DK160436B - Immobiliseret vanduoploeselig lactase - Google Patents

Description

i

O

DK 160436 B

Den foreliggende opfindelse angår en vand--uopløselig immobiliseret lactase. Mere specielt angår opfindelsen en stabil og vand-uopløselig immobi-liseret lactase med høj'lactosehydrolyserende aktivitet, 5 som kan fremstilles ved immobilisering af en lactase hidrørende fra Aspergillus oryzae på en makroporøs, amfoter phenol-formaldehyd ionbytterharpiks.

Når et enzym, som per se er katalysator for en reaktion i en homogen vandig opløsning, immobiliseres, bli-10 ver det muligt at anvende det gentagne gange og kontinuerligt. I betragtning af en sådan anvendelighed af et immo-biliseret enzym til industrielt formål, er der i den seneste tid blevet udviklet et antal metoder til immobilisering af enzymer, jfr. C.R. Zaborsky, Immobilized Enzymes, C.R.C.

15 Press (1973) og Ichiro Chihata, Immobilized Enzymes,

Kodansha (1975).

De kendte metoder til fremstilling af immobiliser-ede enzymer kan groft opdeles i følgende fire metoder: 1) Adsorptionsmetoden 20 2) Kovalent bindings-metoden 3) Opfangningsmetoden 4) Tværbindingsmetoden

Da metoderne hver især har både fordele og ulemper, er det vanskeligt at sige, hvilken er den bedste. Desuden er 25 der endnu ikke tilvejebragt et bærestof eller en metode til enzym-immobilisering, som er anvendelig til alle mulige forskellige enzymer. I praksis må man individuelt vælge et egnet bærestof og en metode afhængig af det specifikke formål, således at man kan få et fortrinligt immobiliseret enzym 30 til det beregnede formål.

Desuden bør man være opmærksom på, at selv de enzymer, som er klassificeret i samme kategori og har fået tildelt samme enzym-nummer i overensstemmelse med "Report of the Commission on Enzymes of the International Union of 35 Biochemistry", 1964, kan være ret forskellige fra hinanden

O

DK 160436 B

2 med hensyn til molekylvægt og enzymatiske egenskaber/ hvis de har forskellig oprindelse. I sådanne tilfælde er det ganske naturligt, at kombinationen af et bestemt enzym med et bærestof og en fremgangsmåde, hvorved der kan fås et 5 særdeles fordelagtigt immobiliseret enzym, varierer afhængigt af enzymernes oprindelse, selv om disse har fået tildelt samme enzym-nummer.

Lactase (β-galactosidase, enzym-nummer 3.2.1.23) er det enzym, som hydrolyserer lactose til glucose og galac- 10 tose. Det er kendt, at dyr, planter, bakterier, svampe og gær producerer lactase. Lactase er et typisk eksempel på enzymer, under hvis navn der er mange slags enzymer, som er forskellige med hensyn til deres egenskaber bortset fra én fælles egenskab, der går ud på at hydrolysere lactose 15 til glucose og galactose. Eksempelvis kan nævnes, at blandt enzymerne fra bakterier, er lactase fra Escherichia coli (i det følgende benævnt "E. coli”) et intracellulært enzym, 4 4 hvis molekylvægt ligger i omradet fra 52 x 10 til 54 x 10 , hvis optimale pH-værdi er 7,3 og hvis Michaelis konstant, 20 Km (som angiver en katalysator-kemisk egenskab ved enzymet) —4 er 9,5 x 10 M [substrat: orthonitrophenyl-3-D-galactopyra- -•5 nosid (ONPG)] og 7,5 x 10 M (substrat: lactose) .

På den anden side er lactase fra gær, såsom Saccharo-myces fragilis eller Saccharomyces lactis, også et intra-25 cellulært enzym, hvis molekylvægt er så lille som 20 x 10^, mindre end halvdelen af molekylvægten af lactase fra E. coli. Lactase fra gær har en optimal pH-værdi på 6,5 til 7,0, og Km-værdierne (substrat: ONPG og lactose) er meget forskellige fra værdierne for lactase fra E. coli.

30 Desuden er lactase fra svampen Aspergillus niger et extracellulært enzym, hvis optimale pH-værdi er så lav som 3,5 og hvis molekylvægt ligger i området fra 10 x 10^ til 4 11 x 10 . Lactasen fra en tilsvarende svamp, Aspergillus oryzae, adskiller sig på mange punkter fra Aspergillus niger 35 lactase inklusiv den optimale pH-værdi, som er 4,5 til 5,0 (C.D. Boyer: The Enzymes, 3. udg., bd. 7, 617-688).

O

DK 160436 B

3

Man kan således næppe forestille sig, at lactaserne, hvis oprindelser er forskellige, har samme kemiske struktur og egenskaber og er samme proteinforbindelse. De har kun én fælles egenskab, som består i, at de alle hydrolyser-5 er lactose til glucose og galactose eller aryl- eller alkyl--β-D-galactosid til en alkohol og galactose.

Man kan derfor sige, at det enzym-immobiliserings--bærestof og den enzym-immobiliserings-metode, der er egnet til ét bestemt enzym, ikke nødvendigvis kan anvendes på alle 10 andre enzymer. Eksempelvis er der i US-patent nr. 3.767.531 beskrevet en fremgangsmåde til immobilisering af lactase fra Aspergillus niger på phenol-formaldehyd harpiks, som kun har phenoliske hydroxylgrupper og methylolgrupper men ikke andre funktionelle grupper, såsom amino- eller substi-15 tuerede aminogrupper eller carboxymethylgrupper. Men disse bærestoffer og den anførte fremgangsmåde er ikke nødvendigvis egnet til alle typer af enzymer.

En væsentlig industriel anvendelse af lactase er til hydrolyse af lactose i mælk til personer, som ikke kan 20 tåle lactose i mælk, og en anden anvendelse af lactase er til hydrolyse af lactose i valle. Som en følge heraf har der været gjort betydelige forsøg for at udvikle lactaser fra mikroorganismer, der er egnet til disse to væsentlige industrielle anvendelser samt en fremgangsmåde til immo-25 bilisering deraf (H.H. Weetall og S. Suzuki, Immobilized

Enzym Technology, Plenum Press, New York (1975), A.C. Olson og C.L. Cooney, Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes, Prenum Press, New York (1974)).

Især har de seneste udviklinger af en membrantek-30 nik gjort det muligt uden vanskeligheder at adskille valle i en proteindel med høj molekylvægt og en forbindelse med lav molekylvægt, som hovedsageligt indeholder lactose. Med henblik herpå har der været foretaget mange forskellige undersøgelser af hydrolyse af lactose med immobiliseret 35 lactase samt anvendelse af produktet inden for fødevareindustrien.

4

DK 160436 B

Næsten ingen af disse undersøgelser er imidlertid blevet ført ud i praksis. Årsagen hertil kan være, at meget få lactaser virker på både mælk og sur valle, og at der er problemer med produktinhibering på grund af galactose og 5 lignende. Blandt årsagerne hertil kan især nævnes følgende:

Kun få lactaser er stabile, højaktive over for lactose og tilgængelige til en rimelig pris

Som tidligere nævnt, betragtes en immobiliseret lactase som værende af stor betydning set ud fra en industriel 10 anvendelse af lactase, men der foreligger ikke én enkelt immobiliseringsmetode, som er alment anvendelig på alle slags lactaser uanset oprindelse. For at fremstille en fortrinlig immobiliseret lactase er det nødvendigt omhyggeligt at udvælge den bedste kombination af lactase, dvs. lactase-15 type med hensyn til oprindelse, et bærestof og en immobiliseringsmetode. Med andre ord er det nødvendigt at udvælge den bedste lactase ud fra et praktisk synspunkt og at beslutte sig til det mest egnede bærestof og immobiliseringsmetode under hensyntagen til den industrielle anvendelsesmåde 20 af slutproduktet. Dette gælder naturligvis for et hvilket som helst andet immobiliseret enzym.

Ud fra dette standpunkt er der nu tilvejebragt fortrinlige immobiliserings-bærestoffer (japansk patentansøgning nr. 26.913/1978 eller patentansøgning nr. 119.084/1979, 25 tysk offentliggørelsesskrift nr, 2.818.086).

Fra FR offentliggørelsesskrift nr. 2.381.059 er det desuden kendt at immobilisere lactase fra A. oryzae på pul-lulangel modificeret med diethylaminoethylgrupper, og - som nævnt ovenfor - er det fra US patentskrift nr. 3.767.531 30 kendt at immobilisere lactase fra A. niger på en ikke-modi-ficeret phenol-formaldehyd-harpiks.

Ifølge den foreliggende opfindelse har det nu vist sig, at der kan tilvejebringes en immobiliseret lactase, som har en overraskende høj aktivitet i forhold til de kendte 35 immobiliserede lactaser, og som er så stabil, at enzymet ikke elueres fra bærestoffet, selv når der anvendes en sub- 5

DK 160436 B

stratopløsning med høj saltkoncentration, når en bestemt lactase fra Aspergillus oryzae immobiliseres ved covalent binding med glutaraldehyd på et bærestof, som er en makro-porøs, amfoter phenol-formaldehydionbytterharpiks med et 5 specifikt overfladeareal på l m2/g eller derover, hvor det totale rumfang af makroporerne, som har en diameter på 100 til 2.000 Å, andrager 0,1 cm3/g eller derover, en anionbyt-terkapacitet hidrørende fra amino- eller substituerede amino-grupper på 1 mækv/g eller derover og en kationbytterkapacitet 10 hidrørende fra carboxymethylgrupper på 0,5 mækv/g eller derover. Det nævnte bærestof er beskrevet i japansk patentansøgning nr. 119.084/1979.

Opfindelsen angår således en immobiliseret vanduop-løselig lactase, som er ejendommelig ved det i krav l's 15 kendetegnende del angivne. Denne immobiliserede lactase muliggør en enkel og effektiv anvendelse af lactase i kontinuerlig kontaktreaktion med substratet, lactose.

Den immobiliserede lactase ifølge opfindelsen besidder fordele set ud fra en industriel udnyttelse af 20 immobiliserede enzymer, idet den f.eks. er aktiv inden for et større pH-område end den immobiliserede lactase fra gær eller Aspergillus niger, og bevarer sin aktivitet selv ved så lav en temperatur som under 10°C.

Der kan anvendes en hvilken som helst fremgangs-25 måde til fremstilling af den ovenfor nævnte makroporøse, amfotere phenol-formaldehyd ionbytterharpiks, der udgør bærestoffet i den immobiliserede lactase ifølge opfindelsen, for så vidt den fremstillede harpiks har de ovenfor definerede egenskaber. Den harpiks,, der specielt er beskre-30 vet her til forklaring af den foreliggende opfindelse, er fremstillet ved indførelse af carboxymethylgrupper i en kommercielt tilgængelig, makroporøs anionbytterharpiks med en matriks af phenol-formaldehyd kondensat, hvorved harpiksen konverteres til amfoter ionbytterharpiks, som beskre-35 vet i japansk patentansøgning nr. 119.084/1979.

Harpiksen kan være formet som granuler eller perler med en størrelse fortrinsvis i området fra 12 mesh

DK 160436 B

o 6 (1410 μτα) til 60 mesh (250 /m) . Det er ikke at foretrække at anvende harpiks af for stor størrelse, fordi hulrumsvo-lumenet øges i forhold til harpiksens størrelse, og som en følge heraf bliver aktiviteten pr. rumfangenhed mindre. En 5 for lille harpiksstørrelse er ikke at foretrække, enten fordi trykfaldet over en kolonne fyldt med partikler bliver for stor eller fordi adskillelsen af reaktionsopløsningen fra det immobiliserede enzym bliver vanskelig, når der anvendes harpiks af for lille størrelse.

10 På tegningen illustrerer: fig. 1 den relative aktivitet af lactase fra Aspergillus oryz:ae, målt ved 30°G under anvendelse af en 13,3%'s (w/v) lactoseopløsning, fig. 2 den relative aktivitet af den immobiliserede 15 lactase ifølge opfindelsen, målt ved 30°c under anvendelse af en 13,3%'s (W/v) lactoseopløsning som substrat.

Lactasen, der anvendes i den immobiliserede lactase ifølge opfindelsen, fås som ekstracellulært enzym fra en stamme hørende til Aspergillus oryzae og har som 20 ' nævnt følgende karakteristika: 1. Optimal pH-værdi og pH-afhængighed:

Den optimale pH-værdi er 4,5 til 5,0, når substratet er hhv. lactose og ONPG. pH-Afhængigheden af den relative ak-25 tivitet for substratet, en 13,3%’s (w/v) lactoseopløsning, fremgår af fig. 1. Forholdet mellem aktiviteten ved en pH-værdi på 6,5 ved 30°C og ved en pH-værdi på 4,5 ved 3Q°C er 0,65-0,05.

30 2. Michaelis1 konstant K : m

Km = 0,10-0,05 mol/liter (pH= 4,5, 30°C, substrat: lactose) 3. Inhiberingskonstant (galactose) K^: ^ = 0,007-0,004 mol/liter (pH= 4,5, 30°C, substrat: lactose).

Den her omhandlede lactases karakteristika er defineret ved de ovenfor anførte data. Desuden er anført yderligere egenskaber i det følgende: 35 0 7

DK 160436 B

4. pH-Stabilitet: Når lactasen neddyppes i en pufferopløsning med vekslende pH-værdi ved 40°C i 1 time, viser det sig, at lactasen er stabil, og der viser sig ikke nogen formindskelse af akti-5 viteten i pH-området fra 4,0 til 7,5.

5. Temperatur-stabilitet: Når lactasen neddyppes i en pufferopløsning med en pH-værdi på 4,5 og 6,5 ved 50°C eller derunder i 30 minutter, mis-10 ter den slet ikke sin aktivitet. Følgende tabel illustrerer enzymets residualaktivitet, efter at det har været nedsænket i en opløsning ved pH = 4,5 og 6,5 ved 55°C eller mere i 30 minutter.

15 Temperatur (°C) Residualaktivitet (%) 55 96 - 97 60 80 65 20

Man fandt ikke nogen forskel mellem resultaterne 20 fra forsøgene ved pH = 4,5 og 6,5.

6. Aktiveringsenergi, E&:

En afbildning ifølge Arrhenius (substrat: 13,3%'s (w/v) lactoseopløsning, pH= 4,5) viser en let krumning, og E -25 -værdien ved 30°C til 40°C er 9-3 kal/mol.

De ovenfor fra punkt 1 til 6 anførte værdier inkluderer naturligvis forsøgsfejl tilladelige ved måling af enzymatiske reaktioner. For så vidt de ovenfor nævnte 30 karakteristika er tilfredsstillet, er fremgangsmåden til fremstilling af lactase ikke specielt begrænset. Lactasen opbevares sædvanligvis i form af pulver eller opløsning.

Hvad angår aktiviteten har et enzym med lav aktivitet ingen mening ifølge formålet med den foreliggende opfindelse.

35 Som en følge heraf, foretrækkes det at anvende et enzympulver, hvis enzymatiske aktivitet ikke er mindre end

O

DK 160436 B

8 15 ILU pr. mg af det ikke-immobiliserede enzympulver, fortrinsvis ikke mindre end 40 ILU/mg.

X den foreliggende beskrivelse er 1 ILU defineret som den mængde lactase, der producerer 1 jomol glucose 5 pr. minut ved pH = 4,5 ved 30°C, når der som substrat anvendes en 13,3%'s (w/v) lactoseopløsning. Mængden af den således fremstillede glucose defineres ved anvendelse af glucose oxidase-peroxidase-farvningssystemet. Når målingen af aktiviteten (enhed) udføres ved en anden pH-værdi el-10 ler temperatur, vil pH-værdien eller temperaturen blive specielt anført i hvert tilfælde.

Den immobiliserede lactase ifølge opfindelsen kan fremstilles ved en hvilken som helst fremgangsmåde, for så vidt det resulterende immobiliserede enzym ligger inden 15 for rammerne af den foreliggende opfindelse. De følgende to fremgangsmåder betragtes imidlertid som værende praktiske:

Den ene af disse fremgangsmåder gennemføres på følgende måde: 20 Bærestoffet neddyppes i en lactaseopløsning i en pufferopløsning (pH = 4,0 til 6,5), hvorved lactasen adsor-beres på bærestoffet. Derpå bringes bærestoffet med adsor-beret lactase, i kontakt med glutaraldehyd ved neddypning af bærestoffet i en vandig glutaraldehydopløsning, ind-25 stillet til en pH-værdi på 3,5 til 7,0, og blandingen omrøres til dannelse af immobiliseret lactase. Derpå vaskes ikke-reageret glutaraldehyd bort. Det antages, at glutaraldehyd tværbinder mellem enzymet og bærestoffet, hvorved enzymet immobiliseres på bærestoffet med en covalent bin-30 ding. Faktisk elueres enzymet ikke fra bærestoffet, selv når der anvendes en substratopløsning med høj saltkoncentration. .

Den anden fremgangsmåde gennemføres i den omvendte rækkefølge af den ovenfor nævnte fremgangsmåde, hvilket 35 vil sige, at bærestoffet neddyppes i en vandig opløsning af glutaraldehyd indstillet til en pH-værdi på 3,5 til

O

DK 160436 B

9 7,0/ hvorved glutaraldehydet reagerer med bærestoffet. Det således fremstillede bærestof neddyppes derpå i en vandig lactaseopløsning i en pufferopløsning med en pH-værdi på 3,5 til 7,0, således at lactasen reagerer med glutaralde-5 hydet bundet til bærestoffet, hvorved der dannes et immo-biliseret enzym. Der er mulighed for, at en vis mængde enzym ikke reagerer med glutaraldehydet og danner covalent binding men simpelt hen adsorberes på bærestoffet. Det således fremstillede, immobiliserede enzym vaskes derfor 10 med en pufferopløsning med en høj saltkoncentration. De ved de to ovenfor nævnte fremgangsmåder fremstillede immobiliserede lactaser har samme enzymatiske egenskaber med en lille forskel inden for forsøgsusikkerheden.

Ved den førstnævnte fremgangsmåde foretrækkes det 15 at vaske ikke-adsorberet lactase bort, efter at lactasen har været underkastet adsorptionsprocessen, således at der ikke dannes tværbindinger mellem de ikke-adsorberede frie enzymer. Behandlingen af bærestoffet, der adsorberer lactase ved hjælp af glutaraldehyd, kan gennemføres inden 20 for en pH-værdi på 2,0 til 8,0. Aktiviteten tabes imidlertid, hvis pH-værdien er for lav, medens reaktionen med glutaraldehyd bliver temmelig inaktiv i det basiske · pH-område. Som tidligere nævnt er det praktisk at arbejde i et pH-område mellem 3,5 og 7,0.

25 Især opnås der et godt resultat, når behandlingen udføres inden for pH-området fra 4,0 til 6,5, fordi den tidligere adsorberede lactase ikke elueres under glutaraldehyd-be-handlingen.

Ved den sidstnævnte fremgangsmåde kan det være 30 tilstrækkeligt at gennemføre reaktionen af glutaraldehyd med bærestoffet inden for pH-området mellem 2,0 og 8,0.

Hvis reaktionen imidlertid gennemføres ved en for lav pH-værdi, bliver det vanskeligt at konvertere pH-værdien i makroporerne hos bærestoffet, der har reageret med glu-35 taraldehyd, til et pH-område, der er egnet til den næste proces. Alt taget i betragtning er det praktisk at udføre reaktionen i pH-området fra 3,5 til 7,0. I den følgende 10

DK 160436 B

o reaktion med lactase er et pH-område fra 3,5 til 7,0, praktisk, fortrinsvis fra 4,0 til 6,5 af samme grund som anført ved den førstnævnte fremgangsmåde.

Med hensyn til reaktionstemperaturen kan den for 5 den vandige opløsning ligge over frysepunktet men ikke over 50°C. Adsorptionen og reaktionen med glutaraldehyd kan fortrinsvis udføres ved en temperatur fra 5°C til 45°C.

For- den førstnævnte fremgangsmådes vedkommende foretrækkes det at udføre adsorptionen ved en temperatur 10 lidt højere end den, hvorved behandlingen med glutaraldehyd foregår, f.eks. udføres adsorptionen ved 30°C og behandlingen med glutaraldehyd ved 20°C.

Hensigtsmæssige glutaraldehydkoncentra-tioner kan være 0,1 til 5%. Til den førstnævnte 15 fremgangsmåde kan der anvendes'en'lavere‘giutaraldehyd-koncentration end til den sidstnævnte. Når koncentrationen af glutaraldehydopløsningen er for lav, sker der en eluering af enzymet, og man kan ikke få det her omhandlede immobiliserede enzym.. På den anden side nedsæt-20 tes den enzymatiske aktivitet af det immobiliserede enzym, hvis glutaraldehydkoncentrationen er for høj. Man skal derfor omhyggeligt vælge en hensigtsmæssig koncentration.

Den tid, der er nødvendig til adsorptionen, behandlingen med glutaraldehyd, reaktionen af bærestoffet 25 med glutaraldehyd og reaktionen af enzymet og glutaralde-hydet, afhænger af temperaturen af den enkelte proces i immobiliseringsreaktionen, men almindeligvis kræves der 1 til 20 timer til hver proces. I de tilfælde, hvor adsorptionen og reaktionen med glutaraldehyd gennemføres ved en 30 temperatur fra 15°C til 40°C, er 1 til 6 timer længe nok til hver proces.

Den maksimale mængde lactase der skal immobiliser-es ligger i området fra 250 til 300 mg pr. g tørt bærestof. Almindeligvis kan der immobiliseres en større mængde 35 lactase ved den førstnævnte fremgangsmåde end ved den sidstnævnte.

11

DK 160436 B

o

Ved udførelsen af immobiliseringsreaktionen er det virkningsfuldt at gennemføre reaktionen under omrøring med 50 til 250 omdr. pr. min. afhængig af reaktionsbeholderen.

5 Både ved den førstnævnte og den sidstnævnte frem gangsmåde er det meget vigtigt at vaske den immobiliser-ede lactase tilstrækkeligt med en pufferopløsning med høj saltkoncentration samt vand for at fjerne al den lactase, som ikke er tilstrækkelig bundet og derfor vil skilles 10 fra. Det her omhandlede immobiliserede enzym vil ikke blive skilt fra ved en sådan behandling.

De enzymatiske egenskaber af de immobiliserede enzymer ifølge opfindelsen er anført i det følgende: 15 1. Optimal pH-værdi og pH-afhængighed:

Den optimale pH-værdi med hensyn til lactose er pH = 4,0 til 5,0. Der iagttages ikke nogen ændring i de optimale pH-værdier ved immobiliseringen. Aktiviteten har imidlertid en tendens til at stige ved et lavere pH-niveau. Af 20 fig. 2 fremgår pH-afhængigheden af aktiviteten af det immobiliserede enzym, når substratet er en 13,3%'s (w/v) lac-toseopløsning. Forholdet mellem aktiviteten ved en pH--værdi på 6,5 og aktiviteten ved en pH-værdi på 4,5 er 0,55-0,1.

25 2. Michaelis" konstant Km:

Km = 0,15-0,1 mol/liter (pH = 4,5, 30°C, substrat: lactose).

3. Inhiberingskonstant (galactose) K^: 30 Ki = 0,15-0,1 mol/liter (pH = 4,5, 30°C, substrat: lactose).

4. pH-Stabilitet: Når det immobiliserede enzym neddyppes i en pufferopløsning ved 40°C i 1 time, er det immobiliserede enzym stabilt, og 35 der iagttages ikke nogen formindskelse af aktiviteten i pH-området fra 2,0 til 7,0.

12

DK 160436 B

o ! 5. Temperatur-stabilitet:

Det immobiliserede enzym neddyppes ved pH =4,5 i 3 timer ved en bestemt temperatur. Det immobiliserede enzym er stabilt, og der iagttages ikke nogen formindskelse i aktivi-5 teten, når temperaturen er 50°C eller derunder, men ak- 1 tiviteten formindskes ved en temperatur ikke under 55°C.

Den her omhandlede immobiliserede lactase besidder de ovenfor anførte enzymatiske egenskaber, og nogle supplerende praktiske karakteristika herfor er følgende: 10 1. Aktiviteten pr. vægtenhed:

Aktiviteten pr. g tør, immobiliseret lactase er ikke specielt begrænset, men en lactase med en meget lav aktivitet er værdiløs set ud fra formålet med den foreliggende 15 opfindelse. (Tør, immobiliseret lactase benævnes i det følgende "IML"). Lactase med 200 ILU/g IML eller derover er anvendelig ud fra et praktisk synspunkt ved pH = 4,5 ved 30°C.

Som tidligere nævnt er den maksimale mængde lac-20 tasepulver, der immobiliseres, 250 til 300 mg/g bærestof.

Som det klart fremgår af den følgende tabel I, varierer aktiviteten af den her omhandlede immobiliserede lactase ikke i væsentlig grad uanset mængden af lactase immobiliseret derpå, for så vidt mængden af den immobiliserede 25 lactase ligger i området fra 50 til 200 mg/g bærestof. Aktiviteten af den omhandlede immobiliserede lactase afhænger først og fremmest af aktiviteten af den lactase, som foreligger som pulver eller væske inden immobiliseringen.

30 Tabel I

Aktiviteten af den immobiliserede lactase og mængden af lactase immobiliseret ved en pH-værdi på 4,5 ved 30°C (aktiviteten af enzympulveret: 72 ILU/mg) 35 Mængden af immobiliseret lactasepulver (mg/g bærestof) 45 66 89 124 162 224

Aktiviteten af den immobiliserede lactase (ILU/g IML) 785 870 880 840 890 770 13

DK 160436 B

0 2. God stabilitet og høj produktivitet:

De karakteristika, der især skal bemærkes ved den her omhandlede, immobiliserede lactase, er, at den er yderst stabil under opbevaring, og når den udsættes for en kontinuer-5 lig hydrolysereaktion af lactose, samt dens høje produktivitet ved hydrolysereaktionen af lactose. Selv når substratet indeholder en høj saltkoncentration og nogle andre forbindelser, såsom mælk eller valle, viser den immobili-serede lactase en høj produktivitet uden at forårsage elu-10 ering af enzymet. Følgende er mere specifikke eksempler herpå.

1) Kemisk resistens:

Den immobiliserede lactase med 760 ILU/g IML ved pH = 4,5 15 ved 30°C neddyppes i en fortyndet opløsning (koncentration: 1/500 af den oprindelige opløsning, hvilken koncentration anses for acceptabel inden for fødevareindustrien) af en iod-desinficeringsmiddel-detergent, Diyazan ® (fra Asahi Glass K.K) ved 4°C i 1 måned. Derefter måles aktiviteten 20 af den immobiliserede lactase under de samme betingelser som ovenfor, og den viser sig at have 765 ILU/g IML. Der er således ikke observeret nogen formindskelse af aktiviteten. Den her omhandlede immobiliserede lactase viser sig således at være yderst resistent over for et kemisk middel.

25 2) Stabilitet i en kontinuerlig reaktion:

Vallepulver (fremstillet i New Zealand) opløses i en pufferopløsning (pH = 4,5), hvorved der dannes en 7%'s (w/v) valleopløsning. Uopløst stof fjernes i en centrifuge ved 30 5.000 g, hvorved der dannes en næsten transparent valle opløsning. Denne opløsning underkastes en kontinuerlig hydrolyse ved 4°C med en rumhastighed på 2,3 h ^ i 135 dage med en søjle fyldt med 10 ml immobiliseret lactase med 685 ILU/g IML (pH = 4,5, 30°C) af den enzymatiske aktivitet 35 for at hydrolysere lactosen i vallen. Hydrolyseringshas- j· tigheden af lactose holdes på 90-3% i de nævnte 135 dage, og der blev ikke observeret nogen formindskelse af aktivi-

O

DK 160436 B

14 teten. Det er derfor tydeligt, at den her omhandlede immo-biliserede lactase er meget stabil og har høj produktivitet. Den her omhandlede, immobiliserede lactase har en fordel ud fra et industrielt anvendelsessynspunkt. De følg-5 ende eksempler tjener til nærmere belysning af den immobiliserede lactase ifølge opfindelsen.

Betingelserne ved måling af aktiviteten af den immobiliserede-lactase ifølge opfindelsen forklares i det følgende.

10 1. Fremgangsmåde til måling af aktiviteten af den immobiliserede lactase:

Den immobiliserede lactase (0,1 til 0,3 ml) suspenderes i en 0,05 M acetatpufferopløsning (pH = 4,5). Til denne op-15 løsning sættes en opløsning af lactose i samme slags puf-feropløsning som ovenfor, hvorved der dannes en 13,3%'s (w/v) lactoseopløsning. Opløsningen omrystes ved 30°C i 15 minutter med en omryster (100 omdr. pr. min., rystebredde: 3,5 cm). Efter fjernelse af den immobiliserede lactase 20 ved filtrering, bestemmes indholdet af glucose i filtratet under anvendelse af glucose oxidase, peroxidase og farvningssystemet. Mængden af enzymer, der producerer 1 pmol glucose i løbet af 1 minut defineres som 1 enhed (1 ILU). pH-Niveauet og temperaturen ved målingen af akti-25 viteten vil blive anført i hvert enkelt tilfælde i beskri velsen.

2. Måling åf vægten af den immobiliserede lactase og bærestoffet: 30 Den immobiliserede lactase eller bærestoffet spredes ud i et 2 mm eller mindre tykt lag og tørres under formindsket tryk (5 mm Hg eller derunder) ved 50°C i mindst 8 timer, indtil der er opnået en konstant vægt. Derefter anbringes den immobiliserede lactase eller bærestoffet, der 35 skal undersøges, i en ekssikkator ved stuetemperatur (18 til 25°C) i 1,5 timer eller mere, hvorefter vægten heraf

O

DK 160436 B

15 bestemmes. Vægten betragtes som værende vægten i tør tilstand. Alle vægtangivelser i den foreliggende beskrivelse er tørvægt.

5 Eksempel 1

Fremstilling af immobiliseret lactase samt dens sammensætning.

15,0 g Lactasepulver fra Aspergillus oryzae (fremstillet hos Shinnihon Kagaku Kogyo Co., aktivitet ved pH = 4,5 ved 30°C: 47 ILU, Km ved pH = 4,5 ved 30°C: 0,11 mol/-10 liter) opløses i 750 ml 0,05 M acetatpufferopløsning (pH = 5,5). I denne opløsning neddyppes 100 g makroporøs, amfoter phenol-formaldehyd ionbytterharpiks, og enzymerne immobi-liseres ved 20 til 22°C i 6 timer under omrystning med 120 omdr. pr. min. Den nævnte harpiks er fremstillet ved 15 indførelse af carboxymethylgrupper på den kommercielt til gængelige Duolite A-7 (varemærke, fremstillet hos Diamond

Shamrock) og har 0,53 cm /g makroporer med en diameter på 2 100 til 2.000 Å, et specifikt overfladeareal på ca. 32 m /g, en partikelstørrelse på 250 ^rni til 1410 ^i diameter, en 20 anionbytterkapacitet fra amino- og substituerede aminogrup-per på 6,08 mækv/g og en kationbytterkapacitet fra carboxymethylgrupper på 2,65 mækv/g.

Den enzymadsorberende harpiks vaskes derpå med en 0,2 M acetatpufferopløsning (pH =5,5) og afioniseret vand, 25 indtil der ikke længere findes enzymprotein i vaskevæsken. Mængden af adsorberet enzym på harpiksen beregnes til at være 132,4 mg/g bærestof ud fra proteinindholdet i vaskevæsken. Den således fremkomne harpiks med adsorberede enzymer neddyppes i 750 ml 1% glutaraldehydopløsning indstil-30 let til en pH-værdi på 4,5 og omrøres med 120 omdr. pr. min. i 6 timer, medens temperaturen holdes på 5°C. Harpiksen vaskes tilstrækkeligt med en 0,2 M acetatpufferopløsning og afioniseret vand, og mængden af enzymer immobiliseret på harpiksen efter behandlingen med glutaraldehyd viser sig 35 at være 131,5 mg/g bærestof. Aktiviteten af den immobili- serede lactase fremstillet som anført ovenfor, er 635 ILU/-g IML ved en pH-værdi på 4,5 ved 30°C. Den immobiliserede 16

DK 160436 B

0 lactase (9 ml hver) fyldes på to søjler udstyret med en rørformet kappe. Medens temperaturen af søjlerne holdes på 40°C, gennemløber en 0,3 M acetatpufferopløsning (pH = 4,5) én af søjlerne med en rumhastighed på 5,0 h ^ i 48 timer, 5 og under samme betingelser gennemløber en 0,3 M phosphat-pufferopløsning (pH = 6,65) den anden søjle. De anvendte pufferopløsninger har samme elektriske ledningsevne som mælk eller en 7%'s valleopløsning. Det fremgår af UV spektrummet af pufferopløsningerne fra søjlerne, at ca. 0,5% 10 af det immobiliserede enzym elueres i de første mange timer, efter at pufferopløsningerne er begyndt at passere igennem. Men der iagttages ikke nogen yderligere eluering af enzymet. Aktiviteten af de immobiliserede enzymer ved en pH-værdi på 4,5 ved 30°C, efter at pufferopløsningerne er 15 løbet igennem i 48 timer, er hhv. 645 ILU/g IML og 640 ILU/g IML. Det kan således konkluderes, at de ovenfor nævnte processer ikke medfører nogen væsentlig formindskelse af aktiviteten. Med andre ord kan man sige, at det immobiliserede enzym er så stabilt, at det ikke separeres fra bære-20 stoffet selv ved behandling med en opløsning med høj saltkoncentration .

Kontinuerlig hydrolyse af lactose i skummetmælk

En søjle fyldt med 30 ml immobiliseret lactase frem-25 stillet som beskrevet ovenfor anbringes i et rum, hvor temperaturen holdes på 4°C, og en skummetmælksopløsning (sukkerindhold: 5% (w/v), målt ifølge Nelson-Somogyi) gennemløber kontinuerligt søjlen i 180 dage med en rumhastighed på 0,8 h pH-værdien af den anvendte skummetmælk er 6,65, og er ikke 30 indstillet kunstigt. Hydrolyseringshastigheden for lactose 7 dage efter at skummetmælken er begyndt at gennemløbe søjlen, er 72%, og for den sidste dag, den 180. dag, er den 71%. Der iagttages således ikke nogen væsentlig formindskelse af aktiviteten. Under ovennævnte proces vaskes det 35 immobiliserede enzym to gange om ugen med en opløsning af et desinfektionsmiddel indeholdende hovedsageligt 2% iod

O

DK 160436 B

17 og 11% ikke-ionisk, overfladeaktivt middel, Diazan ® , der kan fås fra Asahi Glass K.K. (den anvendte koncentration er 1/100 af den oprindelige opløsning) og sterilvand. Dette viser, at aktiviteten ikke formindskes på grund af des-5 infektionsmidlet.

Kontinuerlig hydrolyse af lactose i valle 10 ml af den immobiliserede lactase sættes på en søjle, og søjlen anbringes i et rum, hvor temperaturen hol-10 des på 4°C. Valle (fremstillet i New Zealand) opløses i en pufferopløsning (pH = 4,4), hvorved der dannes en 7%'s (w/v) valleopløsning, og uopløst stof fjernes i en centrifuge ved 5.000 g. Det uopløste materiale, der fjernes fra valleopløsningen, andrager 10% af det anvendte vallepulver.

15 Denne valleopløsning gennemløber kontinuerligt søjlen med en rumhastighed på 2,25 h ^ i 200 dage for at hydrolysere lactosen. Hydrolyseringshastigheden for lactose er 88% i 4 dage, efter at valleopløsningen er begyndt at gennemløbe søjlen, og 90% ved den sidste dag, den 200. dag. Der iagt-20 tages således ikke nogen formindskelse af aktiviteten.

Ved dette forsøg vaskes den immobiliserede lactase én gang hver anden uge med en opløsning af Diazan ® (koncentration: 1/500) og sterilvand for at forhindre forrådnelse, som vil kunne forekomme, når der passerer en valle-25 opløsning gennem det immobiliserede enzym.

Eksempel 2

Fremstilling af immobiliseret lactase samt dens sammensætning 18,2 g af det samme bærestof (i tør tilstand) som 30 anvendt i eksempel 1 afvejes og neddyppes i afioniseret vand, hvorved bærestoffet kvælder. Derefter neddyppes bærestoffet i 150 ml 3%'s glutaraldehydopløsning (indstillet til en pH-værdi på 4,5) og omrøres i 2 timer, medens opløsningens temperatur holdes på 18-1°C. Bærestoffet vaskes 35 tilstrækkeligt med afioniseret vand og en acetatpufferopløsning og neddyppes derpå i 150 ml af en opløsning af sam-

DK 160436 B

O

18 me lactasepulver (3,0 g) som anvendt i eksempel 1 i 0,05 M acetatpufferopløsning (pH = 5,0). Blandingen omrøres langsomt ved 25°C i 4 timer, hvorved immobiliseringsreaktionen fortsætter. Bærestoffet vaskes tilstrækkeligt med 0,3 M 5 acetatpufferopløsning (pH = 5,0) og afioniseret vand for at fjerne de enzymer, der kun er immobiliseret ved adsorption på bærestoffet. Mængden af således immobiliseret enzym viser sig at være 149,4 mg/g bærestof fra beregningen baseret på mængden af protein i vaskeopløsningen, og ak-10 tiviteten af det immobiliserede enzym er 685 ILU/g IML ved en pH-værdi på 4,5 ved 30°C.

Aktiviteten af det immobiliserede enzym, efter at 0,3 M pufferopløsninger med en pH-værdi på 4,5 og 6,65 har gennemløbet enzymet i 48 timer som i eksempel 1, er 15 hhv. 700 ILU/g IML og 690 ILU/g IML. Den her omhandlede immobiliserede lactase er så stabil, at der ikke går enzym tabt, når den bringes i kontakt med pufferopløsning med ca. den samme ionstyrke og pH-værdi som valle og mælk.

20 Stabilitet af Immobiliseret lactase (kemisk resistens)

Den immobiliserede lactase fremstillet som beskrev- ^ vet ovenfor neddyppes i opløsninger med desinfektinsmidlet Osuban fra Takeda Chemical Industries, Ltd., indeholdende 10%'s (w/v) opløsning af benzalkoniumchlorid (koncentration: 25 1/100 og 1/500) og får lov at henstå i én måned ved 4°C.

Aktiviteten af det immobiliserede enzym måles ved en pH--værdi på 4,5 ved 30°C og viser sig at være hhv. 680 ILU/g IML og 685 ILU/g IML. Der iagttages således ikke nogen formindskelse af aktiviteten.

30

Kontinuerlig hydrolyse af lactose i mælk med lavt fedtindhold Den ovenfor fremstillede, immobiliserede lactase (20 ml) anbringes på en søjle, og mælk med lavt fedtindhold (fremstillet af Meiji Nyugyo, sukkerindhold: 5,25% 35 målt ifølge Nelson-Somogyi) gennemløber søjlen med en rumhastighed på 0,75 h”^ i 100 dage i et rum, hvor temperaturen 0 19

DK 160436 B

holdes på 4°C. Hydrolyseringshastigheden for lactose er 72-3% under hele processen, og der iagttages således ikke nogen formindskelse af aktiviteten. Ved dette forsøg steriliseres den immobiliserede lactase ved vaskning to gan-5 ge om ugen med et iod-desinfektionsmiddel og sterilvand.

Måling af og K - og K.-værdien af den immobiliserede lactase m 3 x fremstillet ovenfor måles ved en pH-værdi på 4,5 ved 30°C.

10 Krø-værdien beregnes ud fra Lineweaver-Burk afbildningen til 0,16 mol/liter. K^-værdien, målt ved tilsætning af 0,2 M galactose, er 0,11 mol/liter.

Eksempel 3 15 Fremstilling af immobiliseret lactase samt dens sammensætning 1,15 g Tørpulver af lactase fra Aspergillus oryzae (fremstillet hos Shinnihon Kagaku Kogyo Co., enzymaktivitet: 73 ILU/mg ved en pH-værdi på 4,5 ved 30°C, Km~værdi: 0,1 mol/liter) opløses i 75 ml 0,05 M acetatpufferopløsning 20 (pH = 5,5) . I denne opløsning neddyppes 10 g makroporøs, amfoter phenol-formaldehyd i ionbytterharpiks med en partikelstørrelse på 250 μ til 1.000 μ og et specifikt over-fladeareal på 68 m /g, idet det samlede rumfang af makro-porerne, der har en diameter på 100 til 2.000 Å, er 0,56 3 25 cm /g, kationbytterkapaciteten er 3,62 mækv/g og anionbyt-terkapaciteten fra carboxymethylgrupper er 1,85 mækv/g (fremstillet ved indførelse af carboxymethylgrupper på en kommercielt tilgængelig harpiks, Duolite A-4, fremstillet hos Diamond Shamrock) . Blandingen omrøres i 3 timer med 30 120 omdr. pr. min. for at immobilisere lactasen på bære stoffet, medens temperaturen af blandingen holdes på 35-2°C. Derefter vaskes den immobiliserede lactase godt med 0,2 M acetatpufferopløsning (pH =5,5) og afioniseret vand. Mængden af immobiliseret enzym viser sig at 35 være 96 mg/g bærestof. Aktiviteten af den således fremstillede adsorptionsimmobiliserede lactase er 1.080 ILU/g IML ved en pH-værdi på 4,5 ved 30°C.

20

DK 160436 B

0

Denne adsorptionsimmobiliserede lactase neddyppes i 75 ml 2,5%'s glutaraldehydopløsning (indstillet til en pH-værdi på 4,3) og omrøres med 120 omdr. pr. min. i 4 timer, medens blandingens temperatur holdes på 10 til 15°C.

5 Efter denne behandling med glutaraldehyd, viser mængden af immobiliseret enzym sig at være 92 mg/g bærestof beregnet ud fra vaskeopløsningen. Aktiviteten af denne immo-biliserede lactase ved en pH-værdi på 4,5 ved 30°C er 815 ILU/g IML.

10

Kontinuerlig hydrolyse af lactose

To søjler forsynet med en rørformet kappe fyldes med 10 ml hver af den immobiliserede lactase. En 7%'s (w/v) opløsning af lactose i 0,05 M phosphatpufferopløs-15 ning indeholdende 100 ppm n-propyl-p-hydroxybenzoat gennemløber kontinuerligt søjlerne for at hydrolysere lac-tosen. Opløsningen gennemløber den første søjle ved en pH--værdi på 6,3 ved 40°C med en rumhastighed på 5,0 h \ og den anden søjle ved en pH-værdi på 4,5 ved 40°C med en 20 rumhastighed på 8,5 h Den første søjle (pH-værdi 6,3 og en rumhastighed på 5,0 h opretholder 98-2% af hydrolyseringshastigheden i 100 dage, og der observeres slet ingen formindskelse af aktiviteten. Det immobiliserede enzym skal imidlertid vaskes en gang om ugen med en opløs-25 ning af samme desinfektionsmiddel som anvendt i eksempel 2, Osuban ® (koncentration: 1/300) på grund af kraftig infektion af mikroorganismer. Hydrolyseringshastigheden formindskes lige før vaskningen skal udføres, men genvinder sin oprindelige værdi på 98-2%, når den immobiliserede 30 lactase er vasket, medens den anden søjle (pH = 4,5, rumhastighed 8,5 h-1) opretholder 98-100% af hydrolyserings-hastigheden i alle 200 dage, og der observeres ikke nogen formindskelse af aktiviteten. Under procesbetingelserne for den anden søjle, er det tilstrækkeligt, hvis der sterili-35 seres og vaskes én gang hver anden eller tredje uge.

DK 160436 B

21

O

Eksempel 4

Fremstilling af immobiliseret lactase samt dens sammensætning 28 g Af samme, tørre lactase som anvendt i eksempel 3 opløses i 1.825 ml af en 0,05 M acetatpufferopløs-5 ning (pH = 5,2) . I denne opløsning neddyppes en makroporøs, amfoter phenol-formaldehyd ionbytterharpiks (240 g i tør tilstand) med næsten samme partikelstørrelse, specifikke overfladeareal og makroporøse rumfang som harpiksen anvendt i eksempel 1, men med 6,26 mækv/g anionbytterkapaci-10 tet og 2,86 mækv/g kationbytterkapacitet på grund af car-boxymethylgrupper. Blandingen omrøres i 4 timer med ca.

150 omdr. pr. min., medens blandingens temperatur holdes på 30°C. Derefter vaskes det immobiliserede enzym med en 0,2 M acetatpufferopløsning (pH =4,5) og afioniseret vand.

15 Ved beregninger ud fra mængden af protein i vaske opløsningen viser mængden af adsorberet enzym sig at være 112 mg/g bærestof. Bærestoffet med adsorberet lactase neddyppes i 1.800 ml 0,75%'s glutaraldehydopløsning [i 0,05 M acetatpufferopløsning (pH = 4,5)], og omrøres i 3 timer 20 med 120 omdr. pr. min., medens opløsningens temperatur holdes på 19 til 20°C. Tre timer derefter vaskes den immobiliserede lactase tilstrækkeligt med 0,2 M acetatpufferopløsning og afioniseret vand. Mængden af enzymer, der holdes immobiliseret efter den ovenfor nævnte behandling, 25 viser sig at være 111 mg/g. Aktiviteten af det immobiliserede enzym ved en pH-værdi på 4,5 ved 30°C er 850 ILU/g IML.

pH-Afhængighed af aktiviteten 30 Aktiviteten af den immobiliserede lactase frem stillet ovenfor måles ved 30°C, idet der anvendes en 13,3%'s (w/v) lactoseopløsning. Resultaterne, som er udtrykt ved pH-afhængigheden af den relative aktivitet, svarer til kurven i fig. 2 inden for forsøgsusikkerheden.

35

DK 160436B

22

O

Måling af Km og

Der gennemføres forsøg to gange ved en pH-værdi på 4,5 ved 30°C for at bestemme Km - og K^-værdierne af det immobiliserede enzym fremstillet i dette eksempel. De 5 gennemsnitlige Km~ og K^-værdier for forsøgene er hhv. 0,2 mol/liter og 0,15 mol/liter.

Opbevaringsstabilitet

En del af den immobiliserede lactase fremstillet 10 ovenfor tørres let under formindsket tryk. Når vandindholdet af det immobiliserede enzym bliver 50% (den immo-biliserede lactase ser tør ud, når vægten af den tørre, immobiliserede lactase er lig med vægten af det deri indeholdte vand), deles den således tørrede, immobiliserede 15 lactase i to dele. Disse fyldes på flasker, som forsegles i fri luft. Derpå opbevares den første flaske ved 4°C i to måneder og den anden ved stuetemperatur (15-28°C) i to måneder. Aktiviteten af den immobiliserede lactase i de to flasker måles og viser sig at være hhv. 830 ILU/g IML 20 og 870 ILU/g IML. Der observeres således slet ikke nogen formindskelse af aktiviteten.

De immobiliserede lactaser neddyppes i opløsninger indstillet til en pH-værdi på 2,6 og 3,0 i én måned ved 4°C, derpå måles aktiviteten af de således neddyppede 25 enzymer ved en pH-værdi på 4,5 ved 30°C, og den viser sig at være 845 ILU/g IML i begge tilfælde. Formindskelsen af aktiviteten ligger således inden for forsøgsusikkerheden.

Kontinuerlig hydrolyse af lactose i skummetmælk 30 Den immobiliserede lactase (11,3 ml) fremstillet ovenfor fyldes på en søjle, og skummetmælk (koncentrationen af lactose heri er indstillet til 5,0% (w/v)) gennemløber søjlen med en rumhastighed på 1,0 h ^ i et rum, hvor temperaturen holdes på 4°C. I løbet af de 100 dage, hvorun-35 der den kontinuerlige proces forløber, er hydrélyserings-hastigheden 72-2%, og der iagttages slet ikke nogen for-

O

DK 160436 B

23 mindskelse af aktiviteten. Under dette forsøg vaskes den iimnobiliserede lactase to gange om ugen med en opløsning af et iod-desinfektionsmiddel (fortynding: 1/100).

5 Eksempel 5

Fremstilling af immobiliseret lactase samt dens sammensætning 30 g Lactase fra Aspergillus oryzae (80 ILU ved en pH-værdi på 4,5, 30°C), opløses i 1750 ml acetatpufferopløsning (pH = 5,5). I denne opløsning neddyppes 230 g af 10 den samme harpiks som anvendt i eksempel 4 og omrøres i 4 timer med 120 omdr. pr. min., medens temperaturen af opløsningen holdes på 30°C, hvorved enzymet adsorberes. Mængden af adsorberet enzym viser sig at være 121,4 mg/g bærestof ud fra mængden af protein i vaskeopløsningen. Derefter ned-15 dyppes bærestoffet med det ved adsorption immobiliserede enzym i 1.750 ml 0,5% glutaraldehydopløsning (indstillet til en pH-værdi på 4,5 med 0,05 M acetatpufferopløsning), og omrøres i 5 timer med 120 omdr. pr. min., medens opløsningens temperatur holdes på 20°C. Mængden af immobiliser-20 et lactase viser sig at være 121,1 mg/g bærestof ud fra vaskeopløsningen. Aktiviteten af den således fremstillede, immobiliserede lactase er 1.000 ILU/g IML ved en pH-værdi på 4,5 ved 30°C.

25 Kontinuerlig hydrolyse af lactose i skummetmælk 20 ml af den i dette eksempel fremstillede, immobiliserede lactase fyldes på en søjle, og en skummetmælks-opløsning (sukkerindholdet er indstillet til 5,0% (w/v)) gennemløber søjlen, med en rumhastighed på 1,2 h ^ i et 30 rum, hvor temperaturen holdes på 4°C. Reaktionen fortsættes i 135 dage, i løbet af hvilken tid hydrolyseringshastigheden af lactose er i området fra 70 til 75%, og der iagttages således ikke nogen formindskelse af aktiviteten.

Under denne proces steriliseres og vaskes den immobiliser-35 ede lactase to gange om ugen.

DK 160436B

24

O

Kontinuerlig hydrolyse af lactose i valle

Den immobiliserede lactase (9 ml hver) fyldes på to søjler. En opløsning (7% (w/v)) af vallepulver (fremstillet i New Zealand) indeholdende 150 ppm n-propyl-p-hydroxyben-5 zoat centrifugeres ved 5.000 g for at fjerne uopløst stof. Supernatanten (indstillet til en pH-værdi på 4,5) gennemløber den ene af søjlerne med en rumhastighed på 3,5 h”^ i et rum, der holdes på en temperatur på 4°C, og den anden søjle ved 40°C med en rumhastighed på 16 h .1 det sidst-10 nævnte tilfælde afkøles substratopløsningen og reaktionsopløsningen fra søjlen til 2°C for at forhindre forrådnelse. I begge tilfælde gennemføres den kontinuerlige reaktion i 135 dage. Den førstnævnte søjle opretholder 88-2% af hydrolyseringshastigheden af lactose i procesperioden.

15 Den sidstnævnte søjle opretholder 97 til 100% af hydrolyser ingshastigheden af lactose under hele procesperioden, og der iagttages ikke nogen formindskelse af aktiviteten.

Med hensyn til den førstnævnte søjle undgår man infektion af mikroorganismer, når det immobiliserede enzym i søjlen 20 steriliseres én gang hver anden uge. Men i sidstnævnte tilfælde kan man ikke undgå en infektion, selv når det immobiliserede enzym steriliseres én gang om ugen, og hydrolyseringshastigheden formindskes. Hydrolyseringshastigheden får imidlertid sin oprindelige værdi igen, når enzymet steri-25 liseres.

Sammenligningseksempel 1

Immobilisering af lactase fra gær og aktivitet af produktet Tørpulver af lactase fra en gær, Saccharomyces (Kluyveromyces) lactis, adsorberes på det samme bærestof 30 som anvendt i eksempel 1 ved en pH-værdi på 6,65 og behandles med en 1,0%'s glutaraldehydopløsning (pH = 6,65).

Mængden af immobiliseret enzympulver er 96 mg/g bærestof, og enzymimmobiliseringsgraden er 64%, beregnet på den anvendte mængde enzym. Men et stort praktisk problem herved er, at akti-35 vi teten af det immobiliserede enzym er 1,4 ILU/g IML, når man måler ved en pH-værdi på 6,65 ved 30°C under anvendelse af

DK 160436 B

25

O

en 13,3%'s (w/v) lactose som substrat, hvilket betyder, at enzymet ikke har nogen aktivitet af praktisk betydning.

Når denne immobiliserede lactase vaskes med en acetatpuf feropløsning (pH = 5,5) mistes aktiviteten af en-5 zymet desuden fuldstændigt. Heraf ses, at den immobiliser-ede lactase fremstillet ved immobilisering af lactase fra Saccharomyces lactis ikke har nogen praktisk værdi.

10 Sammenligningseksempel 2

Immobilisering på et bærestof, der hverken har amino- eller carboxymethylgrupper

Idet der anvendes samme lactasepulver som i eksempel 1 udføres immobiliseringen på nøjagtigt samme måde bort-15 set fra; at en kommercielt tilgængelig harpiks, Duolite ES--762 (fremstillet hos Diamond Shamrock? harpiksen har ikke andre ionbyttergrupper end phenoliske hydroxylgrupper eller methylolgrupper) anvendes istedet, og forsøget udføres i 1/10 skala af eksempel 1. Mængden af immobiliseret enzym 20 er 53 mg/g bærestof, og aktiviteten ved en pH-værdi på 4,5 ved 30°C er 285 ILU/g IML, som er mindre end halvdelen af værdien i eksempel 1. En bestemt mængde immobiliseret lactase fra eksempel 1 og den i dette sammenligningseksempel 2 fremstillede neddyppes i en opløsning af et 25 desinfektionsmiddel, Diazan ® (fortyndingsforhold: 1/100) ved stuetemperatur (15-22°C). Aktiviteten af den sidstnævnte, immobiliserede lactase går ned til 90% på 24 timer og til 82% på 5 dage, medens aktiviteten af den førstnævnte ikke formindskes i samme periode.

30 35

DK 160436B

26

O

Sammenligningseksempel 3

Immobilisering af lactase fra Aspergillus niger

En lactase (150 mg pr. g bærestof) af renhed som til industriel anvendelse fra Aspergillus niger og med en ak-5 tivitet på 5 ILU/mg ved en pH-vaerdi på 4,5 og 30°C adsorberes på bærestoffet ifølge eksempel 1 og behandles med en 2,0%'s glutaraldehydopløsning (pH = 4,5). Mængden af immobiliseret enzym er 98 mg/g bærestof. Aktiviteten af denne immobilise-rede lactase er mindre end 1 ILU/g IML ved en pH-værdi på 10 6,65, som er pH-værdien for mælk, ved 30°C, og denne im- mobiliserede lactase har således ikke nogen praktisk betydning til hydrolyse af lactose i mælk.

Sammenligning: 15 Kontinuerlig hydrolyse af lactose.

1) Der anvendes en immobiliseret lactase (815 ILU/g IML) ifølge eksempel 3, en fødestrøm af 7%'s (w/v) lactose-opløsning i 0,05 M phosphatpuffer indeholdende 100 ppm 20 n-propyl-p-hydroxybenzoat og en søjle med 10 ml af den immobiliserede lactase.

Hydrolysen gennemføres ved en pH-værdi på 4,5, en temperatur på 30°C og en rumhastighed på 6,2 h-1.

Der opnås en hydrolyse af lactose på 98-100%. Der 25 observeres ingen nedsættelse af aktiviteten, selv efter 200 dages anvendelse (den immobiliserede lactase steriliseres og vaskes hver 2. eller 3. uge).

2) Der gås frem som beskrevet i US patentskrift nr.

30 3.767.531, eksempel 2.

Der anvendes en fødestrøm af en 3%’s (w/v) lactose-opløsning og en søjle (1,2 x 15 cm) med ca. 17 ml immobiliseret lactase.

Hydrolysen gennemføres ved en pH-værdi på 4,5, en 35 temperatur på 30°C og en rumhastighed på ca. 1,8 h_1 (strømningshastigheden er 0,5 ml/min. =30 ml/h, rumhastighed =30 27

DK 160436 B

ml/h divideret med 17 ml (søjlevolumen)).

Der opnås herved en hydrolyse af lactose på 76%.

Resultaterne af 1) og 2) er sammenfattet nedenfor: 5

Lactose- Hydro- Produceret Rumhas- føde- lyse- glucose tighed strøm grad

1Q (h-1) % (w/v) % g/h*ml IML

1) 6,2 7 100 0,43 2) 1,8 3 76 0,04 15 Resultaterne i den sidste kolonne viser, at aktivi teten af den immobiliserede lactase ifølge US patentskrift er ca. 1/10 af aktiviteten af den immobiliserede lactase ifølge opfindelsen.

Ifølge US patentskriftet anvendes den immobiliserede 20 lactase i op til 6 uger, medens den immobiliserede lactase ifølge opfindelsen kan anvendes i op til 200 dage uden nedsættelse af aktiviteten.

3) Der gås frem som i eksempel 1. Der anvendes en fødestrøm 25 af 5%'s lactoseopløsning, og hydrolysen gennemføres ved en pH-værdi på 4,5 og en temperatur på 30°C. Hydrolysehastigheden er 4,53 μmol/mg·min. Aktiviteten er således 596 ^mol/min.*g (da 131,5 mg lactase er immobiliseret på 1 g bærer i dette eksempel).

30 4) Ifølge FR offentgørelsesskrift nr. 2.381.059 opnås følgende resultater:

Eksempel 7: 68 μπιοΐ/min. *g baseret på 1,70 μιηοΐ/ι^'ΐηΐη.

Eksempel 12: 264 μιηοΐ/min. *g baseret på 2,2 μmol/mg·min.

35 Aktiviteterne er således kun ca. 11 hhv. ca. 50% af aktiviteten af den immobiliserede lactase ifølge opfindelsen.

Claims (3)

1. Den optimale pH-værdi med hensyn til lactose er 4,0 til 5,0, forholdet mellem aktiviteten ved pH = 6,5 og ved pH = 4,5 er 0,55-0,1 (substrat: lactose), og den immo- 25 biliserede lactase er enzymatisk aktiv i pH-området fra 2,0 til 8,0.

1. Immobiliseret vanduopløselig lactase, kendetegnet ved, at det er en lactase fra Aspergillus ory-zae, der har følgende egenskaber: 5 i) den optimale pH-værdi er 4,5 til 5,0 (substrat: lactose) ,

2. Michaelis' konstant Km er 0,15-0,1 mol/liter (pH = 4,5, 30°C, substrat: lactose).

2. Immobiliseret lactase ifølge krav 1, kende-20 tegnet ved, at den har følgende enzymatiske egen-, skaber:

2. Michaelis' konstant Km er 0,1±0,05 mol/liter (pH = 4,5, 30°C, substrat: lactose), og 3. en inhiberingskonstant fra galactose på 0,007+0,004 mol/liter (pH =4,5, 30“C, substrat: lactose), 10 hvilken lactase er immobiliseret ved hjælp af covalent binding på et bærestof af en makroporøs, amfoter phenol-formaldehyd ionbytterharpiks med et specifikt overfladeareal på 1 m2/g eller derover, en anionbytterkapacitet, der hidrører fra amino- eller substituerede aminogrupper, på 1 mækv/g 15 eller derover, en kationbytterkapacitet, der hidrører fra carboxymethylgrupper, på 0,5 mækv/g eller derover og et samlet rumfang af makroporer, der har en diameter på 100 til 2000 Å, på 0,1 cm3/g eller derover.

3. Immobiliseret lactase ifølge krav 1, kende-30 tegnet ved, at inhiberingskonstanten fra galactose K± er 0,15-0,1 mol/liter (pH = 4,5, 30°C, substrat: lactose). 35