JPS5951279B2 - 酵素固定化用担体及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素の固定化用担体とその製造法に関し、より
詳しくは１ ｍｅｑ／ｇ−乾燥樹脂以上の陰イオン交換
基と０．５ｍｅｑ／ｇ−乾燥樹脂以上のカルボキシメチ
ル基を共に有するマクロ多孔性合成樹脂（本発明に於い
て単に樹脂と記述したものも全て多糖類及びその誘導体
を含まない合成樹脂を意味する。

）よりなる酵素固定化用担体及びその製造法に関する。

本発明の目的は固定化酵素活性が高くかつ活性保持性（
安定性）が良く、しかも多くの場合担体の単位重量当り
の酵素固定化量も多い固定化酵素を与える酵素固定化用
担体及びその製造法を提供する事にあり又酵素を固定化
する事により安定性を増大させ本来均一水溶液反応触媒
である酵素を反復および連続使用を可能にし工業的使用
に好適な固定化用担体及びその製造法を提供する事にあ
る。

工業的使用に於ける固定化酵素の有用性の為に近年数多
くの酵素固定化技術が開発されており（例えばサボロス
キー著“インモウビライズドエンザイム“ （Ｃ，Ｒ，
Ｚａｂｏｒｓｋｙ 、 ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＥｎｚ
ｙｍｅｓ ）シー・アール・シー・プレス〔Ｃ０Ｒ，Ｃ
Ｐｒｅｓｓ） １９７３年）従って多くの固定化用担体
が公知である。

これら担体のうち多糖類及びその誘導体例えばセルロー
ス或いは架橋テ゛キストラン及びそれらのイオン性誘導
体は良く用いられており、かなりの成功をおさめている
ものもある。

しかしながらこれら多糖類は機械的強度が十分ではなく
、カラム操作等に於いて十分な流速が得られにくく、又
目づまりを起し易い、更に微生物類の侵食に対しても弱
い等の弱点を持っている。

その上イオン性多糖類誘導体にイオン結合で固定化した
場合には反応溶液或いは生成溶液がやや濃厚な電解質溶
液である場合には酵素が簡単に脱離するという点も実用
上大きな問題である。

一方イオン交換樹脂を固定化酵素の担体として使用する
事は１９５０年代後半には公知（例えばＢｉｏｃｈｉｍ
、 Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ３６巻２４４頁（１９５
９年））であるが担体単位重量当りの酵素固定化量が非
常に少く、得られた固定化酵素の活性も低い為実用的な
意義は薄いとみなされていた。

しかしながら合成樹脂を母核とするイオン交換樹脂類は
一般に十分な機械的強度を持ち、大型カラムに充填した
場合も比較的損傷がなく長期連続運転に耐え、また適当
な粒度を持つ為にカラム操作に於いて十分な流速を確保
でき、更に微生物類の侵食も受けにくく安価である等の
いくつかの点で多糖類及びその誘導体よりも優れた特徴
を持っている。

こうした長所を生かし、その上活性及び活性保持性が良
くしかも酵素固定量も多い固定化酵素を与える抗体を得
る為鋭意研究したところ、多くの酵素蛋白質に対して特
異的親和性を有するカルボキシメチル（以下ＣＭと略記
）基を有し、かつイオン性基としてＣＭ基以外に１級ア
ミン基、２級アミ７基、３級アミノ基或いは４級アンモ
ニウム基等の陰イオン交換基をも同時に有する両性イオ
ン交換樹脂で、しかも約１００人から数１０００人程度
０孔径のマクロポア−を多数持ち従って大きな比表面積
と細孔容量を持ついわゆるマクロ多孔性樹脂あるいはマ
クロ網目構造型樹脂は上記の条件を満す優れた担体であ
り特に固定化酵素を用いて長期の連続運転を行う際にと
りわけ重要な要因である活性保持性（操作条件下での安
定性）が非常に良い画定化酵素を与えるから実用上特に
優れた担体である事を見い出し本発明に到達した。

ＣＭ基とアミン基類等の陰イオン交換基とを共に有する
両性イオン交換樹脂が固定化担体として優れ、活性保持
性（安定性）の良い固定化酵素を与える理由は担体のイ
オン交換基が、酵素中のイオン性基であるカルボキシル
基とアミノ基と類似である為に抗体と酵素分子との親和
性が大きくなる事によるのであろうと考えられる。

本発明の両性イオン交換樹脂は種々の方法で製造できる
が、簡単で好ましいのはマクロ多孔型の陰イオン交換樹
脂にＣＭ基を導入する方法である。

ＣＭ基の導入は、一般式ＸＣＨ２Ｃ００Ｈ（但し、Ｘは
ハロゲン）で表わされる化合物或いはそ・の塩を水酸基
、１級アミン基、２級アミノ基、イミノ基もしくはスル
フヒドリル基を有するマクロ多孔性の合成樹脂又はその
誘導体とアルカリ性化合物の存在下で反応させることに
よって達成される。

ただし、反応時にマクロポア−の内部まで反応溶液で濡
れる様にする事は置換度の高いＣＭ化樹脂を得る為に重
要である。

一回の反応で多量に導入されない場合は同じ反応を２回
、３回と繰り返すと良い。

ＣＭ化試剤の中では反応性及び経済的観点からモノクロ
ル酢酸或いはモノクロル酢酸ナトリウム塩が最も有利で
ある。

ＣＭ化試剤の使用量は得ようとするＣＭ化樹脂のＣＭ基
の導入量によって異なるが本発明の趣旨からあまり導入
量の少い樹脂は意味がない。

通常反応をすみやかに行わしめる為に化学量論量よりも
過剰に使用する方が有利である。

ＣＭ化反応を行わしめようとする樹脂のモル数を正確に
知る事は非常に困難である。

経験的に得られるＣＭ化剤の好ましい使用量は乾燥樹脂
１部に対して約１／２部ないし１０部であり、より好ま
しくは２７３部ないし３部である。

（本発明に於け６’ｒＨ脂の乾燥重量は、当該樹脂が陰
イオン交換樹脂の場合はＯＨ形に、両性イオン交換樹脂
の場合はＨ形に、又イオン交換基を持たない中性樹脂の
場合は酸、次いでアルカリその次に多量の水で洗浄し各
々コンディショニングした後６０℃で６時間以上真空乾
燥後１８℃ないし２５℃の室温に２時間以上放置し、恒
量に達した後ひよう量した値を採用したものである。

以下に於いて樹脂重量又は担体重量を示す際に特に乾燥
重量或いは乾燥担体と記述されていなくても全てこの方
法で測定した乾燥重量を意味する。

）アルカリ性化合物としては水酸化ナトリウム、水酸化
カリウムなどのアルカリ金属の水酸化物、水酸化マグネ
シウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属の水酸
化物或いは場合によってはトリエチルアミン等の有機ア
ミン類も使用可能であるが、最も好ましいのは水酸化ナ
トリウムである。

アルカリ性化合物の添加量はＣＭ化試剤の約１７３倍モ
ルないし２倍モル程度が好ましい。

ＣＭ化反応に際しては副反応としてグリコール酸が生成
するがあまり多量のアルカリ性化合物を使用すると副反
応が多くなｌ）ＣＭ化試剤の効率が悪くなるので最も好
ましいアルカリ性化合物添加量はＣＭ化試剤の約１７３
倍モルないしは約２倍モルまでである。

ＣＭ化しようとする樹脂としては工業用触媒として実用
的に優れた固定化酵素用担体という本発明の趣旨に合致
するのは水酸基、１級アミン基、２級アミン基、イミノ
基もしくはスルフヒドリル基の中の１種又は２種以上の
官能基を持ち、かつ架橋の程度によってできるミクロポ
アー以外に約百へないし数千人程度の孔径の多数のマク
ロポア−を持ち、従って大きい細孔容量と大きい比表面
積を持つマクロ多孔性柑脂である。

マクロポア−は特殊な重合法によって物理的に付与され
たもので一般に物理的強度もミクロポアーしか持たない
ゲル型樹脂より優れており連続運転に適している。

マクロ多孔性柑脂は又ＭＲ型、ＭＰ型、マクロ網目構造
型或いはハイポーラス型などとも称されている。

マクロ多孔型柑脂が酵素の固定化に関して効果を明らか
に示すには少なくとも１ｍ２７ｇ−樹脂以上非常に好ま
しくは５ ｍ□／ｇ−樹脂以上の比表面積（比表面積は
乾燥樹脂をＣａｒｌｏ−Ｅｒｂａ社の表面積測定装置に
よって窒素吸着法で測定し、ＢＥＴ法でテ゛−タ処理し
て算出した値）を有し、かつ孔径１００人から２０００
八までの大きさのマクロポア−の細孔容量の合計が少な
くとも０．ｌｃｃ／ｇ −樹脂以上であることが必要で
あり、０．２ｃｃ／ｇ−樹脂であればより好ましい。

（孔径及び細孔容量はＣａｒｌｏ −Ｅｒｂａ社の水
銀圧入式ポロシメーターで測定したものでマクロポア−
は円形の断面積を持つ円筒形と仮定しデータ処理し算出
した値） ２０００Å以上の大きな孔径の細孔は酵素の
大きさよりもずっと大きいため固定化された酵素の安定
性に殆んど寄与しない。

好ましい平均孔径は固定化する酵素の種類によって異る
が、一般に１５０人から１０００人の間である場合が多
い。

以上の条件を満すマクロ多孔性の樹脂は公知の方法でも
製造できるが一方これらの条件を満す既成量（主として
陰イオン交換樹脂）が販売されており容易に入手できる
。

ただし、市販の樹脂は水酸基、脂肪族１級アミン基もし
くは脂肪族２級アミン基が主でスルフヒドリル基、イミ
ノ基或いは芳香族アミン基を有するものは少い。

いくつかの実例とその物理的及び化学的性質を表に示す
。

なお、比表面積と全細孔量の上限は厳密に限外されない
が余り過大になると樹脂の機械的強度か十分でなくなる
ので比表面積は１２０ｍ２／ｇ−樹脂層下、全細孔容量
は全樹脂体積の８０％以下であることが好ましい。

反応溶媒に関しては、大量の水を用いることは好ましく
なく、アルカリ性化合物と等モルから１０倍モル程度に
とどめておき、反応物質の混合を良くする為に水と混り
うる非水溶媒を用いるのが良い。

例えば、メタノール、エタノール、アセトン、ジオキサ
ン、テトラハイドロフラン等が利用できる。

反応温度は、副反応を出来る丈おさえる為に５０℃以下
である事が好ましく、ＣＭ化剤の効率を出来る丈高める
為には５℃ないし３０℃がより好ましい。

攪拌は反応試剤が良く混和される程度に、しかし樹脂は
粉砕されない程度に行えば良い。

ＣＭ基に基づくイオン交換容量は本発明の趣旨からして
最低０．５ｍｅｑ／ｇ−樹脂である事が必要であり、よ
り好ましくは１．Ｏｍｅｑ／ｇ −樹脂以上である。

又同時に少くとも１ｍｅｑ／ｇ −１ｍ脂以上の陰イオ
ン交換基を持っている必要がある。

本発明に於けるイオン交換容量は陰イオン交換基量を測
定する場合は樹脂をコンディショニングしＯＨ形とし、
陽イオン交換基量を測定する場合はＨ形とし、それぞれ
バッチ法で沖和滴定によりイオン交換容量を算出したも
のであり、全て先に述べた方法で乾燥し、ひよう量した
、単位乾燥樹脂重量当りの値で表示した。

陰イオン交換樹脂にＣＭ基を導入した場合はＣＭ基導入
による重量増加の為に単位乾燥樹脂重量当りの陰イオン
交換当量はＣＭ基大入以前りもやや小さい値になるのは
当然である。

本発明に於けるマクロ多孔性両性イオン交換樹脂の固定
化酵素抗体としての一つの特色はいわゆる“吸着法“に
よる固定化以外に、水酸基、１級アミ７基もしくは２級
アミン基などが樹脂中に未反応で残存している限り共有
結合法による固定化も可能な事である。

しかし、本発明樹脂の固定化担体としての最も優れた特
徴は吸着法によって固定化された酵素の安定性（活性保
持性）が後述の実験例に見る様に非常に良い事である。

これは固定化酵素の工業的利用上非常に有利である。

″吸着法“による固定化酵素の調製は常法により例えば
０．０２Ｍないし３Ｍ濃度程度の酸溶液又はアルカリ溶
液で本発明の樹脂を処理することにより活性化させるが
、或いは固定化しようとする酵素の作用四斤傍に緩衝作
用を有する０、 ０２Ｍないし３Ｍ濃度程度の緩衝液で
緩衝化させた後、いずれの場合もよく水洗し、固定化し
ようとする酵素の溶液に両性イオン交換樹脂をマクロポ
ア−の内部まで濡れる様に十分に浸漬させ、必要に応じ
て攪拌した後濾過し水洗すれば達成される。

吸着固定化時の温度は固定化しようとする酵素が極度に
耐熱性でない限り４０℃以下が望ましく特に１０℃以下
が望ましい。

かくして得られる固定化酵素は通常乾燥担体１ｇ当り１
００ｍｇ或いはそれ以上の酵素蛋白質を含み、非常にイ
オン強度の高い塩溶液で洗浄されない限り安定である。

本発明による担体に固定化される酵素は単純蛋白質から
なる酵素のみならず補酵素を必要とする酵素、更に一種
の酵素のみならず二種或いはそれ以上の酵素を同時に固
定化することができる。

又両性イオン交換樹脂になっているから、酸性蛋白質の
酵素も塩基性蛋白質の酵素もどちらも固定化できる。

一方共有結合法の場合には、本発明の樹脂中に存在する
水酸基、１級アミン基、２級アミン基、スルフヒドリル
基或いはイミド基の反応性を利用する種々の結合方法が
適用可能である。

特に（１）塩化シアヌール又はその誘導体を用いるＳ−
トリアジニル誘導体による結合法、（２）グルタルアル
デヒドを用いる結合法、（３）アンド結合による結合法
、（４）モノハロゲンアセチル誘導体による結合法等が
共有結合法の中では比較的簡単でしがも安定な固定化酵
素を与える方法として適している。

共有結合法による固定化の場合は担体単位重量当りの固
定化酵素量は通常“吸着法“による固定化の場合より少
いが固定化酵素の比活性及び高濃度の電解質溶液共存下
の安定性等には優れたものが得られる。

本発明の担体によって固定化される酵素には特に制限が
なく固定化によって酵素活性が全くなくなるもの以外は
制限なくいずれの酵素にも適用できる。

例えばプロナーゼ、アミノアシラーゼ、グルコースイソ
メラーゼ、ラクターゼ、ヌクレアーゼ、β−アミラーゼ
、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、ウレアーゼ、デ゛ア
ミナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ等が
挙げられる。

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するがその
趣旨を越えない限り以下の実施例によって限定されるも
のではない。

実施例 １ １０、 ＯｇのデュオライトＡ−７を７０ｍ１のメタノ
ールに浸漬し、この液に６．２３ｇの苛性ソーダを７ｍ
ｌの水に溶解した濃厚苛性ソーダ溶液を加え、良く攪拌
混合した後、氷水で冷却しながら３５分間アスピレータ
−で吸引脱気し、マクロポア−の内部まで、′濡らし“
た。

次に８．６８ｇのモノクロル酢酸を１０ｍ１のメタノー
ルに溶解させた溶液を加え室温（２４±１℃）で７時間
ゆっくり攪拌しながら反応させた。

反応後樹脂を濾過し水、０．５Ｍ濃度苛性ソーダ水、水
、０．５Ｍ硝酸水の順で２回繰り返し洗浄後水で十分に
洗浄し樹脂をＨ型とした後導入されたカルボキシメチル
基のイオン交換容量を測定した。

イオン交換容量４．８２ｍｅｑ／ｇ−樹脂、ＣＭ化反応
による重量増加は３．８７ｇ即ち３８．７％であった。

この重量増加によって陰イオン交換容量は７．１０ｍｅ
ｑ／ｇ−樹脂から５．１７ｍｅｑ／ｇ−樹脂に見かけ上
減少したことが確認された。

実施例 ２ 実施例１と全く同一条件でＣＭ化反応を開始し３時間後
に１．４２ｇの苛性ソーダと３．３５ｇのモノクロル酢
酸を５ｍｌの水と１０ｍ１のメタノールの混合液に溶解
したものを加え更に４時間反応させた。

カチオン交換容量は５．４７ｍｅｑ／ｇ−樹脂で重量増
加割り合いは３４．２％であった。

（本実施例に於けるイオン交換容量と重量増加の違い
の原因は現在のところ明確で゛はない。

）実施例 ３ １０ｇのデュオライトＡ−６をｌ１ｇのモノクロル酢酸
ソーダを溶解した水１０ｍ１−メタノール６０ｍ１の混
合溶液に浸漬し、氷水温度で冷却しながらアスピレータ
−で２０分間脱気した。

次いで６．０ｇの苛性ソーダを８ｍｌの水に溶解した濃
厚苛性ソーダ溶液を加え、２２±２℃で６時間ゆるやか
に攪拌して反応させた。

反応後柑脂を濾過し水洗後コンテ゛イシヨニングしＨ型
にした。

導入されたカルボキシメチル基のイオン交換容量は３．
１０ｍｅｑ／ｇ−樹。

脂。

重量増加は２２．３％であった。ＣＭ化反応後の陰イオ
ン交換容量は４．３８ｍｅｑ／ｇ−樹脂であつた。

実施例 ４ 酸、アルカリ次いで水で十分洗浄した後乾燥した１０．
Ｏｇのテ゛ニオライｌ−３−３０を７．２ｇの苛性ソ
ーダを溶解した３５ｍ１の水溶液に浸漬し、この溶液を
氷水で冷却しながら４０分間アスピレータ−で脱気を行
った。

次いで約３５ｍ１の水を追加し、１８．１ｇのβ−ジエ
チルアミノエチルクロリド塩酸塩を溶解させた５０ｍ１
の水溶液を攪拌を続け２２±１℃の室温に保たれてい存
樹脂−苛性ソーダ混合溶液に２時間かけてゆっくりと滴
下し、その後７時間、合計９時間反応を続けた。

９時間後柑脂を？濾過し、０．５Ｍ濃度の硝酸水、０．
５Ｍ濃度の苛性ソーダ水、次いで洗浄後乾燥せずに直ち
にＣＭ化反応に供した。

耶ち得られた甜脂全てを６．６ｇの苛性ソーダを含む４
５ｍ１の水（５ｍｌ）−エタノール（４０ｍｌ）混合溶
液に浸し氷水で冷却しながら約３０分間ゆっくり攪拌し
た後１３ｇのモノクロル酢酸ソーダを含む７０ｍ１のメ
タノール溶液を加え、２１±２℃で７時間ゆるやかに攪
拌しながら反応させた。

反応復水、０．５Ｍ濃度の苛性ソーダ水、水、０．５Ｍ
濃度の硝酸水の順で２回繰り返して洗浄後樹脂を２分し
、一方はそのまま水で繰り返し良く洗浄しＨ形とした。

他方はもう一度０．５Ｍ濃度の苛性ソーダ水で洗浄後や
はり繰り返して水洗しＯＨ形とした。

導入されたカルボキシメチル基に基づく陽イオン交換容
量は１． ｓｓｍｅｑ／ｇ−樹脂で他方導入されたジエ
チルアミノエチル基に基づく陰イオン交換容量は１．４
９ｍｅｑ／ｇ−樹脂であった。

なおこの両性イオン交換樹脂を固定化担体として使用す
るにあたって全樹脂をＨ形にした。

実施例５〜実施例１２ 以下に陰イオン交換基を有している樹脂へＣＭ基を導入
し、両性イオン交換樹脂を製造した条件及び得られた樹
脂の性質を一覧表にして示す。

反応前に使用樹脂をアルカリ化合物溶液或いはＣＭ化試
剤溶液に浸し、氷水で冷却しながら３０分間ないし１時
間脱気を行った。

洗浄は実施例１と同様にして行い、Ｈ形にしてＣＭ基に
基づく陽イオン交換容量を測定した。

又陰イオン交換容量はＣＭ基の導入反応後、洗浄し、樹
脂をＯＨ形にして測定した値である。

次に杢発明の担体への酵素の固定化と反応ｆ験例のいく
つかを示す。

実験例 １ アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏ
ｒｙｚａｅ）起源のラクターゼ（新日本化学工業製、１
３．３Ｗ／Ｖ％濃度の精製ラクトースを基質とし、ｐＨ
４，５，４０℃に於ける溶液状酵素活性が２４．１７ｍ
ｏｌｅｓ／ｍｇ−ｍｉｎ ） ８００ ｍｇを約４℃に
保った。

０、０２Ｍ濃度でｐＨ５，５の酢酸塩緩衝液４０ ｍｌ
に溶解し、この液に実施例１で製造したＣＭ化デュオラ
イ１−Ａ−７を４．０ｇ浸漬し、８０ＲＰＭで振盪しつ
つ１６時間、約４℃に保ち固定化を行った。

固定化後０、０５Ｍ濃度でｐＨ４，５の酢酸塩緩衝液で
、洗液中に酵素蛋白質が全く見い出されなくなるまで十
分に洗滌した。

固定化酵素量は洗浄液の蛋白質量をローリ−（Ｌｏｗｒ
ｙ）法で測定シタトコ６１４９ｍｇ酵素蛋白質／ｇ−４
Ｂ体と算出された。

固定化酵素の比活性は１３．３Ｗ／Ｖ％濃度の精製ラク
トースを基質にし、ｐＨ４，５，４０℃で１５分間８０
ＲＰＭで往復振盪し、生成したグルコース量より４．８
岬ｏ１ｅｓ／ｍｇ −ｍｉｎと算出された。

本固定化酵素３．０ｇ相当分を内径１２ｍｍの外套管付
きカラムに充填し、カラム温度を４０’Ｃに保ちながら
ｐＨ４，５の０．０２Ｍ濃度の酢酸塩緩衝液に溶解した
７ Ｗ／Ｖ％の精製ラクトース溶液をＳｖ（スペースベ
ロシティ） ＝２，３ｈｒ ”で流下させた。

流出液のグルコースの定量からラクトースの分解率は１
００％であった。

同一濃度のラクトース溶液を全く同一条件で１００日間
昼夜休みなく流下させたが、１００日目のラクトースの
分解率も１００％であり、固定化酵素活性の低下は全く
見られなかった。

又本固定化酵素約１００ｍｇを用い、上記の固定化酵素
の比活性測定を２５回繰り返して行ったが２５回目の活
性は４．７ｆｒ１ｏ１ｅｓ／ｍｇ−ｍｉｎで、バッチ法
でも活性の低下は見られなかった。

実験例 ２ 実験例１で用いたのと全く同じラクターゼ１２００ｍｇ
を０．０５Ｍ濃度でｐＨ５，５の酢酸塩緩衝液６０ｍ１
に溶解し、この液に実施例２で製造したＣＭ化テ゛ニオ
ライトＡ−７を６ｇ浸漬し、温度を２０±２℃に保ちな
がら６時間約１８ＯＲＰＭで回転攪拌を続は固定化を行
った。

固定化後実験例１と同様にして固定化酵素の洗浄を行い
、洗液中の蛋白質量より固定化酵素量は１７０ｍｇ酵素
蛋白質／ｇ−担体と算出された。

又固定化酵素の比活性は実験例１と全く同一条件で測定
して５．２ｆｎｏｌｅｓ／ｍｇ−ｍｉｎであった。

かくして得られた固定化酵素等量ずつ二つに分け、一方
を内径１４ｒｎｍの外套管付きカラムに充填し、カラム
温度を４０℃に保ちながら、実験例１で用いたのと同一
条件の精製ラクトース溶液を５Ｖ−８，□ｈｒ’で流下
させた。

固定化酵素によるラクトースの分解率は９５％であった
。

この固定化酵素カラムによるラクトースの分解実験を３
０日間休みなく続けたが３０日口の分解率は９４％で、
わずかな実験誤差を考慮すれば固定化酵素の活性低下は
３０日間の使用で全くないと言える。

実、験例 ３ 実験例２で調製した固定化ラクターゼの残り半分（担体
３ｇに相当）を内径１４ｍｍの外套管付きカラムに充填
し、カラム温度を４０℃に保ちながら実験例１と同一条
件の緩衝液に溶解した１２Ｗ／Ｖ％の精製ラクトース溶
液を５Ｖ＝５．０ｈｒ−１で３０日間休みなく流下させ
た。

流出液のグルコース量から算出したラクトースの分解率
は３０日間にわたって９１±２．５％の間にあり、固定
化酵素の活性の低下は全く見られなかった。

実験例 ４ アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏ
ｒｙｚａｅ）起源のラクターゼ（新日本化学工業製、１
３．３Ｗ／Ｖ％濃度の精製ラクトースを基質とし、ｐＨ
４，５，４０℃に於ける溶液状酵素活性が５０．９ｆｒ
１ｏ１ｅｓ／ｍｇ−ｍｉｎ） ６００ｍｇを０．０５Ｍ
濃度でｐＨ５，５の酢酸塩緩衝液３０ｍ１に溶解し、こ
の液に実施例５で製造したＣＭ化デュオライトＡ−４を
３．０ｇ浸漬し、約２０℃で７時間、約１８ＯＲＰＭで
回転攪拌しながら固定化を行った。

固定化後実験例１と同様にして固定化酵素の洗浄を行っ
た。

固定化された酵素量は１１８ｍｇ酵素蛋白質／ｇ−担体
であった。

又固定化酵素の比活性は実験例１と同一条件で測定した
ところ９．２ｇｍｏｌｅｓ／ｍｇ−ｍｉｎで゛あった。

コノ固定化酵素を内径的１３ｍｍの外套管付きカラムに
充填し、４０℃で実験例１と同一条件の精製ラクトース
溶液をＳＶ ＝ ５． Ｏｈｒ ”で３０日間休みなく
流下させた。

３０日間ラクトースの分解率は１００％で活性低下は全
く見られなかった。

次いでＳｖのみを８、Ｑｈｒ”に上昇させ、他の条件は
そのままで更に２０日間ラクトースの連続分解を行った
が分解率はやはり１００％を保持し、５０日間の連続使
用に於いても活性の低下は全く見られなかった。

実験例 ５ 市販のパパイン１００ｍｇを４℃に保つ７：ｐＨ６，２
で０、０２Ｍ濃度のリン酸塩緩衝液３０ｍ１に溶解させ
、この溶液に実施例６で製造したＣＭ化テ゛ニオライト
Ａ−４を１．０ｇ浸漬し、４℃から１０℃に保ちながら
、１０時間約１５ＱＲＰＭで回転攪拌しながら固定化を
行った。

固定化酵素をｐＨ６，２で０．０５Ｍ濃度のリン酸塩緩
衝液、０．１Ｍ濃度の塩化ナトリウム溶液および純水の
順で十分に洗浄した。

洗浄液を回収し、回収液中の蛋白質量をローリ−（Ｌｏ
ｗｒｙ）法で定量したところ固定化蛋白質量は７６ｍｇ
／ｇ −担体と算出された。

この固定化酵素の比活性を、０、２８Ｍ濃度のＮ−ベン
ソイル−し−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）を
基質としてｐＨ６，２，４０℃で声スタット（平沼ｌ１
（ｓｔａｔ ５Ｐ−１１）によって測定したところ２．
７／１ｎＯ１ｅＳ／ｍｇ・ｍｉｎであった。

これは固定化前の溶液状酵素の比活性の３５％に相当す
る。

この固定化パパインを上記と同一条件で１５回繰り返し
て活性を測定したところ１５回目の活性は第１回目の活
性の９８％であり、活性の低下は殆んどないと言える。

なお、固定化酵素および溶液状酵素の活性の測定に際し
ては２ Ｘｌ０−３Ｍ濃度のエチレンジアミン４酢酸と
５ Ｘｌ０−”Ｍ濃度のシスティンと０．１Ｍ濃度の塩
化ナトリウムを共存させた。

実験例 ６ 市販の精製トリプシン６０ｍｇを約４℃に保った声７．
５で０．０５Ｍ濃度のトリス−塩酸緩衝液１５ｍ１に溶
解させ、この液に実施例８で製造したＣＭ化デュオライ
ｌ−３−３７を１．０ｇ投入し、約４℃に保ちなから６
０ＲＰＭ程度でゆっくりと回転攪拌しながら固定化した
。

１０時間後固定化トリプシンを戸別し、０．０５Ｍ濃度
のトリス−塩酸緩衝液、０．１Ｍ濃度の塩化す） ＩＪ
ウム溶液、次に蒸留水の順に十分に洗浄した。

洗浄液を回収し、回収液中の蛋白質の紫外吸収強度より
固定化酵素量は５６ｍｇ／ｇ−担体と算出された。

この固定化トリプシンの比活性をＢＡＥＥを基質としｐ
Ｈ７，５，３０℃で０．０２Ｍ濃度の塩化カルシウム存
在下で田スタットで測定したところ５．〜血ｏ１ｅｓ／
ｍｇ−ｍｉｎで、これは溶液状酵素の比活性の２２％に
対応する。

この固定化トリプシンの一部分約１００ｍｇを用いてＢ
ＡＥＥを基質とし上記と同一条件の反応を５回繰り返し
たところ５回目の比活性は４．６μｍｏｌｅｓ／ｍｇ
−ｍｉｎであった。

実験例 ７ 市販のウレアーゼ（東京化成製） １２５０サムナ一単
位を含む２０ｍ１の０．１Ｍ濃度のリン酸塩緩衝溶液（
ｐＨ６，７）を調製し、この液に実施例９で製造したＣ
Ｍ化ダイヤイオンＷＡ−２１を１．０ｇ投入し、約４℃
に保ちながら１６時間約６ＯＲＰＭで回転攪拌を行った
。

固定化後固定化酵素を濾過し０．０５Ｍ濃度のリン酸塩
緩衝溶液及び蒸留水で、Ｐ液中に蛋白質が出なくなるま
で十分洗浄した。

固定化酵素量は３８２サムナ一単位／ｇ−担体と算出さ
れた。

この固定化酵素の活性を３．０重量％の尿素を含む０．
１Ｍ濃度のリン酸塩緩衝液中２０℃でｐＨ６，７が萌１
７．７に変化する時間より測定したところ４１２サムナ
一単位／ｇ−担体なる数値が得られた。

（注１）１サムナー（Ｓｕｍｎｅｔ）単位はリン酸塩緩
衝液中ｐＨ７，０１２０℃で５分間にアンモニア窒素１
ｍｇに相当する尿素を分解する酵素量である。

実験例 ８ ストレプトマイセス属生菌体（長潮産業に、 Ｋ。

製）より抽出し精製した３６０００ｕｎ江の活性を持ち
、ローリ−法で定量した蛋白質量２５５ｍｇのグルコー
スイソメラーゼをｐＨ７，６５で０．０５Ｍ濃度のリン
酸塩緩衝液３０ｍ１に溶解した。

この溶液に実施例１で製造したＣＭ化デュオライ１４−
７を３．０ｇ投入し、室温（約１８℃）で９時間約１２
ＯＲＰＭで回転攪拌し吸着固定化を行った。

固定化後固定化酵素を戸別し、０．１Ｍ濃度のリン酸塩
緩衝液（ｐＨ７、６５）で十分洗浄した。

炉液の活性測定及び蛋白質測定より固定化された活性は
９５００ｕｎｉｔ／ｇ−担体で蛋白質量は６１ｍｇ／ｇ
−担体であった。

かくして得られた固定化グルコースイソメラーゼを内径
１、２ｍｍの外套管付きカラムにつめ、外套管の温度を
６０℃に保ちなから５４Ｗ／Ｖ％の精製グルコ−水溶液
（５Ｘ １０−３Ｍ濃度のＭｇＳＯ４・７Ｈ２０を含み
、ｐＨ７，６５）をカラムの上部から５Ｖ＝２．Ｑｈｒ
”で流下させ異性化反応を行った。

反応開始後約５００時間は異性化率５０〜５１％を保ち
、その後ゆっくりと活性は低下した。

（注２） ０．０５Ｍ濃度のリン酸塩緩衝溶液中、０
、００５Ｍ濃度のＭｇＳＯ４・７Ｈ２０の共存下でｐＨ
７，０，７０℃で０．１Ｍ濃度のＤ−グルコース溶液を
基質とし１時間反応させ、１ ｍｇのフラクトースを生成する酵素量をグルコースイソ
メラーゼ１ｕｎｉｔとした。

（注３） フラクトースの定量はＪＡＳの規定に従って
システィン−カルバゾール−硫酸法 で測定した。

実験例 ９ エアロバクターエアロゲネス起源のプルラナーゼ（長潮
産業製） ２００ｍｇを０．０２Ｍ濃度の酢酸緩衝液（
ｐＴ（５，Ｏ） ３０ｍ１に溶解し、この溶液に実施例
９で製造したＣＭ化ダイヤイオンＷＡ−２１を３ｇ投入
した。

約１０℃に保ちながら、ゆっくりと回転攪拌を１６時間
続は固定化を行った。

固定化酵素量は回収した洗浄液より４３ｍｇ／ｇ−担体
と算出された。

この固定化酵素全量を内径１２ｍｍの外套管付きカラム
に充填し、カラム温度を４０℃に保ちながらｐＨ５，０
に調節した１、０％濃度の精製プルラン溶液を５Ｖ＝１
ｈｒ’で昼夜休みなく１０日間流下させた。

流出水のマルトトリオース量をソモギー・ネルラン法で
測定したところマルトトリオースへの変換率は１０日間
９５±４％で変化しなかった。

実験例 １０ 実験例１で用いたのと同じラクターゼ６００ｍｇを用い
、実験例１と同一条件で実施例１１で製造したＣＭ化ダ
イヤイオンＷＡ−２０３，Ｏｇ−担体とし固定化を行っ
た。

固定化酵素量は洗浄液の蛋白質量から９８ｍｇ／ｇ−担
体と算出された。

実験例１に記した条件で本固定化酵素の比活性を測定し
たところ４．５岬ｏ１ｅｓ／ｍｇ−ｍｉｎであった。

この測定に用いた約１００ｍｇの固定化ラクターゼをそ
のまま用い、ラクトース溶液のみを１回ごとに新しい溶
液と交換し比活性測定を１５回繰り返したところ１５回
目の活性は３．５胛ｏ１ｅｓ／ｍｇ−ｍｉｎであった。

実施例１１で製造した抗体は実施例１で製造された担体
よりも固定化酵素の操作安定性の点で少しおとっている
ことがわかる。

その原因の一つとして、実施例１１では導入されたＣＭ
基の量が少いことによると考えられる。

しかし次に示す比較参考例の場合よりも安定な即ち活性
保持性の良い固定化酵素が得られていることは明かであ
る。

比較実験例 アスペルギルス・オリゼー起源のラクターゼが酸性蛋白
質である事を考慮し、弱塩基性のマクロ多孔性イオン交
換樹脂であるダイヤイオンＷＡ−２０を担体として用い
、実験例１０と全く同に実験を行った。

固定化酵素量７９ｍｇ／ｇ−担体、固定化酵素の比活性
は３．６／Ｊｍｏｌｅｓ／ｍｇ−ｍｉｎで、コノ比活性
測定実験を１０回繰り返して行ったところ５回目では比
活性は１．４ｆｎｏｌｅｓ／ｍｇ−ｍｉｎに減少し、１
０回目では０．３岬ｏ１ｅｓ／ｍｇ−ｍｉｎに減少し、
工業的使用に耐える安定な固定化酵素は得られなかった
。

実験例 １１ 実施例６で製造したＣＭ化デュオライ）４−４を２．Ｏ
ｇ取り、ＩＮの苛性ソーダ２０ｍ１に浸漬し、４℃で１
５分間脱気したのち過剰のアルカリ溶液を）濾過し取り
除いた。

この樹脂を５分間室温（約２０℃）で２５ｍ１のジオキ
サンに浸漬させ攪拌後前もって調製してあった４ｇの塩
化シアヌールを含む２０ｍ１のジオキサン溶液を加え、
室温で激しく攪拌した。

３分後２５ｍ１の冷水を反応液に加え、５秒後更に酢酸
２５ｍ１を加え反応を停止させた。

混合液を濾過後甜脂を手早く冷水および冷アセトンで洗
浄し、この樹脂を、ストレプトマイセス・グリセウス起
源の市販酵素プロナーゼＥ２２０ ｍｇを含む０、０５
Ｍ濃度のリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ乙８） ３０ｍ１に加
えた。

約４℃に液温を保ちながら攪拌し０．２規定の苛性ソー
ダの添加によりｐＨ７，８に保ち、５時間固定化反応を
行った。

固定化酵素を炉別し、氷冷したＩＭ濃度の塩化すトリウ
ム溶液、０．１Ｍ濃度のリン酸塩緩衝液、次に氷冷水の
順に洗浄廃液中に蛋白質が見い出されなくなるまで洗浄
した。

固定化酵素量は８６ｍｇ／ｇ−担体、２０％濃度のＤＬ
−リジンメチルエステルを基質とし、ｐＨ６，０，４０
℃でｐＨＸタットで測定した比活性は２．７１Ｉｍｏｌ
ｅｓ／ｍｇ−ｍｉｎであった。

次に１０％濃度のし一リジンメチルエステル１０ｍ１を
基質とし、本固定化酵素的１００ｍｇを用いて−６，０
，４０℃でバッチ法により繰り返し実験を行った。

一回の実験時間は４０分とし、田スタットで測定した反
応速度が第１回目の速度の半分に低下した繰り返し回数
を半減回数とすると本固定化酵素の半減回数は８３回で
あった。

実験例 １２ 実施例２で製造したＣＭ化テ゛ニオライｌ−Ａ−７２ｇ
をメタノールに浸漬し、塩化水素ガスを用いてメチルエ
ステル化し、更に抱水ヒドラジンでヒドラジド化した。

その後３％亜硝酸ソーダ溶液でアンド化し直ちに市販の
ウレアーゼ（東京化成製） １０００サムナ一単位を含
むリン酸塩緩衝液２０ｍｌに浸漬し、約４℃で１６時間
ゆっくりと振盪しながら固定化反応を行った。

次いで５Ｍ濃度の塩化ナトリウム溶液、０．１Ｍ濃度の
リン酸塩緩衝液（…６．７）及びイオン交換水で固定化
酵素を洗浄し、得百７エた固定化酵素活性を３．０％尿
素を基質とし、２０℃で比色法によって測定したところ
２９０サムナ一単位／ｇ−担体であった。

この固定化ウレアーゼを用いて繰り返し反応実験を１０
回行ったが活性の低下は殆んど観察されなかった。

実験例 １３ 実施例４で製造した両性イオン化デュオライトＳ −３
０２，Ｏｇをブロモ酢酸２５ｇを溶解させたジオキサン
２０ｍ１に浸漬し、室温で８時間ゆっくり攪拌した。

次いで１７ｍ１のブロモアセチルプロミドを徐々に滴下
し、滴下後６時間攪拌を続けた。

反応後氷冷した０、１Ｍ濃度の炭酸ナトリウム溶液及び
氷冷水で洗浄しブロモアセチル化樹脂を得た。

この樹脂をアミンアシラーゼ（大野製薬製１５０００単
位／ｇ ） １００ｍｇを溶解した０、２Ｍ濃度のリン
酸塩緩衝液（ｐＴ（８，５）に浸漬し、４勺４℃で１８
時間ゆっくり攪拌しながら固定化反応を行い、次いで得
られた固定化酵素を繰り返し洗浄した。

０．２Ｍ濃度のＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニン溶液（
ｐＨ７，０、ｌＸｌ０−’モルのＣｏＣ１□含有）を基
質として３７℃で１定化酵素の活性をＬ−メチオニン生
成量より測定したところ２７０単位／ｇ−担体であった
。

この固定化酵素を全量を内径１０ｍｍの外套管付きカラ
ムに充填し、４０℃に保ちなから５Ｖ＝１．１で活性測
定に用いたＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニン溶液を連続
的に昼夜休みなく流下させた。

１日後のＬ体の加水分解率は９９％で１０日後に於いて
も活性の低下は殆んど見られなかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ カルボキシメチル基による陽イオン交換容量０、５
   ｍｅｑ／ｇ−乾燥樹脂以上と陰イオン交換基による陰イ
   オン交換容量１ ｍｅｑ／ｇ−乾燥樹脂以上を有し、比
   表面積が１ｍ２／ｇ−乾燥樹脂以上で孔径（直径）１０
   ０人ないし２０００人のマクロポア−の容量の合計がＯ
   ，ｌｃｃ／ｇ−乾燥樹脂以上のマクロ多孔型両性イオン
   交換樹脂よりなる酵素固定化用担体。 ２ 一般式ＸＣＨ２Ｃ００Ｙ（但しＸはハロゲン、Ｙは
   水素またはアルカリ金属）で表わされる化合物を、当該
   化合物と反応しつる官能基を有し、１ｍｅｑ／ｇ−乾燥
   樹脂以上の陰イオン交換能を持ちかつ比表面積が１ ｍ
   □／ｇ−乾燥樹脂以上で孔径１００人ないし２０００人
   のマクロポア−の容量の合計が０．１ｃｃ／ｇ−乾燥樹
   脂以上のマクロ多孔型陰イオン交換樹脂とアルカリ性化
   合物の存在下で反応せしめることにより０．５ｍｅｑ／
   ｇ−乾燥樹脂以上のカルボキシメチル基を導入せしめ両
   性イオン交換樹脂を調製する事を特徴とする酵素固定化
   用抗体の製造法。