DK160563B - Beta-amylase, fremgangsmaade til dens fremstilling samt praeparat indeholdende beta-amylasen - Google Patents

Beta-amylase, fremgangsmaade til dens fremstilling samt praeparat indeholdende beta-amylasen Download PDF

Info

Publication number
DK160563B
DK160563B DK077086A DK77086A DK160563B DK 160563 B DK160563 B DK 160563B DK 077086 A DK077086 A DK 077086A DK 77086 A DK77086 A DK 77086A DK 160563 B DK160563 B DK 160563B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
amylase
enzyme
preparation
beta amylase
maltose
Prior art date
Application number
DK077086A
Other languages
English (en)
Other versions
DK160563C (da
DK77086D0 (da
DK77086A (da
Inventor
Helle Outtrup
Barrie Edmund Norman
Original Assignee
Novo Industri As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Industri As filed Critical Novo Industri As
Publication of DK77086D0 publication Critical patent/DK77086D0/da
Priority to DK077086A priority Critical patent/DK160563C/da
Priority to US07/015,239 priority patent/US4970158A/en
Priority to EP87301408A priority patent/EP0234858B1/en
Priority to DE87301408T priority patent/DE3788291T2/de
Priority to ES87301408T priority patent/ES2059362T3/es
Priority to AT87301408T priority patent/ATE97954T1/de
Priority to JP62034706A priority patent/JPS62201577A/ja
Priority to CA000530152A priority patent/CA1304030C/en
Publication of DK77086A publication Critical patent/DK77086A/da
Publication of DK160563B publication Critical patent/DK160563B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK160563C publication Critical patent/DK160563C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2425—Beta-amylase (3.2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/22—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a beta-amylase, e.g. maltose
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

1 DK 160563 B
Opfindelsen angår en hidtil ukendt β-amylase, en fremgangsmåde til dets fremstilling samt præparater indeholdende β-amylasen sammen med andre enzymer.
5 Som β-amylase betegnes sædvanligvis de exo-virkende maltogene amylaser, som katalyserer hydrolysen af 1,4-a-glucosid bindinger i amylose, amylopektin og beslægtede glucosepolymerer. Maltoseenheder fjernes trin for trin fra de ikke-reducerende kædeender, indtil molekylet er nedbrudt eller, hvis det drejer 10 sig om amylopektin, indtil et grenpunkt nås. Den frigivne maltose har den β-anomere form, heraf betegnelsen β-amylase.
β-formen af maltose vil i vandige opløsninger isomeri-sere spontant til en blanding af a- og β-formerne. Langvarig reaktion af β-amylase på amylopektin eller delvist nedbrudt 15 amylopektin fører til dannelsen af β-grænsedextrin, d.v.s.
materiale, som ikke er påvirkelig ved yderligere hydrolyse med β-amylase.
β-amylaser kan anvendes til fremstilling af maltose-holdige sirupper, der kan bruges i konfekture-, bageri- og 20 bryggeriproduktion.
Ved fremstillingen af højmaltosesirupper anvendes β-amylaser almindeligvis sammen med afgreningsenzymer for at forøge maltoseindholdet i produktet ved hydrolyse af 1,6-a-glucoside bindingerne i β-grænsedextrinerne.
25 β-amylaser er blevet isoleret fra forskellige planter og mikroorganismer (W.M. Fogarty og C.T. Kelly: Progess in Industrial Microbiology, bind 15, p. 112-115, 1979). Disse β-amylaser er kendetegnet ved temperaturoptimer i området fra 40°C til 65°C og pH-optimum i området fra 4,5 til 7.
30 Afgreningsenzymer udviser oftest et pH-optimum i området fra 3,5 til 6 og er således mere aktive i en sur opløsning. Ved kombineret anvendelse af β-amylaser og afgreningsenzymer er det valgte pH sædvanligvis et kompromis mellem pH-optimet af hvert af de valgte enzymer, eller enzymerne anvendes 35 successivt.
DK 160563 B
Ved en fremgangsmåde til fremstilling af maltose, hvori stivelse i en vandig opløsning hydrolyseres ved hjælp af en β-amylase, er det endvidere en fordel at anvende temperaturer på eller over 60°C for at hæmme retrogradering og for at undgå 5 mikrobiel infektion.
Plånte-β-amylaserne har yderligere den ulempe, at der til fremstilling deraf kræves store mængder råmateriale og et stort energiforbrug til ekstrahering og forarbejdning, hvorimod mikrobielle β-amylaser kan produceres i stor målestok med 10 relativt lave omkostninger.
Dansk patent nr. 153.799 beskriver en maltogen amylase, som er tilstrækkeligt thermostabil til anvendelse ved temperaturer i området fra 60 til 65°C. Imidlertid ligger dette enzyms pH-optimum ved pH 4,5 til 5,5. Ydermere hydrolyserer enzymet 15 ifølge det nævnte danske patent maltotriose, hvilket resulterer i fremstilling af glucose.
I højmaltosesirupper bør tilstedeværelsen af glucose undgås, og anvendelsen af den omtalte maltogene amylase kræver derfor påfølgende fjernelse af den fremkomne glucose til et 20 akceptabelt niveau.
Der er derfor stadig et behov for et effektivt mikrobielt β-amylaseprodukt, som er tilstrækkeligt thermostabilt til at kunne anvendes ved 60 - 70°C i perioder af længere varighed til at muliggøre hydrolyse af stivelsen på en rentabel måde, som 25 er tilstrækkeligt stabil ved pH-værdier under 5 til opnåelse af samtidig hydrolyse af stivelse med β-amylasen og et afgrenings-enzym under optimale forhold, og som under produktionen af højmaltosesirup ikke producerer for store mængder glucose, som i nogle tilfælde bagefter skal fjernes fra siruppen.
30 Det er den foreliggende opfindelses formål at tilveje bringe en hidtil ukendt mikrobiel β-amylase, som har en høj temperaturstabilitet, et pH-optimum ved pH-værdier under 5, og som producerer minimale mængder glucose.
Den foreliggende opfindelse bygger på den opdagelse, at 35 en hidtil ukendt mikrobiel extracellulær β-amylase (21 - 51 β-amylase), der har disse egenskaber, kan fremstilles fra en nyligt isoleret Bacillus stamme NCIB 11608.
3
DK 160563 B
Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvisning til tegningen, hvori fig. 1 illustrerer det maltogene enzyms relative aktivitet i forhold til temperatur, og 5 fig. 2 illustrerer relativ aktivitet i forhold til pH.
Ifølge et første aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en hidtil ukendt thermostabil β-amylase, som er ejendommelig ved, at den har temperaturoptimum målt ved 30 10 minutters reaktionstid i acetatpuffer (0,1M) ved pH 4,5 på ca 70°C, pH optimum ved ca. 60° i området mellem 4 og 5 og kan fremstilles ved dyrkning af Bacillusstammen NCIB 11608 i et passende næringsmedium og efterfølgende isolering af den dannede β-amylase med de ovennævnte egenskaber fra kulturvæsken.
15 Ifølge et andet aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af den ovenfor omtalte thermostabile β-amylase, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved at Bacillusstamme NCIB 11608 eller varianter eller mutanter deraf med i det væsentlige samme egenskaber som 20 denne dyrkes i et egnet næringsmedium indeholdende carbon- og nitrogenkilder og uorganiske salte, efterfulgt af udvinding af β-amylaseenzymet fra dyrkningsmediet.
Forsøg har vist, at den nye β-amylase er egnet til produktion af maltose og højmaltosesirupper. sådanne produkter er 25 af betydelig interesse i forbindelse med produktionen af visse konfekturevarer p.g.a. lav vandoptagelse, lav viskositet, god varmestabilitet og mild, ikke for sød maltosesrnag.
Den industrielle fremgangsmåde til fremstilling af maltosesirupper omfatter forflydigelse af stivelse, derpå 30 forsukring med et maltoseproducerende enzym, og eventuelt med et enzym, der spalter 1,6-grenpunkterne i amylopektin, f.eks. pullu-lanase eller isoamylase.
Ifølge yderligere et aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse et enzympræparat, som er ejendommeligt ved at 35 det omfatter en β-amylase ifølge krav 1 i kombination med mindst et afgreningsenzym.
4 DK 160563 B
Ved anvendelse af det nye enzympræparat er det muligt at udføre den ovennævnte forsukring af stivelsen under optimale pH-betingelser, hvorved udbyttet af maltose øges, og mængden af tilsat enzym kan mindskes.
5 21-51 β-amylase hydrolyserer amylopektin, glycogen og amylose, idet der kun frigives β-maltose.
Fra forgrenede polysaccharider, såsom amylopektin og delvist hydrolyseret amylopektin danner 21 - 51 β-amylase β-grænsedextriner, som kan hydrolyseres med glucoamylase, isoamy-10 lase, pullulanase eller lignende.
21-51 maltogen amylase adskiller sig fra andre Bacillus β-amylaser i følgende henseender: 1. det er stabilt i puffer ved 70°C, 2. det er stabilt i et pH-område fra 4,0 til 5,0, hvilket 15 betyder, at det kan anvendes i forbindelse med afgreningsenzymer såsom isoamylase og pullulanase.
3. glucose produceres kun i ubetydelige mængder.
Den mikroorganisme, der er i stand til at producere β-20 amylasen ifølge den foreliggende opfindelse, blev udvalgt under hensyntagen til dens evne til at vokse på et agarsubstrat fremstillet som følger: trypton (10 g), amylopektin (CPC snowflake 10 g), Bacto agar (40 g) og deioniseret vand (1000 ml) blandes aseptisk ved 25 55°C med en tilsvarende mængde saltopløsning med følgende s ammensætning: (NH^) 2 SO^ : 0,04% vægtprocent
MgS04, 7H20 : 0,1% -
CaCl2 : 0,05% - 30 KH2P04 : 0,6% - hvor saltopløsningens pH indstilles til 3,0 med 10 N svovlsyre.
Den isolerede mikroorganisme blev deponeret hos National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Aberdeen, Scotland, d. 15. marts 1983 og fik tildelt nr. 35 NCIB 11608. NCIB, der er et internationalt deponeringsinstitut,
DK 160563 B
5 autoriseret under Budapesttraktaten af 1977, sikrer permanent deponering og offentlig adgang dertil i overensstemmelse med henholdsvis regel 9 og regel 11 i ovennævnte traktat.
5 Taxonomi Morfologi
Stavformede bakterier med en diameter på 0,6 til 0,8 pm.
10 Sporerne er af oval eller cylindrisk form, anbragt centralt til subterminalt, og forårsager ikke opsvulmen af sporehusene.
Biokemiske reaktioner 15 gramfarve: positiv, anaerob vækst: negativ, catalase: positiv, VP reaktion: negativ, nitratreduktion: positiv, 20 lecithinase: negativ, vækst i 3,5% NaCl: negativ, hydrolyse af: stivelse: positiv, casein: svagt positiv, 25 syreproduktion fra: glucose: positiv, arabinose: negativ, xylose: negativ, mannitol: positiv, 30 anvendelse af: citrat: negativ, propionat: negativ, og vækst ved 50°C negativ.
35 Bacillus NCIB 11608 vokser ikke på almindeligt anvendte medier med en pH-værdi over 6. De optimale vækstbetingelser for denne bakterie er pH 4,8 til 5,8 og en temperatur på 30 til 37°C.
6 DK 160563 B
Den maksimale væksttemperatur er for denne bakterie 45°C.
I de førnævnte forsøg anvendtes et standardmedium indeholdende lige store mængder af 1% trypton og BA-1 salte.
5 BA-1 salte indeholder: (NH4)2S04 0,04%
MgS04 7H20 0,1%
CaCl2 2H20 0,05% KH2P04 0,6% 10.
pH indstilles til 3,0 med 10 N H2S04 inden autoklavering.
pH er 4,8 til 5,2 i det færdigblandede trypton basis medium.
15 Alle nævnte biokemiske reaktioner og dyrkningsforsøg blev udført på dette substrat med eller uden tilsætning af 1% gærekstrakt.
Standarddyrkningsmediet til formering af NCIB 11608 indeholder 0,5% amylopektin og intet gærekstrakt. Vegetative 20 celler af NCIB 11608 indeholder ofte bobler, som i et fasekon-trastmikroskop fremstår som brydningskugler, og som ikke farves, når cellerne stænkes let med safranin eller methylenblåt.
De morfologiske og biokemiske egenskaber af Bacillus NCIB 11608 er meget lig dem, der kendetegner Bacillus megaterium; 25 men (3-amylasens egenskaber ligger meget langt fra, hvad der er beskrevet for B. megaterium β-amylase, der har temperaturoptimum ved ca. 50°C, pH optimum ved ca. pH 7.
30 Bestemmelse af enzymaktivitet
En β-amylaseenhed (βϋ) defineres som den mængde enzym, som under standardbetingelser (temperatur 60°C, pH 4,5 og reaktionstid 30 minutter) producerer reduktionssukker svarende til 1 μπιοί maltose/minut.
j
7 DK 160563 B
0,5 ml 2% stivelse i 0,1 M acetatpuffer inkuberes med 100 μΐ enzym opløst i deioniseret vand indeholdende 0,5 - 2 βϋ per ml. Reaktionen standses efter 30 minutter ved tilsætning af 0,3 ml 0,5 N NaOH, og blandingen fortyndes til et forhold på 1:10 5 med deioniseret vand.
Indholdet af reduktionssukker bestemmes derpå efter Somogyi metoden (Somogyi: J.Biol.Chem., 153, p. 375-80 (1944)).
Enzymfremstilling 10 En Bacillusstamme, der er i stand til frembringe β- amylasen ifølge den foreliggende opfindelse, opformeres oftest på et fast substrat inden dyrkning under aerobe betingelser i et egnet næringsmedium. Begge medier indeholder assimilerbare carbon- og nitrogenkilder foruden uorganiske salte, fortrinsvis 15 sammen med vækstfremmende næringsstoffer, såsom gærekstrakt.
Fermenteringen udføres typisk ved 30°C - 37°C og ved et pH på 5 -6 og holdes fortrinsvis automatisk konstant. Enzymet udskilles i mediet.
Den resulterende gæringsvæske kan befris for bakterie-20 celler og affaldsstoffer sammen med andre faste stoffer, f.eks. ved filtrering. Supernatanten indeholdende enzymet kan renses yderligere, f.eks. ved filtrering eller centrifugering, og derpå koncentreres som krævet, f.eks. ved ultrafiltrering eller i en inddamper under reduceret tryk til et koncentrat, som, om ønsket, 25 kan tørres, f.eks. ved lyophilisering eller forstøvningstørring.
Rensning af enzymet
Den maltogene amylase ifølge den foreliggende opfindelse kan renses fra en kontinuert gæringskulturvæske som følger: 30 250 liter dyrkningsmedium filtreres, og filtratet ultrafiltreres, sterilfiltreres, og frysetørres.
Pulveret opløses i 15 mM acetatpuffer, pH 5,0, og dialyseres mod 15 mM acetatpuffer, pH 5,0, indtil ledningsevnen er ca. 1 mS. Dialysatet sættes derefter på en kationbytter CM-35 sepharose® C1-6B, som er blevet bragt i ligevægt med den samme puffer. Amylasen passerer gennem søjlen, medens 60% af de resterende proteiner holdes tilbage af ion-bytteren.
a DK 160563 B
pH i effluenten fra denne søjle indstilles til 4,0 med eddikesyre, og eluatet sættes derefter til en CM-sepharose® C1-6B søjle indstillet med 15 mM acetatpuffer med pH på 4,0. Under disse omstændigheder adsorberes amylasen af ion-bytteren. Enzymet 5 elueres derpå med acetatpuffer med pH 4,0 med stigende ionstyrke. Enzymaktiviteten i eluatet følger proteinindholdet i en symmetrisk top.
Enzymkemiske egenskaber
10 Den omhandlede β-amylases aktivitets afhængighed af pH
og temperatur blev bestemt ved den tidligere beskrevne metode under anvendelse af en reaktionsblanding, hvori pH og temperatur blev indstillet til forudbestemte værdier.
Der henvises igen til figurerne, hvor 15 fig. 1 grafisk illustrerer den relative aktivitet i forhold til temperatur (substrat 2% opløselig stivelse, pH 4,5 (0,1 M acetat), 30 minutter reaktionstid), og fig. 2 grafisk illustrerer den relative aktivitet i forhold til pH (temperatur 60°C, substrat 2% opløselig stivelse, 20 30 minutters reaktionstid, Mcllvaine puffer).
Det fremgår af figurerne, at 21 - 51 (3-amylase har et aktivitetsoptimum ved pH 4,5 på ca. 70°C, og at dets pH-optimum ligger i området fra 4,0 - 5,0. Mere end 60% af den maksimale aktivitet findes stadig ved 80°C.
25
Eksempel 1
Fremstilling af β-amylase fra Bacillus sp. 21 - 51 30 (deponeringsnummer NCIB 11608)_
Podningsmateriale 21 - 51-kulturen blev dyrket i 2 dage ved 37°C på følgende agar: 35 trypton 10 g amylopektin (CPC snowflake) 10 g Bacto agar 40 g
DK 160563 B
deioniseret vand 1000 ml blandet med en tilsvarende mængde saltopløsning med følgende sammensætning: 5 (NH4)2S04 0,04 vægt%
MgS04,7H20 0,1 vægt%
CaCl2 0,05 vægt% KH2P04 0,6 vægt% 10 hvor saltopløsningens pH indstilles til 3,0 med 10 N H2S04· Kontinuerlig gæring
Kontinuerlig gæring blev udført med et substrat med følgende sammensætning: 15 Difco gærekstrakt 0,2% 0,2 % maj sstøbevand 1,0 % (nh4)2so4 0,1 %
MgS04.7H20 0,0375 % Κ-ΗΡΟ. 0,0375 % 20 CaCl2.2H20 0,0375 %
Bacto trypton 0,4 %
Pullulan 0,5 %
Pluronic 60 1 0,08 % indstillet til 100% med vand og autoklaveret ved 130° i 30 25 minutter.
Gæringen blev udført i en BIOFLO® (New Brunswick,
Canada) fermentor med et arbejdsvolumen på 1 liter.
Gæringen blev påbegyndt med 100 ml af det ovenfor beskrevne podemateriale og substratdoseringen påbegyndt efter 24 ...... 30 timer ved 30°C.
pH blev indstillet til 5,5 ± 0,2 med 3% svovlsyre og temperaturen blev holdt på 30°C ± 0,2.
Beluftning: 0,5 liter/liter substrat/minut
Fortyndingshastighed: D = 0,090 ± 0,005 t.
35 24 timer efter podning var kulturen vokset ud og kontinuert kørsel startede, og allerede 24 timer senere var kulturen i ligevægt.
10
DK 160563 B
Over ca. 7 døgn blev der over tøris opsamlet 4450 ml kulturvæske, som blev centrifugeret ved 2300 rpm, 45 min. 4376 ml centrifugat blev koncentreret i et ultrafiltrerings-laboratoriemodul fra Sartorius med G-600 membran til 1200 ml 5 efter udskylning af apparatet. Dette koncentrat blev yderligere inddampet til 200 ml på en Buehi rotationsfordamper, 3 timer, 45°C. Dette materiale var udgangsmateriale for adskillelse af (3-amylasen fra de andre aktiviteter.
• 10
Adskillelse af β-amylaseaktiviteten fra pullulanase- og a-, amylaseaktiviteterne_
Et præparat, fremstillet som angivet ovenfor, opløstes 15 i 0,05 M acetat pH 4,0 og sattes på en ionbytningssøjle med CM-sepharose-CL-6B. Under disse betingelser bindes såvel pullulanase- som a-amylaseaktiviteterne, og β-amylasen løber lige igennem søjlen.
Fraktionerne analyseredes med stivelse og pullulan som 20 substrat, og aktivitetstyperne bestemtes ved tyndtlagskromatografi.
De fraktioner, der ikke gav reaktion med pullulan, og som hydrolyserede stivelse til maltose og ikke andet, samledes og anvendtes til analyse af β-amylasens egenskaber.
25 ' Eksempel 2
Forsukringssubstrater blev fremstillet ved at genopløse 30 en 7 DE (dextrinækvivalent) forstøvningstørret maltodextrin i deioniseret vand og tilnærme til ca. 30% tørstof (DS). Forsukringseksperimenterne blev udført i standardiaboratorie-batch-reaktorer på 500 ml. Substratprøver blev opvarmet til 55°C eller 60°C, pH blev indstillet til en begyndelsesværdi på 5,5, og 35 5 βϋ eller 20 j3U/g DS blev derpå tilsat. Prøver blev udtaget efter 4, 24, 48, 96 og 168 timer og opvarmet i kogende vand i 10 minutter for at inaktivere enzymet. Efter afkøling blev prøverne
11 DK 160563 B
filtreret og behandlet med mixed-bed ionbytterharpiks (Bio-Rad® AG 501 x 8 (D)) for at fjerne aske og opløselig N før analyse ved HPLC og gelkromatografi.
Fremgangsmåden blev gentaget med henholdsvis blandinger 5 af 5 eller 20 βυ/g DS af B-amylasen ifølge opfindelsen og 1 pullulanaseenhed (PNU)/g DS pullulanase og 100 isoamylaseenheder (IU)/g DS.
Resultaterne fremgår af tabel 1, hvor DPn angiver polymeriseringsgraden for produktet, d.v.s. DP1 er 10 monosaccharid(glucose) o.s.v..
12 DK 160563 B
Tabel 1
Forsukringstemperatur: 60°C
Pullu- Reak- 5 β-amylase lanase tionstid _(PNU/g DS) (timer) pH %ΡΡχ %PP2 %PP2 %DP1| 0 4 5,3 0,5 12,6 2,4 84,5 24 5,3 0,3 30,8 15,2 53,8 5 48 5,3 0,3 40,7 19,6 39,4 10 96 5,2 0,4 47,4 20,2 31,4 168 5,0 0,6 51,1 20,1 28,2 20 0 4 5,2 0,2 26,3 10,4 63,2 24 5,2 0,3 46,9 13,8 39,1 15 48 5,0 0,5 54,2 14,7 30,6 96 4,9 0,5 57,3 15,0 27,2 168 4,8 0,5 57,6 15,3 26,7 5 1 4 5,3 0,1 13,6 5,7 80,6 20 24 5,3 0,2 31,9 16,8 51,1 48 5,3 0,3 41,1 21,9 36,4 96 5,2 0,5 51,3 25,3 23,0 168 5,1 0,6 56,9 26,8 15,7 25 20 1 4 5,2 0,1 26,8 10,6 62,5 24 5,2 0,3 50,6 15,6 33,6 48 5,1 0,3 59,4 18,9 21,5 96 5,0 0,4 66,1 20,6 13,0 168 4,9 0,4 68,5 21,5 9,6 30
" DK 160563 B
Forsukringstemperatur: 55°C
Isoamy- Reak- 5 β-amylase lase tionstid _(IU/g DS) (timer) pH %DP1 %ΡΡ2 %ΡΡ3 %ΡΡ1Ί_ β-amylase 4 5,2 0,1 11,4 5,2 83,3 24 5,2 0,2 29,4 16,1 54,3 5 100 48 5,2 0,3 38,5 20,4 40,9 10 96 5,2 0,3 50,4 25,0 24,3 168 5,1 0,5 58,2 28,4 13,0 20 100 4 5,2 0,2 23,6 10,8 65,5 24 5,1 0,3 48,9 15,8 35,0 15 48 5,0 0,3 59,3 18,7 21,7 96 5,0 0,4 68,1 20,2 11,3 168 4,8 0,4 72,4 20,0 7,3
Tabellen viser, at der kun produceres ubetydelige glucosemængder (DP-^) ved anvendelse af β-amylasen ifølge 20 opfindelsen, og at anvendelsen af nævnte β-amylase i kombination med afgreningsenzymerne pullulanase eller isoamylase fører til sirupper med højt maltoseindhold (DP2).

Claims (3)

  1. 2. Fremgangsmåde til fremstilling af β-amylaseenzymet ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Bacillusstamme NCIB 11608 eller en variant eller mutant deraf med i det væsentlige samme egenskaber som denne dyrkes i et passende næringsmedium indeholdende carbon- og nitrogenkilder og uorganiske 25 salte, efterfulgt af udvinding af β-amylaseenzymet fra dyrkningsmediet.
  2. 3. Enzympræparat, kendetegnet ved, at det omfatter en β-amylase ifølge krav 1 i forbindelse med et eller 30 flere afgreningsenzymer.
  3. 4. Enzympræparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at afgreningsenzymet er isoamylase eller pullulanase. 35
DK077086A 1986-02-19 1986-02-19 Beta-amylase, fremgangsmaade til dens fremstilling samt praeparat indeholdende beta-amylasen DK160563C (da)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK077086A DK160563C (da) 1986-02-19 1986-02-19 Beta-amylase, fremgangsmaade til dens fremstilling samt praeparat indeholdende beta-amylasen
US07/015,239 US4970158A (en) 1986-02-19 1987-02-17 Beta amylase enzyme product, preparation and use thereof
ES87301408T ES2059362T3 (es) 1986-02-19 1987-02-18 Producto enzimatico de beta-amilasa, preparacion y su empleo.
DE87301408T DE3788291T2 (de) 1986-02-19 1987-02-18 Beta-Amylase-Enzym-Produkt, Herstellung und Verwendung.
EP87301408A EP0234858B1 (en) 1986-02-19 1987-02-18 Beta-amylase enzyme product, preparation and use thereof
AT87301408T ATE97954T1 (de) 1986-02-19 1987-02-18 Beta-amylase-enzym-produkt, herstellung und verwendung.
JP62034706A JPS62201577A (ja) 1986-02-19 1987-02-19 β−アミラ−ゼ酵素
CA000530152A CA1304030C (en) 1986-02-19 1987-02-19 .beta.-AMYLASE ENZYME PRODUCT, PREPARATION AND USE THEREOF

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK77086 1986-02-19
DK077086A DK160563C (da) 1986-02-19 1986-02-19 Beta-amylase, fremgangsmaade til dens fremstilling samt praeparat indeholdende beta-amylasen

Publications (4)

Publication Number Publication Date
DK77086D0 DK77086D0 (da) 1986-02-19
DK77086A DK77086A (da) 1987-08-20
DK160563B true DK160563B (da) 1991-03-25
DK160563C DK160563C (da) 1991-09-02

Family

ID=8097353

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK077086A DK160563C (da) 1986-02-19 1986-02-19 Beta-amylase, fremgangsmaade til dens fremstilling samt praeparat indeholdende beta-amylasen

Country Status (8)

Country Link
US (1) US4970158A (da)
EP (1) EP0234858B1 (da)
JP (1) JPS62201577A (da)
AT (1) ATE97954T1 (da)
CA (1) CA1304030C (da)
DE (1) DE3788291T2 (da)
DK (1) DK160563C (da)
ES (1) ES2059362T3 (da)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE38507E1 (en) * 1989-09-27 2004-04-27 Novozymes A/S Antistaling process and agent
US5312739A (en) * 1992-05-28 1994-05-17 National Science Council Production of high-maltose syrup and high-protein byproduct from materials that contain starch and protein by enzymatic process
FI109358B (fi) * 2001-02-06 2002-07-15 Danisco Sugar Oy Menetelmä entsyymin uuttamiseksi
EP1350432A1 (en) 2002-04-05 2003-10-08 Puratos N.V. Method and composition for retarding staling of bakery products by adding a thermostable protease
AU2004220052B2 (en) 2003-03-10 2010-08-19 Genencor International Inc. Grain compositions containing pre-biotic isomalto-oligosaccharides and methods of making and using same
EP2595488B1 (en) 2010-07-21 2019-12-04 Novozymes A/S Process for preparing a baked product with anti-staling amylase and peptidase
MX2011008654A (es) 2010-08-24 2012-02-23 Corn Products Int Inc Produccion de isomaltooligosacaridos y usos para los mismos.
WO2013019977A2 (en) * 2011-08-02 2013-02-07 Purdue Research Foundation Extraction, purification, and processing of phytoglycogen
MX2014007603A (es) 2011-12-26 2014-09-12 Dupont Nutrition Biosci Aps Uso de enzima exoamilasa.
CN106659168A (zh) 2014-07-08 2017-05-10 卡拉万成分股份有限公司 产生糖和结构改善的焙烤方法和由该方法形成的产品
MX2020004318A (es) 2017-10-25 2020-08-13 Basf Se Enzimas beta-amilasa.
JP7649547B2 (ja) * 2019-04-15 2025-03-21 公立大学法人大阪 新規βアミラーゼ及びその利用・製造法
CA3176520A1 (en) 2019-04-23 2020-10-29 Basf Se Beta-amylase variants
WO2024243330A1 (en) 2023-05-22 2024-11-28 Caravan Ingredients Inc. Baked goods enhancer and methods of making and using the same

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA973492A (en) * 1970-10-27 1975-08-26 Jiro Ito Production of new amylases by cultivation of streptomyces and uses of these new amylases
US3804718A (en) * 1971-04-01 1974-04-16 Hayashibara Co Method of producing beta-amylase by bacterial fermentation
JPS4867487A (da) * 1971-12-17 1973-09-14
US4560651A (en) * 1981-04-20 1985-12-24 Novo Industri A/S Debranching enzyme product, preparation and use thereof
DK135983D0 (da) * 1983-03-25 1983-03-25 Novo Industri As Maltogen amylaseenzymprodukt og fremgangsmade til dets fremstilling og anvendelse
US4647538A (en) * 1984-09-18 1987-03-03 Michigan Biotechnology Institute Thermostable beta-amylase

Also Published As

Publication number Publication date
CA1304030C (en) 1992-06-23
EP0234858A2 (en) 1987-09-02
EP0234858A3 (en) 1988-08-03
DE3788291D1 (de) 1994-01-13
JPS62201577A (ja) 1987-09-05
ES2059362T3 (es) 1994-11-16
DK160563C (da) 1991-09-02
DK77086D0 (da) 1986-02-19
DE3788291T2 (de) 1994-03-31
ATE97954T1 (de) 1993-12-15
EP0234858B1 (en) 1993-12-01
US4970158A (en) 1990-11-13
DK77086A (da) 1987-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0171218B1 (en) Enzymatic hydrolysis of granular starch directly to glucose
CA1199292A (en) Debranching enzyme product, preparation and use thereof
US4560651A (en) Debranching enzyme product, preparation and use thereof
Satyanarayana et al. Development of an ideal starch saccharification process using amylolytic enzymes from thermophiles
JPH06217770A (ja) プルラナーゼ、それを生産する微生物、そのプルラナーゼの調製方法及び使用
DK160563B (da) Beta-amylase, fremgangsmaade til dens fremstilling samt praeparat indeholdende beta-amylasen
WO1992002614A1 (en) Novel thermostable pullulanases
KR890001827B1 (ko) α-아밀라제의제법
CA2019756C (en) Novel thermoduric and aciduric pullulanese enzyme and method for its production
Legin et al. Production of thermostable amylolytic enzymes by Thermococcus hydrothermalis
DK158522B (da) Beta-amylase, samt fremstilling og anvendelse deraf
CA1081633A (en) Heat and acid-stable alpha-amylase enzymes and processes for producing the same
Dobreva et al. Effect of temperature on some characteristics of the thermostable α-amylase from Bacillus licheniformis
EP0860500B1 (en) Purified acid-stable alpha-amylase from fungal origin
RU2177995C2 (ru) Штамм бактерий bacillus licheniformis - продуцент комплекса термостабильных амилолитических и протеолитических ферментов
EP0157638A2 (en) Method for production of high conversion syrups and immobilized alpha-amylase employed in the process
Legin et al. A single step high temperature hydrolysis of wheat starch
US6379721B1 (en) Process for preparation of α-amylase from Tinospora cordifolia Miers useful for starch saccharification
US4925795A (en) Method of using G-4 amylase to produce high maltotetraose and high maltose content starch hydrolysates
JP2863607B2 (ja) アミラーゼ及びその製造法
JPH062071B2 (ja) 糖類の製造法
RU2324734C1 (ru) Штамм бактерий bacillus licheniformis вкм в-2396 d - продуцент термостабильной альфа-амилазы
JP2691354B2 (ja) 新規なα−アミラーゼ、その製造法及びそれを用いた糖類の製造法
DK146941B (da) Glucoamylase og fremgangsmaade til fremstilling af en sirup med hoejt glucoseindhold ved saccharificering af smeltet stivelse
DK141123B (da) Fremgangsmåde til fremstilling af en beta-amylase.

Legal Events

Date Code Title Description
PSP Patent surrendered