lipasas como aditivo para la hornada.

Así, la patente US nº 3.368.903 da a conocer preparaciones de lipasa purificada aislada de semillas vegetales que, cuando se añaden a una mezcla de pasta de pan, poseen un significativo efecto de retraso sobre el proceso de degradación del pan.

La patente JP-62-285749-A describe un procedimiento para fabricar el pan en el que la lipasa se añade a la pasta, mezclándola con gluten vital y lecitina. Se determina que esta lipasa deteriora las propiedades de calidad tales como el volumen del pan y la elasticidad de la miga.

Mohsen et al. (Egypt. J. Food Sci.,1986, 14:175-182) describe que una lipasa producida por Rhizopus delemar mejora la blandura del pan.

En la patente EP 468 731 A1 se da a conocer una combinación que mejora el pan, que comprende glucosa oxidasa con oxidasas distintas que ésta, o hidrolasas tales como por ejemplo, lipasa. Se obtiene pan de un volumen suficiente que es satisfactorio en la calidad de las características internas y externas. Sin embargo, la utilización de lipasa sola posee un efecto de proporcionar volumen al pan.

La patente WO-94/04035 da a conocer un procedimiento para mejorar las propiedades de una pasta (con grasa añadida o no) y/o de un producto de panadería fabricado a partir de ésta, añadiéndole una lipasa de origen microbiano. La utilización de la lipasa microbiana dió lugar a un aumento del volumen y mejoró la blandura del producto de panadería. Además, se encontró un efecto anti-degradación.

La patente EP 585 988 A1 da a conocer una composición que mejora el pan, que incluye por lo menos una lipasa, una hemicelulosa y una amilasa. Los experimentos de cocción mostraron que la utilización de sólo la lipasa en una pasta a la que no se le había añadido grasa, dió lugar a un volumen reducido del producto de panadería, mientras que no se observó ningún efecto sobre el volumen cuando la lipasa se utilizó en una pasta que contenía grasa añadida.

A partir de la técnica anterior puede, por tanto, deducirse que los efectos de lipasas conocidas cuando se utilizan como aditivos de la pasta, son muy variables respecto a la acción sobre su degradación, al retardo en la firmeza de la miga y en el volumen del pan.

La presente invención proporciona la utilización de un polipéptido que tiene actividad lipásica, en la preparación de una pasta y/o de un producto de panadería, el cual polipéptido es un enzima que hidroliza el triacilglicerol y en la que dicho polipéptido es capaz de dividir los ácidos grasos que presentan cadenas cortas, medias y largas, caracterizada porque dicho polipéptido es capaz de hidrolizar galactolípidos que se encuentran normalmente presentes en la harina a los correspondientes galactosil monoglicéridos, y en la que dicho polipéptido es capaz de hidrolizar por lo menos un 10% de los galactosil diglicéridos, que se encuentran normalmente presentes en la pasta de harina, a galactosil monoglicéridos, y en la que el enzima proporciona una o más de las características siguientes del producto de panadería: mejora en la homogeneidad de los poros y diámetro reducido de éstos.

Según la presente invención, pueden utilizarse nuevos polipéptidos con actividad lipásica que se encontró que conferían características desconocidas en la técnica anterior a las pastas y a los productos de panadería. Así, en experimentos de cocción estos polipéptidos mostraron propiedades sorprendentes que no habían sido enseñadas o sugeridas cuando se utilizaron en pastas de harina, que incluyen el aumento de la homogeneidad del poro de la miga y la reducción del diámetro de éste, sin efectos negativos concomitantes sobre el volumen del pan y la porosidad de la miga. De este modo, la utilización según la invención proporciona productos de panadería que son menos propensos a la deformación mecánica.

El diámetro medio de poro pequeño, el aumento de la homogeneidad de los poros y la porosidad que no ha cambiado, implican que la invención proporciona los medios para obtener productos de panadería con una estructura reforzada de la miga. La mejora en la homogeneidad de los poros del producto de panadería implica además la ventaja de que se obtiene un producto que es más capaz de partirse en rebanadas y resistente a la manipulación física, debido a la estructura reforzada de la miga.

Es bien conocido que resulta difícil extender capas delgadas de mantequilla o margarina sobre rebanadas de pan que presentan una estructura de los poros muy poco homogénea. Por tanto, constituye una ventaja que el pan, tal como puede obtenerse según la presente invención, presente una estructura de poro fina y homogénea.

Es bien sabido que una hoja cortada es menos resistente a la manipulación física que una hoja que no se corte. Por tanto, la estructura reforzada de la miga, que se obtiene añadiendo el polipéptido de la presente invención a la pasta, es particularmente ventajosa en los productos de panadería, tales como el pan tostado, que se parten típicamente en rodajas inmediatamente después de ser cocidos por el fabricante y que son distribuidos en rodajas a establecimientos de comida rápida y supermercados.

Se ha encontrado además que la utilización según la presente invención mejora la estabilidad de la red de gluten en pastas de harina, lo cual implica la ventaja de que se potencia la tolerancia a las variaciones en el tiempo de fermentación.

Constituye, por tanto, un objetivo importante de la presente invención proporcionar dichos polipéptidos lipasa activos útiles. Se ha encontrado que dichos polipéptidos puede derivarse de hongos filamentosos tales como por ejemplo Aspergillus tubigensis. Sin embargo, el polipéptido se produce sólo en pequeñas cantidades en cepas fúngicas de tipo salvaje. Otro objetivo importante es por tanto proporcionar un procedimiento para producir los nuevos polipéptidos de una forma rentable utilizando tecnología del ADN recombinante.

Sumario de la invención

En consecuencia, la presente invención se refiere a la utilización de un polipéptido con actividad lipásica en la preparación de una pasta y/o del producto de panadería y el cual polipéptido es un enzima que hidroliza el triacilglicerol y en la que dicho polipéptido es capaz de dividir los ácidos grasos que poseen cadenas cortas, medias y largas, caracterizada porque dicho polipéptido es capaz de hidrolizar galactolípidos que se encuentran normalmente en la harina, a los correspondientes galactosil monoglicéridos, y en la que dicho polipéptido es capaz de hidrolizar por lo menos el 10% de los galactosil diglicéridos, que se encuentran normalmente en la pasta de harina, a los galactosil monoglicéridos, en la que dicho polipéptido conserva por lo menos una actividad del 80% después de 4 días a 20ºC y a un pH del orden de 3,5-8; y en la que el enzima da lugar a una o más de las características siguientes en el producto de panadería: mejora en la homogeneidad del poro y reducción en el diámetro de éste.

Un polipéptido que se utiliza según la presente invención, que posee actividad lipásica y que puede provenir de Aspergillus tubigensis, presenta las características siguientes: (i) conserva por lo menos el 80% de la actividad después de 4 días a 20ºC a un pH del orden de 3,5-8, (ii) conserva por lo menos al 60% de su actividad después de 1 hora a 60ºC en tampón de 100 mM acetato sódico a pH de 5,0, y (iii) posee un punto isoeléctrico determinado por un enfoque isoeléctrico del orden de 3,5-4,5. Específicamente, el polipéptido es uno que comprende por lo menos una secuencia aminoácida seleccionada a partir del grupo formado por SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2 y SEC ID nº: 3, donde Xaa en dichas secuencias es un aminoácido seleccionado a partir del grupo formado por Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.

En la presente memoria, también se da a conocer una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia nucleótida que codifica el polipéptido con actividad lipásica.

En la presente memoria, se hace referencia también a una célula que comprende la molécula de ADN recombinante que es capaz de expresar el polipéptido que posee actividad lipásica.

También se hace referencia en la presente memoria a un procedimiento para la preparación del polipéptido para su utilización según la invención, el cual procedimiento comprende la transformación de una célula huésped con una molécula de ADN recombinante que incluye una secuencia que codifica el polipéptido, siendo capaz dicha célula huésped de expresar la secuencia nucleótida que codifica el polipéptido cuando dicha célula huésped se cultiva transformada, bajo condiciones en las que la secuencia nucleótida se expresa, y se recupera el polipéptido.

Un procedimiento para la preparación de un producto de panadería, el cual producto exhibe una mejora en la homogeneidad del poro y un diámetro de éste reducido, comprende la adición del polipéptido, según la utilización de la invención, a la pasta.

De este modo, la presente invención se refiere a la utilización del polipéptido que presenta actividad lipásica en una pasta, para que un producto de panadería mejore la estabilidad de la red de gluten en ella, o para producir una mejoría en la homogeneidad del poro o reducir el diámetro de éste en el producto de panadería, y una composición que mejore la pasta, que incluye el polipéptido y por lo menos otro componente aditivo convencional de la pasta.

Exposición detallada de la invención

Como se ha mencionado anteriormente, la invención se refiere a la utilización de un polipéptido que posee actividad lipásica. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "lipasa" se utiliza para designar cualquier enzima que hidrolice el triacilglicerol, que incluye los enzimas que son capaces de dividir los ácidos grasos que poseen cadenas cortas, medias y largas. Según la invención, el polipéptido que posee actividad lipásica es el que conserva el 80%, por lo menos, de la actividad, después de 4 días a 20ºC y a un pH del orden de 3,5-8 que incluye un pH del orden de 5-7.

Para que sea útil de modo práctico, es también ventajoso que el polipéptido que debe utilizarse según la invención, posea una buena termotolerancia y una temperatura óptima para su actividad, por lo menos en un grado en el que sea completamente activo en una pasta, por lo menos hasta que la (pasta) que se someta a prueba se caliente en un horno. Preferentemente, la lipasa posee una termoestabilidad que hace que el enzima sea activo durante por lo menos, parte del proceso de cocido. Específicamente, la termoestabilidad del polipéptido se encuentra a un nivel en el que conserva por lo menos el 60% de su actividad, después de 1 hora a 60ºC en un tampón de 100 mM acetato sódico a un pH de 5,0, incluyendo un polipéptido que conserva por lo menos un 80% de su actividad después de 1 hora a 50ºC bajo las mismas condiciones.

En una forma de realización específica, el polipéptido para su utilización según la invención comprende por lo menos una secuencia aminoácida que se muestra en la presente memoria como SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2 y SEC ID nº: 3.

En unas formas de realización ventajosas, el polipéptido para su utilización según la invención, muestra actividad enzimática a un pH del orden de 3,5-8,0, que incluye un pH del orden de 5-7.

El polipéptido para su utilización según la presente invención, posee un punto isoeléctrico determinado mediante enfoque isoeléctrico en el intervalo de 3,5-8,0, tal como el intervalo de 3,8 a 4,2 incluyendo un punto isoeléctrico de 4,0 \pm 0,1.

Una característica muy ventajosa del polipéptido para su utilización según la invención, es su capacidad para hidrolizar galactolípidos tales como galactosil diglicéridos, incluyendo el digalactosil diglicérido y el monogalactosil diglicérido, que se encuentran normalmente en la harina, a los correspondientes galactosil monoglicéridos. Así, se ha encontrado que estos polipéptidos son capaces de hidrolizar por lo menos el 10% de los galactosil diglicéridos que se encuentran en una pasta de harina, a monoglicéridos. Preferentemente, el 15%, por lo menos, de estos diglicéridos, tales como, por lo menos, el 25%, son hidrolizados.

El polipéptido para su utilización según la invención puede estar en forma glicosilada. Sin embargo, se ha encontrado que la actividad enzimática de dicha lipasa glicosilada puede potenciarse mediante desglicosilación. De acuerdo con esto, puede preferirse suministrar el polipéptido de forma no glicosilada. Así, cuando el polipéptido se obtiene a partir de su fuente natural o a partir de una célula huésped recombinante en una forma glicosilada, su actividad puede potenciarse mediante N-desglicosilación mediante, por lo menos, eliminación parcial de fracciones de hidratos de carbono por digestión con un enzima desglicosilante tal como la endo-\beta-N-acetil-glucosamidasa H.

Alternativamente, un polipéptido no glicosilado para su utilización con la invención, es suministrado mediante la modificación de una secuencia de ADN que codifica dicho polipéptido, de modo que se proporcione una secuencia codificante que no codifique aminoácidos o una subsecuencia del polipéptido que proporciona sitios de glicosilación. Como se explicará a continuación, pueden proporcionarse dichas secuencias mutadas que codifican polipéptidos mutantes con actividad lipásica, las cuales, respecto al polipéptido de tipo salvaje, presentan una actividad enzimática aumentada.

El grado de glicosilación del polipéptido obtenido de este modo se refleja en el peso molecular. Como ejemplo, cuando el polipéptido para su utilización según la invención se deriva de Aspergillus tubigensis en una forma glicosilada, posee típicamente un peso molecular determinado mediante filtración en gel utilizando Superose 12 de 32 \pm 1 kDa. Por ionización de desabsorción de láser asistida por una matriz (MALDI Ms), mediante un espectrómetro de masas, el polipéptido para su utilización según la invención, posee típicamente un peso molecular de 31 \pm 1,5 kDa. Se ha encontrado que en este polipéptido glicosilado inicialmente, los oligosacáridos unidos a N, dan cuenta del 10% aproximadamente del polipéptido.

En una forma de realización específica, el polipéptido para su utilización según la invención comprende la secuencia aminoácida que se muestra en la presente memoria como SEC ID nº: 9 o una variante, homólogo o fragmento suyo.

En el contexto presente, los términos "variante" o "fragmento" respecto al polipéptido para su utilización según la presente invención, incluyen cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazamiento, deleción o adición de uno o más aminoácidos de o a la secuencia SEC ID nº: 9, con tal que la secuencia aminoácida resultante posea actividad lipásica, preferentemente, por lo menos, la misma actividad que el polipéptido que se muestra como SEC ID nº: 9.

En particular, el término "homólogo" tal como se utiliza en la presente memoria para incluir polipéptidos con actividad lipásica que, respecto a la secuencia que se muestra como SEC ID nº: 9, tiene una composición o secuencia similar en aminoácidos, permite variaciones secundarias que no tienen un efecto adverso sobre las propiedades enzimáticas y/o la función biológica, o que puede dar lugar a interesantes propiedades y útiles nuevas propiedades o funciones biológicas. El polipéptido homólogo puede provenir de cualquier organismo o puede derivarse también utilizando técnicas de ADN recombinante, por lo que un polipéptido que se encuentra de forma natural se modifica en su secuencia. Preferentemente, un polipéptido homólogo es el que posee una homología, por lo menos, del 75%, más preferentemente, por lo menos, del 85%, y muy preferentemente, por lo menos, del 95%, respecto a la secuencia que se muestra como SEC ID nº: 9.

En otra forma de realización de la invención, el polipéptido forma parte de una proteína de fusión que comprende otras secuencias enzimáticamente activas. Aunque es posible construir dichos polipéptidos quiméricos mediante modificaciones post-traduccionales, se prefiere generalmente proporcionar dichas proteínas de fusión mediante técnicas del ADN recombinante, en los que una célula huésped se transforma con una secuencia de ADN que codifica el producto de fusión y que tiene este producto expresado como una proteína quimérica. Ejemplos de dicha actividad enzimática adicional incluye actividades proteolíticas, amilolíticas y hemicelulolíticas.

Cuando un polipéptido se obtiene a partir de una célula que expresa el gen que codifica el polipéptido, es generalmente en forma de una preparación más o menos en bruto que contiene otras actividades enzimáticas (contaminantes). Según la invención, también es posible proporcionar el polipéptido en una forma sustancialmente pura. Dicho polipéptido purificado puede obtenerse sometiendo una preparación enzimática en bruto a cualquier procedimiento convencional para la purificación de polipéptidos y proteínas.

Según la invención, el polipéptido puede obtenerse a partir de Aspergillus tubigensis, tal como se describe en los ejemplos siguientes. Sin embargo, puede derivarse a partir de cualquier organismo que produzca dicho polipéptido, incluyendo hongos, especies de levaduras, bacterias Gram + y Gram -, células vegetales o animales, incluyendo células humanas.

Tal como se menciona anteriormente, propiedades importantes del polipéptido para su utilización según la invención son su capacidad para reducir el diámetro del poro de la miga y aumentar la homogeneidad de éste. En una forma de realización específica, el polipéptido es el que, cuando se añade a una pasta de pan en una cantidad de 5.000 unidades lipásicas (LUS) por kg de harina, reduce en por lo menos un 10% el diámetro medio del poro de la miga del pan fabricado con la pasta, respecto a un pan que se fabrique a partir de una pasta de pan sin añadir la lipasa. En otra forma de realización, el polipéptido es el que cuando se añade a una pasta de pan en una cantidad de 5.000 LUS por kg de harina, aumenta en por lo menos un 5% la homogeneidad del poro de la miga del pan fabricado a partir de la pasta, respecto a un pan que se fabrique a partir de una pasta de pan sin añadir la lipasa.

Se describe en la presente memoria como referencia a una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia nucleótida que codifica el polipéptido con actividad lipásica tal como se ha dado a conocer anteriormente.

Dicha secuencia nucleótida puede aislarse a partir de una fuente natural o puede construirse tal como se describe con detalle en los ejemplos (que se dan) a continuación, en los que dicha secuencia codificante aislada a partir de Aspergillus tubigensis y a la que se hace referencia como lipA, se describe detalladamente. La secuencia nucleótida puede también ser sintetizada basándose en las secuencias aminoácidas de un polipéptido que se encuentre naturalmente y que exhiba actividad lipásica.

En formas de realización útiles, la molécula de ADN recombinante comprende una secuencia nucleótida que codifica un polipéptido que exhibe actividad lipásica, que incluye por lo menos una de las secuencias aminoácidas que se muestran en la presente memoria como SEC ID nº: 1, SEC ID nº: 2 y SEC ID nº: 3, o una secuencia nucleótida que codifique un polipéptido que muestre actividad lipásica que comprende la secuencia aminoácida que se muestra como SEC ID nº: 9.

En otras formas de realización específicas, la molécula de ADN recombinante comprende por lo menos una de las secuencias SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 6 y SEC ID nº: 7 o por lo menos la secuencia codificante de la secuencia nucleótida que se muestra como SEC ID nº: 8 o una variante, homóloga o fragmento de la misma, o una secuencia complementaria a ella.

En este contexto, los términos "variante" o "fragmento" respecto a la secuencia nucleótida que codifica el polipéptido de la presente invención, incluyen cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazamiento, deleción o adición de uno o más ácidos nucleicos de, o a, la secuencia que proporciona la secuencia nucleótida resultante que codifica un polipéptido que tiene actividad lipásica, preferentemente que presente por lo menos la misma actividad que el polipéptido que se muestra como SEC ID nº: 9.

El término "homólogo" abarca la homología con respecto a la secuencia y/o estructura y/o función, con tal que la secuencia nucleótida resultante codifique un polipéptido que posea actividad lipásica. Respecto a la homología secuencial (es decir, similitud), existe preferentemente una homología por lo menos del 75%, más preferentemente por lo menos, del 85%, y muy preferentemente por lo menos, del 95%, con la secuencia que se muestra como SEC ID nº: 8.

La molécula del ADN recombinante puede comprender una secuencia que codifica un polipéptido según la invención, que no comprende aminoácidos que proporcionen sitios de glicosilación. Dichas útiles moléculas de ADN recombinante pueden seleccionarse a partir de los plásmidos depositados con los números de registro NCIMB 40931, NCIMB 40932, NCIMB 40933, NCIMB 40934, NCIMB 40935.

Una célula que comprende una molécula de ADN recombinante, tal como se ha descrito anteriormente y la cual es capaz de expresar el polipéptido para su utilización según la invención, también se da a conocer en la presente memoria. Dicha célula puede seleccionarse a partir de hongos, especies de levadura, bacterias, células vegetales y animales, incluyendo células humanas. Las células útiles son seleccionadas a partir de hongos filamentosos tales como Aspergillus sp., un Penicillium sp., un Rhizomucor sp., un Mucor sp., un Trichoderma sp que incluye T. reesei, T. viridae y T. longibrachiatum, un Neurospora sp., y un Humicola sp. Especies apropiadas de Aspergillus incluyen A. niger, A. tubigensis, A. oryzae y A. awamori.

Células bacterianas huéspedes útiles incluyen especies Gram negativas tales como por ejemplo E. coli que incluyen la cepa de E. coli que alberga el plásmido pLIP4 depositado con el número de registro No. NCIMB 40863, y especies Gram negativas tales como por ejemplo, especies de Bacillus y especies bacterianas del ácido láctico tales como Lactococcus lactis.

En la presente memoria, se da a conocer un procedimiento para la preparación del polipéptido para su utilización según la invención, mediante la expresión de una secuencia nucleótida capaz de expresar el polipéptido en una célula huésped apropiada, capaz de transformarse. El procedimiento comprende en una primera etapa que una célula apropiada se transforme con la molécula de ADN recombinante anteriormente mencionada, para proporcionar una célula huésped transformada que exprese el polipéptido. Los procedimientos para la transformación de las células huésped procarióticas está bien documentados en la técnica, por ejemplo, véase Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

El término "célula huésped transformada" se utiliza en la presente memoria para incluir cualquier organismo transformable en el que la secuencia nucleótida que codifica el enzima según la presente invención, se ha introducido. La introducción de la secuencia codificante puede llevarse a cabo introduciendo un replicón episómico tal como un plásmido, un bacteriófago o un cósmido en el interior celular. Dichos replicones pueden introducirse ventajosamente en múltiples copias para obtener una expresión aumentada del polipéptido. En ciertos casos, puede ser ventajoso que la secuencia nucleótida se incorpore al genoma del organismo de la célula huésped mediante, por ejemplo, un elemento capaz de transposición o un evento recombinacional.

Un organismo huésped que se prefiere actualmente, para la expresión de la secuencia nucleótida de la presente invención y/o para la preparación del polipéptido de la presente invención, es un organismo del género Aspergillus, tal como Aspergillus niger o Aspergillus tubigensis.

Una cepa transformada de Aspergillus según la presente invención puede, por ejemplo, prepararse según procedimientos descritos por Rambosek y Leach (CRC Crit. Rev. Biotechnol., 1987, 6:357-393), Davis (en:Progress in Industrial Microbiology, Martinelli y Kinghorn (eds), Elsevier Amsterdam, 1994, 29:525-560), Ballance (en: Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Leong y Berka (eds), Marcel Dekker Inc, New York 1991, páginas 1-29) y Turner (en: Progress in Industrial Microbiology, Martinelli y Kinghorn (eds), Elsevier Amsterdam, 1994, 29:641-666).

En otra forma de realización, el procedimiento utiliza una célula huésped de levadura tal como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris. La expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae ha sido revisada por Goody et al. (en: Yeast Biotechnology, Berry et al. (eds), Allen y Unwin, London, 1987, págs 401-429) y por King et al. (en: Molecular and Cell Biology of Yeasts, Walton and Yarronton (eds), Blackie, Glasgow, 1989, págs. 107-133).

Además, la presente invención se refiere a un aspecto particular para la utilización del polipéptido según la invención, con objeto de mejorar la estabilidad de la red de gluten en una pasta de harina y producir una mejoría en la homogeneidad del poro y una reducción en el diámetro de éste para el producto de panadería, fabricado a partir de dicha pasta. Se ha encontrado que el polipéptido posee estos efectos de mejora en una pasta sin grasa.

En este contexto, el término "pasta sin grasa" se utiliza para indicar que no se añaden lípidos o grasas a la pasta de harina. Una harina que se prefiere es la harina de trigo o una harina compuesta, en la que parte de la harina de trigo es reemplazada por almidón, suplementado opcionalmente con proteínas vegetales y aditivos tales como emulsificantes. También se consideran otros tipos de harinas derivadas del arroz, maíz, cebada y centeno.

Así, los ingredientes más importantes de la pasta incluyen harina, preferentemente harina de trigo, agua y una "sustancia que genera gas" tal como la levadura o un agente químico de fermentación. Además de los ingredientes más importantes anteriormente mencionados, la pasta puede incluir ingredientes secundarios tales como sal, azúcar, minerales, vitaminas, condimentos y por lo menos, otro aditivo de la pasta, tal como, por ejemplo, un agente emulsificante, un hidrocoloide, un enzima degradante del almidón o un enzima degradante de la celulosa o de la hemicelulosa.

Durante el mezclado y moldeado de los ingredientes de la pasta para proporcionar una pasta homogénea, la interacción entre el gluten de trigo, el almidón, y el agua, es esencial para la obtención de una pasta con buenas propiedades de manipulación y un producto de panadería satisfactorio fabricado a partir de la pasta.

Se supone generalmente que el almidón y el gluten forman una red estructural que incluye los glicolípidos en forma de fases líquido-cristalinas de estructura lamelar como capas entre proteínas del gluten y el almidón.

La estructura de la miga de un producto de panadería puede evaluarse mediante inspección visual del corte transversal del pan. Sin embargo, un procedimiento más seguro que da lugar a una medición cuantitativa de la estructura de la miga, es mediante análisis de la imagen, utilizando un analizador de imagen, el cual, sobre el corte transversal entero del pan, separa y analiza los poros individuales uno por uno y calcula el diámetro medio del tamaño del poro. El corte transversal completo del pan está caracterizado por la distribución de los poros individuales, por ejemplo, en forma de un histograma. Por homogeneidad se entiende la uniformidad del tamaño del poro, y en este contexto, el término "homogeneidad" se define como el porcentaje de poros que es superior a 0,5 veces e inferior a 2 veces el medio del diámetro del poro. El analizador de imagen calcula asimismo la porosidad, que es la proporción del corte transversal entero del pan que está formada por poros.

Utilizando el análisis de imagen, se ha encontrado que los productos de panadería fabricados a partir de una pasta tal como se definió anteriormente, que incluye una pasta sin grasa suplementada con el polipéptido según la presente invención, alcanzan/obtienen un aumento en la homogeneidad del poro y una reducción en su tamaño, mientras que la porosidad no cambia.

Así, utilizando el polipéptido según la invención, una pasta sin grasa provee productos de panadería con una estructura fortificada de la miga. También se ha encontrado que el aumento en la homogeneidad de poro y la disminución en el tamaño de éste, no se acompaña por una reducción de otras características del pan, tales como su volumen y las propiedades antidegradantes.

Como ya se ha mencionado, la característica más interesante del polipéptido para su utilización según la presente invención, es su capacidad para modificar, mediante hidrólisis de los glicolípidos monogalactosil diglicérido (MGDG) y digalactosil diglicérido (DGDG), a los componentes más polares monogalactosil monoglicérido (MGMG) y digalactosil monoglicérido (DGMG), que son componentes superficiales más activos que MGDG y DGDG.

Sin querer teorizar, se asume que la mejoría en la homogeneidad del poro de la miga del pan, que se obtiene utilizando el polipéptido de la invención en una pasta, está causada por la formación de los glicéridos superficiales más activos MGMG y DGMG, que en combinación con los ácidos grasos liberados en forma ionizada, contribuirán a la formación de fases mesomórficas de estructura lamelar.

Según la invención, la cantidad añadida de polipéptido en la pasta corresponde a una actividad lipásica del orden de 100-30.000 unidades lipásicas (LUS) por kg de harina, tal como del orden de 500-10000 unidades lipásicas (LUS) por kg de harina, incluyendo del orden de 1000-8000 unidades lipásicas (LUS) por kg de harina.

En una interesante forma de realización, la utilización de la invención implica el empleo combinado del polipéptido para su utilización según la invención, y un emulsificante tal como mono- y diglicéridos, ésteres de sorbitano, polisorbatos, ésteres de sacarosa, ésteres de ácido cítrico de mono y diglicéridos, ésteres de poliglicerol de ácidos grasos, propilenglicol monoestearato, ésteres de ácido láctico, lecitinas, mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles y éster diacetilo del ácido tartárico de mono y diglicéridos de ácidos grasos comestibles.

Los ésteres diacetilo del ácido tartárico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles, son bien conocidos en la tecnología del procesamiento alimentario y son ampliamente utilizados en la industria panadera como aditivos de la pasta, para proporcionar la estabilidad de ésta y un aumento del volumen de los productos de panadería. Típicamente, los ésteres diacetilo del ácido tartárico de los mono y diglicéridos se utilizan en una cantidad de hasta el 1% en peso de la harina.

Se ha encontrado que utilizando el polipéptido según la invención en combinación con los ésteres diacetilo del ácido tartárico de los mono y diglicéridos de los ácidos grasos se obtiene todavía una mejoría en la homogeneidad del poro, y además, que una concentración mucho más baja de los ésteres diacetilo del ácido tartárico de los mono y diglicéridos de los ácidos grasos, es necesaria para obtener el mismo volumen de pan.

Según la invención, una cantidad conveniente de ésteres diacetilo del ácido tartárico de mono y diglicéridos de ácidos grasos es del orden de 0,1 al 1,0% en peso de la harina, preferentemente del orden de 0,1 al 0,5% en peso de la harina y muy preferible del orden de 0,1 al 0,4% en peso de la harina.

Los ésteres diacetilo del ácido tartárico de mono y diglicéridos que pueden utilizarse según la invención, están caracterizados por tener un valor de saponificación del orden de 300 a 600, preferentemente un valor de saponificación del orden de 300 a 400, y un valor ácido del orden de 40 a 120, preferentemente un valor ácido del orden de 50 a 100.

Según la descripción anterior de la utilización del polipéptido en una pasta de harina que incluye una pasta sin grasa, la presente invención se refiere en otro aspecto a un procedimiento para la preparación de un producto de panadería que posee una homogeneidad mejorada del poro y un diámetro reducido de éste, a partir de una pasta sin grasa tal como se ha definido anteriormente, que comprende la adición del polipéptido de la invención a la pasta.

En una forma de realización, la utilización de la invención se refiere a un polipéptido que tiene actividad lipásica, la cual tiene la capacidad de aumentar el nivel de etilésteres de ácidos grasos en una pasta de harina en por lo menos el 10%, tal como, por lo menos, el 50%, incluyendo por lo menos el 100%.

Según la utilización de la invención, el polipéptido que tiene actividad lipásica tiene la capacidad de aumentar el índice de gluten en una pasta de harina. De acuerdo con esto, en una forma de realización útil, la utilización de la invención para la preparación de un producto de panadería, comprende la adición a la pasta del polipéptido en una cantidad que proporciona un aumento del índice del gluten de por lo menos un 5%, determinado mediante un aparato Glutomatic 2200 en la pasta, respecto a una en la que el polipéptido no se haya añadido.

Preferentemente, el índice de gluten aumenta por lo menos un 10%, tal como, por lo menos, un 15%, o más preferentemente, en un 20%, por lo menos.

En otra útil forma de realización, la utilización según la invención es una en la que, por lo menos, otro enzima se añade a la pasta. Ejemplos de dichos otros enzimas incluyen hemicelulasas, proteasas, amilasas, oxidoreductasas tales como por ejemplo, hexosa oxidasa y celulasas.

El polipéptido puede añadirse convenientemente a la pasta o a cualquiera de los ingredientes de ésta o a cualquier mezcla de los ingredientes de la pasta, en forma de una composición seca o como una preparación líquida que comprende el polipéptido de la presente invención.

Tal como se ha considerado anteriormente, la cantidad de la actividad polipeptídica es del orden de 100-30000 unidades lipásicas (LUS) por kg de harina, incluyendo del orden de 500-10000 unidades lipásicas (LUS) por kg de harina, tal como del orden de 1000-8000 unidades lipásicas (LUS) por kg de harina.

En una útil forma de realización de la utilización según la invención, el polipéptido se añade a la pasta mezclado con un éster diacetilo del ácido tartárico de mono y diglicéridos de ácidos grasos comestibles.

En otra útil forma de realización de la utilización según la invención, el producto de panadería es pan tostado.

Breve descripción de las figuras

La presente invención se ilustra de forma más completa haciendo referencia a las figuras adjuntas, en las que

la Fig 1 muestra el mapa de restricción del clon genómico del gen lipA,

la Fig 2 muestra la estructura del gen lipA que codifica la lipasa 3,

la Fig 3 muestra un cromatograma de un sobrenadante de un cultivo fraccionado de HIC de un transformante de Aspergillus tubigensis con un aumento de 62 veces de la lipasa 3, y

la Fig 4 muestra un cromatograma de un sobrenadante de un cultivo fraccionado de HIC de una cepa de Aspergillus tubigensis no transformada.

Ejemplos Procedimientos analíticos para la determinación de la actividad lipásica y de la proteína (i) Determinación de la actividad lipásica 1. Ensayo en placa sobre un medio que contiene tributirina

El ensayo se ha modificado de Kouker y Jaeger (Appl. Environ. Microbiol., 1987, 53:211-213).

Un protocolo típico para este ensayo es el siguiente: 100 ml de agar al 2% en 50 mM de tampón fosfato sódico (pH 6,3), se calienta hasta ebullición, y después de enfriar hasta 70ºC aproximadamente bajo agitación, se añaden entonces, igualmente bajo agitación, 5 ml de Rodamina B al 0,2%, más 40 ml de tributirina. La agitación se continúa durante 2 minutos. La mezcla se trata entonces con ultrasonidos durante 1 minuto. Después de otros 2 minutos de agitación, 20 ml de la mezcla de agar se vierten en discos de Petri individuales. En ausencia de actividad lipásica, las placas de agar que contienen tributirina y Rodamina B aparecerán opacas y coloreadas de rosa.

Para cuantificar la actividad lipásica, se perforan orificios con un diámetro de 3 mm en el agar mencionado y se rellenan con 10 \mul de la preparación de lipasa. Las placas se incuban durante tiempos variables a 37ºC. Cuando existe actividad lipásica en la preparación que va a ensayarse, se forma alrededor de los orificios una zona intensa de color rosa/rojizo. Cuando las placas se irradian con luz UV a 350 nm, la actividad lipásica se observa como halos de fluorescencia de color anaranjado.

2. Ensayo modificado del Food Chemical Codex respecto a la actividad lipásica

La actividad lipásica basada en la hidrólisis de la tributirina, se mide según el Food Chemical Codex, Cuarta Edición, National Academy Press, 1996, página 803, con la salvedad de que el pH es 5,5 en vez de 7. Una LUT (unidad de lipásica de tributirina) se define como la cantidad de enzima que puede liberar 2 \mumol de ácido butírico por min, bajo las condiciones del ensayo que se han mencionado.

3. Ensayo del acetato de p-nitrofenilo

La actividad lipásica puede también determinarse colorimétricamente utilizando el acetato de p-nitrofenilo como substrato, utilizando, por ejemplo, el protocolo siguiente: a una placa de microtitulación, se añaden 10 \mul de la muestra o del blanco, seguido de la adición de 250 \mul de substrato (0,5 mg de acetato de p-nitrofenilo por ml de 50 mM de tampón fosfato, pH 6,0). La placa de microtitulación se incuba durante 5 minutos a 30ºC y la absorbancia a 405 nm se lee utilizando un lector de microplaca. 1 unidad se define como 1 \mumol de p-nitrofenol que se ha liberado durante 5 minutos.

4. Ensayo del hexanoato de p-nitrofenilo

La actividad lipásica puede también determinarse utilizando el hexanoato de p-nitrofenilo como substrato. Este ensayo se lleva a cabo añadiendo 10 \mul de una preparación de la muestra o del blanco a una placa de microtitulación, seguido por la adición de 250 \mul de substrato (0,5 mg de hexanoato de p-nitrofenilo por ml de 20 mM de tampón fosfato, pH 6). A esta concentración de substrato, la mezcla reactiva aparecerá como una solución lechosa. La placa de microtitulación se incuba durante 5 minutos a 30ºC y la absorbancia a 405 nm se lee en un lector de microplaca.

5. Ensayo titrimétrico de la actividad lipásica

Alternativamente, la actividad lipásica se determina según el Food Chemical Codex (3º Edición, 1981, pág 492-493), modificado para el aceite de girasol y un pH de 5,5, en vez de aceite de oliva y un pH de 6,5. La actividad lipásica se mide como LUS (unidades lipásicas de girasol) en la que 1 LUS se mide como la cantidad del enzima que puede liberar 1 \mumol de ácidos grasos por minuto a partir de aceite de girasol, bajo las condiciones anteriormente citadas del ensayo.

6. Medición proteica

Durante la purificación de la lipasa, tal como se describe a continuación, la proteína eluída a partir de las columnas se midió determinando la absorbancia a 280 nm. La proteína en las muestras que se unieron, se determinó en placas de microtitulación mediante un procedimiento sensible Bradfor según Bio-Rad Bulletin 1177 EG, 1984). La albúmina sérica bovina se utilizó como un estándar.

Ejemplo 1 Producción, purificación y caracterización de la lipasa 3 1.1. Producción

Se seleccionó una cepa mutante de Aspergillus tubigensis y se utilizó para la producción de lipasa de tipo salvaje. A esta lipasa se hace alusión en la presente memoria como lipasa 3. La cepa se sometió a una fermentación en un fermentador de 750 l que contenía 412,0 kg de agua del grifo, 10,8 kg de harina de soja, 11,1 de monohidrogenofosfato amónico, 4,0 kg de ácido fosfórico (75%), 2,7 kg de sulfato de magnesio, 10,8 kg de aceite de girasol y 1,7 kg de antiespumante 1510. El substrato se calentó y se trató a 121ºC durante 45 minutos. El medio de cultivo se inoculó directamente con 7,5 x 10^{9} esporas de la cepa mutante. La cepa se cultivó durante tres días a 38ºC, controlándose el pH a 6,5, la aireación a 290 l/min y la agitación a 180 rpm los primeros dos días y a 360 rpm el último día. El fermentado se separó utilizando un filtro de tambor y el filtrado del cultivo se concentró 3,8 veces mediante ultrafiltración. El filtrado concentrado se conservó con sorbato potásico (0,1%) y benzoato sódico (0,2%) y se utilizó como un material de partida para la purificación de la lipasa.

1.2. Purificación de la lipasa

Una muestra de 60 ml de fermento (cf 1.1) que contenía 557 LUS/ml, pH 5,5 se filtró en primer lugar a través de un filtro GF/B y a continuación, a través de un filtro de 0,45 \mum. La muestra filtrada se desaló utilizando una columna Superdex G25 SP (430 ml, 22 x 5 cm), y se equilibró en 20 mM trietanolamina, pH 7,3. La velocidad del flujo fue de 5 ml/min. El volumen total después de desalación fue de 150 ml.

La muestra desalada se aplicó sobre una columna de intercambio aniónico Source Q30 (100 ml, 5 x 5 cm) y se equilibró en 20 mM de trietanolamina, pH 7,3. La columna se lavó con tampón de equilibración hasta que se obtuvo un valor basal estable.

La actividad lipásica se eluyó con un gradiente lineal de 420 ml entre 0 y 0,35 M de cloruro sódico en tampón de equilibrio, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Se recuperaron fracciones de 10 ml. Se añadió acetato sódico (100 \mul de una solución 2 M) a cada fracción para ajustar el pH a 5,5. Se reunieron las fracciones 26-32 (70
ml).

Al conjunto de la etapa de intercambio aniónico se añadió sulfato amónico hasta 1 M y la muestra se aplicó a una columna Source Phenyl HIC (20 ml, 10 x 2 cm) equilibrada en 20 mM de acetato sódico (pH 5,5), 1 M de sulfato amónico. La columna se lavó con el tampón de equilibración. La lipasa se eluyó con un gradiente lineal de 320 ml entre 1 M y 0 M de sulfato amónico en 20 mM de acetato sódico (pH 5,5), a una velocidad de flujo de 1,5 ml/min. Se recuperaron fracciones de 7,5 ml.

Las fracciones 33-41 se analizaron mediante SDS-PAGE utilizando un sistema NOVEX con geles prefabricados. Tanto la electroforesis como la tinción argéntica de los geles se llevaron a cabo según el fabricante (Novex, San Diego, USA).(El mismo sistema se utilizó para la electroforesis y el enfoque isoeléctrico nativos). Se encontró que la fracción 40 y la 41 contenían lipasa como única proteína.

1.3. Caracterización de la lipasa purificada (i) Determinación del peso molecular

El peso molecular aparente de la lipasa nativa fue de 37,7 kDa, medido mediante el procedimiento SDS-PAGE anteriormente citado. La lipasa purificada eluyó a un peso molecular de 32,2 kDa a partir de una columna de filtración de gel Superose 12 (50 mM fosfato sódico, 0,2 M cloruro sódico, pH 6,85, flujo de 0,65 ml/min) y es, por tanto, un monómero.

El peso molecular de la lipasa se determinó también por ionización de desabsorción de láser asistida por una matriz (MALDI), mediante un espectrómetro de masas (Voyager BioSpectrometry Workstation, Perspective Biosystems) con un tiempo de trayectoria (TOF). Las muestras se prepararon mezclando 0,7 \mul de una solución desalada de lipasa y 0,7 \mul de una solución matriz que contiene ácido sinápico (ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxi cinnámico) en acetonitrilo al 70% (0,1% TFA, 10 mg/ml). 0,7 \mul de la mezcla de la muestra se situó en la parte superior del extremo de una sonda de acero inoxidable y se dejó secar al aire antes de introducirse en el espectrómetro de masas. Los espectros se obtuvieron a partir de, por lo menos, 100 disparos de láser y se promediaron para obtener una buena señal respecto a la proporción de ruido. Se encontró que el peso molecular para la lipasa era de 30,384 Da y de 30,310 Da mediante dos análisis independientes.

La digestión de la lipasa con endo-\beta-N-acetil-glucosamidasa H (10 \mul) de Streptomyces (Sigma) se llevó a cabo añadiendo 200 \mul de lipasa e incubando a 37ºC durante 2 horas. La mezcla digestiva se desaló utilizando un filtro VSWP y se analizó directamente mediante espectrometría de masas MALDI. Un componente importante de la lipasa desglicosilada dió lugar a un peso molecular de 29,339 Da y de 29,333 Da, mediante dos análisis independientes. También se observó un componente secundario con un peso molecular de 29,508 Da. Estos valores corresponden bien al valor teórico calculado posteriormente de 28,939 Da, basado en la secuencia aminoácida completa de la lipasa madura.

(ii) Determinación del punto isoeléctrico

El punto isoeléctrico (pI) para la lipasa se determinó mediante enfoque isoeléctrico y se encontró que era de 4.1.

Un cálculo del pI basado en la secuencia aminoácida, tal como se determina a continuación y se muestra en la SEC ID nº: 9, dió lugar a un pI estimado de 4,07.

(iii) Determinación de la estabilidad de la temperatura

Tubos de Eppendorf con 25 \mul de lipasa 3 purificada, más 50 \mul de tampón de 100 mM acetato sódico (pH 5,0), se incubaron durante 1 hora en un baño acuoso a respectivamente 30, 40, 50 y 60ºC. Un control se trató de la misma forma, pero se dejó a temperatura ambiente. Después de una hora, la actividad de la lipasa 3 se midió mediante el ensayo del acetato de p-nitrofenilo, tal como se describió anteriormente.

La lipasa purificada presentaba una buena termoestabilidad. Se encontró que la lipasa conservaba el 60% de su actividad después de 1 hora a 60ºC. Un actividad del 80% y del 85% se mantuvo después de 1 hora, a 50ºC y 40ºC, respectivamente.

(iv) Determinación de la estabilidad del pH

Se añadió lipasa 3 purificada (200 \mul) a 5 ml de soluciones de 50 mM de tampón: (fosfato sódico, pH 8,0, 7,0 y 6,0 y acetato sódico, pH 5,0, 4,0 y 3,5). El control se diluyó en 5 ml de 4 mM acetato sódico pH 5,5. Después de cuatro días a 20ºC, la actividad residual se midió mediante el Food Chemical Codex modificado respecto a la actividad lipásica, tal como se ha descrito anteriormente. La lipasa fue muy estable en un pH del orden de 4,0 a 7,0, donde mantenía una actividad del 100% aproximadamente respecto al control (Tabla 1.1). Al pH de 3,5, la lipasa conservaba una actividad del 92%, y a un pH de 8,0., se conservó una actividad residual del 95 % cuando se comparó con el control.

TABLA 1.1. Estabilidad pH de la lipasa 3

1

Ejemplo 2 Secuenciación aminoácida de la lipasa 3

La enzima lipasa purificada se liofilizó y 100 \mug del material liofilizado se disolvieron en 50 \mul de una mezcla de 8 M urea y 0,4 M de hidrogencarbonato amónico, pH 8,4. La proteína disuelta se desnaturalizó y se redujo durante 15 minutos a 50ºC, seguido por un revestimiento con nitrógeno y la adición de 5 \mul de 45 mM ditiotreitol. Después de enfriamiento a temperatura ambiente, se añadieron 5 \mul de 100 mM yodoacetamida para que los residuos de cisteína se derivatizaran durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, bajo nitrógeno.

135 \mul de agua y 5 \mug de endoproteinasa Lys-C en 5 \mul de agua, se añadieron a la mezcla reactiva anterior y la digestión se llevó a cabo a 37ºC bajo nitrógeno durante 24 horas. Los péptidos resultantes se separaron mediante HPLC de fase inversa en una columna VYDAC C18 (0,46 x 15 cm; 10 \mum; The Separation Group, California, USA) utilizando disolvente A: TFA al 0,1% en agua, y disolvente B:TFA al 0,1% en acetonitrilo. Péptidos seleccionados se volvieron a cromatografiar en una columna Develosil C18 (0,46 x 10 cm, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dinamarca) utilizando el mismo sistema disolvente, antes de la secuenciación del extremo N. La secuenciación se realizó utilizando un secuenciador 476A de Applied Biosystems utilizando ciclos rápidos del líquido impulsado, según las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, California, USA).

Para la secuenciación directa del extremo N, la proteína purificada se hizo pasar a través de una columna Brownlee C2 Aquapore (0,46 x 3 cm, 7 \mum, Applied Biosystems, California, USA) utilizando el mismo sistema de disolvente que antes. La secuenciación del extremo N se llevó a cabo entonces tal como se ha descrito anteriormente. Como la proteína no se derivatizó antes de la secuenciación, los residuos de cisteína no pudieron determinarse.

Se encontraron las siguientes secuencias peptídicas:

N-terminal:	Ser-Val-Ser-Thr-Ser-Thr-Leu-Asp-Glu-Leu-Gln-Leu-Phe-Ala-Gln-Trp-Ser-Ala-Ala-Ala-
	Tyr-X-Ser-Asn-Asn (SEC ID nº: 1)
Péptido interno 1:	Val-His-Thr-Gly-Phe-Trp-Lys (SEC ID nº: 2)
Péptido interno 2:	Ala-Trp-Glu-Ser-Ala-Ala-Asp-Glu-Leu-Thr-Ser-Lys-Ile-Lys (SEC ID nº: 3)

No se pudieron purificar más péptidos a partir del fraccionamiento de HPLC, considerando que eran muy hidrofóbicos y por tanto, estaban unidos fuertemente a la columna de fase inversa.

Una investigación que se llevó a cabo en la base de datos SWISS-PROT 31, respecto a las secuencias aminoácidas que presentaban homología con los péptidos anteriores, encontró sólo tres secuencias.

Todos los péptidos anteriores mostraron una escasa homología respecto a las secuencias anteriores conocidas. Especialmente, el péptido interno 2 posee una homología muy escasa respecto a las tres lipasas, LIP-RHIDL, LIP-RHIMI y MDLA-PENCA de Rhizopus delamar(Haas y Berka, Gene, 1991, 109:107-113), Rhizomucor miehei (Boel et al., Lipids, 1988, 23:701-706) y Penicillium camenbertii (Yamaguchi et al., Gene, 1991, 103:61-67; Isobe y Nokihara, Febs, Lett., 1993, 320:101-106) respectivamente. Aunque la homología no fue muy alta, se pudieron posicionar los péptidos lipasa 3 sobre estas secuencias, tal como se muestra a continuación en la Tabla 2.1.

TABLA 2.1. Alineación de los péptidos lipasa 3 con secuencias lipásicas conocidas

2

3

Ejemplo 3 Aislamiento y purificación del ADN genómico de Aspergillus tubigensis

La cepa mutante de Aspergillus tubigensis se hizo crecer en PDB (Difco) durante 72 horas, recuperándose el micelio, congelándose 0,5-1 gramos de éste en nitrógeno líquido y haciéndolos crecer en un mortero. Después de la evaporación del nitrógeno, el micelio que se había desarrollado se mezcló con 15 ml de un tampón de extracción (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, 10 mM \beta-mercaptoetanol) y 1 ml de dodecilsulfato sódico al 20%. La mezcla se mezcló vigorosamente y se incubó a 65ºC durante 10 minutos. Se añadieron 5 ml de 3 M acetato de potasio, (pH 5,1 ajustado con ácido acético glacial) y la mezcla se incubó posteriormente durante 20 minutos en hielo. Los desechos celulares se eliminaron mediante centrifugación durante 20 minutos, a 20000 x g, añadiéndose 10 ml de isopropanol al sobrenadante para precipitar (30 min a -20ºC) el ADN. Después de ulterior centrifugación durante 15 minutos a 20000 x g, el sedimento del ADN se disolvió en 1 ml de TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) y se precipitó otra vez añadiendo 0,1 ml de 3 M NaAc, pH 4,8 y 2,5 ml etanol. Después de centrifugar durante 15 minutos a 20000 x g, el sedimento de ADN se lavó con 1 ml de etanol al 70%, secándose al vacío. Finalmente, el ADN se disolvió en 200 \mul de TE y se conservó a -20ºC.

Ejemplo 4 Generación de un fragmento del gen putativo que codifica la lipasa 3 utilizando PCR

Para obtener un fragmento del gen putativo (al que se hará referencia en el futuro como el gen lipA) como una marca identificativa para aislar el gen completo, se llevó a cabo un procedimiento PCR que se basó sobre la información en las secuencias peptídicas aisladas.

Para la amplificación PCR de un fragmento del gen de la lipasa, se diseñaron iniciadores degenerados, basándose en las secuencias aminoácidas de los péptidos aislados. Se sintetizaron los siguientes tres iniciadores PCR:

C035: TTC CAR AAN CCN GTR TGN AC

\hskip2cm

(SEC ID nº: 4)

mezcla 256 de 20 unidades metaméricas, basada en la secuencia VHTGFWK del péptido 1 (Invertida).

C036: CAR YTN TTY GCN CAR TGG

\hskip2.6cm

(SEC ID nº: 5)

mezcla 256 de 18 unidades metaméricas, basada en la secuencia QLFAQW del extremo N.

C037: GCV GCH SWY TCC CAV GC

\hskip2.9cm

(SEC ID nº: 6)

mezcla 216 de 17 unidades metaméricas, basada en la secuencia AWESAA (Invertida).

Los oligonucleótidos se sintetizaron en un Sintetizador de ADN/ARN de Applied Biosystems, modelo 392. Para reducir el grado de degeneración, en el diseño del iniciador CO37 se excluyeron el raro codon GCA de Ala y el codon TCA de Ser.

Con estos iniciadores, los fragmentos deseados se amplificaron mediante PCR. Utilizando estos iniciadores, se esperaba que se amplificaría un fragmento de 300 pares de bases aproximadamente, teniendo en cuenta que no existen intrones en el fragmento.

Las siguientes reacciones PCR se fijaron en tubos PCR de 0,5 ml para amplificar un fragmento putativo lipA:

0,5 \mug de ADN genómico total,

100 pmol del iniciador CO36,

100 pmol del iniciador CO37,

10 \mul del tampón II de PCR (Perkin Elmer),

6 \mul de 25 mM MgCl_{2},

2 \mul de mezcla de dNTP (10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP, 10 mM de dTTP),

2 unidades de polimerasa Amplitaq (Perkin Elmer), y

agua hasta un volumen total de 100 \mul.

0,5 \mug de ADN genómico total,

100 pmol del iniciador CO35,

100 pmol del iniciador CO36,

10 \mul del tampón II de PCR (Perkin Elmer),

6 \mul de 25 mM MgCl_{2},

2 \mul de mezcla de dNTP (10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP, 10 mM de dTTP),

2 unidades de polimerasa Amplitaq (Perkin Elmer), y

agua hasta un volumen total de 100 \mul.

Las reacciones se llevaron a cabo utilizando el siguiente programa:

94ºC	2 min
94ºC	1 min )
40ºC	1 min )
72ºC	1 min ) Estos tres pasos se repitieron durante 30 ciclos.
72ºC	5 min
5ºC	PONER EN REMOJO

Las amplificaciones PCR se realizaron en un Termociclador PTC-100 de MJ Research Inc.

En la reacción 1, pudieron detectarse tres bandas distintas de 300, 360 y 400 pares de bases respectivamente. Estas bandas se aislaron y clonaron utilizando el equipo del vector-T-Azul-pT7 (Novagene). Los tamaños de este fragmento están de acuerdo con el tamaño esperado, teniendo en cuenta que el fragmento contiene 0, 1 ó 2 intrones, respectivamente.

Los tres fragmentos se secuenciaron utilizando un "equipo Thermo Sekvenase" de secuenciación de ciclos de iniciadores marcados fluorescentemente (Amersham) y se analizaron en un secuenciador ALF (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. El fragmento de alrededor de 360 pares de bases contenía una secuencia que se identificó como una lipasa, y, como contenía la parte del extremo N distal a la secuencia utilizada para el diseño del iniciador, se concluyó que se había obtenido el fragmento génico lipA deseado.

La secuencia del fragmento PCR de 360 pares de bases aproximadamente (SEC ID nº 7) se muestra en la Tabla 4.1 siguiente. La secuencia peptídica utilizada para el diseño del iniciador, está subrayada. La parte restante de la secuencia N-terminal está doblemente subrayada.

TABLA 4.1 Secuencia putativa lipA generada mediante PCR

4

El hallazgo de esta secuencia permitió la identificación plena del fragmento PCR como parte del gen lip. El codon de finalización que se encontró en el marco de lectura, puede estar causado por un PCR o un error de lectura o puede existir un intrón codificado en el fragmento como una señal consenso de finalización y partida del intrón (que se muestra en negritas). Si el intrón putativo se elimina tendrá lugar un cambio en el marco de lectura. Sin embargo, un alineamiento de la secuencia aminoácida deducida y las lipasas fúngicas que se muestran en la Tabla 2.1, sugirieron que el fragmento formaba parte del gen deseado.

Ejemplo 5 Clonación y caracterización del gen lipA (i) Construcción de una genoteca de Aspergillus tubigensis

El ADN genómico del Aspergillus tubigensis se digirió parcialmente con Tsp5091 (New England Biolabs Inc.). 10 \mug del ADN se digirieron en 100 \mul de la mezcla reactiva que contenía 2 unidades Tsp5091. Después de 5, 10, 15 y 20 minutos, se eliminaron 25 \mul de la mezcla reactiva y la digestión se detuvo añadiendo 1 \mul de 0,5 M EDTA, pH 8,0. Después de que las cuatro reacciones se hubieron detenido, las muestras se procesaron sobre un gel de agarosa al 1% en tampón TAE (10 x almacenamiento de TAE, conteniendo por litro: 48,4 g de Trizma base, 11,5 ml de ácido acético glacial, 20 ml de 0,5 M EDTA pH 8,0). Se utilizó ADN del fago lambda digerido con HindIII como marcador del peso molecular (ADN molecular weight marker II, Boehringer, Mannheim). Fragmentos de un tamaño de entre 5 y 10 kb aproximadamente se extrajeron del gel y los fragmentos de ADN se purificaron utilizando el equipo Gene Clean II (Bio- 101 Inc). Los fragmentos purificados se reunieron y 100 ng de los fragmentos que se habían juntado se unieron con 1 \mug de un vector ZAP II defosforilado y digerido con EcoRI (Stratagene) en un volumen total de 5 \mul. 2 \mul de este volumen se empaquetaron con extracto de empaquetamiento Gigapack II (Stratagene) que dió lugar a una genoteca primaria de 650.000 pfu.

Una cepa XL1-Blue-MRF de E. coli (Stratagene) se infectó con 5 x 50000 pfu de la genoteca primaria. Las bacterias infectadas se mezclaron con agarosa "superior" (como en las placas NZY pero con 6 g de agarosa por litro, en vez del agar) y se sembraron sobre placas 5 NZY (13 cm). Después de la incubación a 37ºC durante 7 horas, se añadieron 10 ml de tampón SM (por litro: 5,8 g NaCl, 2,0 g MgCl_{2}.7 H_{2}O, 50 ml de 1 M Tris.HCl pH 7,5., 5,0 ml de gelatina al 2% (peso/vol)) y se incubaron por la noche a temperatura ambiente con una suave agitación. El tampón que contenía los fagos lavados, se recuperó y reunió. Se añadió cloroformo al 5% y después de una mezcla vigorosa, la mezcla se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de centrifugación durante 2 minutos a 10000 x g, la fase superior que contenía la genoteca amplificada se recuperó y se añadió dimetilsulfóxido al 7%. Se recogieron alícuotas de la genoteca en tubos pequeños y se congelaron a -80ºC. La genoteca congelada contenía 2,7 x 10^{9} pfu/ml con alrededor del 6% sin inserciones.

(ii) Rastreo de la genoteca de Aspergillus tubigensis

2 x 50.000 pfu se sembraron en grandes (22 x 22 cm) placas NZY que contienen un medio que comprende por litro: 5 g de NaCl, 2 g de MgSO_{4}.7H_{2}O, 5 g de extracto de levadura, 10 g de hidrolisado de caseína, 15 g de agar, pH ajustado a 7,5 con NaOH. El medio se sometió al autoclave y se enfrió hasta alrededor de 60ºC y se vertió en las placas. Se utilizaron 240 ml de medio por placa.

Las placas NZY inoculadas se incubaron por la noche a 37ºC y se produjeron calvas en las placas. Se produjeron dos calvas para cada placa sobre filtros Hybond N (Amersham). El ADN se fijó utilizando radiación UV durante 3 minutos, y los filtros se hibridizaron, tal como se describe a continuación, utilizando, como sonda, el fragmento PCR anteriormente citado de alrededor de 360 pares de bases, que se marcó con ^{32}p-dCTP utilizando el equipo de marcaje Ready-to- Go (Pharmacia).

Los filtros se prehibridizaron durante una hora a 65ºC en 25 ml de tampón de prehibridización que contenía 6,25 ml de 20 x SSC (0,3 M Na_{3} citrato, 3 M NaCl), 1,25 ml de 100 x solución Denhard, 1,25 ml de SDS al 10% y 16,25 ml de agua. Se añadieron 150 \mul de 10 mg/ml de ADN espermático de salmón al tampón de prehibridización inmediatamente antes de utilizarlo. Después de la prehibridización, el tampón de prehibridización se eliminó y los filtros se hibridizaron durante la noche a 65ºC en 25 ml del tampón de prehibridización con el fragmento PCR marcado radioactivamente.

Al día siguiente los filtros se lavaron según el siguiente procedimiento: 2 x 15 min. con 2 x SSC + SDS al 0,1%, 15 min. con 1 x SSC + SDS al 0,1% y 10 min. con 0,1 x SSC + SDS al 0,1%.

Todos los lavados se realizaron a 65ºC. Las láminas se autoradiografiaron durante 16 horas y se aislaron los clones positivos. Los clones se consideraron positivos sólo si se daba una señal de hibridización en las dos calvas de la placa en cuestión.

Se aislaron siete clones putativos y cuatro se purificaron mediante siembra sobre pequeños discos de Petri, produciéndose calvas, esencialmente tal como se ha descrito anteriormente.

Los clones purificados se convirtieron a plásmidos, utilizando un equipo ExAssist (Stratagene).

Se diseñaron dos iniciadores de secuenciación, basándose en el fragmento PCR de alrededor de 360 pares de bases. Los iniciadores de secuenciación se utilizaron para secuenciar los clones, encontrándose un clon positivo, con el gen lipA que codificaba la lipasa 3. El clon positivo aislado se denominó pLIP4.

(iii) Caracterización del clon pLIP4

Se llevó a cabo un mapa de restricción del clon. El fragmento anterior PCR de 360 pares de bases contenía un sitio SacII y como éste se podía encontrar en el clon genómico, también este sitio facilitaba la construcción del mapa. El mapa de restricción que muestra la estructura de pLIP4 se muestra en la Fig 1. El mapa de restricción muestra que el gen completo se encuentra en el clon. Además, ya que las secuencias del promotor y del finalizador están presentes, se asumió que todas las regiones importantes estaban presentes en el clon.

Una muestra de la cepa DH5\alpha de Escherichia coli que contenía pLIP4 se depositó según el Tratado de Budapest en el National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), en el número 23 de St. Machar Drive, Aberdeen, Escocia, Reino Unido, AB2 1RY, el 24 de febrero de 1997, con el número de registro NCIMB 40863.

El gen se secuenció utilizando la secuenciación en ciclos y la tecnología convencional de secuenciación. La secuencia completa (SED ID NO: 8) se muestra a continuación en la Tabla 5.1. La secuencia se ha determinado, para ambas cadenas, para la región codificante completa y (para) alrededor de 100 pares de bases por encima y por debajo de la región codificante. Las secuencias por debajo de la región codificante se han determinado sólo en una cadena y contienen algunas incertidumbres. En la Tabla 5.1 que se muestra a continuación, las secuencias intrónicas se indican como letras minúsculas y el extremo N y los dos péptidos internos (péptido 1 y péptido 2) están subrayados:

TABLA 5.1 Secuencia de ADN para el gen lipA y las secuencias flanqueantes

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(iv) Análisis de la secuencia del gen completo

Las secuencias peptídicas obtenidas podían encontrarse todas en la secuencia aminoácida que se deduce (véase Tabla 5.1), que confirma otra vez que la secuencia encontrada, es la secuencia del gen de la lipasa 3. El gen se denominó lipA.

La secuencia aminoácida se alineó con las tres lipasas fúngicas utilizadas para alinear las secuencias peptídicas. La alineación se muestra en la Tabla 5.2.

TABLA 5.2 Alineación de la secuencia de la lipasa 3 con lipasas fúngicas conocidas

LIPASA 3

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La alineación anterior muestra que la lipasa 3 es homóloga para las secuencias lipásicas conocidas, pero que la homología no es muy alta. Deleciones o inserciones en la secuencia de la lipasa 3 no se observaron cuando se comparó la secuencia con estas tres lipasas. Esto refuerza la probabilidad de que los intrones putativos se han identificado correctamente.

Una investigación que se llevó a cabo en la base de datos SWISS-PROT 31, no condujo a ulteriores secuencias con una homología más alta que aquella para las lipasas conocidas, que anteriormente se mencionaron. (Tabla 5.3)

La secuencia con la homología más alta es una mono-diacil lipasa de Penicillium camembertii, en la que la identidad que se encuentra es del 42%. Sin embargo, el C terminal de la lipasa 3 se parece a 2 lipasas de Zygomycetes (Rhizopus y Rhizomucor) y no al enzima de P. camembertii.

TABLA 5.3 Alineación de secuencias codificantes del gen lipA y del gen que codifica la mono-diacil lipasa de Penicillium camemberti

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Identidad: 126 aminoácidos (42,42%)

Se ha determinado, mediante secuenciación N-terminal, que el extremo N de la lipasa madura es el residuo de serina nº 28 del precursor de la lipasa 3 (SEC ID nº: 9), tal como se muestra en la Tabla 5.4 a continuación. Por lo tanto, los aminoácidos nº 1 a nº 27 constituyen la secuencia señal.

TABLA 5.4 Secuencia aminoácida del precursor de la lipasa

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Número de residuos: 297.

Los residuos 167-176 se reconocen como un motivo común para las serín lipasas (PROSITE). Se ha examinado la estructura cristalina para la serín lipasa de Rhizomucor miehei y los residuos en el sitio activo identificado (Brady et al., Nature, 1990, 343:767-770; Derewanda et al., J. Mol. Biol., 1992, 227:818-839). Los residuos del sitio activo de la R. miehei lipasa se han conservado en su totalidad en todas las lipasas y corresponden a los residuos siguientes en la lipasa 3: serina 173, ácido aspártico 228 e histidina 285.

La lipasa 3 contiene 7 residuos de cisteína. Cuatro de estos se conservan en la lipasa de P. camembertii donde forman enlaces disulfuro (Isobe y Nokuhara, Gene, 1991, 103:61-67). Esto corresponde a enlaces disulfuro entre el residuo 62 y 67 y el 131 y el 134. Además, dos residuos de cisteína homólogos a dos residuos C que forman otro enlace disulfuro en las lipasas de Rhizopus y Rhizomucor que corresponden a los residuos 49-295.

Dos sitios putativos de N-glicosilación se encontraron en la lipasa 3 en posición 59 y 269. Ninguno de estos se conservan en las otras lipasas fúngicas.

Ejemplo 6 Transformación de Aspergillus tubigensis y sobreexpresión de la lipasa 3 en A. tubigensis

El protocolo para la transformación se basó en las enseñanzas de Buxton et al. (Gene, 1985, 37:207-214), Daboussi et al. (Curr. Genet., 1989, 15:453-456) y Punt y Van den Hondel, (Meth. Enzym., 1992, 216:447-457).

Una cepa multicopia lipA se produjo transformando el plásmido pLIP4 en la cepa 6 M 179 de Aspergillus tubigensis utilizando la cotransformación con un plásmido marcador resistente a la higromicina.

Un procedimiento de rastreo utilizado para visualizar la lipasa fúngica después de un enfoque isoeléctrico de capa ultrafina, se adaptó a rastrear transformantes de Aspergillus tubigensis que habían crecido sobre placas de agar. El rastreo de los productores de lipasa sobre placas de agar se llevó a cabo utilizando aceite de oliva al 2% como substrato para el enzima (lipasa), así como el inductor para el promotor lipásico. Además, las placas contenían un tinte fluorescente, Rodamina B. En presencia del aceite de oliva, los transformantes serán inducidos a secretar lipasa. La lipasa secretada en la placa de agar hidrolizará el aceite de oliva, causando la formación de colonias fluorescentes anaranjadas que serán visibles con radiación UV (350 nm). La aparición de colonias fluorescentes se controló generalmente después de 24 horas de crecimiento. Después de varios días de crecimiento, las cepas productoras de lipasa podían identificarse como cepas fluorescentes anaranjadas que eran visibles a simple vista. Bajo estas condiciones de rastreo de las placas, la cepa no transformada no volvió a mostrar fluorescencia y aparecía como colonias opacas de color rosado.

Dieciséis transformantes que mostraban halos de fluorescencia anaranjada se cultivaron durante 8 días en matraces para agitación que contenían 100 ml de medio mínimo suplementado con aceite de oliva al 1%, extracto de levadura al 0,5%, y casaminoácidos al 0,2%. La cantidad de lipasa secretada se cuantificó aplicando 10 \mul de sobrenadante del cultivo acelular en pocillos taladrados en placas de agar con Rodamina B-aceite de oliva, e incubando las placas por la noche a 37ºC. Se encontraron cinco transformantes con una abundante producción de lipasa.

Los sobrenadantes del cultivo acelular procedentes de los cinco transformantes, se desalaron utilizando columnas NAP 5 (Pharmacia) y se equilibraron en 1 M sulfato amónico (50 mM acetato de sodio, pH 5,5). Los sobrenadantes del cultivo desalados se fraccionaron mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) en una columna Biogel Phenyl-5 PW (Biorad). Se llevó a cabo la elución mediante un gradiente salino descendente de 1 M a 0 M sulfato amónico (20 mM acetato sódico, pH 5,5). Se observó, después de fraccionamiento, un único y discreto pico proteico. El área de los picos de la proteína se calcularon entre los distintos transformantes y se compararon con la cepa no transformada. El mejor transformante mostró un aumento de 62 veces en la cantidad de lipasa después del fraccionamiento mediante HIC.

En la Fig 3, se muestra un cromatograma del sobrenadante del cultivo fraccionado mediante HIC de este transformante, y un cromatograma similar para la cepa no transformada se muestra en la Fig 4.

La fracción que contiene la lipasa transformada se liofilizó. La lipasa transformada se carboximetiló y se sometió a secuenciación aminoácida del N-terminal de los primeros 15 aminoácidos y se encontró que la secuencia de la lipasa recombinante era exactamente la misma que la de la lipasa nativa, indicando una fragmentación correcta de la secuencia señal.

Las distintas fracciones lipásicas recuperadas después de HIC, se separaron sobre un gel SDS Tris-Glicina al 12% y la tinción argéntica reveló una banda proteica, confirmando la homogeneidad de las fracciones. Además, el extracto en bruto mostró una banca lipásica principal como la única banda que se acumulaba en el sobrenadante del cultivo en cantidades considerables cuando el hongo se cultivó en el medio que contenía aceite de oliva.

La lipasa recombinante se analizó mediante ionización de desabsorción de láser asistida por una matriz (MALDI), mediante un espectrómetro de masas con un tiempo de trayectoria (TOF), tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. El peso molecular de la lipasa recombinante fue de 32,237 Da.

La detección de oligosacáridos unidos a N se alcanzó mediante digestión de la lipasa con endo-\beta-N-acetil-glucosamidasa H de Streptomyces (Sigma). La digestión de la lipasa recombinante secretada en el medio de cultivo alteró la movilidad de la banda que se había apreciado en SDS-PAGE, que se trasladó como una banda única con un peso molecular de alrededor de 30 kDa.

La lipasa recombinante desglicosilada que se generó mediante digestión con endoglicosidasa y se analizó directamente mediante espectrometría de masas MALDI, dió lugar a un peso molecular de la estructura polipeptídica de 29,325 Da.

Ejemplo 7 Construcción de mutantes de glicosilación de la lipasa 3

La sobre expresión de la lipasa 3 en la cepa 6 M 179 de A. tubigensis (Ejemplo 6), dió lugar a la sobreglicosilación de la proteína y a la subsiguiente reducción en la actividad enzimática. Con objeto de burlar el problema de la sobreglicosilación y de la pérdida de actividad, se construyeron varios genes lipA mutados. Un modelo molecular para la estructura tridimensional de la lipasa 3 basada en la comparación de las bases de datos con lipasas conocidas y sus estructuras cristalinas resueltas, reveló la topología superficial de los dos sitios putativos de N-glicosilación en la lipasa. Los dos sitios posibles responsables de la glicosilación, son los residuos de asparagina en los lugares N59 y N269. Los 2 residuos de asparagina se cambiaron mediante mutación, bien a un residuo de treonina (T), o a un residuo de glutamina (Q). La mutación a la treonina (N>T) elimina el grupo amida mediante el cual la asparagina es glicosilada, sin alterar el tamaño de la cadena lateral, así como conservando el oxígeno polar. La mutación a la glutamina (N>Q) da lugar a un carbono extra en la cadena lateral y a la retención del grupo amido. Tres mutantes únicos, N59T; N269T; N269Q y dos mutantes dobles, N59TN269T y N59TN269Q, se construyeron, tal como se describe a continuación.

Los iniciadores mutagénicos diseñados para incorporar mutaciones secuenciales específicas se fosforilaron utilizando T4 polinucleótido quinasa, tal como se describe en el Manual del Equipo de Mutagénesis in Vitro M13 de Bio-Rad. La hibridación a la matriz del ADN monocatenario tuvo lugar en 20 mM Tris, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl_{2} en una proporción molar del iniciador a la matriz de 30:1, incubación a 30ºC durante alrededor de 1,5 horas. La síntesis de la segunda cadena se llevó a cabo mediante la T7 ADN polimerasa (0,5 unidades) en una mezcla reactiva que contenía 0,4 mM de cada dNTP, 0,75 mM ATP, 17,5 mM Tris-Cl (pH 7,4), 3,75 mM MgCl_{2}, 21,5 mM DDT y 4 T ADN ligasa (5 unidades) para la unión de la cadena nuevamente sintetizada al extremo 5' de los iniciadores. La reacción se incubó en hielo durante 5 minutos, seguidamente a 25ºC durante 5 minutos y finalmente a 37ºC durante 30 minutos, deteniéndose por la adición de tampón de detención (10 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA) y congelando. Las reacciones se analizaron en un gel de agarosa al 1% en tampón TAE antes de la transformación a células E. coli SURE. Los transformantes se analizaron mediante secuenciación del ADN.

Los transformantes de E. coli SURE que contenían los genes lipA mutados, se depositaron, según el Tratado de Budapest, en el National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), en el número 23 de St. Machar Drive, Aberdeen, Escocia, Reino Unido, AB2 1RY, el 24 de marzo de 1998, con los siguientes números de registro: los tres mutantes únicos N59T: NCIMB 40931; N269T: NCIMB 40932; N269Q:NCIMB 40933 y los dos mutantes dobles, N59TN269T: NCIMB 40934; y N59TN269Q: NCIMB 40935.

Ejemplo 8 Transformación de la cepa 3 M pyrA de Aspergillus tubigensis con mutantes lipA que codifican mutantes de glicosilación de la lipasa 3 y expresión de los genes mutados (i) Procedimiento de transformación

Esporas de la cepa 3 M pyrA de Aspergillus tubigensis se cultivaron durante la noche a 34ºC en un matraz de agitación que contenía medio mínimo suplementado con glucosa al 2% y 10 mM de uridina. Los micelios se recuperaron y se volvieron a suspender en tampón de lisis más enzima de lisis. Los protoplastos producidos se mezclaron con plásmidos que codificaban los distintos mutantes de glicosilación de la lipasa mediante el procedimiento de co-transformación.

(ii) Expresión de los genes lipA que codifican las lipasas mutantes

Los transformantes se rastrearon respecto a la producción de lipasas mutantes. Cultivos puros de los transformantes se propagaron en medio líquido de la siguiente forma: se añadieron esporas con una densidad de 10^{6}/ml y se hicieron crecer a 34ºC durante 5 días bajo agitación a 200 rpm. El medio para el cultivo de los transformantes contenía 100 ml de medio mínimo suplementado con aceite de girasol al 2% (inductor), peptona al 1,5%, 0,2 casamino ácidos y 50 \mug/ml de ampicilina. El filtrado de los cultivos se recuperó cada día y se ensayó en placas de aceite de oliva-rodamina respecto a la actividad lipásica. Las placas de aceite de oliva-rodamina se inspeccionaron respecto a la producción de halos fluorescentes (actividad lipásica), después de una incubación nocturna a 37ºC. Además, se utilizó un ensayo cromogénico utilizando un éster de 1,2-O-dilauril-rac-glicero-3-ácido glutárico-resorufina (Lipase chromogenic substrate, Boehringer Mannheim Biochemica, cat. No. 1179934) para chequear doblemente los filtrados recuperados en los días 2, 3, 4 y 5. La Tabla 8.1 que sigue muestra la actividad lipásica de transformantes seleccionados que expresan distintos genes lipA modificados que codifican la lipasa 3 mutante. La actividad lipásica se midió en el día 5 utilizando el ensayo cromogénico que se acaba de mencionar.

TABLA 8.1 Actividad lipásica de los enzimas lipasa 3 codificados por mutantes de glicosilación del gen lipA

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Además, la actividad lipásica en los filtrados del cultivo de los transformantes S3-4, S4-3 y la cepa 6 M 179 (que expresa la lipasa 3 sobreglicosilada), mostraron un aumento de las actividades lipolíticas (Tabla 8.2) durante la fermentación desde el día 2 al día 5.

TABLA 8.2 Actividad lipásica en los filtrados del cultivo durante la fermentación (ensayo cromogénico medido a 572 nm)

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Ejemplo 9 Fermentación y purificación de la lipasa 3 modificada y de tipo salvaje (i) Fermentación

Esporas (10^{6}/ml) de cepas de Aspergillus tubigensis que expresaban distintos mutantes de glicosilación de la lipasa 3, se utilizaron para inocular matraces de agitación que contenían 200 ml de medio mínimo suplementado con aceite de girasol al 2% (inductor), peptona al 1,5%, casamino ácidos al 0,2% y 50 \mug/ml de ampicilina. Los cultivos se hicieron crecer mediante agitación a 200 rpm durante 4 días a 34ºC. El filtrado del cultivo se separó de los micelios mediante filtración a través de un calibrador de nylon.

(ii) Purificación de la lipasa

Muestras del sobrenadante del cultivo de las fermentaciones S2-6, S3-4, S4-1 y S4-3, respectivamente, se trataron todas de la misma forma. Una muestra de 15 ml se desaló en primer lugar en una columna PD-10 equilibrada en 20 mM trietanolamina, pH 7,3. La muestra desalada se aplicó a un intercambiador aniónico Source Q15 (HR5/5) equilibrado 3n 20 mM de trietanolamina, pH 7,3. Flujo de 1,5 ml/min. La columna se lavó con un tampón de equilibración hasta que se obtuvo un nivel de base estable. La actividad lipásica se eluyó entonces con un gradiente lineal de 30 ml entre 0 y 0,53 M NaCl en tampón de equilibración. Se recuperaron fracciones de 1,5 ml. Las fracciones se rastrearon respecto a la actividad, utilizando el ensayo de placa sobre tributirina tal como se describió anteriormente.

Al conjunto de la actividad lipásica del intercambiador aniónico Source Q15 se le añadió sulfato amónico hasta 1 M y la muestra se aplicó a una columna Source Phenyl HIC (HR5/5) equilibrada en 20 mM de acetato sódico (pH 5,5) y 1 M de sulfato amónico. La columna se lavó con tampón de equilibración. La lipasa se eluyó con un gradiente lineal desde 1 a 0 M de sulfato amónico en 20 mM de acetato sódico (pH 5,5), flujo 1,5 ml/min. Se recuperaron fracciones de 0,75 ml. Las fracciones pico lipásicas eran totalmente homogéneas (una banda) cuando se examinaron mediante SDS-PAGE seguido por una tinción argéntica, tal como se ha descrito anteriormente.

Los cuatro distintos mutantes lipásicos de glicosilación se comportaron de la misma forma durante la purificación.

(iii) Determinación de la actividad específica

La actividad específica se determinó para los cuatro mutantes lipásicos purificados, tanto con respecto a la actividad sobre la tributirina (LUT) tal como se ha descrito anteriormente, como con respecto al aceite de girasol (LUS), también descrito antes. La proteína se determinó tal como se determinó anteriormente. Los resultados se resumen en la Tabla 9.1.

TABLA 9.1 Actividad específica de lipasas mutantes comparada con la lipasa 3 de tipo salvaje y la lipasa 3 sobreglicosilada

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Puede apreciarse que la actividad específica de las lipasas mutantes expresadas en S2-6, S4-1 y S4-3 es el doble de la actividad específica de la lipasa 3 sobreglicosilada cuando se mide (LUS) en el aceite de girasol que contiene ácidos grasos de cadena larga como los lípidos que se encuentran normalmente en la harina y en la pasta. Cuando se miden sobre la tributirina (LUT), las diferencias en la actividad específica son menos pronunciadas. Esto podría explicarse por el hecho de que un posible "oscurecimiento" del sitio activo por la sobreglicosilación, será menos perjudicial si el substrato es pequeño como la tributirina, opuesto a las largas cadenas de los ácidos grasos en el girasol. La actividad específica de la lipasa 3 S3-4 es inferior que la de la lipasa 3 sobreglicosilada (medida sobre el aceite de girasol).

Cuando se ensayan con la prueba LUS, ninguno de los mutantes tiene una actividad específica tan buena como la lipasa 3 del tipo salvaje, pero tal como se muestra en el ejemplo siguiente, la actividad enzimática es superior para los mutantes glicosilados que para la lipasa 3 de tipo salvaje en un sistema de pasta.

(iv) Determinación del peso molecular

El peso molecular aparente de las lipasas mutantes purificadas se determinó procesando las lipasas sobre un gel SDS-PAGE. Los resultados se muestran en la tabla 9.2.

TABLA 9.2 Peso molecular de lipasas de tipo salvaje, sobreglicosiladas y mutantes

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Se aprecia que la lipasa sobreglicosilada da lugar a una molécula de lipasa 3 que posee un peso molecular más grande que la lipasa 3 nativa de tipo salvaje. Eliminando uno de los dos sitios potenciales de N-glicosilación, tal como se lleva a cabo en S2-6 (N269Q) y en 3S-4 (N269T), se obtuvo un peso molecular más bajo, pero que es todavía ligeramente más alto que el de la lipasa-3 de tipo salvaje, indicando una sobreglicosilación en el segundo sitio de glicosilación. Eliminando ambos sitios potenciales de N-glicosilación tal como se realiza en S4-1 y S4-3 (ambos N59T N269Q), se obtiene un peso molecular claramente más bajo que el de la lipasa 3 de tipo salvaje, que está de acuerdo con una falta total de N-glicosilación en este mutante.

(v) Determinación del punto isoeléctrico para los mutantes de la lipasa

Los puntos isoeléctricos para los 4 mutantes de glicosilación de la lipasa se determinaron mediante cromatoenfoque en un intercambiador aniónico Mono P (HR5/5), pH 4,1, para todos los enzimas mutantes. La columna se equilibró en 25 mM bib-tris, pH 6,10. Se generó un gradiente de pH procesando 100% de un politampón 74 al 10% en agua (pH 3,6 con HCl) más betaína al 2,5%, eluyendo esto las lipasas. Flujo de 0,70 ml/min. Se recuperaron fracciones de 0,4 ml.

(vi) Determinación de la estabilidad de la temperatura de la lipasa mutante S4-1

Una muestra de lipasa S4-1 purificada (296 LUT/ml) se diluyó 1:1 con 200 mM NaAc, pH 5,0. Tubos de Eppendorf con 1 ml de esta muestra diluída se incubaron durante 1 hora en un baño acuoso a 30, 40, 50 y 60ºC respectivamente. Se trató un control de la misma forma, pero a la izquierda a la temperatura ambiente. La actividad lipásica restante se determinó mediante el ensayo del acetato de p-nitrofenilo, tal como se describió anteriormente. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 9.3.

TABLA 9.3 Estabilidad de la temperatura de la lipasa mutante (S4-1) comprada con la lipasa de tipo salvaje

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(vii) Determinación de la estabilidad del pH de la lipasa S3-4 mutante

Muestras de 200 \mul de lipasa S3-4 mutante purificada se añadieron a 5 ml de 50 mM de tampón (pH 3,5, 4,0, 5,0 NaAc y tampón fosfato de pH 6,0, 7,0, 8,0). El control se diluyó en 5,0 ml de 4 mM NaAc, pH 5,5. Después de 4 días a 200ºC las muestras se midieron respecto a la actividad residual mediante el ensayo modificado del Food Chemical Codex para la actividad lipásica, tal como se describió anteriormente. La lipasa mutante S3-4 fue muy estable en el intervalo de pH entre 4,0 y 8,0, donde mantuvo una actividad del 88%, cuando se comparó a un control. Los resultados se muestran en las Tabla 9.4.

TABLA 9.4 Estabilidad del pH de la lipasa mutante S3-4

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Ejemplo 10 Experimentos de cocción utilizando la lipasa 3 10.1 Procedimientos de cocción y procedimientos analíticos (i) Procedimiento de cocción para el pan tostado danés

Harina (harina Danesa de reforma) 2000 g, levadura seca 30 g, sal 30 g y agua, que corresponden a 400 unidades Brabender + 3%, se amasaron en un Mezclador Hobart con un garfio durante 2 minutos, a una velocidad baja y 10 minutos a velocidad alta. La temperatura de la pasta después del amasamiento fue de 25ºC. Hubo un tiempo de descanso de 10 minutos, a 30ºC. La pasta se distribuyó, pesando piezas de 750 g y se dejó otra vez reposar durante 5 minutos a 33ºC y 85% RH. Después de moldear en un moldeador Glimik, las pastas se probaron enlatadas durante 50 minutos a 33ºC y se cocieron en un horno Wachtel durante 40 minutos a 220ºC con una inyección de vapor durante 16 segundos. Después de enfriar, el pan se pesó y su volumen se midió mediante el procedimiento del desplazamiento de la semilla de colza. El volumen específico se calcula dividiendo el volumen del pan (ml) por el peso (g) del
mismo.

La miga se evaluó objetivamente utilizando una escala de 1 a 5, en la que 1= toscamente no homogénea y 5= bellamente homogénea.

Tres panes cocidos y enlatados se guardaron a 20ºC y se utilizaron para mediciones de la firmeza y de los poros mediante un Analizador de Imagen.

(ii) Procedimiento de cocido para los bollos daneses

Harina (harina Danesa de reforma) 1500 g, levadura comprimida 90 g, azúcar 24 g, sal 24 g y agua, que corresponden a 400 unidades Brabender - 2%, se amasaron en un Mezclador Hobart con un garfio durante 2 minutos, a una velocidad baja y 9 minutos a velocidad alta. La temperatura de la pasta después del amasamiento fue de 26ºC. La pasta pesó 1350 g. Después de reposar durante 10 minutos, a 30ºC, la pasta se moldeó en un moldeador Fortuna, después de lo cual la pasta se probó enlatadas durante 45 minutos a 34ºC y se coció en un horno Bago durante 18 minutos a 220ºC con una inyección de vapor durante 12 segundos. Después de enfriar, los bollos se pesaron y su volumen se midió mediante el procedimiento del desplazamiento de la semilla de colza. El volumen específico se calcula como anteriormente.

(iii) Determinación de la homogeneidad de los poros

La homogeneidad de los poros del pan se midió mediante un analizador de imagen compuesto de una cámara de vídeo CCD estándar, un digitalizador de vídeo y un ordenador personal con software WinGrain. Para cada pieza de pan, los resultados del diámetro de los poros en mm y de la homogeneidad del poro se calcularon como un medio de las mediciones a partir de 10 rebanadas de pan. La homogeneidad del poro se expresó como el porcentaje de los poros que son mayores que 0,5 veces el medio del diámetro del poro y más pequeños que 2 veces el diámetro
medio.

(iv) Determinación de la firmeza

La firmeza del pan, expresada como N/dm^{2}, se midió mediante un modelo Instron UTM 4301 conectado a un ordenador personal. Las condiciones para la medida de la firmeza del pan fueron:

\newpage

Carga celular	Máx 100 N
Diámetro del émbolo	50 mm
Velocidad de la barra terminal del vástago del émbolo	200 mm/min
Compresión	25%
Grosor de la rebanada de pan	11 mm

El resultado fue un medio de las mediciones sobre 10 rebanadas del pan para cada pieza de pan.

(v) Determinación del índice de gluten

El índice de gluten se midió mediante Glutomatic 2.200, de Perten Instruments (Suecia). Inmediatamente después del ensayo, 15 g de la pasta se pesaron y situaron en el Glutomatic, lavándose con 500 ml de una solución de NaCl al 2% durante 10 minutos. La pasta lavada se transfirió a una Centrífuga del Indice de Gluten 2015, pesándose las dos fracciones de gluten, calculándose el índice de gluten según la ecuación siguiente:

Índice de gluten = (peso del gluten que queda en el tamiz x 100) / peso total del gluten.

(vi) Extracción de lípidos a partir de la pasta

30 g de una pasta que se había ensayado completamente, se congelaron inmediatamente y se liofilizaron. La pasta liofilizada se molió en un molinillo de café y se hizo pasar a través de un filtro de 235 \mum. En un tubo de centrífuga de 50 ml con tapa roscada se introdujeron 4 g de la pasta liofilizada (que se habían pesado), añadiéndose 20 ml de butanol saturado con agua (WSB). El tubo de centrífuga se emplazó en un baño acuoso a una temperatura de 100ºC durante 10 minutos, después de lo cual los tubos se situaron en un Rotamix para proveerles de una rotación a 45 pm durante 20 minutos, a temperatura ambiente. Los tubos se dispusieron otra vez en el baño acuoso durante 10 minutos, y se sometieron a la rotación en el Rotamix durante otros 30 minutos, a temperatura ambiente.

Los tubos se centrifugaron a 10000 x g durante 5 minutos. 10 ml del sobrenadante se pipetearon en un vial y se evaporaron hasta sequedad bajo una cubierta de nitrógeno. Esta muestra se utilizó para análisis HPLC.

Una muestra similar se fraccionó en un Bond Elut Si (Varian 1211-3036). La fracción no polar se eluyó con 10 ml de ciclohexano:isopropanol:ácido acético (55:45:1) y se evaporó hasta sequedad. Esta muestra se utilizó para análisis GLC.

(vii) Análisis HPLC

Columna: LiChrospher 100 DIOL 5 \mum (Merck art. 16152) 250 x 4 mm con una camisa (envoltura) acuosa de una temperatura de 50ºC.

Fases móviles:

A:heptano:isopropanol:n-butanol:tetrahidrofurano:isooctano:agua (64.5:17,5:7:5:5:1)

B:isopropanol:n-butanol:tetrahidrofurano:isooctano:agua (73:7:5:5:10)

Las fases móviles contenían un 1 mmol de ácido trifluoroacético por 1 fase móvil y se ajustaron a pH 6,6 con amoníaco.

Bomba: Waters 510 equipada con un controlador de gradiente.

Gradiente:

	Flujo (ml/min)	Tiempo (min)	A (%)	B (%)
	1,0	0	100	0
	1,0	25	0	100
	1,0	30	0	100
	1,0	35	100	0
	1,0	40	100	0

Detector: CUNOW DDL21 (dispersión evaporatoria de la luz); temperatura 100ºC; voltaje:600 voltios; flujo de aire:6,0 l/min.

Inyector: Hewlett Packard 1050; volumen de inyección: 50 \mul.

\newpage

Las muestras para el análisis se disolvieron en 5 ml de cloroformo: metanol (75:25), se trataron con ultrasonidos durante 10 minutos y se filtraron a través de un filtro de 0,45 \mum.

(viii) Análisis GLC

Cromatógrafo Gaseoso Capilar 8420 Perkin Elmer equipado con una columna de sílice fusionada WCOT de 12,5 x 0,25 mm revestida con 0,1 \mum de una fase estacionaria de fenil-metil-silicona al 5% (CP Sil 8 CB de Crompack).

Transportador: Helio

Inyección: 1,5 \mul con división

Detector: FID 385ºC

Programa del horno:	1	2	3	4
Temperatura del horno, ºC	80	200	240	360
Tiempo isotérmico, min	2	0	0	10
Tasa térmica, ºC/min	20	10	12	- -

Preparación de la muestra: 50 mg de la fracción no polar de los lípidos del trigo se disolvieron en 12 ml de heptano:piridina (2:1) que contenía 2 mg/ml de heptadecano como estándar interno. 500 \mul de la solución se transfirieron a un vial acanalado, añadiéndose 100 \mul de N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida. Se dejó que la mezcla reaccionara durante 15 minutos a 90ºC.

Cálculo: Los factores de respuesta para los mono-, di- y triglicéridos y los ácidos grasos libres se determinaron a partir de las mezclas de referencia de estos componentes. Basándose en estos factores de respuesta, en los lípidos del trigo se calcularon los glicéridos y los ácidos grasos libres.

10.2. Experimentos de cocción con la lipasa 3 en el pan tostado Danés

Se evaluó el efecto de adición de la lipasa 3 a una pasta para obtener pan tostado Danés. El enzima se añadió como una preparación liofilizada sobre maltodextrina, conjuntamente con los otros ingredientes. Los resultados de las pruebas de cocción se muestran en las Tablas 10.1 a 10.4.

TABLA 10.1

17

TABLA 10.2

18

TABLA 10.3

19

TABLA 10.4

20

Mediante la adición de hasta alrededor de 5.000 LUS/kg de harina, de lipasa, no se observaron cambios en el volumen del pan, pero con una dosis más alta de la lipasa 3 existió una tendencia a una pequeña pero no estadísticamente significativa disminución en el volumen (Tabla 10.1).

De los resultados en la Tabla 10.2 se deduce que la lipasa 3 mejoró la homogeneidad de la miga del pan y que el diámetro medio de los poros de la miga se redujo significativamente.

El índice de gluten se correlacionó también claramente con la adición de la lipasa 3, como indicación de un gluten más firme causado por la modificación de los componentes lipídicos del trigo que provocan una mayor estabilidad de la pasta y una estructura más homogénea de los poros del pan. Sin embargo, estas modificaciones parecieron ser óptimas con la adición de 5.000 LUS /kg de harina, de lipasa 3, mientras que una dosis más alta dió lugar a una modificación demasiado intensa del gluten del trigo.

Los resultados de los análisis de GLC y HPLC (Tabla 10.3), demostraron claramente que los triglicéridos en la pasta fueron hidrolizados. Pero, de forma más interesante, se observó también una modificación de los glicolípidos, monogalactosil diglicérido y digalactosil diglicérido. Estos componentes se convirtieron en los componentes más polares monogalactosil monoglicérido y digalactosil monoglicérido. Como el digalactosil monoglicérido es un componente superficial más activo que el digalactosil diglicérido, se asume que este componente contribuye a la mejora observada en la estructura celular y en la homogeneidad de la miga. También se deduce que los fosfolípidos como la fosfatidil colina sólo se modificaron en un grado muy pequeño.

10.3. Experimentos de cocción con la lipasa 3 en los bollos daneses

Se evaluó el efecto de adición de la lipasa 3 a una pasta para obtener bollos daneses. El enzima se añadió como una preparación liofilizada sobre maltodextrina, conjuntamente con los otros ingredientes. Los resultados de las pruebas de cocción se muestran en las Tablas 10.5 a 10.7.

TABLA 10.5

21

TABLA 10.6

22

TABLA 10.7

23

De los resultados que se muestran en la Tabla 10, es obvio que la adición de lipasa 3, no aumentó significativamente el volumen de los bollos. Además, se encontró que la lipasa 3 mejoró la homogeneidad de la miga.

Los análisis GLC y HPLC de los lípidos del trigo, tal como se muestra en las Tablas 10.6 y 10.7, demostraron la modificación de estos lípidos.

Ejemplo 11 Experimentos comparativos de cocción utilizando la lipasa 3 y productos comerciales de ésta

La lipasa se ensayó en los bollos daneses en una prueba comparativa con dos productos de lipasa comercialmente disponibles: NOVOZYM 677 BG (no. 1885) de Novo Nordisk (Dinamarca) y Lipasa A "Amano 6" (no. 1757) de Amano (Japón). Los resultados se resumen en la Tabla 11.1.

TABLA 11.1

24

Es obvio, que a partir de los resultados en la Tabla 11.1 que la lipasa 3 no afecta al volumen de los bollos, mientras un significativo efecto sobre el volumen se observó para los productos enzimáticos comerciales no. 1885 y no. 1757.

Ejemplo 12 Experimentos comparativos que muestran la hidrólisis relativa de los triglicéridos, comparada con la hidrólisis de DGDG

La lipasa 3, la lipasa no. 1885 y la lipasa no.1757 se ensayaron en bollos daneses con el propósito de estudiar la hidrólisis relativa de los triglicéridos, comparada con la hidrólisis del digalactosil diglicérido (DGDG). La pasta que se había ensayado completamente, se liofilizó y se extrajo con n-butanol saturado con agua. Los lípidos extraídos se analizaron mediante GLC y HPLC tal como se ha descrito anteriormente. A partir de los resultados analíticos, se calculó el grado de hidrólisis de los triglicéridos comparado con el del digalactosil diglicérido (DGDG), con distintos niveles de lipasas. Los niveles de lipasa utilizados fueron para el No. 1885: 0, 400 y 800 LUS/kg de harina; para el nº 1757: 0, 1770 y 2360 LUS/kg de harina, y para la lipasa 3: 0, 10.000 y 20.000 LUS/kg de harina. Los resultados se muestran en la Tabla 12.1.

TABLA 12.1

25

A partir de los resultados en la Tabla 12.1, es obvio que la lipasa 3 posee un efecto significativo sobre la hidrólisis del digalactosil diglicérido, mientras que los efectos de las dos lipasas disponibles comercialmente, nº 1757 y nº 1885, son despreciables.

Ejemplo 13 Experimentos de cocción utilizando lipasa 3 en combinación con un éster diacetil del ácido tartárico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos

La lipasa 3 se ensayó en combinación con un éster diacetilo del ácido tartárico de mono- y diglicéridos de ácidos grasos comestibles que tienen un valor de saponificación de 355 y un valor ácido de 60 (PANODAN A2020 DATEM). Los bollos se cocieron después de cuatro distintos tiempos de fermentación, de 45, 65, 85 y 105 minutos. La lipasa 3 se añadió a los ingredientes de la pasta como un polvo liofilizado. La homogeneidad de los poros se evaluó subjetivamente en una escala de 1 a 5, donde 1 = curso no homogéneo y 5 = homogéneo exigente.

Los resultados de los experimentos se muestran en la Tabla 13.1.

TABLA 13.1

26

De la Tabla 13.1 se deduce que la lipasa 3 en combinación con DATEM mejoró la homogeneidad de los poros y se encontró que existía un efecto combinado, lo que significa que es posible utilizar DATEM a una concentración mucho más baja en combinación con la lipasa 3 y obtener todavía el mismo volumen y una miga mejor.

Ejemplo 14 Experimento de cocción con la lipasa 3 en la preparación de bollos daneses con y sin la adición de aceite de soja

El efecto de la lipasa 3 de tipo salvaje purificada se ensayó en la preparación de bollos daneses con y sin la adición de aceite de soja a la pasta. Los bollos cocidos se evaluaron respecto al volumen específico, homogeneidad de los poros de la miga y calidad de la corteza del pan. El volumen específico se midió tal como se ha descrito previamente. La homogeneidad de los poros se evaluó subjetivamente en una escala de 1 a 10, donde 1 = curso no homogéneo y 5 = homogéneo exigente. La calidad de la corteza del pan se evaluó en una escala de 1 a 10, donde 1 = baja calidad y 10 = alta calidad.

Las pastas que se habían ensayado completamente a partir de estas pruebas de cocción, se congelaron y liofilizaron. Las pastas liofilizadas se extrajeron con n-butanol saturado con agua y el contenido de ácidos grasos libres se determinó mediante análisis GLC, tal como también se describió en el Ejemplo 10. Los resultados de los ensayos de cocción y del análisis de los ácidos grasos libres, se resumen en la Tabla 14.1.

TABLA 14.1 Evaluación de la calidad de los bollos y del contenido de ácidos grasos libres en las pastas que se habían ensayado

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A partir del experimento de cocción se deduce que la lipasa 3 mejora la homogeneidad de los poros y la calidad de la corteza, tanto en el pan al que se había añadido aceite como en el que no se había añadido. Añadiendo una gran cantidad de lipasa 3 (13.500 LUT/kg harina), se observó una reducción en el volumen del pan.

Los resultados del análisis de los ácidos grasos libres en la pasta, a partir de estos experimentos de cocción, se muestran también en la Tabla 14.1. De estos resultados se deduce que la lipasa 3 es activa en la pasta, tanto si se añade el aceite como si no se añade. Además, el nivel de los ácidos grasos libres en la pasta fue el mismo en las pastas con y sin aceite.

Ejemplo 15 Formación del éster etílico en la pasta añadiendo lipasa 3

Tal como se muestra en el Ejemplo 14, los ácidos grasos libres se producen cuando la lipasa 3 se añade a la pasta. Durante la fermentación de una pasta de pan, la levadura produce dióxido de carbono y etanol, y el nivel de éste en una pasta se encuentra normalmente en un exceso de 1% al final del ensayo. Cuando la lipasa 3 se encuentra en la pasta, este enzima no sólo cataliza la hidrólisis de los triglicéridos, sino que se encontró sorprendentemente que también se forma el éster etílico de los ácidos grasos.

Los etilésteres del ácido graso constituyen componentes olorosos bien conocidos que se utilizan, por ejemplo, para enmascarar los olores en los alimentos que se basan en las grasas. Experimentos de cocción a los que no se alude en la presente memoria han mostrado que la lipasa que se añade a una pasta es capaz de enmascarar "antiguos" sabores del pan que se producen cuando este pan se fabrica a partir de la harina y se guarda a 35ºC durante 3 meses. Esto podría explicarse por la formación de ésteres etílicos en la pasta.

La cantidad de éster etílico de los ácidos grasos se determinó extrayendo pasta liofilizada con butanol saturado con agua. La fase aislada de grasa se analizó mediante GLC-MS para determinar la identidad y la cantidad de los ésteres etílicos de los ácidos grasos. Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla 15.1.

TABLA 15.1 Contenido de éster etílico de ácidos grasos en la pasta a la que se había añadido lipasa

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Los resultados muestran claramente un aumento en el nivel del éster etílico de los ácidos grasos, cuando se aumentó la dosis de lipasa en la pasta.

Ejemplo 16 El efecto de la lipasa 3 en los pastelillos "esponjados"

El efecto de la lipasa 3 se ensayó en un pastelillo esponjado, fabricado con la siguiente receta y procedimiento:

Azúcar	208 g
Harina	188 g
Almidón de maíz	60 g
Polvo de panadería	14 g
Huevos	200 g
GATODAN 504,
gel de pastelillo
"esponjoso"*	18 g
agua	150 g
Lipasa 3	véase a continuación

* Es un emulsificante formado por glicerol y propilen glicol esterificados con ácidos grasos comestibles (28%), etanol (8%), Grinsted PS 409 (estearato sódico al 25% en glicerol) (6%) y agua (58%).

Todos los ingredientes se mezclaron durante 6 minutos utilizando un mezclador Hobart N 50. La mezcla del pastelillo se pesó 3 x 175 g en recipientes de pastelillos "esponjados", cociéndose durante 35 minutos a 180ºC.

El volumen específico del pastelillo se midió mediante el procedimiento del desplazamiento de la semilla de colza, y la blandura del pastelillo se midió después de guardarlo a 20ºC durante 7 días utilizando un Instron Food Tester.

Los resultados del ensayo de cocción se resumen en la Tabla 16.1.

TABLA 16.1 Volumen específico del pastelillo y blandura después de 7 días de almacenamiento (hPa)

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De los resultados, se infiere que la lipasa 3 mejora la blandura del pastelillo sin cambiar el volumen del mismo.

Ejemplo 17 Experimento de cocción utilizando lipasa 3 y opcionalmente hemicelulasa para la preparación de pan de centeno/trigo

El pan de centeno/trigo se fabricó a partir de una pasta que contenía los siguientes ingredientes: Harina de trigo, 667 g; harina de centeno tamizado, 1333 g; "Back aroma sauer" 40 g; levadura comprimida, 60 g; sal 44 g; agua, 1160 g; lipasa 3, véase a continuación; GRINDAMYL™ H 121 (producto comercial de hemicelulasa de Grindsted Products, Brabrand, Dinamarca).

La pasta se mezcló utilizando un mezclador Kemper durante 2 minutos, a baja velocidad y durante 11 minutos, a alta velocidad. Temperatura de la pasta, 27ºC, tiempo de reposo 30 minutos a 32ºC peso de 800 g, duración del ensayo, 20 minutos, a 32ºC y 85% RH., cocción durante 30 minutos a 230ºC y 10 segundos de (corriente) de vapor.

La viscosidad de la pasta se evaluó utilizando una escala entre 1 y 5, en la que 1 = muy viscoso y 5= normal, sin viscosidad. También se evaluó el volumen específico del pan. Los resultados se muestran en la tabla 17.1.

TABLA 17.1 El efecto de la lipasa 3 sobre la viscosidad y el volumen del pan, con y sin adición de GRINDAMYL™ H 121

30

La adición de Lipasa 3 en combinación con la hemicelulasa al pan de centeno/trigo, mejoró claramente las propiedades de manipulación de la pasta porque ésta se volvió menos viscosa.

Ejemplo 18 Evaluación del efecto de la lipasa 3 producida por transformantes de A. tubigensis, en el sistema de pasta modelo

La lipasa producida por cinco transformantes de A. tubigensis: 161, S2-6, S3-4, S4-1 y 720-4 3 M (véase Tabla 8.1) se ensayó en un sistema de pasta modelo a distintas concentraciones, analizándose la formación de ácidos grasos libres según el siguiente procedimiento:

Se preparó una pasta utilizando los siguientes ingredientes: harina 50 g; levadura seca 0,375 g; NaCl 0,75 g; agua, 28 g, lipasa, véase a continuación. Harina, levadura seca y sal, se mezclaron durante 1 minuto, en un recipiente de mezcla Brabender (50 gramos) La lipasa y el agua se añadieron a la pasta, seguido por la mezcla durante 6 minutos, a 62 rpm. La pasta se transfirió a una cubeta provista de una tapa, fermentándose la pasta durante 60 minutos a 32ºC. La pasta se liofilizó. Esta pasta liofilizada se pulverizó, filtró, y se extrajo con butanol saturado con agua (WSB). WSB se evaporó bajo una corriente de N_{2} y el contenido de los ácidos grasos libres se determinó mediante espectrofotometría según Kwon, D.Y. y J.S. Rhee, 1986, JAOCS 63: 89.

En un primer experimento, la lipasa 3 purificada de tipo salvaje se comparó con el enzima mutante producido por el transformante S3-4 a distintas concentraciones, tal como se muestra en la Tabla 18.1. Los resultados mostraron claramente un aumento en el nivel de ácidos grasos al aumentar el nivel de la dosificación del enzima. Sin embargo, también fue evidente que la lipasa 3 de tipo salvaje, a altas dosis, se estabilizó con unos ácidos grasos al 3 \textperthousand aproximadamente, mientras que la lipasa producida por el transformante S3-4 continuaba produciendo más ácidos grasos al aumentar la dosis de aquélla, hasta que estos ácidos grasos alcanzaron un valor del 5 \textperthousand.

TABLA 18.1 Liberación de ácidos grasos libres en un sistema de pasta modelo

31

Las lipasas producidas por los transformantes 161, S2-6, S4-1 y 720-4 3M también se ensayaron mediante el mismo procedimiento con resultados tal como se muestra en la tabla 18.2.

TABLA 18.2 Liberación de ácidos grasos libres en un sistema de pasta modelo

32

Los resultados demuestran claramente que las cinco distintas lipasas transformantes fueron más activas en la pasta, comparadas con la lipasa 3 de tipo salvaje, a la misma dosis (LUT/kg).

Ejemplo 19 Experimento de cocción utilizando lipasas producidas por S3-4 y S4-1 en la preparación de los bollos daneses

Se llevaron a cabo experimentos de cocción en los que se fabricaron bollos daneses con distintas dosis de lipasa producida por los transformantes S3-4 y S4-1, respectivamente. Después de cocción, se determinó el volumen específico del pan, evaluándose subjetivamente la homogeneidad de la miga, tal como se describió anteriormente. Los resultados de los ensayos de cocción, se muestran en la tabla 19.1.

TABLA 19.1 El efecto sobre la calidad del pan de las lipasas producidas por los transformantes S3-4 y S4-1, respectivamente

33

El aumento de la dosis de ambas lipasas anteriores mejoró la estructura de la miga y produjo un pan con una mejor apariencia y estructura de la corteza. A altas dosis del enzima producido por S3-4, apareció una disminución del volumen del pan y la misma tendencia se observó para la lipasa producida por S4-1 a una dosis más baja.

Se concluye que también estas lipasas mutantes que se han ensayado, mejoraron la estabilidad de la pasta, del pan y de la estructura de la miga, tal como lo hace la lipasa 3 del tipo salvaje.

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(Formulario pasa a página siguiente)

\newpage

OBSERVACIONES REFERENTES A UN MICROORGANISMO DEPOSITADO

(Regla PCT 13bis)

34

44

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: DANISCO A/S

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(B)

CALLE: Langebrogade 1

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(C)

CIUDAD: Copenhagen

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(E)

ESTADO: Denmark

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(F)

CODIGO POSTAL (ZIP): 1001 K

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(G)

TELEFÓNO: +45 32 66 22 00

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(H)

TELEFAX: +45 32 66 21 67

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Clonación y uso del gen de lipasa 3 a partir Aspergillus tubigensis

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 24

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(iv)

MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1,0, versión # 1,30 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO FILAMENTO: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Aspergillus tubigensis

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Val Ser Thr Ser Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ala Gln Trp}

\sac{Ser Ala Ala Ala Tyr Xaa Ser Asn Asn}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO FILAMENTO: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Aspergillus tubigensis

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:

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\sa{Val His Thr Gly Phe Trp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Aspergillus tubigensis

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Trp Glu Ser Ala Ala Asp Glu Leu Thr Ser Lys Ile Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "Oligonucleotido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCCARAANC CNGTRTGNAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "Oligonucleotido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CARYTNTTYG CNCARTGG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "Oligonucleotido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCVGCHSWYT CCCAVGC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 317 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "fragmento PCR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1045 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Aspergillus tubigensis

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: join (1..82, 135...300, 347...683, 737...1045)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: sig_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN:1 ..81

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: join (1..82, 135...300, 347...683, 737...1045)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:

36

37

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 297 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9:

38

39

Claims (8)

1. Utilización de un polipéptido que tiene actividad lipásica, para la preparación de una pasta y/o de un producto de panadería y siendo dicho polipéptido un enzima que hidroliza el triacilglicerol y en la que dicho polipéptido es capaz de dividir los ácidos grasos que presentan cadenas cortas, medias y largas, caracterizada porque dicho polipéptido es capaz de hidrolizar galactolípidos que se encuentran normalmente presentes en la harina a los correspondientes galactosil monoglicéridos; en la que dicho polipéptido es capaz de conservar por lo menos una actividad del 80% después de 4 días a 20ºC y a un pH del orden de 3,5-8; en la que dicho polipéptido es capaz de hidrolizar por lo menos un 10% de los galactosil diglicéridos que se encuentran normalmente presentes en la pasta de harina, a galactosil monoglicéridos, y en la que el enzima proporciona una o más de las características siguientes del producto de panadería: mejora en la homogeneidad de los poros y diámetro reducido de éstos.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho pH es del orden de 5-7.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho polipéptido conserva por lo menos un 60% de su actividad después de 1 hora a 60ºC en un tampón de 100 mM de acetato sódico a pH 5,0, que incluye un polipéptido que conserva por lo menos un 80% de su actividad después de 1 hora a 50ºC bajo las mismas condiciones.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que cuando dicho polipéptido se añade a una pasta de pan en una cantidad de 5.000 unidades lipásicas por kg de harina, el diámetro medio del poro de la miga del pan fabricado a partir de la pasta se reduce en por lo menos un 10%, respecto a un pan que haya sido fabricado a partir de una pasta de pan a la que no se haya añadido la lipasa.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cuando dicho polipéptido se añade a una pasta de pan en una cantidad de 5.000 unidades lipásicas por kg de harina, la homogeneidad del poro de la miga del pan fabricado a partir de la pasta aumenta en por lo menos un 5%, respecto a un pan que se fabricó a partir de una pasta de pan a la que no se añadió la lipasa.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la pasta es una pasta sin grasa.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la pasta y/o el producto de panadería comprenden además un emulsificante.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido es capaz de hidrolizar por lo menos un 25% de los galactosil diglicéridos que se encuentran normalmente en la pasta de harina, a galactosil monoglicéridos.