DK158495B

DK158495B - Fremgangsmaade til fremstilling af fiske- og/eller skaldyrsekstrakter til medicinske formaal

Info

Publication number: DK158495B
Application number: DK217583A
Authority: DK
Inventors: Takashi Takasaki; Mitsunori Iwamoto
Original assignee: Nippon Bussan Kk
Priority date: 1983-03-04
Filing date: 1983-05-16
Publication date: 1990-05-28
Also published as: KR840008589A; GB2136002A; DK217583D0; DE3318130C2; DK217583A; US4584197A; FR2541897A1; DE3318130A1; GB2136002B; KR860002095B1; DK158495C; SU1308183A3; JPS59161319A; FR2541897B1; GB8313358D0; JPH0114885B2

Description

DK 158495B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af farmakologisk virksomme fiske- og/eller skaldyrsektrakter ved enzymatisk nedbrydning af fiske-og/eller skaldyrsproteiner ved hjælp af proteinaser ved 5 forhøjet temperatur, adskillelse af de dannede nedbrydningsprodukter fra oliefasen og remanensen og eventuelt efterfølgende koncentrering. Nærmere angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af fiske- og/eller skaldyrsekstrakter med ernæringsbalancerende virkning, 10 anti-ulcer virkning, insulinlignende virkning, anti-lipæmisk virkning og helbredende virkning på rheumatisme og arthritis.

En af de kendte fremgangsmåder til ekstraktion af fiskekødsekstrakter er beskrevet i japansk patent-15 skrift nr. 31935/1978 svarende til US-patentskrift nr. 4036.993. Ved denne fremgangsmåde opvarmes rå fisk, der ikke er blevet underkastet forbehandling såsom opskæring eller maling til en temperatur på ikke mindre end 60°C efterfulgt af dekomposition ved anvendelse af en 20 alkalimodstandsdygtig proteinase ved 50 til 60°C og ved et pH på 9 til 10, og de dekomponerede produkter nedbrydes derefter yderligere ved anvendelse af en syremodstandsdygtig proteinase efter justering af pH-værdien til pH 5 til 6. Denne kendte fremgangsmåde har imidler-25 tid en ulempe i, at råmaterialets pH-værdi skal justeres til pH 9 til 10 ved tilsætning af en natriumionholdig forbindelse såsom natriumcarbonat for at aktivere den alkalimodstandsdygtige proteinase, hvilket er uheldigt ud fra et fødevaresanitært synspunkt. Endvidere medfører 30 denne kendte fremgangsmåde en besværlig og vanskelig pH-justeringsoperation, eftersom reaktionsproduktet skal justeres til en pH på 5 til 6 inden tilsætningen af den syremodstandsdygtige proteinase. En anden ulempe ved denne kendte fremgangsmåde er, at den alkalimod-35 standsdygtige proteinase ikke fuldstændig deaktiveres mod fortsættelse af dens virkning efter tilsætning af den syremodstandsdygtige proteinase, hvilket gør det 2

DK 158495 B

vanskeligt at fremstille en ekstrakt, der kun indeholder de peptidaminosyrer, der hver har en molekylvægt på i det væsentlige mindre end 3000, og frie aminosyrer.

Det primære formål med opfindelsen er at tilveje-5 bringe en fremgangsmåde til fremstilling af fiske- og/eller skaldyrsekstrakter med farmaceutiske funktioner og i det væsentlige bestående af peptidaminosyrer, hver med en molekylvægt på i det væsentlige mindre end 3000, og frie aminosyrer.

10 Formålet med opfindelsen er endvidere at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af fiske- og/eller skaldyrsekstrakter, ved hvilken en vanskelig pH-justeringsoperation elimineres.

Et yderligere formål med opfindelsen er at til-15 vejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af fiske-og/eller skaldyrsekstrakter med ernæringsbalancerende virkning. Med ernæringsbalancerende virkning menes heri en virkning til forbedring af sundhedstilstanden og undgåelse af sygelige tilstande.

20 Et yderligere formål med opfindelsen er også at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af fiske- og/eller skaldyrsekstrakter med anti-ulcerfunktion.

Et yderligere formål med opfindelsen er at til-25 vejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af fiske-og/eller skaldyrsekstrakter med insulinlignende funktion.

Endvidere er det formålet med opfindelsen at angive en fremgangsmåde til fremstilling af fiske-30 og/eller skaldyrsekstrakter med antilipæmisk funktion.

Formålet med opfindelsen er derudover at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af fiske-og/eller skaldyrsekstrakter med helbredende virkning på rheumatisme og arthritis.

35 Disse og andre formål med opfindelsen vil fremgå af den følgende beskrivelse deraf.

DK 158495B

3

Ifølge opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af farmakologiske virksomme fiske-og/eller skaldyrsektrakter ved enzymatisk nedbrydning af fiske- og/eller skaldyrsproteiner ved hjælp af proteina-5 ser ved forhøjet temperatur, adskillelse af de dannede nedbrydningsprodukter fra oliefasen og remanensen og eventuelt efterfølgende koncentrering, der er ejendommelig ved, at man a) fuldstændigt inaktiverer de autolyseenzymer, 10 der findes i fiskene og/eller skaldyrene, ved opvarmning af hele, rå fisk og/eller skaldyr i 10 min. til 1 time ved en temperatur på mindst 0 75 C, b) nedbryder proteinerne indeholdt i fiskene 15 og/eller skaldyrene ved behandling af fiskene 0 og/eller skaldyrene ved en temperatur pa 50-60 C og en pH-værdi fra 6,0 til 7,0 med en proteinase fra Bacillus subtilis til de foreligger på proteosetrinnet, 20 c) fuldstændigt inaktiverer proteinasen, der stam mer fra Bacillus subtilis, ved forhøjelse af 0 temperturen til mindst 75 C, d) sætter en proteinase dannet af en Koji-skimmels-vamp til de således ud fra fiskene og/eller 25 skaldyrene opnåede proteoser og behandler blan dingen med proteinasen ved en temperatur på 40-50°C og pH-værdi fra 6,0 til 7,0 i 1-3 timer, indtil proteoserne er nedbrudt til peptidamino-syrer med en molekylvægt, der er væsentligt la-30 vere end 3.000 og frie aminosyrer, og e) fuldstændigt inaktiverer proteinasen opnået ud fra Koji-skimmelsvampen ved forhøjelse af 0 temperaturen til mindst 75 C.

Fig. l er et fotografi, der viser lungerne på et 35 fedesvin indgivet en makrelekstrakt fremstillet ved den omhandlede fremgangsmåde samt lungerne på et kontrolfe-

DK 158495 B

4 desvin, der ikke var indgivet ekstrakten.

Fig. 2 er et fotografi, der viser hjertet på et fedesvin indgivet en makrelekstrakt fremstillet ved den omhandlede fremgangsmåde og hjertet på et kontrolfede-5 svin, der ikke var indgivet ekstrakten.

Fig. 3 er et fotografi, der viser leveren på et fedesvin indgivet en makrelekstrakt fremstillet ved den omhandlede fremgangsmåde og leveren på et kontrolfede-svin, der ikke var indgivet ekstrakten.

10 Fig. 4 er et fotografi, der viser en anden op skåret leverprøve fra kontrolfedesvinet i fig. 3.

Fig 5 er et fotografi, der viser maven på en rotte indgivet et makrelekstrakt fremstillet ved den omhandlede fremgangsmåde og maverne på kontrolrotter, der 15 ikke var indgivet ekstrakten.

Fig. 6 er en grafisk fremstilling, der angiver den insulinlignende virkning af en makrelekstrakt fremstillet ved den omhandlede fremgangsmåde og viser mængderne af fra fedtceller afgivne frie fedtsyrer.

20 Fig. 7 er en grafisk fremstilling, der viser hævningsprocenten hos rotter indgivet en makrelekstrakt fremstillet ved den omhandlede fremgangsmåde og hævningsprocenten hos rotter, der ikke var indgivet ekstrakten.

25 Den omhandlede opfindelse beskrives nærmere ne denfor. Opfinderne har undersøgt en fremgangsmåde til fremstilling af fiske- og/eller skaldyrsekstrakter omfattende de trin, at et antal fisk og/eller skaldyr nedbrydes ved et pH på 6,0 til 7,0 og en temperatur på 50 30 til 60°C ved indvirkning fra en proteinase opnået ud fra Bacillus subtilis, at proteinasen opnået ud fra Bacillus subtilis fuldstændigt deaktiveres, og at de fra fiskene og/eller skaldyrene opnåede produkter derefter nedbrydes ved indvirkning af en proteinase opnået ud fra Koj i 35 skimmelsvamp ved et pH på 6,0 til 7,0 og en temperatur på 40 til 50°C i 1 til 3 timer. Som et resultat

DK 158495B

5 har det vist sig, at der ved den ovennævnte fremgangsmåde kan opnås fiske- og/eller skaldyrsekstrakter, der i det væsentlige er sammensat af peptidaminosyrer, hver med en molekylvægt på væsentliget mindre end 3000 5 samt frie aminosyrer, og at de ved den ovennævnte fremgangsmåde fremstillede fiske- og/eller skaldyrsekstrakter har forskellige farmaceutiske funktioner, eftersom hele kroppen af fiskene og/eller skaldyrene inklusiv indre organer nedbrydes ved fremgangsmåden. Det har end-10 videre vist sig, at de fiske- og/eller skaldyrsekstrakter, der fremstilles ved den omhandlede fremgangsmåde, og som har den særlige ovennævnte aminosyresammensæt-ning, nemlig de proteiner, der findes i de rå fisk og/eller skaldyr, nedbrudt til dannelse af en blanding 15 i det væsentlige sammensat af peptidaminosyrer, hver med en molekylvægt på væsentligt mindre end 3000 samt frie aminosyrer, har ernæringsbalancerende virkning, anti-ulcervirkning, insulinlignende virkning, antilipæmisk virkning og en helbredende virkning på rheumatisme og 20 arthritis.

Ved den omhandlede fremgangsmåde anbringes hele rå fisk og/eller skaldyr såsom hestemakrel, makrel, sardin, makrelgedde, tun, Atkamakrel, torsk, ti- og ottearmet blæksprutte, rejer, store rejer, østers, 25 corbicula, korthalsede muslinger, ferskvandsmuslinger med hård skal, "ark shell "-arter og muslingearter i et reaktionskar, uden at de udsættes for nogen forbehandling såsom opskæring eller formaling, til dannelse af en opslemning. Materialer af stor størrelse kan tilskæres 30 til passende dimensioner. Umiddelbart efter anbringelse i reaktionskarret hæves temperaturen af de ifyldte fisk og/eller skaldyr til ikke mindre end 75°C, fortrinsvis ikke mindre end 80 °C for fuldstændig at deaktivere de autolyseenzymer, der findes i de rå fisk og/eller skal-35 dyr og samtidig fjerne den fiskelugt eller dårlige odeur, der udsendes af autolyseprodukterne. Indholdet i 6

DK 158495 B

reaktionskarret kan holdes ved den hævede temperatur i almindelighed fra ca. 10 minutter til ca. 1 time for at deaktivere autolyseenzymerne. Ved den tidligere nævnte kendte fremgangsmåde er den laveste temperatur til de-5 aktivering af autolyseenzymer 60°C. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af fiske- og/eller skaldyrsekstrakter med farmaceutiske funktioner, bør den laveste temperatur til deaktivering af autolyseenzymer imidlertid ikke være mindre end 75°C for at fjerne fi-10 skeagtig lugt eller dårlig odeur fuldstændigt.

Derefter nedbrydes de proteiner, der findes i fiskene og/eller skaldyrene til proteosetrinnet ved en temperatur på fra 50 til 60°C og et pH på 6,0 til 7,0, fortrinsvis 6,0 til 6,5, ved tilsætning af en fra 15 Bacillus subtilis frembragt proteinase. Et foretrukkent enzym, til brug ved dette trin, er et i fiskevæv opløseligt enzym, der fremstilles i Japan af Kinki Yakuruto Manufacturing Co., Ltd. og sælges gennem Yakuruto Biochemistry Co., Ltd., som salgsagent, under varemærket 20 "AROAZE AP-10", og dette enzym anvendes i de følgende eksempler. Varigheden af dette nedbrydningstrin er ikke kritisk og ligger i almindelighed fra 1 til 3 timer, fortrinsvis 1,5 til 2 timer. Ved den omhandlede fremgangsmåde kræves pH-justeringsoperationen ikke, eftersom 25 dette nedbrydningstrin udføres ved et pH på 6,0 til 7.0, der ligger indenfor det neutrale eller svagt sure område, og opsvulmningen af muskelkødet 1 de rå fisk * og/eller skaldyr og dets separering fra benene er ikke nævneværdig i sammenligning med den fremgangsmåde, hvor 30 det første nedbrydningstrin udføres i det alkaliske pH-område. Ved at fortsætte nedbrydningen i det pH-område, der er defineret i kravene, nemlig ved et pH på 6,0 til 7.0, nedbrydes proteinerne fuldstændigt til proteoser uden at der frembringes peptidaminosyrer med lav vægt og 35 frie aminosyrer. Det er væsentligt, at proteinerne fuldstændig nedbrydes til proteosetrinnet i dette trin til 7

DK 158495 B

opnåelse af en blanding, der i det væsentlige består af proteoser, og som er velegnet til at blive nedbrudt ved den enzymatiske nedbrydning i det efterfølgende trin.

Derefter hæves temperaturen af indholdet i reak-5 tionskarret til mindst 75°C, fortrinsvis til en tempe ratur på ikke mindre end 80°C. Under dette trin, ved hvilket indholdet i reaktionskarret holdes ved den hævede temperatur, deaktiveres den med Bacillus subtilis fremstillede proteinase, der anvendtes i det foregående 10 nedbrydningstrin fuldstændigt. Hertil holdes indholdet i reaktionskarret ved deaktiveringstemperaturen i i almindelighed 10 minutter til 1 time, fortrinsvis 15 til 30 minutter. Såfremt dette deaktiveringstrin udelades, fortsætter proteinasen, der anvendtes i det forudgående 15 nedbrydningstrin, dets virkning på indholdet i karret under det efterfølgende enzymatiske nedbrydningstrin, hvilket resulterer i, at det mislykkes at fremstille fiske- og/eller skaldyrsekstrakter indeholdende en særlig sammensætning af aminosyrer og med forskellige far-20 maceutiske funktioner, og formålet med opfindelsen kan ikke opnås.

Det efterfølgende trin i den omhandlede fremgangsmåde er et enzymatisk nedbrydningstrin udført ved en temperatur på 40 til 50°C og et pH på 6,0 til 7,0 ved 25 tilsætning af en med Koji skimmelsvamp fremstillet proteinase. Der er ingen grund til at justere pH-værdien af reaktionskarrets indhold inden dette trin. Et særligt anvendeligt enzym til brug ved dette trin fremstilles i Japan af Kinki Yakuruto Manufacturing Co., Ltd. og sæl-30 ges gennem Yakuruto Biochemistry Co., Ltd., som salgsagent, under varemærket "PUNCHDAZE". Eftersom den med Bacillus subtilis fremstillede proteinase fuldstændig er blevet deaktiveret inden dette trin, indvirker kun den med Koji skimmelsvamp fremstillede proteinase på de i 35 det forudgående nedbrydningstrin fremstillede proteoser til at nedbryde disse til peptidaminosyrer, hver med en 8

DK 158495 B

molekylvægt på væsentligt mindre end 3000 og til frie aminosyrer. Varigheden af dette nedbrydningstrin er fra 1 til 3 timer, fortrinsvis ca. 2 timer. Eftersom nedbrydningstrinnet udføres under mere moderate betin-5 gelser i sammenligning med betingelserne i den tidligere kendte fremgangsmåde, nemlig ved en lavere temperatur indenfor et pH-område i den svagt sure eller neutrale zone, kan der opnås den tilstræbte særlige sammensætning af aminosyrer. Såfremt varigheden af dette nedbryd-10 ningstrin er mindre end 1 time, efterlades dele af pro-teoserne, hvilket resulterer i, at det mislykkes at opnå den tilstræbte særlige sammensætning af aminosyrer. Såfremt tidsrummet for dette nedbrydningstrin overstiger 3 timer, påvirkes produktets farmaceutiske funktioner 15 derimod uheldigt.

Umiddelbart efter nedbrydningstrinnet hæves temperaturen af indholdet i reaktionskarret til ikke mindre end 75°C, fortrinsvis ikke mindre end 80°C for fuldstændig at deaktivere den med Koji skimmelsvamp frem-20 stillede proteinase for at undgå yderligere indvirkning fra proteinasen, der fører til nedbrydning af produktet, og for at undgå, at produktets farmaceutiske funktioner nedsættes.

Nedbrydningsprodukterne separeres derefter ved 25 sædvanlige metoder under anvendelse af en centrifugalseparator eller andre kendte apparater til et fiske-og/eller skaldyrsekstraktlag, et olielag og en rest inkluderende benstykker og ikke nedbrudte materialer.

Fiske- og/eller skaldyrsekstrakten kan derefter filtre-30 res og koncentreres under reduceret tryk ved en temperatur, der ikke er større end 60°C.

De ved den omhandlede fremgangsmåde opnåede fiske- og/eller skaldyrsekstrakter indeholder et antal peptidaminosyrer og frie aminosyrer, inklusiv glutamin, 35 asparaginsyre, lysin, arginin, glycin, alanin, leucin, prolin, histidin, phenylalanin, serin osv. og er i det

DK 158495B

9 væsentlige sammensat af de, der hver har en molekylvægt på væsentligt mindre end 3000. Ifølge den omhandlede opfindelse kan der fremstilles fiske- og/eller skaldyrsekstrakter, der indeholder ca. 30 vægt% vand, mere end 50 5 vægt%, f.eks. ca. 60 vægt% råproteiner, og ikke mere end 1 vægt% råfedtstoffer. De ekstrakter, der fremstilles ved den omhandlede fremgangsmåde, har forskellige farmaceutiske funktioner, som det angives nedenfor i de anførte eksempler.

10 Den omhandlede opfindelse beskrives i detaljer under henvisning til nogle eksempler derpå. I de følgende eksempler angiver vægt% med mindre andet er angivet.

15 Eksempel 1

Fremstilling af fiskeekstrakt 4 tons makrel i form af hele fisk (angivet med 20 Saba i tabellerne og figurerne) anbragtes uden nogen forbehandling i et reaktionkar med en omrører sammen med 4 tons vand, og karrets indhold opvarmedes til 80°C.

Efter 15 minutter sænkedes temperaturen af karrets indhold til 55°C og tilsattes 4 kg proteinase fremstillet 25 af Bacillus subtilis til omsætning ved pH 6,2 i 1,5 time. Derefter hævedes temperaturen af indholdet af karret til 80°C og holdtes ved den temperatur i 15 minutter efterfulgt af afkøling til 45°C, hvor 2 kg med Koji skimmelsvamp fremstillet proteinase tilsattes og 30 holdtes ved den temperatur i 2 timer til omsætning af indholdet ved pH 6,5.

Derefter opvarmedes indholdet i karret igen til 80°C for at deaktivere proteinasen. Reaktionsproduktet separeredes efter en almindelig metode ved anvendelse af 35 en centrifugalseparator i et ekstraktlag, et olielag og en rest indeholdende benstykker og ikke omsatte ma- 10

DK 158495 B

terialer. Ekstraktlaget filtreredes og koncentreredes under reduceret tryk ved 60°C til opnåelse af en makrelekstrakt eller Sabaekstrakt.

Makrelekstrakten analyseredes, hvorved man fandt, 5 at den indeholdt 35,4% vand, 57,4% råproteiner, 0,4% råfedtstoffer, 0,5% carbohydrater og 6,3% askeindhold, og at den havde en brændværdi på 235 kalorier/g. Den chro-matografiske analyse af ekstrakten viste, at molekylvægtene havde tre toppe ved 2500, 1300 og 760, hvilket 10 viste, at molekylvægten af aminosyrekomponenterne var i det væsentlige mindre end 3000. Sammensætningen af grupperede aminosyrer og frie aminosyrer er angivet i tabel I.

15 TABEL I

Grupperede og frie aminosyrer i kompositionen (q/100 g).

Arginin 3,40 Alanin: 3,62

Lysin 4,37 Glycin: 4,37 20 Histidin 2,76 Prolin: 2,53

Phenylanalin 1,44 Glutamin: 7,46

Tyrosin 1,27 Serin: 2,24

Leucin 3,31 Threonin: 2,14

Isoleucin 1,70 Asparaginsyre: 4,43 25 Methionin 1,23 Triptophan: 0,31

Valin_2,38_Systein:_0,27_

Eksempel 2 30 Ernæringsbalancerende virkning

Den i eksempel l fremstillede makrelekstrakt fortyndedes 30 gange med vand og 10 cm3 fortyndet ekstrakt indgaves fedesvin hver dag efter afvænningstiden ved at 35 blande den i føden, og fedesvinene dræbtes efter 6 måneders opfodring og underkastedes sammenligning med fede-

DK 158495B

11 svin, der ikke var indgivet ekstrakten.

Resultaterne af anatomiske observationer er anført i tabel II.

5 10 15 20 25 30 35

DK 158495 B

12

TABEL II

Bedre end lunger på andre 5 fedesvin (uden indgivning

Lungerne af ekstrakten) med klar farve og uden sygeligt _ fokus. (Se note 1)_

Bedre end hjerter fra andre 10 fedesvin (uden indgivning

Hjerte af ekstrakten) med ydervæg ge uden vedhæftet fedt.

___(Se note 2)._

Leverne på fedesvin indgi-15 vet ekstrakten havde ingen

Lever sygelige fokus eller fjer nede dele og havde en smuk _brun farve. (Se note 3)

Kun lidt fedt omgav tarme-20 Tyk- og tyndtarme ne på fedesvine, der havde _ fået ekstrakten._ Kødet på fedsvinene, der var indgivet ekstrakten havde god form og tyk masse 25 vedhæftet passende fedt.

Krop Kødet på fedesvinene ind givet ekstrakten var tæt og havde god struktur og farve med fedt med god 30 _farve._ I sammenligning med almindelige fedesvin (uden ekstraktindgivning) observeredes klare forskelle i, at de mængder fedt, der hæftede til organerne nedsattes, og 35 at der ikke observeredes nogen sygelige eller fjernede dele.

DK 158495B

13

Note i: Fedesvinenes lunger er vist i fotografiet i fig. 1, hvor A viser lungerne på et fedesvin indgivet makrelekstrakten ifølge opfindelsen, og B viser lungerne på et fedesvin uden 5 ekstraktindgivning. Som vist har A en klar far ve og intet sygeligt fokus, hvorimod B har en uklar farve og et sygeligt fokus 1.

Note 2: Fedesvinenes hjerter er vist i fotografiet i

fig. 2, hvor A er hjertet på et fedesvin ind-10 givet makrelekstrakten ifølge opfindelsen, og B

er hjertet på et fedesvin uden indgivning af ekstrakten. Som vist har hjertet A ikke noget vedhæftet fedt, hvorimod hjertet B har en stor mængde fedt 2.

15 Note 3: Fedesvinenes lever er vist i fotografierne i figurerne 3 og 4, hvori leveren A i fig. 3 viser leveren fra et fedesvin indgivet makrelekstrakten ifølge opfindelsen, og B i fig. 3 viser leveren fra et fedesvin uden indgivning af 20 ekstrakten. Leveren A har intet sygeligt fokus, hvorimod leveren B har et sygeligt fokus 3.

Fig. 4 er et fotografi af en opskåret prøve fra fedesvinsleveren vist ved B i fig. 3, hvoraf det ses, at det sygelige fokus 4 strækker sig 25 dybt ind i det indvendige.

Eksempel 3

Anti-ulcusfunktion 30

Ved anvendelse af den i eksempel 1 opnåede makrelekstrakt afprøvedes makrelekstraktens anti-ulcus-funktion under anvendelse Shay Ulcer, der er en af de ulcusdannelsesmodeller, hvor der anvendes rotter. Eks-35 traktdoseringens indflydelse på mavesaftsekretionen afprøvedes med den såkaldte maveportafsnøringsmetode.

DK 158495 B

14

Prøvemetoder: 1) Anti-ulcusfunktion (maveportafsnøringsulcer).

Hankønsrotter af Wistar-familien, hver med en 5 legemsvægt på 150 til 200 g udsattes for faste i 24 timer og derefter afsnøredes maveportområderne, generelt ifølge Shay et al's metode (se note (1)) under etherbe-døvelse.

Efter henstand af rotterne i 12 timer uden til-10 førsel af foder og vand, fjernedes rotternes maver og de ulcera, der hver var udviklet forrest i maveområdet, indikeredes med ulcusindeks ifølge Narumi et al's metode (se note (2)).

De afprøvede rotter var hver blevet tildoseret 15 500 m g/kg makrelekstrakt opløst i vand gennem munden én time inden maveportafsnøringen.

2) Hæmmende virkning på mavesaftsekretionen.

Virkningen bestemtes generelt ifølge Shay et al's 20 metode. Nærmere angivet udsattes hankønsrotter af Wistar-familien (legemsvægt: 150 til 200 g) for faste i 48 timer, og derefter afsnøredes deres maveportområder.

Efter 4 timer opsamledes den mavesaft, der var oplagret i maverne og henholdsvis gastrisk volumen, total syre-25 produktion og dets totale peptiske virkning måltes.

Den totale syreproduktion bestemtes ved titrering med 0,02 N NaOH med phenolphthalein som indikator/ og den totale peptiske virkning bestemtes generelt ifølge Anson metoden (se note (3)) med kasein som basis-30 materialet.

De afprøvede rotter indgaves hver ekstrakten gennem munden 1 time inden maveportafsnøringen.

Note (1): H. Shay, S.A. Kowarov, S.S. Fels, D. Me- ranze, M. Gruentein og M. Siplet, Gastro-35 enterology, 5, 43 (1945) 15

DK 158495 B

Note (2): S. Narumi, T. Hirata, K. Gomaibashi og M.

Kanno, J. Takeda Res. Lab., 29, 85 (1970)

Note (3): M.L. Anson, J. Gen. Physiol., 22, 79 (1938)

Prøveresultater: 5 Detaljer og resultater fra de ovennævnte under søgelser er anført i tabel III.

Til sammenligning er resultater opnået ved indgivelse af Atropinsulfat medtaget. Atropinsulfat er et anæstetikum som hæmmer mavefunktionen. Som vist i Pig.

10 5C udviste maven behandlet med Atropinulfat samme transparens som maven behandlet med sabaekstrakter ifølge opfindelsen (A i fig. 5). Sammenligningen viser således at sabaekstrakten medfører bevarelse af den levende maves transparens.

15

TABEL III

Behandling Kontrol a) Saba Atropin- (p.o. )_ekstrakt sulfat 20 Dosis (mg/kg) - 500 10

Antal rotter 8 88

Ulcusindeks (middel+s.e.) 3,1310,55 2,63+0,46 0,00+0,00*

Gastrisk volumen 25 (ml/100 gl.V.) 4,2410,36 2,7510,50** 0,6210,18***

Totalt syreudbytte (yEq/100 g l.V.) 470,8+42,5 303,9176,1**43,7+17,1***

Total peptisk aktivitet mg som 30 tyrosin/100 g l.v. 217,7+38,2 157,3+43,6 23,6+7,4*** a)0,2% C.M.C. (carboxymethylcellulose) i vand klart forskellig fra kontrolgruppen: *p<0,00l **p<0,05 ***p<0,001

Som det tydeligt fremgår af tabel III bemærkes 35 der betydelige forskelle i hæmningen af gastrisk volumen og total syreproduktion og den hensigt at hæmme dannel-

DK 158495B

16 sen af af ulcus erkendes, når den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede makrelekstrakt indgaves i en mængde på 500 mg/kg. Fig. 5 er et fotografi, der viser maverne fra rotter, der var underkastet de under-5 søgelser, der er beskrevet ovenfor i dette eksempel, hvor A viser maven på en rotte indgivet den ved den omhandlede fremgangsmåde fremstillede makrelekstrakt, B viser maven på en rotte (kontrol) uden indgivning af ekstrakten, og C viser maven på en rotte indgivet atro-10 pinsulfat. Som det fremgår af fig. 5 er de opskårne maver A og C transparente og uden ulcus, hvorimod den opskårne mave B er ulcereret ved stykket 5.

Eksempel 4 15

Insulinlignende funktion

Ved anvendelse af den i eksempel 1 fremstillede makrelekstrakt undersøgtes ekstraktens insulinlignende 20 virkning ved som indeks at anvende makrelekstraktens virkning på adrenalininduceret lipolyse i frie fedtceller.

Prøvemetode: 25

Bitestiklerne på hver rotte udtoges og de ved collagenasebehandling præparerede fedtceller anvendtes til testning ud af den hæmmende virkning på afgivelse af frie fedtsyrer fra fedtcellerne induceret ved lipolyse 30 på grund af tilstedeværelsen af adrenalin. Undersøgelsernes resultater er vist i fig. 6.

Undersøgelsesresultater:

Som vist i fig. 6 isoleredes der 5,5 yEq/ml frie fedtsyrer, såfremt der sattes 1 yg/ml adrenalin til de 35 frie fedtceller. Mængden af isolerede frie fedtsyrer reduceredes til 2,3 yEq/g, når der sattes 1 mIU/ml insulin 17

DK 158495 B

dertil.

Såfremt makrelekstrakten anvendtes i stedet for insulin observeredes der en betydelig hæmmende virkning for isolering af frie fedtsyrer, når koncentrationen af 5 makrelekstrakten i det undersøgte system hævedes til 500 yg/ml.

Det bemærkes ud fra de i fig. 6 angivne resultater, der er beskrevet ovenfor, at den ved den omhandlede fremgangsmåde fremstillede makrelekstrakt har en insu-10 linlignende funktion og kan anvendes som en virkningsfuld medicin til helbredelse af diabetes.

Eksempel 5 15 Cholesterolsænkende virkning

Den farmaceutiske aktivitet af den i eksempel 1 fremstillede makrelekstrakt til sænkning af cholesterolindholdet i blod eller til helbreldelse af 20 mindre leverdefekter i tilfælde med fodring med meget fedtrig kost eller foder undersøgtes.

Undersøgelsesmetode: 25 En salatolie opvarmedes ved 170 til 180°C i 2 timer, mens oxygen bobledes gennem, hvorved der dannedes peroxiderede fedtstoffer. Der fremstilledes en foderblanding ved blanding af pulveriseret fodermateriale indeholdende natriumcholesterolcholat med salatolien, der 30 indeholdt de peroxiderede fedtstoffer, og foderblandingen blev givet til en gruppe rotter. Efter 5 uger blev rotterne syge af for meget cholesterol og lette lever-defekter.

En gruppe rotter indoseredes makrelekstrakten for 35 at finde ekstraktens cholesterolsænkende virkning hæma-tologisk. Rotternes indre organer observeredes ud fra et

DK 158495B

18 patologisk-morfologisk synspunkt. Ekstrakten indgaves hver rotte en gang om dagen gennem munden. Undersøgelsesresultater:

Detaljer og resultater fra undersøgelsen er vist 5 i tabellerne 4 og 5. Værdierne opnåedes som middelværdier + standardafvigelsen ved testning af syv rotter.

Som det fremgår af tabellerne 4 og 5 erkendes der en signifikant virkning til reduktion af indholdet af de frie fedtsyrer, der fås fra neutrale fedtstoffer, 10 der er tegn på sygdom pga. for højt cholesterolindhold, såfremt der tilsættes 500 mg/kg makrelekstrakt. Også GOT-værdien (GOT = aspartataminotransaminase) viser for den gruppe, der var indgivet ekstrakten, en signifikant reduktion, GOT-værdien indikerer leversygdomme.

15 Ved sammenligning af kontrolværdien på 359+58 for tests, hvor Sabaekstrakt ikke tilførtes, med værdien 398+68 ses det, at denne sidste ligger indenfor standardafvigelsen.

Det samme kan siges om værdierne 56+4 og 56+2, hvorfor det ikke kan fastslås, at ekstrakterne har virkninger på 20 LDH og cholesterolindhold. Heller ingen af de øvrige testværdier viser signifikante forskelle.

Den patologisk-morfologiske observation af leverne afslørede, at de grupper, der var fodret med peroxideret salatolie, havde et antal døde celler, og at antallet af 25 døde celler i rotterne fra den gruppe, der er doseret med makrelekstrakten var nedsat.

30 35 19

TABEL IV

DK 158495 B

Virkning af Saba-ekstraktion på peroxidation af salatolie._ 5

Behandling (p.o.) Normal Kontrol Saba-ekst. Saba-ekst.

Dosis (mg/kg) 200 500 10 Antal • rotter 777 7 GOT 88±5 93±6 94±2 8113* GPT 2612 3915 3813 3313 ALP 13,211,0 19,211,8 17,611,6 18,310,9 15 LDH 252165 359158 398168 316156

Total bilirubin 0,310 0,310 0,310 0,310

Direkte bilirubin 0,110 0,110 0,110 0,110 20 Cholesterol 4013_5513_5614_5612_ *Signifikant forskellig fra kontrolgruppen: p<0,05 GPT = Alaninaminotransferase ALP = Alkalisk phosphatase LDH = Lactatdehydrogenase 25 30 35 i

DK 158495B

20

TABEL V

Virkning af Saba-ekstrakt på peroxidation af salatolie 5 Behandling (p.o.) Normal Kontrol Saba-ekst. Saba-ekst.

Dosis (mg/kg) 200 500

Antal 10 rotter 7 7 7 7

Tri- glycerid 28+4 26+6 23+4 11+2

Total protein 6,910,1 6,910,1 7,110,1 7,110,1 15 Alb. 3,2±0 3,110 3,210,1 3,1+0 A/G- forhold 0,8410,01 0,8110,01 0,8210,02 0,7710,02 P.P.A. 446129 578145 516144 480129* β-lipo- 20 protein 7815 10716 10718 10814 HDL 4012 3312 3812 3512

Peroxidation_8,910,4 10,310,6 10,010,3 10,310,8 *Signifikant forskellig fra kontrolgruppen: p<0,05.

25 A/G = forholdet mellem indholdet af albumin og globulin FFA = frie fedtsyrer

Eksempel 6 30 Helbredende virkning på rheumatisme og arthritis.

Ved anvendelse af den i eksempel 1 fremstillede makrelekstrakt undersøgtes dens farmaceutiske virkning på Adjuvans Arthritis, der er et modelforsøg for in-35 flammation, herunder rheumatisme og arthritis.

Undersøgelsesmetode: 21

DK 158495 B

Undersøgelsen udførtes generelt efter Sele-meto den. Ved anvendelse af rotter med hver en legemsvægt på 140 til 160 g injiceredes 0,05 ml blanding af steriliserede kimlegemer af Mycobakterium butyricum (DIPCO) i 5 Bayol blandet i et forhold på 10 mg/ml subkutant i højre pote på hver rotte og 0,05 ml af den samme blanding in-j iceredes subkutant i halen på hver rotte. Hævningsprocenten opnåedes ved at måle rumfanget af det ødem, der fremkom på poten og halen på hver rotte. Resultaterne er 10 vist i fig. 7.

Efter 1 måneds forløb udtoges blodet fra hver rotte fra hjertet og underkastedes hæmologisk undersøgelse. Nedbrydning af knoglerne på begge ben observeredes ved hjælp af røntgenfotografi. Ekstrakten indgaves 15 hver rotte i den undersøgte gruppe en gang om dagen gennem munden. Resultaterne af målingerne er anført i tabellerne vi og vil.

Undersøgelsesresultater: 20

Ved den subkutane injektion fik det højre bagben en primær inflammation med en topinflammation på den 5. dag efter injektionen, og en sekundær inflammation begyndende fra den 15. dag fra injektionen. Den inflamma-25 tion, der begyndte fra den 15. dag fra injektionen dæmpedes ved tilsætning af 500 mg/kg makrelekstrakt (jvf. fig. 7).

Undersøgelsen af røntgenfotografierne afslørede, at ødemets hævning også dæmpedes.

30 Det fremgår af tabel 6 og 7, at albuminindholdet og indholdet af total protein i blodet er reduceret i grupperne, der har fået indgivet ekstrakten ifølge opfindelsen, i forholdet til kontrolgruppen. Der ses ikke signifikante forskelle for de øvrige værdier.

35 22

TABEL VI

DK 158495B

_Virkning af Saba-ekst. på serum hos rotter_

Behandling Dosis Antal GOT GPT ALP

5 (p.o)_(mg/kg) rotter_

Normal 7 126±7 30±3 23,0+2,5

Kontrol 10 118+6 23+3 23,1+2,8

Saba-ekst. 200 10 11715 23+2 19,3+1,8

Saba-ekst. 500 10 127112 29+7 19,5+2,7 10 Phenylbutazon 50 7 11816 2212 16,410,5 TABEL VI (fortsat) 15 Behandling Dosis Antal Urinstof Cu (p.o)_(mg/kg) rotter_N_

Normal 7 20+2 152+13

Kontrol 10 2512 207111

Saba-ekst. 200 10 22+1 214110 20 Saba-ekst. 500 10 25+3 21717

Phenylbutazon 50 7 19+2 193+22

TABEL VII

25 Virkning på Saba ekst. på serum hos Adjuvansrotter_

Behandling Dosis Antal Alb. c^-G a2~G

(p.o)_(mg/kg) rotter_

Normal 7 2,59+0,2 0,8410,07 0,3910,03

Kontrol 10 2,08+0,08 1,3710,06 0,37+0,06 30 Saba ekst. 200 10 2,07+0,16 1,0910,06 0,50+0,04

Saba ekst. 500 10 1,85+0,18 1,2810,10 0,4710,06

Phenylbutazon 50_7 2,62+0,22 0,9410,14 0,43+0,04 35 23

DK 158495 B

TABEL VII (fortsat)

Behandling Dosis Antal β-G y-G

(p.o)_(mq/kq) rotter__ 5 Normal 7 0,8310,1 0,8710,1

Kontrol 10 0,88+0,09 1,07+0,14

Saba ekst. 200 10 0,89+0,04 0,94+0,09

Saba ekst. 500 10 0,95+0,05 0,79+0,04

Phenylbutazon 50_7_0,8810,05 0,8810,11 10 TABEL_VII (fortsat)

Behandling Dosis Antal T.P A/G

(p.o)_(mq/kg) rotter_ 15 Normal 7 5,810,2 0,85+0,1

Kontrol 10 5,810,1 0,56+0,03

Saba ekst. 200 10 5,710,2 0,61+0,06

Saba ekst. 500 10 5,410,2 0,5410,07

Phenylbutazon 50_7_5,8+0,2_0,8610,13 20 p.o. = per oralt Alb. = albumin T.P. = total protein.

25 30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af farmakologisk virksomme fiske- og/eller skaldyrsektrakter ved enzymatisk nedbrydning af fiske- og/eller skaldyrs-5 proteiner ved hjælp af proteinaser ved forhøjet temperatur, adskillelse af de dannede nedbrydningsprodukter fra oliefasen og remanensen og eventuelt efterfølgende koncentrering, kendetegnet ved, at man 10 a) fuldstændigt inaktiverer de autolyseenzymer, der findes i fiskene og/eller skaldyrene, ved opvarmning af hele, rå fisk og/eller skaldyr i 10 min. til 1 time ved en temperatur på mindst 0

75 C, 15 b) nedbryder proteinerne indeholdt i fiskene og/eller skaldyrene ved behandling af fiskene og/eller skaldyrene ved en temperatur på 50-60°C og en pH-værdi fra 6,0 til 7,0 med en proteinase fra Bacillus subtilis til de foreligger på 2 0 proteosetrinnet, c) fuldstændigt inaktiverer proteinasen, der stammer fra Bacillus subtilis, ved at hæve tempera- 0 turen til mindst 75 C, d) sætter en proteinase dannet af en Koji skimmel- 25 svamp til de således ud fra fiskene og/eller skaldyrene opnåede proteoser og behandler blandingen med proteinasen ved en temperatur på 40-50 C og pH-værdi fra 6,0 til 7,0 i 1-3 timer, indtil proteoserne er nedbrudt til peptidamino-30 syrer med en molekylvægt, der er væsentligt lave re end 3.000 og frie aminosyrer, og e) fuldstændigt inaktiverer proteinasen opnået ud fra Koji-skimmelsvampen ved forhøjelse af 0 temperaturen til mindst 75 C.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende- 0 tegnet ved, at temperaturen er mindst 80 C DK 158495 B under trin a).

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at pH-værdien er fra 6,0 til 6,5 i trin b).

4. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af krave ne l til 3, kendetegnet ved, at nedbrydningen af fiskene og/eller skaldyrene i trin b) sker i et tidsrum på 1 til 3 timer.

5. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af 10 kravene 1 til 4, kendetegnet ved, at inaktiveringen i trin c) udføres ved opvarmning til en temperatur på mindst 80° C i 10 minutter til 1 time.

6. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af 15 kravene 1 til 5, kendetegnet ved, at fiskene og/eller skaldyrene vælges fra gruppen bestående af hestemakrel, makrel, sardin, makrelgedde, tun, Atka-makrel, torsk, tiarmet blæksplutte, ottearmet blæksprutte, rejer, store rejer, østers, corbicula, kort-20 halsede muslinger, ferskvandsmuslinger med hård skal, "ark shell"-arter, muslingearter samt blandinger deraf. 30 35