DK160880B - Insulinderivater samt injicerbare oploesninger indeholdende disse - Google Patents

Description

i

DK 160880B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte insulinderivater af den i krav 1 angivne art og hidtil ukendte, injicerbare opløsninger med retarderet insulinvirkning.

Til behandling af diabetes mellitus er der foreslået 5 og anvendt mange forskellige insulinpræparater. Nogle af præparaterne er hurtigtvirkende, og andre præparater har mere eller mindre retarderet virkning. En sådan retarderet virkning kan fås ved indgivelse af insulinet som en suspension af insulinkrystaller. De krystallinske præparater kan fås ved kry-10 stallisation af insulin i nærværelse af zink (såsom Lente^, se Schlichtkrull: Insulin Crystals, Chemical and Biological Studies on Insulin Crystals and Insulin Zinc Suspensions, Munksgaard, 1958) eller ved krystallisation af insulin i nærværelse af zink og protamin (såsom NPH-insulin, se Rep.Steno 15 Mem.Hosp. 1 (1946), 60).

En ulempe ved anvendelsen af de kendte suspensioner af zinkinsulinkrystaller eller af zinkprotamininsulin er nødvendigheden af at ryste hætteglasset for at sikre, at der injiceres den rigtige mængde insulin, og for at sikre, at insulin-20 koncentrationen i hætteglasset forbliver konstant under anven-delsen deraf, I Penfill 1 -ampuller, hvor der ikke må være luft til stede, nødvendiggør insulinsuspensioner med retarderet virkning inkorporering af et fast legeme i ampullen for at muliggøre omrystning. Omrystningen af insulinsuspensioner og 25 insulinopløsninger med luft er i sig selv en uønsket proces, idet insulin har tendens til at denaturere under dannelse af fibriller ved vand-luftgrænseflader. Insulinopløsninger med retarderet virkning er derfor ønskelige.

Opløsninger af insulinderivater med retarderet virk-30 ning kunne fås fra insulin, som var modificeret i aminogrupper-ne ved omsætning med phenylisocyanat (såkaldt Isoinsulin, se Hallas-Møller: Chemical and Biological Insulin Studies based upon The Reaction between Insulin and Phenylisocyanate, Køben- i i DK 160880 B ! 2 havn 1945). På tilsvarende måde var det angivet, at Al,B29-di- j

Boc-substitueret insulin (Boc betegner tertiær butyloxycarbo- j nyl) viser retarderet insulinvirkning efter subkutan indgivelse (se Geiger & Enzmann: Proinsulin, Insulin, C-peptide; Proceed-5 ings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-Peptide,

Tokushima 1978; Amsterdam-Oxford 1979, 306 - 310). Al,B29-di-Boc-substitueret insulin viste sig at udvise for ringe retarderet virkning til at være klinisk anvendelig.

Opløsninger af umodificerede insuliner kræver store 10 mængder zinkioner (f.eks. 0,4-1 mg/U insulin) for at udvise retarderet virkning (se J.Pharmacol. (1935), 206). Injektion af så store doser zinkioner vil sandsynligvis være smertefuldt, og derfor har sådanne opløsninger aldrig været anvendt i behandlingsøjemed.

15 Insulins isoelektriske punkt er ca. 5,5, og der er gjort forsøg på at formindske opløseligheden af insulinderivater ved neutralt pH ved at ændre det isoelektriske punkt opad, f.eks. ved i B-kædens N-terminal at indføre basiske aminosyrer såsom lysin eller arginin (se f.eks. tysk offentliggørelses-20 skrift nr. 2.042.299) eller med det basiske dipeptid, arginyl-arginin (se Geiger & Enzmann, som er anført ovenfor). Opløse-ligheden af Arg ' '-Arg -insulin nær dens isoelektriske punkt var imidlertid meget højere end opløseligheden af det til grund liggende insulin.

25 Japansk patentansøgning nr. 55-144032 angår humanin- sulinanaloger, hvori B30-aminosyren er udskiftet med en aminosyre med mindst fem kulstofatomer, og amider og estere deraf.

Disse insulinanaloger skulle anvendes til patienter, der havde dannet antistoffer mod pattedyrinsuliner. I den japanske 30 patentansøgning er der beskrevet seks specifikke forbindelser, hvoraf ingen er angivet at have retarderet virkning. Der er ikke beskrevet specifikke, injicerbare præparater i den japanske patentansøgning.

Europæisk patentansøgning nr. 84108442.9 (EP-offent-35 liggørelsesskrift nr. 132.770) angår insulinanaloger, hvori der er knyttet en basisk, organisk gruppe til B30-aminosyren, hvor-

DK 160880B

3 ved der indføres en positiv ladning ved neutral pH. I disse analoger er B30-aminosyren neutral' og fortrinsvis threonin som i humaninsulin. Tysk patentansøgning nr. 3.327.709,5 angår en suspension af krystaller af de i ovennævnte europæiske patent-5 ansøgning angivne derivater samt en aromatisk hydroxyforbindel-se. Tysk patentansøgning nr. 3.326.473,2 angår et lægemiddel indeholdende en blanding af insulinforbindelser, blandt hvilke mindst en er beskrevet i ovennævnte europæiske patentansøgning. Europæisk patentansgning nr. 84110813.7 (EP-offentliggørelses-10 skrift nr. 140.084) angår forbindelser, der er særdeles nært beslægtede med de i førstnævnte europæiske patentansgning angivne forbindelser.

Europæisk patentansøgning publikationsnr. 194.864 med prioritet fra 12. marts 1985 angår insulinderivater, hvori den 15 C-terminale B30-rest altid er blokeret med en amido- eller estergruppe, og hvori A21-aminosyren altid er asparagin som i humaninsulin.

Ingen af de i de to foregående afsnit citerede patentansøgninger omhandler forbindelsernes ringe kemiske 20 stabilitet. I ingen af de citerede patentansøgninger er der tale om det specielle substitutionsmønster, som er grundlaget for den foreliggende opfindelse.

Det har nu overraskende vist sig, at insulinderivater med den i krav 1 angivne almene formel I har særdeles fremra-25 gende kemisk stabilitet og en kombineret kort og retarderet insulinvirkning.

Insulinderivaterne ifølge den foreliggende opfindelse er forskellige fra humaninsulin ved: a) eventuel tilstedeværelse af en usubstitueret amid-30 rest i B-kædens C-terminale carboxylgruppe, b) at den har mindst én ladning mere end humaninsulin ved pH 7, fortrinsvis ikke mere end 4 ladninger mere end humaninsulin ved pH 7, j

DK 160880B

4 j

S

] ΐ i c) at den C-terminale asparaginrest i A-kæden, |

A21 I

Asn , kan være udskiftet med en anden naturligt forekommende i aminosyre, som der kan kodes for af nucleotidsekvenser, j d) at såfremt en ændring i ladningen fås ved bloke-5 ring af carboxylgruppen i B30-aminosyren, er A21-aminosyrere- sten forskellig fra en asparaginrest.

Ændringen i ladningen fås ved at udskifte en eller flere af aminosyreresterne sammenlignet med humaninsulin og om ønsket ved blokering af carboxylgruppen i B30-aminosyren.

10 Specifikt kan de forbindelser, der er af interesse ved udførelsen af denne opfindelse, karakteriseres som følger:

En eller flere af de fire glutaminsyrerester i A4, A17, B13 og B21 er erstattet med en glutaminrest, og/eller threoninresten i B27 er erstattet med L-arginin- eller L-lysinrest, og/eller 15 threoninresten i B30 er erstattet med en lysinrest, den C-terminale carboxylgruppe i B-kæden kan være beskyttet, og aspara-ginresten i A21 kan være udskiftet med en af de i krav 1 angivne L-aminosyrerester.

Opfindelsen angår også opløsninger af nedenstående 20 forbindelser med formlen I, eventuelt indholdende et kontrolleret zinkionniveau. Derved forbedres og reguleres insulinvirkningens retarderingsgrad. Disse injicerbare opløsninger ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de som aktiv bestanddel indeholder en forbindelse ifølge krav 1.

25 Den fremragende kemiske stabilitet fremgår af neden stående tabel IV og V, hvoraf det fremgår, at stabiliteten opnås ved udskiftningen i A21-stillingen (W). De øvrige udskiftninger af aminosyrer giver den ønskede, retarderede virkning.

Der er følgelig ved denne opfindelse foretaget flere ændringer 30 i forhold til humaninsulin for at få både forøget kemisk stabilitet og retarderet virkning.

En undergruppe af forbindelser med formel I er hidtil ukendte forbindelser med den almene formel I, hvori A, B, E^, 2 3 4 E , E , E , X og Y er som angivet i krav 1, R betegner en usub-35 stitueret amidorest, der blokerer den C-terminale carboxylgruppe i B-kæden, og W er forskellig fra en asparaginrest.

DK 160880 B

5

Sammenlignet med humaninsulin opnås ændringen i ladning ved at udskifte threoninresteri i B27-stillingen med en arginin- eller lysinrest og/eller ved at udskifte en vilkårlig af de fire glutaminsyrerester i A4-, A17-, B13- og B21-stillin-5 gen med en glutaminrest. Yderligere kan den C-terminale car-boxylgruppe i B-kæden være blokeret af en aminogruppe, hvorved den eliminerer den negative ladning af carboxylgruppen. Ydermere kan der indføres en positiv ladning ved at indføre en lysylrest i B30-stillingen.

10 Da forbindelser med formlen I kan anvendes i klinik ken som opløsninger med retarderet virkning, kan der forekomme et fald i immunogeniciteten i sammenligning med de almindeligt anvendte opløsninger af svine- eller humaninsulin.

Retarderingsgraden kan forøges og reguleres ved til-15 sætning af zinkioner.

Væsentlige parametre til regulering af retarderingsgraden af insulinvirkningen er koncentrationen af zink og valget af forbindelsen med formlen I. Området for det foretrukne zinkindhold strækker sig fra 2 μg til ca. 2 mg/ml, fortrinsvis 20 fra 5 μg til 200 μg/ml zink med udskiftning i B13- og/eller B27-stillingen og fortrinsvis fra ca. 20 til 200 μg/ml med andre analoger i et præparat indeholdende 240 nmol af en forbindelse med formel I pr. ml. Ved anvendelse af andre koncentrationer af forbindelsen med formel I skal zinkindholdet 25 justeres tilsvarende.

Den retarderede virkning af opløsninger af forbindelser med formel I i nærværelse af zinkioner tilskrives den lave opløselighed af sådanne forbindelser ved neutralt pH.

pH-værdien af den injicerbare opløsning ifølge denne 30 opfindelse skal fortrinsvis være under den fysiologiske pH-værdi, idet den øvre grænse er den pH-værdi, ved hvilken der sker udfældning. Ved den fysiologiske pH-værdi har forbindelser med formel I ifølge opfindelsen en lav opløselighed. Der er fremstillet stabile opløsninger indeholdende ca. 240 nmol/ml af 35 forbindelser med formel I ved pH-værdi ca. 5,5. Den øvre grænse afhænger af opløsningens bestanddele, dvs. isotonikum, konser- DK 160880 B ) i 6 ! j i ! i veringsmiddel og zinkkoncentration og af valget af forbindelse med formel I. Der er ingen nedre grænse for opløsningernes pH- i værdi, og den kemiske stabilitet af forbindelserne med formlen i i I, hvor W er forskellig fra en asparaginrest, er høj, selv ved \ 5 pH 3. Det foretrukne pH-område for de injicerbare opløsninger ' ifølge denne opfindelse er fra ca. 2,5 til 8,5, mere foretruk- | ket fra ca, 4,5 til 8, Specielt foretrukket er pH-området fra ca. 2,5 til 5,5, især fra ca. 3 til 4,5.

Det er et yderligere aspekt ved denne opfindelse, at 10 den muliggør forøget fleksibilitet for patienterne. Patienten kan med to vandige opløsninger, én indeholdende en forbindelse med formel I og den anden indeholdende et zinksalt, få en ønsket grad af retarderet virkning og en ønsket profil ved at blande de to opløsninger på passende måde. Under anvendelse af 15 to stamopløsninger har patienten følgelig mulighed for at vælge én virkning og profil til morgeninjektionen og en anden virkning og profil til afteninjektionen. Zinkopløsningen ifølge opfindelsen indeholder fortrinsvis mellem ca. 2 μg og 20 mg zink pr. ml. Alternativt kan begge stamopløsninger indeholde zink, 20 enten i samme eller forskellige koncentrationer, og/eller begge stamopløsninger kan indeholde en forbindelse med formel I - enten den samme eller forskellige forbindelser.

De injicerbare opløsninger ifølge denne opfindelse har fortrinsvis en styrke på mellem ca. 60 og 6000 nmol/ml af 25 forbindelsen med formel I.

Når W ikke er en L-asparaginrest, kan den være glycin, serin, threonin, asparaginsyre, arginin eller histidin.

I en gruppe af foretrukne forbindelser med formel I er Y en lysinrest.

30 En anden foretrukken udførelsesform for denne opfin delse er præparater, der indeholder en forbindelse med formel 12 3 4 I, hvori E , E , E og/eller E er en glutaminrest, og/eller X er Lys eller Arg, og W er Gly, Ser, Thr, His eller Asp, og inden for denne undergiruppe af forbindelser med formel I er en

DK 160880 B

7 yderligere foretrukken udførelsesform præparater, der indeholder en forbindelse med formel I, hvori gruppen -Y-R er -Thr-NH2 eller -Lys-NH2.

Specifikke, foretrukne forbindelser med formel I er 5 hver af de følgende: A21 non

Gly ,Arg ,Thr -NH^-humaninsulin, A21 R27 ^

Ser ,Arg ,Thr -NH2-humaninsulin,

HisA^, ArgB^, Thr B^-NH2-humaninsulin,

AspA^, ArgB^ ,ThrB^-NH_-humaninsulin, A21 R77 Ώ7Π ^ 10 Asp ,Arg° ,LysB -NH2-humaninsulin,

GlyA^,GlnB^ ,ArgB^ ,ThrB^-NH2-humaninsulin,

Ser^^Gln®^ ArgB^,ThrB^-NH2-humaninsulin og

ThrA^,GlnB^,ArgB^,ThrB^-NH2-humaninsulin.

En yderligere foretrukket udførelsesform for denne 15 opfindelse er præparater indeholdende en forbindelse med formel I, i hvilken Y er Thr, R er hydroxy, og W er Gly, Ser, Thr, His eller Asp, og et eksempel på en sådan forbindelse er A21 Λ B27 .

His /Arg -humamnsulm. 1 2

en gruppe af foretrukne forbindelser med formel I

2 3 20 er E og E en glutaminrest.

I en anden gruppe af foretrukne forbindelser med formel I er X en arginin- eller lysinrest.

I en yderligere gruppe af foretrukne forbindelser med formel I er W Gly, Ser, Thr, His eller Asp.

25 Som det er fagmanden bekendt, er ikke alle aminosyre- resterne i humaninsulin essentielle for insulinvirkningen.

Svine- og okseinsulin, der m.h.t. aminosyrerester er forskellig fra humaninsulin, er da også blevet brugt til behandling af diabetikere. Der forekommer betydelige variatio-30 ner i insulinmolekylet fra art til art. Således kan mange aminosyrerester i humaninsulinmolekylet ændres, uden at der sker en utilladelig formindskelse af insulinaktiviteten, heriblandt nogle rester med indflydelse på molekylets isoelektriske punkt.

•i 8

DK 160880B

12 3

Det er indlysende, at grupperne betegnet E , E , E , E4, R, W, X og Y skal vælges således, at den resulterende forbindelse med formel I er farmaceutisk acceptabel- j I de kendte, bifasiske insulinpræparater er det ΐ 5 almindeligt at kombinere hurtigtvirkende, opløst insulin med 1 krystallinsk insulin med retarderet virkning i- samme injektion. i i

Under anvendelse af forbindelser med formel I ifølge denne op- ! findelse kan der opnås en tilsvarende kombineret hurtig og re- | tarderet virkning med en opløsning af en enkelt forbindelse med ] 10 formel I. Forholdet mellem hurtig virkning og retarderet virk- j

ning aftager, når opløsningens zinkionkoncentration forøges. I

Forbindelser med formel I kan fremstilles ved en i transpeptidering, i hvilken en biosyntetisk precursorforbindel- j se, som har de korrekte insulindisulfidbroer, og som har den i 15 almene formel II: i i X-B(26-22)-E4-B(20-14)-E3-B(12-1) I (II)

B{28-29)-(Qg-T)r-A(1-3)-E1-A(5-16)-E2-A(18-20)-W

hvori Q er en peptidkæde med q aminosyrer, q er et helt tal fra 20 0 til 33, T er Lys eller Arg, r er nul eller én, og A, B, E1, 2 3 4 E , E , E , W og X er hver som beskrevet i krav 1, omsættes med en aminoforbindelse med den almene formel III: H-Y-R (III) hvor Y og R hver er som angivet i krav 1, under anvendelse af 25 trypsin eller et trypsinlignende enzym som katalysator i en blanding af vand og organiske opløsningsmidler analogt som beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.343.898. En foretrukken forbindelse med formel III til brug ved denne metode er Thr-NI^·

Blandt de trypsinlignende enzymer er lysylendopeptidase fra 30 Achromobacter lyticus anvendelig.

DK 160880 B

9

Forbindelsen med formel II kan udtrykkes i en værtsorganisme såsom gær i lighed med beskrivelsen i europæisk patentansøgning publikationsnr. 163.529 under anvendelse af et gen med de korrekte codoner til de pågældende aminosyrer. Det 5 gen, der koder for det hidtil ukendte insulinderivat, indsættes så i en egnet udtryksvektor, der, når den overføres til gær, er i stand til at udtrykke den ønskede forbindelse. Det udtrykte produkt isoleres derefter fra cellerne eller kulturvæsken, afhængigt af om det er udskilt fra cellerne eller ikke.

10 Ændringer i A4-, A17-, A21-, B13-, B21- eller B27- stillingen kan hensigtsmæssigt foretages ved gensplejsning, idet den ønskede C-terminale rest i B-kæden indføres ved tryp-sinkatalyseret semisyntese.

Fordelen ved at indføre de yderligere, positive lad-15 ninger inden for rammerne af insulinmolekylets 51 aminosyrer for at lave de hidtil ukendte forbindelser med formel I i stedet for at forlænge B-kæden ud over pattedyrinsulins 30 rester er, at fremstillingen bliver lettere. Ved den semisyntetiske transpeptidering bruges der et stort molært overskud af amino-20 syreamidet eller aminosyreesteren. Hvis der ved transpetide-ringsreaktionen skulle bruges dipeptidamid eller -ester, ville enten prisen eller opløseligheden eller begge dele forhindre anvendelsen af et stort overskud, og udbyttet af produktet bliver følgelig lavere.

25 Insulinpræparater ifølge denne opfindelse fremstilles ved at opløse en forbindelse med formel I i et vandigt medium under svagt sure betingelser, f.eks. i en koncentration på 240 eller 600 nmol/ml. Det vandige medium gøres isotonisk, f.eks. med natriumchlorid, natriumacetat eller glycerol. Endvidere kan 30 det vandige medium indeholde zinkioner i en koncentration på indtil ca. 30 μg Zn++ pr. nmol af forbindelsen med formel I, puffere såsom acetat, citrat og histidin og konserveringsmidler såsom m-cresol, nipagen eller phenol. Det endelige insulinpræparats pH-værdi afhænger af antallet af ladninger, der er æn-35 dret i forbindelsen med formel I, koncentrationen af zinkioner, koncentrationen af forbindelsen med formel I og af, hvilken DK 160880 B i 10 forbindelse med formel I der er valgt. pH-værdien indstilles til en værdi, der er egnet til administration som f.eks. ca.

2,5 - 4,5, hvorved udfældning undgås. Insulinpræparatet steriliseres ved sterilfiltrering.

5 Insulinpræparaterne ifølge denne opfindelse anvendes analogt med anvendelsen af de kendte insulinpræparater.

De heri anvendte forkortelser for aminosyrerne er de, som er angivet i J.Biol.Chem. 243 (1968), 3558. Aminosyrerne, der er beskrevet i denne beskrivelse, er i L-konfiguration. I 10 formel I og andre steder heri er A(1-3) Gly-Ile-Val, A(5-6) er Gln-Cys osv., jfr. aminosyresekvensen for humaninsulin. Med mindre andet er angivet, er insulinarten i denne beskrivelse humaninsulin.

Syntese af insulinforbindelser 15 Insulinudgangsmaterialet var en insulinprecursor, som var udtrykt i gær som beskrevet i europæisk patentansøgning publikationsnr. 163.529.

Insulinprecursorerne blev udvundet fra fermentations-væskerne ved adsorption til LiChroprep^ RP-18 som beskrevet i 20 eksempel 7 i den samme europæiske patentansøgning. Precursorer-ne elueredes fra søjlen med 0,2 M. KCl, 0,001 M HCl i 33% (rum-fang/rumfang) ethanol. Insulinprecursorerne blev krystalliseret fra den opsamlede fraktion ved successivt at tilsætte vand (1 rumfang pr. rumfang af det opsamlede), fast trinatriumcitrat 25 til opnåelse af en molaritet på 0,05 M og til Sidst zinkacetat til opnåelse af en molaritet på 0,006 M. pH-værdien blev justeret til 6,8, og blandingen henstod natten over ved 4°C. Krystallerne blev isoleret ved centrifugering, vasket med vand og tørret i vakuum.

30 Beskyttede aminosyrer og beskyttede peptider til enzymatisk semisyntese var enten fremstillet ved standardmetoder eller indkøbt (almindelige synteser) fra enten Nova Biochem eller Bachem, begge Schweiz.

DK 160880 B

11

Bogstaverne VM efter et navn angiver, at det er et varemærke.

I udgangsmaterialet i eksemplerne 1 til og med 14 blev (Q -T)r fra formel II valgt til Ala-Ala-Lys og fremstillet 5 som beskrevet for gærplasmid pMT610 i eksempel 10 i europæisk patentansøgning publikationsnr. 163.529. Nucleotider, der koder . B13 pi Al7 , B27 τ B27 . A21 rl„A21 A21 for Gin. / Gin / Ajtcj * Lys ψ Asp * Gly ^ His / A?1 A21

Ser og Thr blev udskiftet i pMT610 ved site specifik mutagenese under anvendelse af fremgangsmåden i Nucl.Acids.Res.

10 11 (1983), 5103 - 5112.

Eksempel 1 „ B13 „ B27 , . , .

Syntese af Gin ,Arg -humamnsulm

Der sættes 25 ml 25,5% (rumfang/rumfang) vand i DMF (25,5 ml vand, DMF op til 100 ml) til en suspension af 5 g D 1 o no η 15 Gin ,Arg ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-insulinprecursor i 50 ml 2 M Thr-OBut CH C00H (L“threonin-tert.butylester-hydroace-tatsalt). Suspensionen nedkøles til 12°C under omrøring. Der tilsættes en opløsning af 0,5 g svinetrypsin i 12,5 ml af en 0,05 M vandig opløsning af calciumacetat. Omrøringen fortsættes 20 indtil opløsning. Efter 48 timer ved 12°C udfældes proteinerne ved, at blandingen hældes i 600 ml acetone. Bundfaldet isoleres ved centrifugering, vaskes en gang med 200 ml acetone, isoleres ved centrifugering og tørres i en nitrogenstrøm. Bundfaldet opløses i 100 ml 0,04 N saltsyre, pH-værdien indstilles til 2,5, 25 og opløsningen sættes på en 5 x 30 cm's præparativ højtryksvæ-skekromatografisøjle (i det følgende benævnt HPLC), som er pakket med silikapartikler, der er udskiftet med octadecyldi-methylsilyl (gennemsnitlig partikelstørrelse 15 micron, porestørrelse 100 Ångstrøm). Søjlen ækvilibreres med ethanol/0,3 M 30 vandig opløsning af kaliumchlorid, 0,001 N saltsyre i forholdet 35,5/64,5 (rumfangsdele). Proteinerne elueres fra søjlen med den samme puffer med en hastighed på 2 liter/t.

DK 160880B

12 «ι B13 * B27 _u B30 „ t .

Gin ,Arg ,Thr -OBu -humamnsulm findes i en top, der kommer ud fra kolonnen mellem 55 og 100 minutter.

Gin ,Arg ,Thr . -OBu -humamnsulm isoleres fra det opsam- lede materiale ved successive tilsætninger af vand til en 5 ethanolkoncentration på 15% (rumfang/rumfang), fast trinatrium-citrat til opnåelse af en molaritet på 0,05 M med hensyn til citrat og fast zinkchlorid til opnåelse af en molaritet på 0,006 M med hensyn til zink. pH-værdien indstilles til 6,8, og efter 1 time ved stuetemperatur fortsættes krystalliseringen 10 ved 4°C i 24 timer under omrøring. Krystallerne centrifugeres, vaskes to gange med 20 ml iskoldt vand, centrifugeres og tørres in vacuo. Udbytte; 2,51 g GlnB^,ArgB27,ThrB^-OBu1"-humaninsulin.

ol q R9 7 R7H +

Gin , Arg ,Thr -OBu -humaninsulin opløses i 100 15 ml trifluoreddikesyre og henstår i to timer ved stuetemperatur. Trifluoreddikesyren fjernes ved frysetørring. Det frysetørrede produkt opløses i 100 ml vand, pH-værdien indstilles til 2,5, og 20 g natriumchlorid tilsættes. Saltkagen bestående af B13 B27

Gin ,Arg -humaninsulin isoleres ved centrifugering. Salt-20 kagen opløses i 850 ml vand, og Gin ,Arg -humaninsulin krystalliseres ved successiv tilsætning af 150 ml ethanol, 14,7 g trinatriumcitrat-dihydrat og 0,82 g zinkchlorid efterfulgt af indstilling af pH-værdien til 6,8. Efter 1 time ved stuetemperatur fortsættes krystalliseringen ved 4°C i 24 timer under let 25 omrøring. Krystallerne centrifugeres, vaskes to gange med 20 ml iskoldt vand, centrifugeres og tørres in vacuo. Udbytte; 1,71 g B13 B27

Gin ,Arg -humaninsulin svarende til 36%.

Aminosyresammensætningen er i overensstemmelse med teorien, to argininrester pr. molekyle. Produktet er rent ved 30 DISC PAGE-electrophorese, vandringshastigheden er 55% af humaninsulins vandringshastighed svarende til en forskel i ladninger på ca. 2. Detaljer for DISC PAGE-elektrophorese fremgår af Horm.Metab.Res.Supplement Series No. 5 (1974), 134. Zinkindholdet i krystallerne er 0.,42% (vægt/vægt).

DK 160880 B

13

Eksempel 2-6

Syntese af GlnA^7,GlnB^3-humaninsulin, GlnA3-7,ArgB27-humaninsu-B27 B27 lin. Arg -humaninsulin, Lys -humaninsulin og . A?1 R97

His ,Arg -humaninsulin__________________ 5 De 5 i overskriften nævnte forbindelser syntetiseres ud fra de tilsvarende, enkeltkædede insulinprecursorer, nemlig

Gin ,GlnaiJ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21),

Al 7 R77

Gin ,Arg“ ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), B27 9 ,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21), B2 7 10 Lys ,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) og A21 B27

His ,Arg ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) under anvendelse af de i eksempel 1 beskrevne metoder. Udbytter, ladninger i forhold til humaninsulin, bevægelseshastighed i forhold til insulin ved DISC PAGE-elektroforese ved pH 8,9 og afvigelser i 15 aminosyresammensætningen fra humaninsulin fremgår af tabel I.

Eksempel 7-13

Syntese af AspA21,ArgB27,ThrB30-NH2-humaninsulin,

GlyA2^,ArgB27,ThrB3B-NH2-humaninsulin,

HisA2^,ArgB27,ThrB3B-NH2-humaninsulin, 20 GlyA2^,GlnB^3,ArgB27,ThrB3B-NH2-humaninsulin, SerA21,GlnB13,ArgB27,ThrB30-NH2-humaninsulin,

ThrA21,GlnB13,ArgB27,ThrB30-NH2-humaninsulin og SsrA2^,Arg827,ThrB39-NH2-humaninsulin__

De 7 i overskriften nævnte forbindelser syntetiseres 25 ud fra de tilsvarende enkeltkædede insulinprecursorer, nemlig A21 B27

Asp ,Arg ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), A21 no7

Glyft , Arg1^ ' ,B (1-29 ) -Ala-Ala-Lys-A(1-21), A21 B27

His ,Arg /B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), A21 Ri^ R97

Gly ,Gin ,Arg ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), A21 Bi3 b27 30 Ser ,Gln ,Arg ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), DK 160880 B ! 14 A21 B13 B27

Thr ,Gln ,Arg /B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) og i

A21 B27 I

Ser ,Arg ,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) ved tryptisk trans- peptidering i organisk vandig opløsning i nærværelse af Thr-NH2 som beskrevet i europæisk patentansøgning publikationsnr. j 5 194.864/ eksemplerne 4 og 6. Udbytter, ladninger i forhold til |

humaninsulin, bevægelseshastigheder i forhold til insulin ved I

DISC PAGE-elektroforese ved pH 8,9 og afvigelser fra humaninsulin med hensyn til aminosyresammensætningen fremgår af tabel I. i

Eksempel 14 10 Syntese af AspA2^,ArgB^^,LysB30-NH^-humaninsulin

Den i overskriften nævnte forbindelse syntetiseres ud fra den tilsvarende enkeltkædede insulinprecursor, nemlig

AspA^,ArgB^,B(l-29 )-Ala-Ala-Lys-A( 1-21), ved tryptisk trans- peptidering i organisk vandig opløsning i nærværelse af B3 0 15 Lys(Boc)-NH^, rensning af mellemproduktet, Lys(Boc) -N^-humaninsulin, efterfulgt af fjernelse af Boc-beskyttelsesgrup-pen ved hjælp af TFA som beskrevet i europæisk patentansøgning publikationsnr. 194.864, eksemplerne 5 og 7. Udbytte og analysedata er vist i tabel I.

l5 DK 160880 B

U Vi U Vi U M

43 jo jc j3 43 43 * E-i £-< t-< E-< E-< E-1 0)

I (O r—I rH rH rH l—I iH

a >i i i i I i i (C r—( I £ O ' ' v ' v

m + vi & Λ Oj Οι Λ Cu U

i, r|fl a) cfi cn yi tn tn +: >,>1 < < < < < < 0) <C +3

Qj^ r—1 rH rH rH rH H CN

emu i till ii

·+ OS

g C (M) * ' · (C 0) rH VlVlVlO'VlO'O'U'O'aiO’0} +3 43 43++:M>H + SHcnvi ·+ G 0) ·+ 4-) (1)

14 C IH H t—IrHr—I rH I—IHrHi—I rH r+ ι—I rH

(1)4-)(1)0 I I IH-I+ + + +I+ +

Ml E

H 0) C \ ».«.«.fck»·.*.·.·.*·.

0) C -+ Vi tJ'DitndlS'SM^VB'Vt? U» Q) rH fl) GVi)H>i-+3h<+-+'+<1)M!1)Vi •h g 3 4) Φ<;ι<ι-3Κ<ίυ=:αα)<(Λ<: > g en cn ο* ih nj g dj c; .—i <—i s—i i—i <—i <—i —ι <—i <—ι ·—i >—f <—i < 0) ·+ Vl -H + + + + + + + + + + + + I -Ό S3

03 O' rH -H

(DO - O C

in 0) co 43 (0 rH xl SH ε 0) O' D3 0 35 minininminininminininin OH ο,νι £ C ιηιηΓ-'Γ-Γ'-Γ-'ίΟιηηηηιηιη «4.) +

> (I) Ό Ή H H

<D (0 <D -HO

ffl 43 > dP 4-1 to •h a (0 t-

CnO ε C

C Ή 33-+33 H ^ η ο λ η a - ~ _

C +3 33 CMCMHrHrHHCMCMCOCOCOCMCN

Ό vi ι—ι cn Ό + + + + + + + + + + + + + <3 Ο ·+ C 4) +1+4+)-+ > h» 0) 4-)

4_J (Jp COCMLOO'+OrOCMOCOrHO' CO

>, *3* CO CO CO <—I CM CO CM CM CM CM <—I

XZ

Ό

D

CM CM X S CM

2 2 S3 I I z

o o I

CO CO o ffl ffl CO

cm cm cm Sh Vi CQ cm cm 333333+:43 Sh 33 33

S2ZEHEH43ZZ III -- Eh I I

ooot-r-t-oo

COCOCOCMCMCMCOCO

Vi Vi Sh O' O' O’ Vi in ni— c-c-r-t-cococot-t-

S3 I rH CM CMCMCMCMHHHCMCM

00 CQ CQ fflfflCQBfflffl»«« *r4 tsi S3 O' 0'0'0'0'C3GC30'0' 4J G ι—1 Vl VlWVlVlHrHrHVlVl 3 ·+ OC <<<<ΟΟϋ<< μ_( 4_J C wfc.

(¾ p"* Γ**- Γ— rH 1—I rH rH rH rH rH rH rH

rH 4-) £ rHrHCMCNCMCMCMCMCMCMCMCNCN

aline) cc<mcQ<<<c<i<rf:<i<<c oocjc CdO'cncnainin^viViViCii (CO -H 1-1(+3-1^1-+031-1-+ I—10)430)03 B tn-HH ϋθ<^κ<θΕθΐηΕΗω<

DK 160880B

16 I

(

Eksempel 15 i

Fremstilling af injicerbare opløsninger af forbindelser med formel I

Med henblik på analyse af graden af retarderet virk-5 ning fremstilles sterile, injicerbare opløsninger af forbindelserne med formel I under anvendelse af 1,6% (vægt/rumfang) glycerol som isotonikum med 0,3% (vægt/rumfang) m-cresol som konserveringsmiddel og pufret med 0,01 M natriumacetat. Koncentrationen af zinkioner er 8 eller 80 μg/ml. Opløsningernes pH-10 værdi indstilles tilstrækkeligt langt fra det isoelektriske punkt af forbindelserne med formel I til at holde opløsningerne klare ved opbevaring ved 4°C. Opløsningerne indeholder 240 nmol/ml af forbindelserne med formel I. Koncentrationen på 240 nmol/ml etableres ved måling af absorptionen ved 276 nm af en 15 mere koncentreret stamopløsning fri for m-cresol under anvendelse af den molære ekstinktionskoefficient for svineinsulin på 6100 for disse derivater (se Handbuch der Inneren Medizin, bd.

7/del 2A, redaktør: Oberdisse, 1975, 113). For monokomponent svineinsulin er den anerkendte styrke 28,5 U/mg tørstof (se 20 Diabetes Care, bind 6/supplement 1 (1983), 4), dvs. 1 U svarer til 5,95 nmol.

Der fremstilles injicerbare opløsninger indeholdende 240 nmol/ml af forbindelserne med formel I som vist i tabel II og med pH-værdier og zinkindhold som vist deri.

25 Test af retardering af insulinvirkning

Retarderingen af den hypoglycæmiske virkning, der opnås med de injicerbare insulinopløsninger afprøves ifølge British Pharmacopoeia 1980, A 142, på fastende kaniner. Hver prøveopløsning indgives subkutant i en dosis på 14,3 nmol til 30 hver kanin i en gruppe på 12 dyr med en vægt på 3 - 4 kg, og forløbet af hypoglycæmien følges i 6 timer. Til sammenligning

17 DK 160880B

inkluderes det hurtigtvirkende præparat, ActrapidVM svineinsu-lin, og det middelhurtigtvirkende, Monotard^ humaninsulin, i forsøgene. Forsøgsresultaterne fremgår af tabel II.

Tabel II

I |- 5 Forbindelse Zn , pH % glucose af det oprindelige_ med formel I_μ9/πι1_1 time 2 timer 4 timer 6 timer

Gin 7, ArgB27-humaninsulin 80 4,5 53 47 50 66

GlnB^,ArgB2^-humaninsulin 80 4,5 55 46 61 91

Glri^3"7 ,GlnB^3-humaninsulin 80 4,5 53 47 55 82 10 ArgB27-humaninsulin 80 4,5 45 34 51 91 DO 7

Lys -humaninsulin 80 4,5 .47 40 55 93 . A21 . B27 B30

Asp ,Arg ,Thr humaninsulin 80 4 60 54 58 60 . A21 . B27 τ B30 Asp ,Arg ,Lys -N^- 15 humaninsulin 80 4 72 67 61 59

Gly ,Arg ,Thr -NH_- humaninsulin 8 4 59 62 71 74

Giy“W2W30-(<V

humaninsulin 80 4 72 73 74 74 20 His^2^,ArgB27-humaninsulin 80 4 65 53 66 88

His ,Arg ,Thr humaninsulin 80 4 61 52 52 72

Gly^Gln813,^7,^630- NH„-humaninsulin 80 4 82 86 85 90 25 SerA21,GlnB13,ArgB27,ThrB3°- NH„-humaninsulin 80 4 90 91 88 92 ^“\GlnB13,W*V30- ΝΕ,-humaninsulin 80 4 90 90 88 93

SeHW^.Thr»0-^- 30 humaninsulin 80 4 60 62 64 68

Actrapid^ svineinsulin 15 7 46 44 74 91

Monotard^ humaninsulin_80 7_54_43_50_74

DK 160880B

18 j

Styrken af insulinforbindelserne bestemmes ved muse-blodsukkerdepletionsprøven (British Pharmacopoeia 1980, A 141 -A 142). For at minimere problemet med at bedømme styrken af insulinerne med en timing, der er forskellig fra standarden, 5 fremstilles insulinopløsninger til styrkebestemmelser uden tilsætning af zink. Opløsninger fremstilles, så de indeholder 240 nmol/ml baseret på absorptionen ved 276 nm. Zinkindholdet i opløsningerne er 8 - 10 μg/ml hidrørende fra de krystallinske derivater. Den estimerede styrke af nogle insulinforbindelser 10 er vist i tabel III.

Tabel III

19

DK 160880 B

Styrke i Konfidens- forhold til grænser ______insulin, %_(p = 0,05), % A17 B27 5 Gin ,Arg -humaninsulin 69 79 - 62

Bl3 B27

Gin ,Arg -humaninsulin 78 88 - 69 A17 _ Bl3 .

Gin ,Gln -humaninsulin 50 63 - 40 B27

Arg -humaninsulin 87 95 - 80 B27

Lys -humaninsulin 88 97 - 80 10 AspA21,ArgB27,ThrB30-NH2- humaninsulin 83 92 - 74

AspA21,Arg82 7,Lys83 0-NH2~ humaninsulin 69 77 - 62

GlyA21,ArgB27,ThrB30-NH2- 15 humaninsulin 75 83 - 68 API RP7

His ,Arg -humaninsulin 71 79 - 63 H isA21,Arg82 7,Thr83 0-NH2~ humaninsulin 72 81 - 64

GlyA21,GlnBl3,ArgB27,Thr830- 20 NH_-humaninsulin 49 54 - 44 *A21 r, B13 B27 B30

Ser ,Gln ,Arg ,Thr NHp-humaninsulin 47 54 - 40 ^A21 B13 B27 , B30

Thr ,Gin ,Arg ,Thr - NH--humaninsulin 28 32 - 24 __ _ ^A21 , B27 B30 25 Ser ,Arg ,Thr ~NH2~ humaninsulin 76 83 - 68

Eksempel 16

Den markante forbedring af den uønskede dannelse af

„ API

monode s ami doprodukter, som opnas ved udskiftning af Asn med 30 andre aminosyrer, fremgår af nedenstående tabel IV. Den opnåede

DK 160880 B

20 forbedring ved en pH-værdi på 3 - 5 er en faktor 10 - 100 gange og er højest ved pH 3. I tabellen angives den hastighed med hvilken monodesamidoprodukter dannes som procent pr. uge for forskellige insuliner ved opbevaring som opløste, sterile præ-5 parater.

Tabel IV

Dannelse af monodesamidoprodukter, % pr. uge

Temperatur, °C 45 37 25_ pH-vær di_3,0 5,0 3,0 5,0 3,0 5,0 10 Humaninsulin 45 2* 90 2* - B27 , B30

Arg ,Thr -NH2~ humaninsulin 40 7 - 10 10 2 . A21 Λ B27 B30

Asp ,Arg ,Thr -NH2~ humaninsulin - - 1,5 1 15 GlyA21,ArgB27,ThrB30-NH2- humaninsulin 1 1 1 2 0,20,2

HisA21,ArgB27,ThrB30-NH2~ humaninsulin_2 _0,5 _0,2 0,2 *delvis udfældet 20 Den markante forbedring af den uønskede dannelse af di- og polymerisatttionsprodukter, som opnås ved udskiftning af AsnA2^ med andre aminosyrer, fremgår af nedenstående tabel V.

Tabel V

21

DK 160880 B

Dannelse af di- og polymerisationsprodukter, % pr. uge

Temperatur, °C 45 37 25_ pH-værdi_ 3,0 5,0 3,0 5,0 3,0 5,0 5 Humaninsulin 2,4 7,9* 2,2 8*

ArgB27,ThrB30-NH2- humaninsulin 1,6 5,1 - - 0,15 1,3

AspA21,Arg827,ThrB3 0-NH2- humaninsulin - - 0,1 0,3 10 GlyA21,ArgB27,ThrB30-NH2- humaninsulin 0,1 0,4 0,06 0,27 0,03 0,17

HisA21,ArgB27,ThrB30-NH2- humaninsulin_0,1 -_-_-_0,02 0,06 ♦delvis udfældet 15 Den høje stabilitet, som opnås ved udskiftning af A21

Asn med andre aminosyrer, kan muliggøre opbevaring af opløste insulinpræparater ved stuetemperatur, hvorimod de hidtil anvendte insulinpræparater skal opbevares køligt.

Eksempel 17 20· Den fremragende protraherede virkning af forbindel serne ifølge denne opfindelse illustreres yderligere i nedenstående tabel vi, hvor indexet for protraheret virkning er beregnet som angivet i Protein Engineering 1 (1987), side 211, øverst, venstre spalte. I tabel VI er de 3 første forbindelser 25 omfattet af patentkrav i tidligere offentliggjorte patentansøgninger .

DK 160880 B

Tabel VI

22

Index for protraheret

Forbindelse_virkning/ 3 Zn++/hexamer O O 1

Lys -NH^-humaninsulin -7 5 Arg -Arg -svineinsulin 4 B31 332

Lys -Arg -humaninsulin -9 A21 _ A27 B30„TT ,

Gly ,Arg /Thr NH~-humanxnsulin 41 A21 B13 _ B27 B30 „„ . .

Gly #Gln /Arg ,Thr -NH_-humanxnsulxn 37 A21 Ri^ R27 R^O ^

Ser /Gin /Arg ,Thr -NH -humaninsulin 38 A?1 Ri2 R77 R^H ^ 10 Thr »Gin /Arg ,Thr -NH -humaninsulin 29 A21 B27 B13 ^

Ser /Arg ,Thr -NH_-humaninsulin 44 . A21 B27 __ B30 * . , . . ,

Arg /Arg , Thr -NH^-humanxnsulxn_14_ I nedenstående tabel VII er angivet index for protraheret virkning for nogle yderligere forbindelser ifølge denne 15 opfindelse ved højere tilsætning af zink.

Tabel VII

Index for protraheret

Forbindelse_ virkning/ 3 Zn++ hexamer

AspA^,ArgB^ ,ThrB^°-NH2-humaninsulin 56 20 AspA^ ,ArgB^ ,Lys53°-NH_-humaninsulin 70 • A21 B27 ^

Hxs ,Arg -humaninsulin___25_

Claims (10)

1. Insulinderivater med den almene formel I A(1-3)-E1-A(5-6)-Cys-A(8-16)-E2-A(18-19)-Cys-W (A-kæde) I I

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X er en lysin- eller argininrest. DK 16088QB

3. Forbindelser ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at E og EJ hver er en gluta-minrest.

4. Forbindelser ifølge et hvilket som helst af de 5 foregående krav, kendetegnet ved, at Y er lysin.

5. Forbindelser ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at R er -NH2.

5. S I I s S (I) I I B(1-6)-Cys-B(8-12)-E3-B(14-18)-Cys 10 I (B-kæde) R-Y-Lys-Pro-X-B(26-22)-E4-Gly hvori bogstaverne A og B efterfulgt af tal i parenteser betegner de ved tallene i parentes angivne peptidfragmenter i hen-holdsvis A- og B-kæderne i humaninsulin, E , E , E"3 og E4 er 15 ens eller forskellige og hver betegner en rest af glutaminsyre eller glutamin, X betegner en L-threonin-, L-arginin- eller L-lysinrest, W betegner en rest af arginin, histidin, glycin, asparaginsyre, asparagin, serin eller threonin, Y betegner en rest af threonin eller lysin, og R betegner hydroxy eller 20 -NH2/ med det forbehold, at hvis W er en asparaginrest, er R hydroxy, og hvis W er en asparaginrest, X og -Y-R er en threo-ninrest, og E3 er en glutaminrest, er ikke både E1, E2 og E4 glutaminsyrerester, og yderligere med det forbehold, at mindst 12 3 4 en af de seks aminosyrerester E , E , E , E , W og X er for-25 skellig fra de aminosyrerester, der er til stede i de tilsvarende stillinger i humaninsulin, og at mindst en af de syv 12 3 4 aminosyrerester E , E , E , E , W, X og Y og gruppen R vælges således, at forbindelsen med formlen I har mindst en ladning mere end humaninsulin ved en pH-værdi på 7.

6. Forbindelser ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at W er en asparginsyre-, 10 histidin-, glycin-, serin- eller threoninrest.

7. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er GlyA21,ArgB27,Thr53°-NH--humaninsulin, „ A21 . B27 B30 1TT/ . Ser ,Arg ,Thr -NH--humaninsulin, K A21 B27 B30 * . .

15 His ,Arg ,Thr -NH~-humaninsulin, Λ01 R97 ^ Asp ,Arg ,Thr -NH2-humaninsulin, AspA23", ArgB27 ,LysB3^-NH--humaninsulin, Gly ,Gln ,Arg ,Thr -NH2~humaninsulin, SerA2\ GlnB3-3, ArgB2 7, ThrB3^-NH2 -humaninsulin,

20 ThrA2^,GlnB^^,ArgB27,ThrB3^-NH2“humaninsulin eller H is , ArgB2 7 -human insulin.

8. Injicerbare opløsninger med retarderet insulinvirkning, kendetegnet ved, at de indeholder et insulinderivat med den i krav 1 angivne almene formel I.

9. Injicerbare opløsninger ifølge krav 8, kendetegnet ved, at de indeholder en forbindelse med formel I ifølge et hvilket som helst af kravene 2-7.

10. Præparat ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at det indeholder zinkioner, fortrinsvis fra ca. 2 pg til ca. 2 30 mg zink pr. ml, mest foretrukket fra ca. 5 μg til 200 μg zink pr. ml.