DK160944B - Modificerede beta2-mikroglobuliner og farmaceutiske praeparater indeholdende disse - Google Patents

Description

DK 160944 B

Opfindelsen angår hidtil ukendte modificerede P2~mi-kroglobuliner (mj02ln) °9 farmaceutiske præparater indeholdende m/^m.

5 De modificerede β2'^^c^i^τogl6buliτιeτ ifølge opfindelsen har den almene formel I:

R1-Cys-R2-X

I I

Y-R3-Cys-R4 10 hvori R3 er en 24 aminosyregruppe med sekvensen:

Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala-

Glu-Asn-Gly-Lys-Ser-Asn-Phe-Leu-Asn-, R2 er en 30 aminosyregruppe med sekvensen: -Tyr-Val-Ser-Gly-Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu-Val-Asp-Leu-Leu-15 Lys-Asn-Gly-Glu-Arg-Ile-Gly-Lys-Val-Glu-His-Ser-Asp-Leu-Ser-,

Rj er en 20-aminosyregruppe med sekvensen: -Trp-Ser-Phe-Tyr-Leu-Leu-Tyr-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Pro-Thr-Glu-Lys-Asp-Glu-Tyr-Ala-, R4 er en 19 aminosyregruppe med sekvensen: 20 -Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-Arg-Asp-Met, -X er -Phe, -Phe-Ser, eller -Phe-Ser-Lys, fortrinsvis -Phe, og Y- er Asp-, Lys-Asp-, Ser-Lys-Asp-, fortrinsvis Asp-, 25 idet summen af antallet af aminosyrerester i X og Y højest er 4.

Modificeret /?2-mikr°gl°bulin (mj02m) er en variant af β2-mikroglobulin (^2m)/ hvilken variant er blevet opdaget i forbindelse med et antal cancertyper og immunsystemlideiser.

30

Dets præcursor /?2m er et serumprotein med en molekylvægt på 11.800 Daltons bestående af et enkeltkædet polypeptid med 99 aminosyregrupper med en disulfidbro mellem cysteingrupperne i positionerne 25 og 80, og med en kendt aminosyresekvens (1).

35 Strukturelt fremviser /J2m en markeret homologi med det konstante område i IgG, især Cfj3 området og a3 området i den tunge kæde HLA-B7. /32m er en del af det store histokompabilitetskompleks på cellemembraner og er i fri form til stede i legemsvæsker såsom 2

DK 160944 B

serum, spinalvæske, spyt, sæd og kolestrum (2, 3). Hos sunde individer er serumkoncentrationen af 50 - 200 nmol/1 (4).

Serumkoncentrationen af /3 2® er forhøjet ved en række 5 sygdomme f.eks. rheumatoid arthritis (RA), systemisk lupus erytho-matosus (SLE), malignt lymphom (ML), og visse typer lungecancer såsom småcellet lungecancer (SLC) (5-7) . Høje serum 02® niveauer ved ML falder under påvirkning af kemoterapi, mens tilbagefald i almindelighed ikke medfølges af stigende serum >02m· 10 Småcellet lungecancer (SLC) er næsten altid dissemineret på diagnosetidspunktet, og hovedbehandlingen er derfor kombinationskemoterapi. Med kemoterapi er det muligt at inducere remission hos mere end 80% af alle patienter, men i de fleste tilfælde vil tumoren senere undslippe kontrol. Den tidligst mulige diag-15 nose, fortrinsvis på et trin hvor sygdommen er lokaliseret, kan følgelig være afgørende for at forbedre overlevelsesgraden for patienter, der lider af SLC.

Erhvervet immundefektsyndrom (AIDS) er den sluttelige kulmination for en sygdom, der øjensynlig foreligger i andre 20 former, såsom AIDS-relateret kompleks eller lymphadenopathi-syndrom, og i mindre udtrykte tilstande, inklusiv bærertilstanden. Bloddonorundersøgelse med et antistof mod den formodede frembringende virus (HTLV-III/LAV) er påbegyndt. En sådan undersøgelse for viruset opdager kun en udsættelse for det, ikke tilste-25 deværelsen af eller en prognose for udviklingen af sygdommen. Endvidere lykkes det til tider ikke for antistofprøven for HTLV-III at detektere tilstedeværelsen af viruset (1). Der foreligger således et behov for en ånden undersøgelse, der vil muliggøre en mere kvantitativ bedømmelse af immunsystemets respons overfor 30 udsættelse for HTLV-III.

02® har modtaget megen opmærksomhed som en mulig markør, der kunne anvendes til diagnose og overvågning af sygdomme såsom de ovennævnte.

Det er således blevet rapporteret, at de fleste undersøgte AIDS-patienter har 02m niveauer over det normale. Det er endvidere blevet rapporteret, at forøgede 02m niveauer har vist 35 3

DK 160944 B

sig i et antal tilfælde endog to år inden klinisk diagnose af AIDS.

In vitro inkubering af serum fra patienter med RA; SLE, kimcelletumorer og ML har vist sig at resultere i forekomsten af 5 en /32m fraktion med "α-elektroforetisk mobilitet" ved krydset radioimmunelektroforese (CRIE). Hos patienter med ML har man fundet en omvendt korrelation mellem mængden af denne a-fraktion og reaktion på kemoterapi.

Rhavi B. Bhalla et al.: Clinical Chemistry 31, (1985) s.

10 1411 har rapporteret, at den α-elektroforetiske form af /?2m eller modificeret var til stede hos alle deres AIDS-patienter inklusive dem, der havde normale 02m niveauer, og derudover også en patient, som var HTLV-III negativ.

Swanson et al.: Clinical Chemistry 28 (1982) s. 2033-15 2039 beskriver på side 2038, at deres /92-inikroglobulin bestemmelser viser 5 forskellige former ved 2-dimensional elektroforese, alle med forskellige pi'er, men ensartede molekylvægte.

Det er således endnu ikke fastlagt, hvilken eller hvilke 20 fraktioner, der er interessante til brug ved de ovennævnte metoder.

Hidtil er der ikke blevet beskrevet nogen biologisk betydning af nogen af de i litteraturen anførte modificerede 25 former for 02m, men under arbejdet på opfindelsen fandtes det overraskende, at m/?2m er biologisk aktiv som biologisk responsmodificerende middel, der forstærker immunologiske reaktioner, der allerede er blevet aktiveret, idet m/?2m ifølge opfindelsen forøgede den cytotoksiske aktivitet i blandede lymphocytkulturer 30 samt stimulerede produktionen af lymphokinen interleukin-2, og at jS2m i denne henseende virker som præcursor for det aktive stof mjS2TO» idet /32m øjensynlig i organismen nedbrydes til det aktive stof.

35 På baggrund af disse opdagelser er det ved opfindelsen også til hensigt at angive farmaceutiske præparater, hvilke præparater er ejendommelige ved det i den kendetegnende del af krav 6 angivne. De er fortrinsvis biologiske responsmodificerende midler 4

DK 160944 B

såsom immunstimulerende eller -undertrykkende midler.

Opfindelsen beskrives nedenfor i detaljer under henvisning til tegningen, hvorpå 5

Fig. 1 viser aminosyresekvensen for de omhandlede modificerede 02-mikroglobuliner i sammenligning med sekvensen for /32m,

Fig. 2 viser krydset radioimmunelektroforese (CRIE) og 10 krydset immunelektroforese (CIE) analyser af humant serum og humant serum tilsat /?2m,

Fig. 3 viser resultaterne fra et /32m enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) af fraktioner fra den kromatografiske elue-15 ring af /S2m og m/S2m,

Fig. 4 viser CIE analyser af fraktioner fra de to toppe I i Fig. 3B, og j l i 20 Fig. 5 viser relationen mellem cytotoksisk aktivitet af 1 25 blandede lymfocytkulturer (MLC) og tilsat m/32m.

Modificeret £2-mikroglobulin er defineret som den 1 fraktion af jff2m, der har en relativ mobilitet på 2,0 i sammen-25 ligning med det native protein ved CRIE analyse.

Det modificerede /?2-mikroglobulin ifølge opfindelsen opnåedes ved at isolere det sammen med /32m fra serumprøver fra patienter med histologisk verificeret småcellet anaplastisk lunge-30 cancer og efterfølgende adskillelse fra /?2m.

Isolering af m/?2m og 02m fra serumet udførtes ved gelfiltrering efter 5 dages inkubation ved 20'C.

35 Fraktioner indeholdende m/?2m og /?2m kromatofokuseredes ved pH 7-4 for at adskille m/92® fra /?2m, og den m/?2m holdige fraktion rensedes efterfølgende ved gelfiltrering.

5

DK 160944 B

Det omhandlede produkt m£2ra karakteriseredes fysiskkemisk og biokemisk ved CIE, CRIE, natriumdodecylsulfatpolyacryl-amid gelektroforese (SDS-PAGE) og analytisk isoelektrisk fokusering (IEF) og fandtes at svare til den α-elektroforetiske form af 5 jø2m eller m/32m som defineret angivet i Fig. 4 B, s. 630, i Piesner: Allergy 35 (1980) s. 627-637.

Det omhandlede m/32m kan også opnås ved enhver anden kombination af velkendte metoder, hvorved molekyler fraktioneres 10 efter deres størrelse og isoelektriske punkt.

M/?2m ifølge opfindelsen have en tilsyneladende molekylvægt på 15.000 i ikke-reduceret form, og opspaltes i to mindre peptider med molvægt under 12.000 i reduceret form ved SDS-PAGE 15 analyse. I ikke-reduceret form havde m/92m et pi på 5,3 ved analytisk IEF.

Det isolerede mjS2m underkastedes aminosyresekventering og fandtes at bestå af en blanding af peptider med den almene 20 formel I

R1-Cys-R2-X

I I

Y-R3-Cys-R4 hvori Ri er en 24 aminosyregruppe med sekvensen: 25 Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala-Glu-Asn-Gly-Lys-Ser-Asn-Phe-Leu-Asn, R2 er en 30 aminosyregruppe med sekvensen: Tyr-Val-Ser-Gly-Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu-Val-Asp-Leu-Leu-Lys-Asn-Gly-Glu-Arg-Ile-Gly-Lys-Val-Glu-His-Ser-Asp-Leu-Ser, 30 r3 er en 20-aminosyregruppe med sekvensen:

Trp-Ser-Phe-TyrLeu-Leu-Tyr-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Pro-Thr-Glu-Lys-

Asp-Glu-Tyr-Ala R4 er en 19 aminosyregruppe med sekvensen: Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-35 Arg-Asp-Met, -X er -Phe, -Phe-Ser, eller -Phe-Ser-Lys, fortrinsvis -Phe, og Y- er Asp-, Lys-Asp-, Ser-Lys-Asp-, fortrinsvis Asp-,

DK 160944B

6 idet summen af antallet af aminosyrerester i X og Y højest er 4.

Aminosyresekvensen for R1-Cys-R2-X-kæden (A-kæden) er identisk med den i (1) offentliggjorte sekvens af grupperne 1-56 5 (58) i det native /?2m roed den eneste undtagelse af aminosyrerest 42, hvor resten ifølge opfindelsen er Asn, hvorimod den offentliggjorte sekvens angiver Asp. Sekvensen ifølge opfindelsen er imidlertid i overensstemmelse med den sekvens, der udledtes ud fra klonet cDNA af Suggs et al.iProc. Natl. Acad. Sci. USA 78. (1981) 10 s. 6613-6617, som også angiver Asn i position 42.

Sekvensen for den C-terminale ende af R1-Cys-R2-X-kæden bestemtes både ved Edman nedbrydning fra den N-terminale ende og ved carboxypeptidasenedbrydning fra den C-terminale ende, og det 15 fandtes, at produktet i overvejende grad bestod af det peptid, hvor X er Phe. Den C-terminale bestemmelse kompliceredes af tilstedeværelsen af serinrester i positionerne 52, 55 og 57.

Aminosyresekvensen for Y-R3-Cys-R4-kæden (B-kæden) er 20 identisk med resterne (57) 59 - 99 i den i (1) offentliggjorte sekvens for nativ /32m, idet Y overvejende var Asp.

I et overraskende aspekt ved opfindelsen viste det sig, at renset m/?2m forøgede den cytotoksiske aktivitet i blandede 25 lymphocytkulturer (MLC) samt stimulerede produktionen af lympho-kinen interleukin-2 (IL-2). Vekselvirkningen af m/32m med det store histokompabilitetskompleks (MHC), hvori /J2m er en normal komponent, kunne føre til aktivering af celler resulterende i f.eks. en forøget cellulær receptorexpression for generel stimulatorisk 30 aktivitet såsom interleukin-1 (IL-1) og en forøget expression af receptorer for IL-2 og forhøjet endogen produktion af denne lymphokin. Denne biologiske aktivitet ved det omhandlede mjS2m angiver en farmaceutisk anvendelighed af m/32m som biologisk responsmodificerende middel, hvor den farmakologiske virkning vil 35 være relateret til immunsystemets tilstand. Farmakologiske virkninger af m/32m er relateret til virkningen på membranniveauet på grund af vekselvirkning med MHC og er blandt andet relateret til den specifikke stimulatoriske virkning på IL-2 produktion.

7

DK 160944 B

En stimulatorisk virkning på IL-2 produktion forstærker en række immunologiske aktiviteter, såsom stimulering, suppression o.s.v. afhængigt af immunsystemets tilstand ved indgivningen af 5 m^2®>· Et særligt vigtigt aspekt ved stimuleringen af IL-2 produktion med m/S2m vil være forstærkningen af lymphokinaktiveret dræb-ning (LAK) formidlet af naturlige dræberceller (NK), som er kendte for at stimulere tumorregressioner.

10 Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

15 Eksempel 1

Isolation og rensning af mB^m a) Materialer og metoder: 20

Materialer

Sephadex® G-75 og Polybuffer Exchanger 94 leveredes fra Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige. Acrylamid, methylen-25 bis-acrylamid og ammoniumpersulfat leveredes fra Serva, Heidelberg, Vesttyskland. Ammediol og natrium dodecylsulfat leveredes fra Merck, Darmstadt, Vesttyskland.

Udgangsmateriale 30

Serumprøver fra to patienter med histologisk verificeret småcellet anaplastisk lungecancer (17) isoleredes indenfor 6 timer efter udtagning af blodprøverne og holdtes frosne ved -20°C indtil anvendelse.

35 - 8 -

DK 160944 B

Urinær B^m

Urinprøver opsamlet fra uremiske patienter anvendtes til isolering af urinært 62m. Proteiner udfældedes med 90% - 100% 5 ammoniumsulfat ved 5000 G i en time. Det udfældede stof solubilise-redes derefter i isotonisk saltopløsning. Rensningsprocedurerne var derefter identiske med, hvad der er beskrevet for serum nedenfor.

125

I mærkning af protein A

10 5 mg protein A (Pharmacia Fine Chemicals) rekonstitueredes i isotonisk saltopløsning til en slutkoncentration på 1,25 g/1.

125

Ca. 12,5 μΐ mærkedes med 2 mCi I (IM 5681, Amersham,' Buckinghamshire, England) efter Bolton-Hunter metoden (ref.). Mærket protein 15 A afsaltedes derefter på en PD-10 søjle (Pharmacia Fine Chemicals) og fortyndedes derpå i 2 liter phosphatpufferet saltopløsning (PBS) pH 7,4 indeholdende okseserumalbumin (BSA) (1 g/1) og NaN^ (5 mM) (Merck). Det anvendtes derefter i et tidsrum på en måned til inkubering af immunoelektroforeseplader.

20

Krydset immunoelektroforese (CIE)

Gelen var 1% (w/v) HSA agarose (Litex, København,

Danmark) i 7,3 mM Tris, 28 mM barbital puffer (pH 8,6) indeholdende 25 2 mM NaN^. Gelbundet film 70 m x 75 mm x 0,2 ni (Marine Colloids, Rockland, Maine, U.S.A.) anvendtes som underlag. Til elektroforese i den første dimension påførtes 20 μΐ eller 40 μΐ og elektroforere-des ved 10 V/cm indtil en hæmoglobinmarkør havde vandret 2,5 cm (ca. 75 minutter). Elektroforese i den anden dimension overfor 30 kanin anti-human 6210 (Dakopatts, København, Danmark) (1 μΐ/σπ^) udførtes ved 2 V/cm i mindst 16 timer. Pladen pressedes derefter og vaskedes to gange i isotonisk saltopløsning efterfulgt af tørring og farvning med Commassie Brilliant Blue R-2500 (Sigma, St. Louis, U.S.A.).

35 - 9 -

DK 160944 B

Krydset radioimmunoelektroforese (CRIE)

Til krydset radioimmunoelektroforese inkuberedes den 125 samme plade som ovenfor natten over med I mærket protein A 5 opløsning. Ikke-specifikt bundet radioaktivitet fjernedes ved vask af pladerne i isotonisk saltopløsning i 6 timer, og i destilleret vand natten over. Efter tørring visualiseredes det radioaktive udfældede stof ved autoradiografi på Kodak XS-1 film. Exponerings-tiden var normalt 2-16 timer (18). CRIE anvendtes til at bedømme 10 den 62m modificerende aktivitet, eftersom mængden af m32m anses for at være proportional med arealet under 62m præcipitatet i det a-elektroforetiske område. Arealet af de to toppe måltes med et semiautomatisk planimeter, som beskrevet af Weeke (19). Andelen udtryktes på en skala fra 0-1 arbitrær enhed (A.U.). (Arealet der 15 er afgrænset af 32m præcipitatet i α-området divideret med det totale areal af både 62m toppen og m62m toppen (α + β fraktionen)). Standardafvigelsen var 0,03 A.U.

Enzymbundet immunosorbent assay af 32m 20 B2m indholdet af forskellige fraktioner blev anslået ved en modifikation af ELISA metoden ifølge (20).

Anvendte antisera: Kanin anti-human 32m antistof (lot 25 095) og peroxidasekonjugeret kanin anti-human 62m antistof (lot 100) leveredes begge fra DAKO-Immunoglobulins A/S, København, Danmark.

Reagenser: Reagens A (overtrækspuffer): PBS (0,010 M 30 Naf^PO^/NaHPO^; 0,145 M NaCl, pH 7,2 + 0,2). Reagens B (vaske- og fortyndingspuffer): PBS; 0,1% Tween 20 (v/v) (Merck), 0,5 M NaCl. Reagens C (farvereagens): 8 mg 1,2-phenylendiamin dihydrochlorid (lot 095 (DAKO)), 12 ml 0,1 M citronsyrefosfatpuffer, pH 5,0 + 0,2, 5 μΐ 30% H202.

35 - 10 -

DK 160944 B

Sera: Standard sera fremstilledes ved 300 gange fortynding af standarderne i Pharmacia 82m RIA kit Katalog Nr. 10-6408-01, lot 8577 med reagens B til opnåelse af et arbejdsområde på 1,33 1 53,33μg/l. Kontrolsera var 82m højt niveau og lavt niveau begge 5 leveret fra Pharmacia.

Bjin ELISA: Brøndene i en polystyren mikrotiterplade (kode 239454, Nunc, København) blev overtrukket med 82m antistof ved tilsætning af 100 μΐ B2m antistof (2,9 g/1) fortyndet 1:1000 med 10 reagens A i hver brønd. Efter 24 timers inkubering ved stuetemperatur tømtes pladen og vaskedes tre gange med reagens B. Standard- og undersøgelsesprøver fortyndedes med reagens B, 100 μΐ fortynding pipeteredes i de sensitiviserede brønde. Hver bestemmelse udførtes in duplo. Inkuberingen afsluttedes efter 1 time ved at tømme brønd-15 ene efterfulgt af tre gange vask med reagens B. Det peroxidasemær-kede B2m antistof (1,3 g/1) fortyndedes 1:1000 med reagens B, og 100 μΐ af fortyndingen afpipetteredes i hver brønd og inkuberedes i 0,5 time i mørke ved stuetemperatur. Derefter tømtes pladen og vaskedes tre gange med reagens B efterfulgt af tilsætning af 100 μΐ 20 farvereagens C i hver brønd og inkubering i nøjagtig 15 minutter, hvorefter enzymreaktionen standsedes ved tilsætning af 150 μΐ 1 M svovlsyre i hver brønd. Ekstinktionen i mikrotiterpladens brønde bestemtes ved aflæsning med en ELISA læser SLT 210 (Salzburg, Østrig) ved 492 nm bølgelængde. Alle analysens trin udførtes ved 25 stuetemperatur. Der anvendtes en 8-kanals pipette (Titertek, Teknunc) til hurtig tilsætning af reagenser til brøndene.

Standardkurven konstrueredes ved at indføre middelværdien for hver dobbelte standardbestemmelse som funktion af koncentratio-30 nen på semi-logaritmisk papir. Variationskofficienten for dobbelt-bestemmelser var 9%.

SDS-PAGE

35 SDS-PAGE udførtes i 2,0 mm tykke 13 x 16,5 cm pladegeler.

Gelen og puffersystemet var, som anført af Wycoff (22) og Bury (23), under anvendelse af en lineær gradientgel (T = 5,2% - 15,3%, - 11 -

DK 160944 B

C = 2,6% (bis)). Stackinggelen var T = 4,2%, C = 2,61% (bis). De analyserede prøver opvarmedes i 5 minutter ved 95°C i 1% SDS. Til alkylering af frie thiolgrupper i ikke-reducerede prøver tilsattes jodacetamid (Sigma) til en slutkoncentration på 110 mM. I tilfælde 5 med disulfidbindingsreduktion tilsattes dithiothreitol (Sigma) til en slutkoncentration på 55 mM. Umiddelbart efter opvarmning gennemførtes tilsætning af jodacetamid til en slutkoncentration på 220 mM i ikke-reduceret og 110 mM i reduceret form.

10 Der anvendtes de følgende MW standarder fra Pharmacia

Fine Chemicals: Phosphorylase b(94.000), albumin (67.000), ovalbumin (43.000), karbonanhydrase (30.000), trypsinhæmmer (20.100) og a-lactalalbumin (14.400). Bromphenolblue (Riedel de Hauen, Seelze, Vesttyskland) anvendtes som frontmarkør. Gelerne farvedes med 15 Coomassie Brilliant Blue R-250 efter Fairbanks et al. (24).

Analytisk IEF

Analytisk IEF udførtes på Ampholine® PAG plader (LKB, 20 Bromma, Sverige) ved 25 w/time. Efter IEF fikseredes gelen i 0,14 M sulfosalicylsyre og 0,7 M trichloreddikesyre i destilleret vand. Gelen farvedes derefter i Coomassie Brilliant Blue R-250 solubili-seret i affarvningsopløsning i 10 minutter ved 60°C. Affarvning til fjernelse af overskud af farvestof udførtes i 500 ml 25% v/v 25 ethanol blandet med 160 ml 8% v/v eddikesyre. Til pi bestemmelse var de følgende markører inkluderet; Trypsinogen (pi 9,30), lentil lectin-basisk bånd (pi 8,65), lentil lectin-mellem (pi 8,45), lentil lectin-sur (pi 8,15), myoglobinbasisk bånd (pi 7,35), myogl-obin-surt bånd (6,85), human karbonhydrase B (pi 6,55), oksekarbon-30 hydrase B (pi 6,85), B-lactoglobulin A (pi 5,20) sojabønnetrypsin-hæmmer (pi 4,55), amyloglucosidase (pi 3,50). Bredt kalibreringssæt pi 3,5 - 10 (Pharmacia Fine Chemicals).

- 12 -

DK 160944 B

Sekvensanalyse

Edman nedbrydninger udførtes med en gasfasesekvenser (Applied Biosystems model 470A) som beskrevet i (25) . Phenyliso-5 thiocyanataminosyrerne identificeredes og kvantificeredes ved modfase HPLC på en IBM cyanosøjle.

Ved S-aminoethyleret peptid mærkedes cysteingrupperne med 14 C under ammoethylenngen og cysteingrupper i disse peptider 10 bestemtes ved radioaktiv tælling fra 20% af hver phenylthiohydan-toinaminosyre (PTH-a.a.) gruppe.

Aminosyreanalyse 15 Ca. 5 nmol protein hydrolyseredes i 100 μΐ 6 N HC1 ved 110°C i 24 timer. Aminosyreanalysen udførtes på en Beckmann model 121 aminosyreanalysator. Der foretoges ingen korrektion for destruktion af Trp, Ser, Thr og Cys.

20 C-Terminalbestemmelse

Ca. 20 nmol S-aminoethyleret A-kæde opløstes i 650 μΐ 50 mM pyridin-acetatpuffer (pH 6,15). 20 μΐ norleucin standard (6,5 nmol/μΐ vand), og 30 μΐ carboxypeptidase Y (Boehringer, Mannheim, 25 Vesttyskland) opløst i vand (1,7 μg/μl) tilsattes. Inkuberingen udførtes ved 37°C, og 100 μΐ af nedbrydningsblandingen fjernedes ved tidspunkterne 0, 10, 30 og 120 minutter. Omsætningen standsedes ved tilsætning af 15μ1 eddikesyre. Efter 120 minutters nedbrydning tilsattes 5 μΐ carboxypeptidase B opløsning i vand (Boehringer, 30 Mannheim, Vesttyskland) (0,02 μg/μl) og prøver på 100 μΐ fjernedes til tidspunkterne 125 minutter, 180 minutter og 22 timer, og enzymreaktionen standsedes ved tilsætning af 15 μΐ eddikesyre. Prøverne lyophiliseredes og underkastedes aminosyreanalyse. Der udførtes korrektioner for prøverumfang (intern standard) og for frit amino-35 syreindhold i pufferen (prøvé ved 0 minutter).

- 13 -

DK 160944 B

Reduktion, alkylering og S-aminoethylering 100 nmol ir^m reduceredes natten over ved stuetemperatur med 5 mM dithiothreitol i 0,5 M Tris - HC1 puffer pH 8,1 indehol-5 dende 6 M guanidinhydrochlorid (Sigma) og 0,005 M ethylendiamino-etetraeddikesyre (EDTA) (Merck). Efter reduktion tilsattes 50 μΟΐ jod(2-‘*'^C)eddikesyre (Amersham, CFA 269, specifik aktivitet på 56 mCi/mmol) og alkyleringen fortsattes i 30 minutter i mørke, hvorefter kold jodeddikesyre tilsattes til 10 mmol og alkylering fort-10 sattes i mørke indtil A- og B kæderne var adskilt på HPLC på den samme dag.

Reaktionsblandingen fraktioneredes ved præparativ HPLC på en Waters Nova-pak® 5 μ, C-18 søjle (4,6 mm x 150 mm). A-pufferen 15 var 0,1% (v/v) trifluoreddikesyre i H20 og B-pufferen var 0,07% (v/v) trifluoreddikesyre i acetonitril. Søjlen bragtes i ligevægt med 95% A / 5% B, og 200 μΐ prøve injiceredes. Efter prøveinjektionen elueredes søjlen med en strømningshastighed på 1 ml/minut med 95% A / 5% B i 2 minutter og derefter med en lineær gradient på 1% 20 B-puffer/minut. Absorbansen ved 280 nm registreredes og fraktioner samledes. Peptidmaterialet isoleredes ved vakuum-centrifugering (Savant vacuum centrifuge) og underkastedes sekvensanalyse.

b) Procedure 25

Inkubering

Ca. 50 ml -serum isoleredes fra to patienter med småcellet lungecancer, og 3,62 mg renset urinært 82m tilsattes. Serumet 30 inkuberedes derefter i 6 dage ved 20°C.

For at overvåge og identificere m82m under rensningsprocedurerne anvendtes CIE på prøver udtaget fra forskellige fraktioner under proceduren. Til sammenligning viser fig. 2 CRIE (fig. 2 a 35 og b) og CIE (fig. 2 c og d) analyser af henholdsvis serum og serum med tilsat 62m, inden inkubering og efter 3 dages inkubering ved 20 °C.

- 14 -

DK 160944 B

Af fig. 2 fremgår det, at fremkomsten af mfl^111 ®r et resultat af inkuberingen, og det er også tydeligt, at tilsætningen af nativt 62m forøger udbyttet af m62m meget.

5 G-75 Sephadex® gelfiltrering

Efter inkubering anbragtes serumprøven (50 ml) på en søjle (100 x 5 cm) pakket med Sephadex® G-75 og bragt i ligevægt med 0,025 M imidazol/HCl puffer pH 7,4. Eluering udførtes med den samme 10 puffer med en strømningshastighed på 40 ml/time. Fraktioner på 10 ml indsamledes og analyseredes med 82m ELISA. Resultaterne heraf er anført i fig. 3A.

Chromatofocusering 15

Fraktioner indeholdende 62m fra G-75 søjlen samledes og anbragtes på en søjle (0,9 x 70 cm) pakket med Polybuffer Exchanger 94 (Pharmacia Fine Chemicals) og bragt i ligevægt med imidazol/HCl puffer pH 7,4. ¢2111 elueredes med po lypuf fer 74 fortyndet 1:8 i 20 destilleret vand og justeret til pH 4,0 med HC1. pH gradienten overvågedes ved pH målinger i hver fraktion efter eluering. Fraktioner på 5 ml indsamledes og analyseredes i et é^111 ELISA, hvis resultater er vist i fig. 3B. Fraktioner svarende til hver af de i fig. 3B viste toppe samledes og analyseredes ved CIE, hvis resultat 25 er vist i fig. 4. Nativt 82111 elueredes ved pi 5,7 og mf^ni ved pi 5,3. Renset opnåedes ved at samle de fraktioner, der svarer til den anden top i fig. 3B.

Fjernelse af forureninger og endelig rensning 30

For at fjerne forureninger og ammoniumsulfat fra produktet udfældedes de samlede ir^m-holdige fraktioner med 90 - 100% ammoniumsulfat ved 5000 G i en time, hvorefter det udfældede stof solubiliseredes i isotonisk saltopløsning og anbragtes på en søjle 35 pakket med Sephadex® G-25 og bragt i ligevægt med lM eddikesyre. Eluering udførtes med samme puffer, og ir^m-holdige fraktioner samledes.

- 15 -

DK 160944 B

Det således opnåede produkt analyseredes ved CIE og fandtes at være m82m som defineret ovenfor.

Aminosyresekvens 5

Aminosyresekvensen for m82m ifølge opfindelsen bestemtes efter de ovenfor angivne metoder.

Resultaterne af den N-terminale sekvensanalyse er angivet 10 i Tabel 1 nedenfor.

DK 160944 B

- 16 -Tabel 1 N-Terminale aminosyresekvenser i de to kæder af mg^m 5 Cyklus PTH-a.a. Udbytte PTH-a.a. Udbytte

Nr._(pmol)_(pmol) 1 Ile 2022 Asp 654 2 Gin 1494 Trp 883 10 3 Arg 500 Ser 190 4 Thr 474 Phe 1845 5 _Pro_1173_Tyr_ 1293 6 Lys 1091 Leu 1572 7 Ile 1383 Leu 1905 15 8 Gin 1361 Tyr 1213 9 Val 1415 Tyr 1305 10 Tyr ' 1472 Thr 436 11 Ser 73 Glu 596 12 Arg 223 Phe 1070 20 13 His 206 Thr 196 14 Pro* (636) Pro* (636) 15 Ala 935 Thr 221 16 Glu** (387) Glu** (387) 17 Asn 691 Lys 456 25 18 Gly 503 Asp 307 19 Lys 536 Glu 365 20 Ser 61 Tyr 487 21 Asn 559 Ala 552 22 Phe 506 (Cys) 30 23 Leu 578 Arg 185 24 Asn 318 Val 453 25 (Cys) - Asn 382 26 Tyr 379 His 74 27 Val*** (351) Val*** (351) 35 ' "

Gennemsnitligt repetitivt udbytte: 92,2% *) Pro er til stede i begge kæder i cyklus nr. 14 **) Glu er til stede i begge kæder i cyklus nr. 16 ***) Val er til stede i begge kæder i cyklus nr. 27 40

Som angivet af disse resultater, frigøres der to PTH-a.a.-grupper i tilnærmelsesvis ækvimolær mængde ved hver nedbrydningscyklus, hvilket viser at molekylet består af to kæder.

- 17 -

DK 160944B

Aminosyresammensætning

Aminosyresammensætningen bestemtes som angivet ovenfor, og resultaterne er tabuleret for mB^m og B^m nedenfor.

5

Tabel 2

Aminosyresammensætning af modificeret og nativt B2-mikroglobulin 10 Aminosyrerest pr. molekyle

Aminosyre _m32m_Nativt 82~M__

Asx1 11,3 12

Thr 5,6 5 15 Ser 8,5 9

Glx1 11,8 11

Pro 6,4 5

Gly 5,4 3

Ala 3,9 2 20 Cys 1/2 1,7 2

Val1 7,0 7

Met 1 1,1 1

Ile 4,3 5

Leu1 7,6 7 25 Tyr 5,3 6

Phe 4,6 5

Lys1 7,0 8

His 3,7 4

Arg1 5,3 5 30 Trp n.d. 2 n.d". = ikke bestemt 40 aminosyre anvendt til normalisering 35

Grundet urenheder i proteinpræparatet, er det ikke muligt at fastlægge den nøjagtige aminosyresammensætning af mB^m ved analysen, men af Tabel 2 fremgår det, at aminosyresammensætningen af mB2m ligger tæt ved aminosyresammensætningen for nativ B2m.

- 18 -

DK 160944 B

R^-Cys-R^-X-kæde (A-kæde) R^-CysHE^-X-kæden i mi^ni isoleredes ved modfase HPLC af det reducerede og S-aminoethylerede protein. Ved sekvenbestemmelse 5 af dette peptid kunne aminosyregrupperne nr. 1 - 56 bestemmes. Sekensbestemmelsens resultater er tabuleret nedenfor:

Tabel 3 10 Aminosyresevkens for den S-aminoethylerede A-kæde i mB^m

Cyklus 1 Udbytte Cyklus Udbytte

Nr. PTH-A.A. (pmol) Nr. PTH-A.A. (pmol) 15 1 Ile 7789 31 His 422 2 Gin 2656 32 Pro 671 3 Arg 1024 33 Ser 106 4 Thr 1895 34 Asp 457 20 5 Pro 3500 35 Ile 566 6 Lys 7625 36 Glu 373 7 Ile 4655 37 Val 767 8 Gin 3470 38 Asp 276 9 Val 4950 39 Leu 721 25 10 Tyr 4006 40 Leu 810 11 Ser 495 41 Lys 352 12 Arg 1119 42 Asn 345 13 His 978 . 43 Gly 239 14 Pro 2295 44 Glu 136 30 15 Ala 3650 45 Arg 187 16 Glu 1675 46 Ile 328 17 Asn 1475 47 Glu 154 18 Gly 1749 48 Lys 203 19 Lys 5410 49 Val 213 35 _20__Ser_166_50_Glu_148 21 Asn 1542 51 His 58 22 Phe 2214 52 Ser 17 23 Leu 2239 53 Asp 92 24 Asn 1200 54 Leu 166 40 25 - - 55 Ser 8 26 Tyr 1427 56 Phe 193 27 Val 1660 57 - 28 Ser 173 58 - 29 Gly 783 59 - 45 _30_Phe_1359_

Gennemsnitligt repetitivt udbytte: 96,9% (a.a. 1 - 20), 90,9% (a.a. 20 - 56)

_ 19 _ DK 160944B

Fastlæggelsen af cysteingruppen i position 25 var baseret på radioaktiv tælling af en portion af hver PTH-a.a. gruppe.

På denne kæde udførtes C-terminal aminosyresekvensbestem-5 melse ved carboxypeptidase nedbrydning af den S-aminoethylerede kæde. Resultaterne af denne analyse er vist i den følgende Tabel 4.

Tabel 4

10 C-terminalbestemmelse af den S-aminoethylerede A-kæde i m82m med carboxypeptidase Y og B

A.a. _TID_____ 15 _10 min. 30 min. 120 min. 125 min. 180 min. 22 t

Asp 0,7 1,1 1,5 1,6 1,7 3,5

Thr 0 0 0 0 0 1,8

Ser 2,3 2,7 3,2 3,2 _ 3,6 6,9 20 Glu 0,5 1,0 1,5 1,6 2,1 5,6

Pro 0 0 0 0 0,91,9

Gly 0,1 0,3 0,4 0,4 0,6 2,4

Ala 0 0 0 0 0,2 1,1

Val 0 0,5 0,8 0,9 1,2 4,1 25 Ile 0,2 0,4 0,6 0,6 0,8 3,9

Leu 2,7 3,5 3,6 3,6 3,6 4,9

Tyr 0 0,1 0,3 0,3 0,4 1,9

Phe 1,5 2,5 2,6 2,5 2,7 3,2

Lys 0,3 0,3 0,6 0,7 1,0 2,8 30 His 0,3 0,5 0,7 0,8 1,3 2,6

Arg_0_0j_2_0^3_0^3_0,5 2,0

Af denne tabel kan det udledes, at i produktet ifølge opfindelsen er X i formel I overvejende Phe, i mindre grad Phe-Ser, 35 og kun mindre mængder, hvor X er Phe-Ser-Lys.

Y-R^-Cys-R^-kæde (B-kæde)

Resultaterne af sekvensanalysen af den S-aminoethylerede Y-R^-Cys-R^-kæde er vist i Tabel 5 nedenfor: '2°· DK 160944 Β 5 Tabel 5

Aminosyresekvens for den S-Aminoethylerede B-kæde i

Cyklus Udbytte 10 Nr._PTH-A.A. _(pmol) 1 Asp 2979 2 Trp 3770 3 Ser 406 4 Phe 3941 15 5 Tyr 3634 6 Leu 3562 7 Leu 3946 8 Tyr 3036 9 Tyr 3315 20 10 Thr 512 11 Glu 2128 12 Phe 2581 13 Thr 448 14 Pro 1353 25 15 Thr 292 16 Glu 1068 17 Lys 1302 18 Asp 690 19 Glu 669 30 20 Tyr 1170 21 Ala 1005 22 2 3 Arg 350 24 Val 1022 35 25_Asn_586_ 26 His 304 27 Val 724 28 Thr 94 29 · Leu 400 40 30 Ser 37 31 Gin 207 32 Pro 261 33 Lys 307 34 Ile 244 45 35 Val 281 36 Lys 280 37 Trp 153 38 Asp 112 39 Arg 141 50 40 Asp 167 41 Met 35

Gennemsnitligt repetitivt udbytte: 87,4%.

- 21 -

DK 160944 B

Som ovenfor er fastlæggelsen af cysteingruppen i position 22 baseret på radioaktiv tælling af en portion af hver PTH-a.a. gruppe. Sekvensen ovenfor er identisk med sekvensen af grupperne 5 59 - 99 i den offentliggjorte sekvens af B2m.

Eksempel 2 MB^m som biologisk responsmodificerende middel 10

Aktiviteten af ir^m som et biologisk respons-modificerende middel bedømtes ved forstærkningen af envejs allogene blandede lymphocytkulturer (MLC).

15 Blandede lymphocytreaktioner

Der anvendtes tre forskellige protokoller.

1. Mikrokulturmetoden (Claesson, M.H. og Miller, R.G.

20 J.Immunol. 134 (1985) s. 684. Kulturer udførtes i replikater på fire til seks i 96-brønds koniske mikrotiterplader (NUNC, Roskilde, Danmark). Responderceller, 2 - 5 x 10^/kultur, og mitomycinbehand-let stimulatorceller (10^/kultur), dyrkedes i et totalt rumfang på 200 μΐ.

25 2. Kulturer udførtes i 12 mm x 75 mm plastrør (Falcon, Oxnard, U.S.A.) med 0,5 - 1,0 x 10^ mitomycinbehandlede stimulatorceller pr. ml i rumfang på 1 - 2 ml.

30 3. Kulturer udførtes i 50 ml vævskulturkolber (NUNC) med 10^/ml henholdsvis responder- og stimulatorceller i rumfang på 5 -10 ml. Nativt og modificeret sattes til individuelle MLC ved dyrkningens dag 0 eller i separate undersøgelser ved dyrkningens dag 0 til 4.

35

DK 160944B

- 22 -

Cytotoxicitets-assays

Cytotoxisk aktivitet af MLC kulturerne bestemtes efter 5 dages dyrkning ved et 4 timers 3^Cr-frigørelsesassay. Targetceller 5 var 2 - 5 x 103 51Cr-mærkede RBL5 (H2b, P815 (H-2d)) og YAC (NK target) tumorcellelinier, og ved nogle undersøgelser Concanavalin A inducerede miltcelleblaster fra MLC stimulatorstammen eller en g ubeslægtet tredie stamme. Targetceller, 1 - 5 x 10 i 0,1 ml føtalt kalveserum mærkedes med 150 pCi natrium (3^Cr) kromat i 1 - 2 timer 10 ved 37°C. Derefter vaskedes cellerne fire gange inden cytotoxici-tetsassay. Spontan 33Cr-frigørelse bestemtes ud fra targetceller, der var sat til kulturer, der kun indeholdt mitomycinbehandlet stimulatorceller. Total frigørbar 3^Cr bestemtes ud fra eddikesyrebehandle targetceller. Procentvis specifik 33Cr-frigørelse beregne-15 des som: (Observeret frigørelse minus spontan frigørelse)/(total frigørelse minus spontan frigørelse) x 100.

Ved mikrokultur MLC fjernedes 0,1 ml ovenstående væske og 51 erstattedes med 0,1 ml Cr-mærkede targetceller. I kulturrørs- og 20 kulturkolbe MLC systemerne, tilsattes 0,1 ml rumfang i replikater på fire 96-brønds V-bundede mikrotiterplader (NUNC) efterfulgt af en passende tilsætning 3^Cr-mærkede targetceller i rumfang på 0,1 ml. I separate undersøgelser rensedes MLC responderceller ved centrifugering på Lymphopaque® (Pharmacia, Sverige) og titreredes mod 25 et konstant antal targetceller. Efter fire timers assay fjernedes kulturrumfang på 0,1 ml ovenstående væske til gammatælling.

Interleukin 2(IL-2) måling 30 IL-2 indholdet måltes in duplo i 2 ml rør MLC kulturer fra dyrkningens dag 1 til 4. Ethundrede μΐ individuelle kultur-supernatanter sattes til tre replikater af en IL-2 afhængig CTL linie, 4B3 (Curtis, A.S.G. og Rooney, P., Nature, London, 281 (1979) s. 222) fra Dr. R.G. Miller, the Ontario Cancer Institute, 35 Toronto, Canada. 4B3 CTL dyrkedes med 4 x 103 celler pr. brønd i fladbundede 96-brønds mikrotiterplader (NUNC) i 48 timer efterfulgt

_ 23 . DK 160944B

af tilsætning af 3H-TdR (0,1 μ(Γΐ pr. brønd) i 6 timer. Celler høstedes i en Scantron Cell Harvester (Oslo, Noge) og taltes i en Scintiliationstæller.

5 Fig. 5 viser, at mS2m signifikant (p 0,01) forøger dannelsen af cytotoxiske lymphocytter (CTL) når det sættes til MLC ved koncentrationer fra 10 - 1000 nM. Den funktionelle aktivitet af CTL frembragt i m-82m exponerede MLC var specifik eftersom, der ikke frembragtes nogen cytotoxisk aktivitet overfor en tredie 10 haplotype targetceller eller naturlige dræberfølsomme targetceller. Endvidere påvirkede m82m sat direkte til det cytotoxiske assay ikke MLC frembragt drab ved CTL.

Supernatanterne fra MLC udsat for nativt eller modifice-15 ret 62m undersøgtes for endogen IL-2 produktion fra dyrkningernes dag 1-4. Data er anført i Tabel 6.

- 24 -

DK 160944 B

Tabel 6 IL-2 produktion i MLC exponeret for 8 m og m60m (200 nM/'ml) og PBS.

5 MLC bestod af 2 x 10 SJL anri 2 x 10° BALB/c i rumfang på 2 ml.

IL-2 produktion undersøgtes med.en IL-2 afhængig CTL klon, 4B3.

IL-2a enheder pr. MLC kulturer 10

Tilsætning l1^ 2 2 £ mS2m 0 14 136 80 62m 2 12 42 104 15 PBS 0 16 28 70 a) En IL-2 enhed er defineret som den mængde af IL-2, der fordobler 3 formeringsreaktionen for 5 x 10 4B3 CTL i 48 timers kulturer.

20 b) Dage for MLC.

Af Tabel 6 fremgår det klart, at m82m stimulerer den tidlige (dag 3) produktion af endogent IL-2 i sammenligning med MLC exponeret for nativt 82m og PBS. I fjerde dags-MLC-kulture var IL-2 25 koncentrationen imidlertid faldende i m82m exponerede MLC sandsynligvis på grund af en forøget optagelseshastighed af de formerende CTL på dette tidspunkt i kulturen. M82m har ikke i sig selv nogen IL-2 virkning, når det afprøves direkte på den klonede CTL linie 4B3 (Curtis, A.S.G. og Rooney, P., Nature (London) 281 (1979) s.

30 281) anvendt til titrering af IL-2 aktivitet.

- 25 -

DK 160944 B

Litteraturhenvisninger: 1. Cunningham, Β.Δ., Wang, J.L., Berggård, I. & Peterson, P.A.

5 (1973) Biochemistry 12, 4811 - 4822.

2. Suggs, S.V., Wallace, R.B., Hirose, T., Kawashima, E.H. & Itakura, K. (1981) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 78, 6613 - 6617.

10 3. Berggård I. & Bearn A.G. (1968) J.Biol.Chem. 243, 4095 - 4103.

4. Piesner T. & Bjerrum O.J. (1980) Scand.J.Immunol. 11, 341 -351.

15 5. Solheim, B.G. & Thorsby, E. (1974) Nature (Lond) 249, 36 - 38.

6. Peterson P.A., Rask, L. & Lindblom, J.B. (1974) Proc.Natl.-Acad. Sci. U.S.A. 71, 35 - 39.

20 7. Cotner, J., Mashimo, H., Kung, P.G. Goldstein, G. &

Strominger, J.L. (1981) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 78, 3858 -3862.

8. Terhorst, C., Agthoven, v.A., LeClair, K., Snow, P., Reinherz, 25 E. & Schlossman, S. (1981) Cell 23, 771 - 780.

9. Peterson, P.A., Cunningham, B.A., Berggård, I. & Edelman, G.M. (1972) Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 69, 1697 - 1701.

30 18. Piesner, T., Wilken, M., Bjerrum, O.J. & Hansen, M.M. (1982) J.Clin.Lab.Immunol. 8, 137 - 414.

19. Weeke, B. (1973) in Manual of quantitative Immunoelectrophoresis. Methods and applications. 1st edn. (Axelsen, N.H., Krøll, 35 J. & Weeke, B., eds.) s. 47 - 56, Universitetsforlaget, Oslo.

- 26 -

DK 160944 B

20. Piesner, T., Nørgaard-Pedersen, B. & Boenisch T. (1975) Scand.J. Clin.Lab.Invest 35, 729 - 735.

22. Wycoff, M., Rodbard, A. & Chrambach, A. (1977) Anal.Biochem.

5 78, 459 - 482.

23. Bury, A.F. (1981) J.Chromatography 213, 491 - 500.

25. Moody, A.J., Thim, L. & Valverde, I. (1984) FEBS Lett. 172, 10 142 - 148.

Claims (7)

27 DK 160944 B

1. Modificeret ^-mikroglobulin, kendetegnet ved, at det har den almene formel I:

2. Modificeret β2-mikroglobulin ifølge krav 1, kende- 25tegnet ved, at -X er -Phe-Ser-Lys, og Y- er Asp-.

3. Modificeret β2-mikrogiobulin ifølge krav 1, kendetegnet ved, at -X er -Phe, og Y- er Asp-.

4. Modificeret /02”mifcro9l°kulin ifølge krav 1, kende tegnet ved, at -X er -Phe-Ser, og Y- er Asp-.

5. Modificeret 02-mikroglobulin ifølge krav 1, 2, 3, eller 4. kendetegnet ved, at det er i detekterbart mærket 35 form, fortrinsvis radiomærket form.

5 Rl-Cys-R2“X I I Y-R3-cys-R4 hvori er en 24 aminosyregruppe med sekvensen: Ile-Gln-Arg-Thr-Pro-Lys-Ile-Gln-Val-Tyr-Ser-Arg-His-Pro-Ala-10 Glu-Asn-Gly-Lys-Ser-Asn-Phe-Leu-Asn-, R2 er en 30 aminosyregruppe med sekvensen: -Tyr-Val-Ser-Gly-Phe-His-Pro-Ser-Asp-Ile-Glu-Val-Asp-Leu-Leu- Lys-Asn-Gly-Glu-Arg-Ile-Gly-Lys-Val-Glu-His-Ser-Asp-Leu-Ser-, R3 er en 20-aminosyregruppe med sekvensen:

15 -Trp-Ser-Phe-Tyr-Leu-Leu-Tyr-Tyr-Thr-Glu-Phe-Thr-Pro-Thr-Glu-Lys-Asp-Glu-Tyr-Ala-, R4 er en 19 aminosyregruppe med sekvensen: -Arg-Val-Asn-His-Val-Thr-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-Arg-Asp-Met,

20 -X er -Phe, -Phe-Ser, eller -Phe-Ser-Lys, fortrinsvis -Phe, og Y- er Asp-, Lys-Asp-, Ser-Lys-Asp-, fortrinsvis Asp-, idet summen af antallet af aminosyrerester i X og Y højest er 4.

6. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det sammen med et eller flere fysiologisk forenelige bæremidler inde- 28 DK 160944 B holder modificeret /32-niikroglobulin ifølge ethvert af kravene 1 til 5 eventuelt i kombination med /^“inikroglobulin.

7. Farmaceutisk præparat ifølge krav 5, kend e te g- 5. e t ved, at det er et biologisk responsmodificerende middel.