DK160565B - Plasmid p sg 2, fremgangsmaade til dets fremstilling og dets anvendelse - Google Patents
Plasmid p sg 2, fremgangsmaade til dets fremstilling og dets anvendelse Download PDFInfo
- Publication number
- DK160565B DK160565B DK192482A DK192482A DK160565B DK 160565 B DK160565 B DK 160565B DK 192482 A DK192482 A DK 192482A DK 192482 A DK192482 A DK 192482A DK 160565 B DK160565 B DK 160565B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- plasmid
- fragments
- culture
- length
- lengths
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- 241000948169 Streptomyces viridosporus Species 0.000 claims abstract description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 18
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000187133 Streptomyces espinosus Species 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910052586 apatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;fluoride;triphosphate Chemical compound [F-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O VSIIXMUUUJUKCM-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
DK 160565 B
Opfindelsen angår plasmidet p SG 2, en fremgangsmåde til dets fremstilling og dets anvendelse.
Det er fra DE offentliggørelsesskrift nr. 3.005.226 kendt, at plasmidet p UC 6 kan fremstilles ud fra en kultur 5 af Streptomyces espinosus. Det er endvidere fra PCT-ansøgning nr. 79/01169 kendt, at der ud fra Streptomyces lividans kan fremstilles et plasmid, der synes egnet som vektor til indføring af DNA i mikroorganismer.
Det fremgår heraf, at anvendelsen af genteknologiske 10 metoder på antibiotikadannende Streptomycesarter tillægges særlig betydning. Imidlertid er de hidtil kendte metoder forblevet af ringe interesse for praktisk anvendelse.
Den genetiske forbedring af de til antibiotikafremstilling anvendte Streptomycet-stammer med det formål at 15 forøge mængden af det dannede antibiotikum er en vigtig opgave. Den kan imidlertid kun løses med held ved genteknologiske metoder, når man har et plasmid til rådighed, der ikke straks igen elimineres fra den som værtscelle anvendte Streptomyces-art, som det hyppigt observeres ved arter, der 20 ikke er beslægtet med hinanden.
Det har derfor været opgaven at fremstille tilstrækkelige mængder af et plasmid, der er egnet som vektor til genetisk forbedring af Streptomyces ghanaensis-stammer.
Det har nu ifølge opfindelsen vist sig, at denne 25 opgave løses med plasmidet p SG 2, der er ejendommeligt ved, at det kan fremstilles ud fra en kultur af Streptomyces ghanaensis ATCC 14 672 og har en konturlængde på 4,58 /m og en molekyllængde på ca. 13,8 kilobaser (kb), og at det ikke fragmenteres af restriktions-endonucleaserne EcoR I, BamH 30 I, Sal I, Hpa I og Hind II, men spaltes af restriktions— endonucleasen Hind III til et fragment med en længde på ca. 14 kb, af Cla I til to fragmenter med længderne 10,15 kb og 3,65 kb og af Pst I til to fragmenter med længderne 10,85 kb og 3,0 kb, af Bgl II til to fragmenter med længderne 35 11,25kb og 2,6 kb, samt af Bel I til tre fragmenter med længderne 11,6 kb, 1,25 kb og 1,0 kb.
2
DK 160565 B
Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af plasmidet p SG 2, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en kultur af Streptomyces ghanaensis ATCC 14 672 lyseres, og plasmidet isoleres.
5 Opfindelsen angår endelig også anvendelsen af plasmid p SG 2 til konstruktion af vektorpiasmider.
Den her anvendte stamme af Streptomyces ghanaensis er beskrevet i enkeltheder i DE-patentskrift nr. 1.113.791 og betegnes dér S. ghanaensis nov. sp. 4092. I en kultur af 10 Streptomyces ghanaensis foreligger der pr. celle ca. 10-20 kopier af plasmidet p SG 2. Dette plasmid er således et egnet udgangsplasmid til anvendelse af genteknologiske metoder på både stammen Streptomyces ghanaensis selv og på andre Streptomyces-arter.
15 Plasmidet p SG 2 har en molekylvægt på ca. 9,2 mega- dalton og en molekyllængde på ca. 13,8 kilobaser. Dette er påvist ved agarose-gelelektroforese af molekylet selv og dets spaltningsstykker. Bestemmelsen af længden til 4,58 ± 0,09 /im er fremkommet ved elektronmikroskopisk udmåling af 20 27 plasmidmolekyler. Intensiteten af plasmidbåndene ved elektroforesen tillader en vurdering af kopiantallet pr. celle til ca. 10-20. Ved fragmentering af plasmidet p SG 2 med et større antal kendte restriktions-endonucleaser er spaltningsstederne og fragmentlængderne bestemt, og de 25 er sammenfattet i den følgende tabel.
O
3 DK 160565B
Restriktionsforhold for p SG 2 ved behandling af forskellige enzymer: 5 Restriktions- Antal spalt- Længde af Totallængde enzym__ningssteder fragmenter__
EcoRI
BamHI
Sall 10
Hpal Hindi I
Hindlll 1 ^14 kb ^14 kb
Bglll 2 11,25 kb 13,85 kb 2,6 kb 15 Clal 2 10,15 kb 13,8 kb 3,65 kb
PstI 2 10,85 kb 13,85 kb 3.0 kb 20 Bell 3 11,6 kb 13,85 kb 1,25 kb 1.0 kb
BstEII 8 3,8 kb 13,65 kb 2,45 kb 25 1,9 kb 1.15 kb 1.15 kb 1.0 kb 0,9 kb 30____0,8 kb____
Smal 10
Xhol 10 ikke be-·
Sau3A__10___stemt____ 35
O
4 DK 160565 B
Et restriktions-endonuclease-spaltningsbillede af p SG 2 er vist på den vedføjede tegning. På denne kan ses et langt og et kort PstI- hhv. Clal- og Bglll-frag-ment samt et langt og to korte BclI-f ragmen ter. Spaltnings-5 stedernes position i forhold til hinanden er bestemt ved del- og dobbelt-enzymbehandlinger.
Plasmidet p SG 2 angribes altså overhovedet ikke af restriktions-endonucleaserne EcoR I, BamH I, Sal I, Hpa I og Hind II, men af restriktions-endonucleasen Hind III spaltes til Ί0 et fragment med en længde på ca. 14 kb, af Cla I til to fragmen ter med længderne 10,15 og 3,65 kb og af Pst I til to fragmenter med længderne 10,85 og 3,0 kb, af Bgl II til to fragmenter med længderne 11,25 kb og 2,6 kb samt af Bel I i tre fragmenter med længderne 11,6 kb, 1,25 kb og 1,0 kb.
15 Dette mønster tydeliggør, at plasmidet p SG 2 kan anvendes til konstruktion af et vektorplasmid. Ved arbejdet på genetisk ændring af dette plasmid kan der anvendes de samme metoder, som med held er blevet anvendt ved Escherichia coli-plasmider og f.eks. er beskrevet af 20 M. Bibb, J.C. Schottel og S.N. Cohen, Nature 284, 526-531 (1980), og C.J. Thompson, J.M. Ward og D.A. Hopwood,
Nature 286, 525-527 (1980).
Således kan der i Hind III-, Cla I-, Bgl II-,
Pst I- og Bel I-spaltningsstederne uden videre indføres 25 antibiotika-resistenser. Endvidere synes det muligt at indføre gener i plasmidet p SG 2, som hos Streptomyces ghanaensis fører til en forøgelse af antibiotikaproduktionen. På tale kommer herved både gener for biosyntesevejen og reguleringsgener. Således modificerede p SG 2-30 -plasmider er ifølge alle indtil nu foreliggende iagttagelser lige så leve- og formeringsdygtige som udgangsplasmidet.
Plasmidet p SG 2 fås ud fra en kultur af Streptomyces ghanaensis ATCC 14 672 ved dyrkning af kulturen på et egnet medium, fragmentering af myceliet, inkubering 35 af det fragmenterede mycelium, høstning af kulturen og påfølgende lysering af myceliet. Isoleringen af plasmidet
s DK 160565 B
0 fra lysatet lykkes ved en alkalisk denaturering, hvorved man lader en ca. 0,1-0,5N natriumhydroxidopløsning, til hvilken der hensigtsmæssigt er sat ca. 1% natriumdodecyl-sulfat, indvirke på lysatet ved ca. 0°C i indtil 10 minutter.
5 Derefter indstilles der igen til en svagt sur pH-værdi ved tilsætning af en pufferopløsning og opnås derved en renaturering. Derpå centrifugeres blandingen, og ud fra den ovenstående væske fremstilles ved tilsætning af et overskud af ethanol ved -20°C og påfølgende centri-10 fugering en pellet. Denne pellet optages derpå i en puffer opløsning og underkastes i en cæsiumchlorid-ethidiumbromid-opløsning en isopyknisk vægtfyldegradientcentrifugering i en ultracentrifuge. Derefter udtages plasmiderne fra gradienten ved punktering, renses chromatografisk og karakteriseres i 15 agarosegel og i elektronmikroskop. Der er her tale om kendte metoder (jfr. R. Radloff, W. Bauer, J. Vinograd. Proc.
Nati. Acad. Sci. USA, 57, 1514-1521 (1967) og A.A.
Szalay, C.J. Mackey, H.W.R. Langridge, Enzyme Microb.
Techno1. 1, 154-164 (1976).
20 Her og i det følgende er procentangivelserne efter vægt, hvis der ikke er angivet andet.
Eksempel 1
Til fremstilling af plasmidet p SG 2 gås der 25 frem på følgende måde:
En kultur af Streptomyces ghanaensis ATCC 14 672 dyrkes i 3-5 dage ved 30°C i 100 ml af et næringsmedium med følgende sammensætning: 30 glucose 1 g pepton 0,4 g gærekstrakt 0,4 g
MgS04, 7H20 0,05 g KH2P04 0,2 g 35 K2HP04 0,4 g glycin 2 g aq. dest. ad 100 g
6 DK 160565 B
O
Kulturens ovenstående væske fjernes derefter, og restkulturen homogeniseres og centrifugeres derpå i 5 minutter. Efter to ganges vask i en pufferopløsning bestående af 10 mmol tris-HCl og 1 mmol ethylendiamintetra- 5 eddikesyre (pH-værdi 7,5), til hvilken der yderligere er sat 10% saccharose, resuspenderes der i 10 ml af en opløsning med følgende sammensætning.
50 mmol glucose 10 10 mmol EDTA
25 mmol tris-HCl (tris-(hydroxymethyl)-aminomethan) 2 mg/ml lysozym
Denne opløsning har en pH-værdi på 8.
15 o o
Efter en inkubationstid ved 32 C pa 30 til 60
minutter tilsættes der 20 ml frisk fremstillet 0,2N
natriumhydroxidopløsning, hvortil der yderligere er sat
1% natriumdodecylsulfat, og blandingen henstilles ved 0°C
i 5 minutter. Efter tilsætning af 15 ml af en 3M natrium- 20 acetatopløsning med en pH-værdi pa 4,8 blandes der pa ny og inkuberes i 1 time ved 0°C. Efter fornyet centrifugering sættes der ved -20°C det tredobbelte volumen ethanol (96%) til den ovenstående væske. Bundfaldet fraskilles ved centrifugering, tørres i vakuum og optages derefter i 25
6 ml af en puffer af 10 mmol tris-HCl og 1 mmol EDTA
(pH-værdi 7,5). Derpå centrifugeres der i 2 dage ved 34.000 o/m i en cæsiumchlorid/ethidiumbromid-gradient. Den fraktion, der indeholder plasmiderne, chromatograferes derefter også på apatit.
30 På denne måde isoleres plasmidet p SG 2 i ren form. Eksempel 2
Plasmidet p SG 2 kan også fremstilles på følgende måde: 1 g mycelium af Streptomyces ghanaensis ATCC 14 672 dyrkes i 3-5 dage ved 30°C i det samme medium som beskrevet i eksempel 1. Også her frahældes kulturens ovenstående 35
O
DK 160565 B
væske, hvorefter der homogeniseres, og cellematerialet fraskilles ved centrifugering. Derpå vaskes der to gange med en puffer, der består af 10 mmol tris-HCl og 140 mmol NaCl (pH-værdi 8,0). Derefter resuspenderes der i 5 ml af 5 en puffer bestående af 100 mmol tris-HCl, 20 mmol EDTA og 25% saccharose. Derpå tilsættes der 0,1 ml af en lysozym-opløsning (30 mg/ml) og inkuberes i 20 minutter ved 25°C. Efter afkøling til 0°C og tilsætning af 6 ml iskoldt vand tilsættes 1 ml af en 1%'s opløsning af 10 natriumdodecylsulfat, og efter tilsætning af yderligere 3,4 ml af en 5M natriumchloridopløsning blandes der forsigtigt. Blandingen henstilles derefter ved 4°C.
Efter at udfældningen ved 4°C er tilendebragt, centrifugeres der i 1 time ved 0°C og 16.000 o/m. Til 15 den ovenstående væske sættes en trediedel af dens volumen af en 42%'s polyethylenglycolopløsning (molekylvægt af polyethylenglycolen:6000), hvorved der fremkommer et bundfald. Efter at udfældningen ved en temperatur på 4°C er tilendebragt, fraskilles plasmiderne ved centrifugering ved 20 16.000 o/m i 15 minutter, hvorefter den dannede pellet forsigtigt optages i 1 ml af en 0,4%'s opløsning af Sarkosyl (N-lauroyl-sarkosid) i en puffer bestående af 10 mmol tris-HCl og 1 mmol EDTA (pH-værdi 7,5). Med den samme puffer fyldes der til slut op til 5 ml og centrifugeres i cæsium-25 chlorid-ethidiumbromid-gradient i en ultracentrifuge. Derefter arbejdes der videre som i eksempel 1.
30 35
Claims (5)
1. Plasmid pSG2, kendetegnet ved, at det kan fremstilles ud fra en kultur af Streptomyces ghanaen-sis ATCC 14 672 og har en konturlængde på 4,58 /xm og en 5 molekyllængde på ca. 13,8 kilobaser (kb), og at det ikke fragmenteres af restriktions-endonucleaserne EcoR I, BamH I, Sal I, Hpa I og Hind II, men spaltes af restriktions--endonucleasen Hind III til et fragment med en længde på ca. 14 kb, af Cla I til to fragmenter med længderne 10,15 10 kb og 3,65 kb og af Pst I til to fragmenter med længderne 10,85 kb og 3,0 kb, af Bgl II til to fragmenter med længderne II, 25 kb og 2,6 kb, samt af Bel I til tre fragmenter med længderne 11,6 kb, 1,25 kb og 1,0 kb.
2. Fremgangsmåde til udvinding af plasmidet p SG 2, 15 kendetegnet ved, at en kultur af Streptomyces ghanaensis ATCC 14 672 lyseres og plasmidet isoleres.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at plasmidet isoleres fra lysatet ved en alkalisk denaturering med påfølgende renaturering og alkoholfældning.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kende tegnet ved, at kulturen af Streptomyces ghanaensis ATCC 14 672 lyseres ved en temperatur på ca. 0eC med en detergent i en mængde på ca. 0,1 vægtprocent.
5. Anvendelse af plasmid p SG 2 til konstruktion af 25 vektorplasmider.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19813117131 DE3117131A1 (de) | 1981-04-30 | 1981-04-30 | "plasmid psg 2 und verfahren zu seiner gewinnung" |
| DE3117131 | 1981-04-30 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK192482A DK192482A (da) | 1982-10-31 |
| DK160565B true DK160565B (da) | 1991-03-25 |
| DK160565C DK160565C (da) | 1991-09-09 |
Family
ID=6131159
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK192482A DK160565C (da) | 1981-04-30 | 1982-04-29 | Plasmid p sg 2, fremgangsmaade til dets fremstilling og dets anvendelse |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4621061A (da) |
| EP (1) | EP0066701B1 (da) |
| JP (1) | JPS57185300A (da) |
| AT (1) | ATE37562T1 (da) |
| AU (1) | AU550414B2 (da) |
| CA (1) | CA1187823A (da) |
| DE (2) | DE3117131A1 (da) |
| DK (1) | DK160565C (da) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA832526B (en) * | 1982-04-16 | 1984-11-28 | Lilly Co Eli | Chimeric cloning vectors for use in streptomyces and e.coli |
| EP0158872B1 (de) * | 1984-03-31 | 1989-01-18 | Hoechst Aktiengesellschaft | Das Streptomyceten-Plasmid pSG5, Verfahren zu seiner Gewinnung und seine Verwendung |
| DE3412093A1 (de) * | 1984-03-31 | 1985-10-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Hybridplasmide mit einem streptomyceten- und einem escherichia coli-replicon |
| US7026468B2 (en) * | 1996-07-19 | 2006-04-11 | Valentis, Inc. | Process and equipment for plasmid purification |
| US7807822B2 (en) * | 1996-08-01 | 2010-10-05 | Robert Bridenbaugh | Methods for purifying nucleic acids |
| JP4258874B2 (ja) * | 1999-02-10 | 2009-04-30 | チッソ株式会社 | 放線菌由来の環状プラスミドｄｎａ |
| WO2004024283A2 (en) * | 2002-09-13 | 2004-03-25 | Valentis, Inc. | Apparatus and method for preparative scale purification of nucleic acids |
| JP4737547B2 (ja) * | 2006-09-15 | 2011-08-03 | 株式会社オーディオテクニカ | 単一指向性コンデンサーマイクロホンユニット |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1113791B (de) * | 1960-02-10 | 1961-09-14 | Hoechst Ag | Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Moenomycin |
| US4273875A (en) * | 1979-03-05 | 1981-06-16 | The Upjohn Company | Plasmid and process of isolating same |
-
1981
- 1981-04-30 DE DE19813117131 patent/DE3117131A1/de not_active Withdrawn
-
1982
- 1982-04-23 AT AT82103443T patent/ATE37562T1/de not_active IP Right Cessation
- 1982-04-23 EP EP82103443A patent/EP0066701B1/de not_active Expired
- 1982-04-23 DE DE8282103443T patent/DE3279073D1/de not_active Expired
- 1982-04-28 JP JP57070551A patent/JPS57185300A/ja active Pending
- 1982-04-29 CA CA000401981A patent/CA1187823A/en not_active Expired
- 1982-04-29 AU AU83131/82A patent/AU550414B2/en not_active Ceased
- 1982-04-29 DK DK192482A patent/DK160565C/da not_active IP Right Cessation
-
1983
- 1983-12-13 US US06/560,312 patent/US4621061A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU8313182A (en) | 1982-11-04 |
| JPS57185300A (en) | 1982-11-15 |
| US4621061A (en) | 1986-11-04 |
| DE3279073D1 (en) | 1988-11-03 |
| AU550414B2 (en) | 1986-03-20 |
| DK192482A (da) | 1982-10-31 |
| ATE37562T1 (de) | 1988-10-15 |
| EP0066701A2 (de) | 1982-12-15 |
| DK160565C (da) | 1991-09-09 |
| EP0066701B1 (de) | 1988-09-28 |
| EP0066701A3 (en) | 1983-06-22 |
| DE3117131A1 (de) | 1982-11-25 |
| CA1187823A (en) | 1985-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stacey et al. | nodZ, a unique host-specific nodulation gene, is involved in the fucosylation of the lipooligosaccharide nodulation signal of Bradyrhizobium japonicum | |
| Thompson et al. | Cloning of antibiotic resistance and nutritional genes in streptomycetes | |
| US4332900A (en) | Construction of co-integrate plasmids from plasmids of Streptomyces and Escherichia | |
| DK160565B (da) | Plasmid p sg 2, fremgangsmaade til dets fremstilling og dets anvendelse | |
| JPH0145355B2 (da) | ||
| US4649119A (en) | Cloning systems for corynebacterium | |
| US4340674A (en) | Cointegrate plasmids and their construction from plasmids of Escherichia and Streptomyces | |
| WO1985004898A1 (en) | An improved method of cloning double-stranded rna, and its use in the production of viral gene clones | |
| WO2021224152A1 (en) | Improving expression in fermentation processes | |
| CA1187824A (en) | Plasmid p svh 1 and its use | |
| JP2619855B2 (ja) | ストレプトミセス科レプリコンおよび大腸菌レプリコンを有するハイブリツドプラスミド | |
| US4393137A (en) | Cloning plasmid for streptomyces | |
| EP0213898B1 (en) | A host-vector system | |
| Ramakrishnan et al. | Molecular cloning and expression of Rhizobium fredii USDA 193 nodulation genes: extension of host range for nodulation | |
| KR920007401B1 (ko) | 다발성 절단부위를 지닌 대장균과 코리네형 세균에서 발현 가능한 신규 셔틀벡터 | |
| US4506014A (en) | Plasmid pAC 1, a process for obtaining it and its use | |
| EP0035914A2 (en) | Plasmid vectors, plasmids and their preparation, and cloning processes using them | |
| da Silva et al. | Use of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation for the inactivation of pectinase genes in Colletotrichum lindemuthianum | |
| JP3240052B2 (ja) | アントラサイクリン抗生物質に対して耐性の遺伝子の単離及び特徴付け | |
| KR0164284B1 (ko) | 로도구균으로 부터 분리한 원형 플라즈미드 | |
| JPS6279794A (ja) | 殺虫用リゾビウム科菌体 | |
| US4460691A (en) | Streptomyces plasmid prophage pUC13 | |
| JPS6181787A (ja) | 新規なプラスミドベクタ− | |
| GB2045251A (en) | A plasmid and its microbiological preparation | |
| JPH0691825B2 (ja) | 放線菌コスミドベクタ− |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |