DK161015B

DK161015B - Blanding til anvendelse ved ekstern paavisning og lokalisering af en blodprop

Info

Publication number: DK161015B
Application number: DK152082A
Authority: DK
Inventors: Stephanie A Olexa; Linda C Knight; Andrei Z Budzynski
Original assignee: Univ Temple
Priority date: 1981-04-02
Filing date: 1982-04-02
Publication date: 1991-05-21
Also published as: EP0063002A2; CA1198671A; IE53340B1; DE3262006D1; JPS5813524A; IE820776L; DK161015C; NO160114C; EP0063002B1; DK152082A; NO160114B; JPH0161087B2; US4427646A; NO821111L; ATE11372T1; EP0063002A3

Description

i

DK 161015 B

Den foreliggende opfindelse angår en blanding til anvendelse ved ekstern påvisning og lokalisering af en blodprop, og specielt anvendelsen af et radiomærket peptid afledt af nedbrydningen af tværbundet fibrin med plasmin som billedannende mid-5 del til at lokalisere blodpropper in vivo.

Forstyrrelser i blodkoaguleringssystemet findes i en betydelig del af den menneskelige befolkning. Den mest almindelige sygdom er dannelsen af blodpropper, klumper af 10 størknet blod i et blodkar eller en hjertehulhed, som forbliver på dannelsesstedet. Blodpropper i hjertekar, f.eks., kan begrænse blodstrømmen, og resulterer i myocardialinfarkt (død af hjertemuskelen), en af de mest alvorlige former for hjerteangreb.

15

Desuden kan dele af en blodprop eller hele blodproppen løs- < nes sig fra sit bindingssted og bevæge sig gennem blodkar-ne indtil den når et punkt, hvor passagen er begrænset.

Den fremkomne pludselige blokering af blodstrømmen kaldes 20 thromboembolisme. En del af cirkulationssystemet, der er særlig udsat for embolidannelse er . lungerne, det første punkt, hvor hovedarterier deler sig i mindre arterier og kapillarer, efter at hjertet har modtaget blod fra venesystemet.

En undersøgelse i 1968 af alle hospitalsdødsfald viste, 25 at pulmonære emboli var til stede i 50% af patienter, som døde ved alderen 60, og i 64% af de som døde ved alderen 70. Hos patienterne med emboli, var en embolus hovedårsagen til døden i 43% af tilfældene. Samlet påvises over 700.000 tilfælde af pulmonær emboli i De Forenede Stater 30 hvert år, og mere end 90% af disse emboli kan føres tilbage til dyb venethrombose.

Fremgangsmåder der gør det muligt at påvise blodpropper har derfor stor medicinsk betydning, således at der kan 35 tages forebyggende foranstaltninger, såsom kirurgi eller

DK 161015 B

2 terapi med aiitikoaguleringsmiddel.

I de senere år er human fibrinogen mærket med en radioisotop blevet anvendt til påvisning af blodpropper i dybe 5 vener i benet og andre dele af legemet. Fibrinogen kan mærkes med jod-125 (amerikansk patent nr. 3.933.996) eller tekhnetium-99m (amerikansk patent nr. 4.057.617) og injiceres via en egnet bærer i en vene* hvor det går ind i dannelse af størknet blodklump (blodprop). Aktivering af 10 fibrinogen med enzymet thrombin forårsager frigørelse af . t fibrinopeptider (fibrin'monomere) , som polymeriserer til dannelse af en fibrinpolymer, der danner en del af en 'y' størkne-t klump eller blodprop. Når radiomærket fibrinogen går ind i dannelse af en strøknet klump, bliver radioakti-15 viteten lokaliseret og blodproppen kan lokaliseres ved ydre påvisning af strålingen.

Selv om brugen af radiomærket fibrinogen har udgjort et fremskridt i lokaliseringen af blodpropper, er der stadig 20 nogle“problemer. Fibrinogen optages kun af forholdsvis friske eller stadig under dannelse værende blodpropper, og kan derfor blive utilstrækkeligt lokaliseret i gamle blodpropper (> 1 dag gammel) til at muliggøre effektiv ydre billeddannelse. Et billeddannende middel, som vil blive 25 optaget af både blodpropper under dannelse og tidligere dannede blodpropper, er derfor meget ønskeligt. Forud for den foreliggende opfindelse kendtes imidlertid intet sådant middel.

Det er derfor formålet med opfindelsen at angive en blanding 30 til at lokalisere både nyligt dannede og tidligere dannede blodpropper.

35

DK 161015B

3

Blandingen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den omfatter radiomærket peptid valgt af gruppen bestående af fragment Ej isoleret af tværbundet fibrin, fragment E2 isoleret af 5 tværbundet fibrin, og peptider, som har en aminosyresekvens, der ligger mellem sekvenserne i fragmenterne Ei og E2, og en farmaceutisk anvendelig bærer, der er egnet til intravenøs injektion.

Fragmenterne E, og E~ er opløselige nedbrydningsprodukter 10 1 <2 frigjort af tværbundet fibrin ved indvirkning af enzymet thrombin. Disse fragmenter er tidligere kendt, men det var ikke kendt at de ville blive optaget af enten friske eller tidligere dannede størknede blodklumper.

I5 Forholdet mellem fibrinogen og fragmenterne E^ og E2 kan bedst ses, når det betragtes på baggrund af biokemien i dannelsen af størknede blodklumper og nedbrydningen af størknede blodklumper.

20 Human fibrinogen er et opløseligt plasmaprotein, som spaltes af enzymet thrombin og danner uopløselig fibrin, som er netværket eller grundmassen i en størknet blodklump.

Fibrinet kan tværbindes kovalent af faktor XHIa til dannelse af en stabiliseret klump. Human tværbundet fibrin 25 nedbrydes af enzymet plasmin, og frigør derved karakteristiske nedbrydningsprodukter: (DD)E-kompleks, fragmenter DD og E, og α-polymerrester. (DD)E-komplekset er det primære opløselige plasminnedbrydningsprodukt, der frigøres af tværbundet fibrin. Dette kompleks kan undergå yderligere 30 35 4

DK 161015B

indvirkning af plasmin efter følgende skema: Tværbundet fibrin —> (DD)E^—> (DD)E2—> DD + E^. Det oprindelige kompleks indeholder fragmenterne DD og E^. Ved yderligere indvirkning spaltes fragment E^ til fragment E2 uden tab af evnen til at binde til fragment DD. Omdannelse af fragment E2 til Eg resulterer i dissociering af komplekset.

De endelige plasminnedbrydningsprodukter af tværbundet fibrin er derfor fragmenterne DD og . Dette nedbrydnings-mønster er konsekvent uanset forholdet mellem plasmin og fibrin, men hastigheden af dannelsen af slutprodukterne varierer betydeligt med plasminkoncentrationen.

Fremstilling af forskellige plasminnedbrydningsprodukter er tidligere beskrevet af to af de foreliggende opfindere, 15

Olexa og Budzynski, i Biochemistry 18, 991 (1979), og i J. Biol. Chem. 254, 4925 (1979), som inkorporeres heri gennem denne henvisning. Den grundlæggende proces beskrevet i disse offentliggørelser for fremstilling og iso-2Q lering af fragmenterne E^ og E2 begynder med dannelsen af en fibrinklump af fibrinogen, beriget med faktor XIII.

Klumpen hydrolyseres med plasmin og det fremkomne omdannede produkt centrifugeres for at fjerne store partikler.

Den overliggende væske indeholder opløselige nedbrydnings-25 produkter, herunder de ønskede fragmenter E^ og E2. Nedbrydningsprodukterne adskilles efter molekylvægt, fortrinsvis på en søjle af perler af agarosegel, til dannelse af-(DD)E-komplekset. Fragmenterne E^ og E2 fås af det rensede (DD)E-kompleks ved inkubation i en koncentreret saltop-3Q løsning, for at bevirke dissociering af DD og E^ eller E2 fragmenter efterfulgt af adskillelse efter molekylvægt, fortrinsvis ved hjælp af en søjle med perler af agarosegel. En detaljeret beskrivelse af processen er anført i 35

DK 161015 B

5 de ovenfor nævnte publikationer af Olexa og Budzynski.

Fragmenterne E er plasminspaltningsprodukterne af human tværbundet fibrin, som indeholder de Nl^-endestillede områder af alle seks polypeptidkæder i fibrinogen. Mindst 5 tre typer fragnsnt E er blevet isoleret og karakteriseret, dvs. fragmenterne E·^, E2 og E^, med molekylvægte 60.000, 55.000 og 50.000. Disse typer er rækkenedbrydningsprodukter og mikroheterogeneiteten af hver type er blevet iagttaget. Fragmenterne E^ og E2 har evnen til at binde til 10 fragment DD fra tværbundet fibrin, men binder ikke med DD-E-komplekset, fibrinogen, eller nogen af plasminnedbrydnings-produkterne af fibrinogen eller af ikke-tværbundet fibrin.

I nyere undersøgelser som har ført til den foreliggende opfindelse, bestemte opfinderne at fragment ville 15 inkorporeres i en fibrinklump under dannelse i et in vitro system. Dette var det første tegn på at E^-fragmentet ville blive optaget i en størknet blodklump. Yderligere undersøgelser viste at fragment E^ også blev inkorporeret i forud dannede blodklumper, dannet af normal plasma og ældet 20 i serum i 2 timer.

Da fragmentet E^ viste sig at binde til både fibrinklumper under dannelse og forud dannede ældede fibrinklumper, men ikke at binde til opløselig fibrinogen eller plasmaproteiner, erkendte opfinderne at dette molekyle kan virke som 25 et røbestof til at lokalisere in vivo blodpropper. Frag- . .. - . . . . 123 125 131 111_ mentet E-, radioaktivt mærket med I, I, I, In, Q Qm

Tc eller en anden egnet isotop der har gammastråling, som egner sig til ydre billeddannelse, kan injiceres intravenøst i en patient, der mistænkes for at have en 30 blodprop. Periodisk ville områder af patientens legeme blive afbilledet med et gammakamera eller skannet med en retlinet scintillationsskanner. En alternativ metode til 6

DK 161015B

at give oversigt over de dybe vener i benene anvender en manuelt holdt scintillationssonde, der anvendes til at foretage tællinger på flere punkter langs hvert ben.

For at bestemme egnetheden af fragment E^ som in vivo 5 billeddannende middel, må flere faktorer tages i betragtning. Et effektivt røbestof til mærkning af in vivo blodpropper skal have følgende egenskaber: (1) det skal let kunne mærkes med en radioaktiv isotop til en høj specifik aktivitet, (2) når det injiceres systemisk skal det både 10 inkorporeres specifikt og hurtigt i blodklumper under dannelse og binde sig til ældede blodklumper, (3) ubundet materiale skal blive fjernet hurtigt fra cirkulationen, (4) materialet skal ikke binde til fibrinogen eller til andre opløselige plasmaproteiner, (5) mængden af bundet 15 materiale skal aftage efterhånden som blodklumpen lyser, og (6) materialet skal være ikke-antigent. Fragmentet E^ tilfredsstiller alle disse krav.

Fragmentet E^ indeholder ca. 20 tyrosinrester og ca. 10 histidinrester, og kan derfor let mærkes med radioaktivt 20 jod, f.eks. med metoderne chloramin-T, jodmonochlorid, jodogen (1,3,4,6-tetrachlor-3a,6a-diphenylglycoluril) eller lactoperoxidase. Radiomærkning med andre isotoper Q Qtti kan også let opnås, f.eks. med Tc, som beskrevet i Abramochi et al, U.S. patent 4.057,617, som inkorporeres 25 heri gennem denne henvisning. Meget stabil binding af radioaktive metalioner kan bedst opnåes ved anvendelse af et bifunktionelt chelateringsmiddel, dvs. et molekyle indeholdende en metalkompleksbindende gruppe, der kan bindes til peptidet gennem en kovalent binding. Et eksempel på 30 et sådant bifunktionelt chelateringsmiddel er beskrevet af Krejcarek og Tucker i Biochem. Biophys. Res. Commun. 77: 581-585 (1977), som inkorporeres heri gennem denne henvisning. Fragmentet E^ binder til både blodklumper under dan-

DK 161015 B

7 nelse og ældede blodklumper, som vist i den foreliggende beskrivelse. Den biologiske halveringstid af human fragment E1 i kaniner er 1,4 time sammenlignet med 49,3 timer for fibrinogen. Det er meget sandsynligt at human fragment 5 E1 ville have en forholdsvis kort halveringstid i mennesker også. Fragmentet E^ binder ikke til fibrinogen eller nogen fibrinogennedbrydningsprodukter, men binder til ensrettede fibrinmonomermolekyler i en fibrinstreng (tabel 1 og 2). Fragmentet binder ikke til nogen opløselige plasma-10 proteiner. Da fragment E^ kan spaltes til fragment af plasmin, og tabe sin bindingsevne, kan fragment E^ inkorporeret i en fibrinklump spaltes og frigøres i blodet. Tabet af radioaktiv fragment E1 fra blodproppen er parallel med lyse af blodproppen. Da fragment E^ kan afledes 15 af human fibrinogen, er det endeligt ikke sandsynligt at det er et kraftigt antigen. Fragment E^, eller enhver del af fragment E^, som indeholder bindingsstederne, ville derfor være et effektivt røbestof for lokalisering af blodpropper in vivo.

20 Hvor produktet skal anvendes til behandling af mennesker, skal fragmentet E^ fortrinsvis være isoleret af human tværbundet fibrin, for at formindske dets antigenesitet, men til andre forhold er dyrisk tværbundet fibrin egnet som kilde til fragment E^.

25 Fragment E^ kan injiceres intravenøs i enhver egnet farmaceutisk bærer, enten alene eller i kombination med andre terapeutiske eller diagnostiske midler. Egnede bærere er de som opløser fragment eller holder det i suspension og som ikke er toksiske i et omfang, som permanent skader 30 værtsorganismen. Foretrukket er ugiftige vandige opløsninger af salte eller ikke-ioniske forbindelser, såsom natriumchlorid eller glukose, fortrinsvis i en isotonisk koncentration, Andre lægemidler kan være tilstede forudsat 8

DK 161015B

at de ikke generer virkningen af fragment som billed- · dannende middel. Egnede mængder til kombination er.5-95% mærket fragment E^, og 95-5% andet lægemiddel eller lægemidler. Særligt egnede er de stoffer, som normalt injiceres 5 med blodpropafbildende midler, såsom heparin.

Fragment E^ kan injiceres i blodstrømmen på ethvert bekvemt punkt^ om end injektion ovenfor (set i strømmens retning) og nær ved stedet for den mistænkte blodprop foretrækkes.

10 Egnede mængder til injektion afhænger af den specifikke radioaktivitet af det radiomærkede fragment E^, og kan let bestemmes ved enten beregning eller simpelt forsøg. Radio-mærket fragment E^ skal administreres i en mængde tilstrækkelig til at kunne påvises ved gammakamerabilled.danneIse 15 eller andre ydre strålingspåvisningsmidler, som er i stand til at lokalisere den lokale stråling som findes i blodproppen, såsom autoradiografi. I almindelighed skal injiceres ca. 10 yCi til 50 mCi stråling for at opnå denne virkning hos mennesker. Den faktiske mængde vil afhænge af 20 egenskaberne af det anvendte radionuclid (f.eks. fysisk halveringstid og energi af udsendt gammastråling)* I almindelighed vil foretrukne mængder være fra 50 til 100% af den maksimal tilladelige administrerede dosis (begrænset af gældende sikkerhedsstandard) baseret på målorganet og 25 hele legemets udsættelse for stråling hos forsøgsindividet.

Analyse ved scintillationskanning eller andre ydre påvisningsmetoder kan begynde indenfor en 1 time efter injektion eller kan udsættes så meget som 3 dage. Bedre resultater opnås i almindelighed mellem 6 og 18 timer efter injektion.

30 Udtrykt ved vægtmængder radioaktiv fragment E^ som administreres, syntes der ikke at være nogen nedre grænse undtagen såvidt angår den grad, hvori fragment E^ kan mærkes med radioaktiv isotoo. Der svntes ikke at være noeren øvre errænse

DK 161015 B

9 undtagen de der er skabt af opløselighed, hvis fragment E1 isoleres af samme art, hvori det injiceres. Der sættes en øvre grænse for injektioner af fragment E1 fra en anden art, som følge af immunreaktioner, således som det er vel-5 kendt og kan bestemmes ved simpelt forsøg. Hvis den specifikke radioaktivitet af fragment E^ er kendt, og den ønskede radioaktivitet er kendt som tidligere beskrevet, kan mængden af fragment E^, som injiceres, let beregnes. Hvis f.eks. den specifikke aktivitet er 2 μθΐ/mg, vil en 5 mg prøve 10 indeholde 10 uCi radioaktivitet.

De høje forhold mellem blodprop og blod, som opnås med radiojoderet fragment E^ i friske og ældede blodpropper, indebærer at radiomærket fragment E^ kan have stor klinisk betydning. Foruden til påvisning af blodpropper i venerne 15 i benene, vil den vigtigste anvendelse af radiomærket fibrin fragment E^ mærket med en egnet billeddannende isotop (f.eks. ^"^In, ^raTc) være til påvisning af blod propper eller emboli ethvert sted i legemet, f.eks. i hjernen i tilfælde af slagtilfælde, i hjertet i tilfælde af 20 myocardial infarkt, og også til påvisning af pulmonære emboli, for hvilke der ikke findes nogen specifik prøve for øjeblikket.

Da fragment E2 også udviser binding med størknede blodklumper og blodpropper, kan desuden fragment E2 anvendes som oven-25 for beskrevet for fragment E^, som blodpropafbildende middel, Da både E^ og E2 udviser binding med tværbundet fibrin, er det sandsynligt at et peptid der har en aminosyresekvens, der ligger mellem de sekvenser som findes i fragmenterne E^ og E2 også vil udvise binding og være nyttig som afbild-30 ningsmidler for blodpropper. Disse peptider kan dannes ved begrænset proteolytisk spaltning af terminale aminosyrer fra de forskellige kæder af fragment E^, og kan mærkes med en radioisotop på samme måde som fragmenterne og E2,

DK 161015B

ίο

Opfindelsen er nærmere anskueliggjort i de følgende konkrete eksempler, der anføres kun til illustrationsformål og ikke skal begrænse opfindelsen med mindre andet er anført, 5 Eksempler,

Rensning af fragment

Human tværbundet fibrin blev nedbrudt med plasmin (6 en-heder/g fibrin) i 24 timer ved 37°C. Ca. 500 mg af nedbrydningsproduktet blev gelfiltreret på en sepharose CLIO 6B søjle (2,5 x 190 cm) i en stødpude indeholdende 0,05 M tris-HCl, 0,028 M natriumcitrat, 01 M natriumchlorid, 25 enheder/ml trasylol (aprotinin), og 0,02% natriumazid, pH 7,8. Fraktioner indeholdende (DD)E-komplekset blev fortyndet med et lige så stort rumfang 6 M urinstof/0,05 M 15 natriumcitrat, pH 5,5, og inkuberet ved 37°C i 1 time, og derefter genkromatograferet på en sepharose CL-6B søjle (2,5 x 190 cm) i ovennævnte stødpude. Denne fremgangsmåde dissocierede (DD)E-komplekset og muliggjorde rensning af fragment E typerne. Fragmenterne E^ og E2 blev opsamlet 20 sammen og adskilt ved kromatografi gennem en 0,6 x 6 cm DEAE-cellulosesøjle. Elueringsopløsningsmidlet var en lineær gradient af 0 til 0,5 M NaCl i 0,01 M natriumcar= bonatstødpude, pH 8,9. Fraktioner indeholdende peptidet blev identificeret ved absorbans ved 280 nm. Alternativt 25 blev fragmenterne E fraskilt ved en præparativ isoelektrisk fokusering i en pH-gradient fra 4 til 6 med en sucrose-gradientstabilisator. Samlede fraktioner blev opsamlet, og amfolytter blev fjernet ved at dialysere fragmenterne E overfor 2 500-dobbelte rumfang af 1,0 M natriumchlorid, 30 2 500-dobbelte rumfang af 0,15 M natriumchlorid, og 4 500- dobbelte rumfang af destilleret vand, og fragmenterne blev så frysetørret.

11

DK 161015B

Fremstilling af radiomærkede fragmenter E^ -E2.

Rensede fragmenter eller E2 blev mærket med radioaktivt jod ved den jodmonochloridmetode, der er beskrevet af McFarlane i Biochem. J., 62, 135-143 (1956), som inkorpo-5 reres heri gennem denne henvisning. Det mærkede præparat indeholdt 0,9 jodatomer/fragment E^ molekyle og havde en specifik radioaktivitet på 0,5 yCi/mg. Fragmenter E2 og E^ blev mærket på samme måde. Når der blev ønsket højere specifik aktivitet, som til dyreforsøg, blev der anvendt jodogen- 10 metoden (1", 3‘, 4,6-tetrachlor-3a,6a-diphenylglycoluril) til 131 123 at binde I eller I til fragmenter E^ og E2· Anvendelse af jodogen til at jodere proteiner er beskrevet af Fraker og Speck i Biochem. Biophys. Res. Commun. 8D: 849-857 (1978), som inkorporeres heri gennem denne henvisning.

15 Det mærkede præparat i dette tilfælde var sporstofmærket uden bærer og havde en specifik radioaktivitet op til 2 mCi/mg.

Karakterisering af fragment E^ - E^.

Aminosyrerækkefølgen i fragmenterne E^, E2 og E^ er blevet bestemt. Hvert fragment E indeholder 6 polypeptidkæder, 20 2 rester fra hver af Αα, Ββ og γ kæderne i fibrinogen.

Parametrene af fragment E~molekylerne er skitserede i tabel 1 baseret på den kendte aminosyrerækkefølge i fibrinogen.

Bindingsforsøg.

Evnen hos fragmenterne E^ og E2 til at gå i forbindelse 25 med eller binde til fibrinogen og fragmenter af fibrinogen eller fibrin blev undersøgt i et opløseligt system. Fragment E og de arter, som skulle undersøges, blev blandet i et 1:1 mol forhold, derefter analyseret på tris-glycin polyacrylamid (9%) geler. Fragmenterne E^ og E2 binder kun 30 til fragment DD, men ikke til fibrinogen, fragmenterne X,

DK 161015 B

12 Y, D eller E (tabel 2). Dette viser at fragment E kun binder til ensrettede· D-: områder af fragment DD, men ikke til det monovalente fragment D-område af fibrinogen eller fibrino-genderivater.

5 For at undersøge denne binding på en overfladegrænseflade· blev der fremstillet sepharose-uopløseliggjort fibrinogen, fibrinmonomer og en kort oligomer af tværbundet fibrin. Fragmenterne og Eg bandt ikke til sepharose-fibrinogen eller sepharose-fibrinmonomer, men bandtes til den tvær- 10 bundne fibrinoligomer (tabel 3). Dette viser igen at fragmenterne Eg og Eg ^ke kinder til fibrinogen eller fibrinmonomer, men kun til ensrettede fibrinmonomere i en fibrin-streng.

Tabel 1.

15 Sammensætning af polypeptidkæderne i 3 typer fragment E fra human tværbundet fibrin på basis af aminosyrerække-følgen i human fibrinogen.

Εχ α 17-78 Eg α 20-78 α 17-78 α 24-78 β 15-122 β 54-120 β 15-122 β 54-120 γ 1-62 γ 1-52 γ 1-62 γ 1-52 Ε2 α 17-78 α 17-78 β 15-121 β 54-121 Ύ 1-62 γ 1-62

DK 161015 B

13

Tabel 2.

Demonstration af binding ved dannelse af stabile komplekser._

Forsøgs^· Kilde Be- E^ E^ DD (DD) E

materiale handling DD Tværbundet fibrin ingen + + - (DD)E " " _____ Εχ » «' _ - _ + _ E2 " " ---- - e3 " " ---- -

Fibrinogen H _____ " T - - - + - X (trin 1) Fibrinogen H _____ II II _ _ _ 4- _ X (trin 2) H _____

Il II gi Y (trin 2) " H _____ ii i· t _ - - + - D (trin 2) H _____ n u T _____ D (trin 3) H _____ ir ii ip — — — — — D (trin 2) ikke-tværbundet fibrin ingen _____ D (trin 3) " _____ E (trin 2) " _____ E (trin 3) " " _____ E (trin 2) Fibrinogen H _____ •i i· t _____ E (trin 3) " T _____ II II ip — — — _ — NDSK " H _____ 11 11 T — — — -f. —

DK 161015 B

14

Bindingsundersøgelserne blev udført enten i nærværelse af hirudin (Ή) ved 10 ATU/mg protein eller thrombin (T) ved 20 NIH enheder/mg eller i fravær af nogen af disse midler. NDSK = NH2 “ terminal disulfidknude.

5 + = binding = fravær af binding.

Tabel 3,

Binding af fibrinogen og fibrinderivater til uopløselig-gjort firbrinogen, fibrinmonomer og tværbundet fibrin.

Derivat Mængde protein bundet til uopløseliggjort

Fibrinogen Fibrinmononer Tværbundet fibrin mg nmol mg nmol mg nmol

Fragment E^ 0 0 0 0 1,2 20,0

Fragment E2 0 0 0 0 0,9 16,1

Fragment Eg 0 0 0 0 0 0 NDSK 0 0 0,05 1,0 0,04 0,81

NDSK

(thrcmbin behandlet) 0,4 6,66 0,825 13,8 0,716 11,9 10 Inkorporering af fragment Eg i fibrinblodklumper.

Fragment Eg blev afprøvet for evne til at inkorporeres i en dannende fibrinblodklump i et in vitro system. Fragmenter Eg og Ε^, radiomærket med 125-jod, blev sat til normal human plasma. Blodstørkning blev igangsat ved tilsætning 15 af thrombin,, og derefter blev den størknede blodklump op-viklet på en glasstang. Radioaktiviteten i blodklumpen og i serumen blev målt. Hver koncentration af fragment E blev 15

DK 161015B

undersøgt in triplo. Middelværdien er vist i tabel 4. En betydelig del af fragment E-^ blev inkorporeret i fibrin-blodklumpen, medens fragment E3 forblev i serumen. Derfor kan fragment E^ binde til en fibrinklump under dannelse.

5 Binding af fragment E^ til foruddannede størknede plasmaklumper._

Størknede plasmaklumper blev dannet af 0,5 ml normal human plasma, ophængt på en trådspiral og ældet i serum i 2 timer. De med 125-jod mærkede fragmenter E^ eller E3 blev sat til 10 serumen og inkubationen fortsatte i 1 time. Klumperne blev vasket 5 gange i 0,5 ml 0,15 M natriumchlorid. Radioaktiviteten i serumen, vaskevæskerne og i klumperne blev målt. Fragmentet blev bundet til klumpen, men fragmentet E3 blev ikke bundet (tabel 5). Mængden af fragment E^ bundet 15 til en foruddannet eller ældet størknet klump var lavere end den mængde, der blev inkorporeret i en klump under dannelse og proportional med overfladearealet af klumpen.

Tabel 4.

Inkorporering af fragmenter og i fibrinklumper 20 under dannelse._ 125-fragment E Koncentration E Koncentration % Inkorporeret (M) fibrinogen3 (M) E. 7,2 x 10_q 4,4 x 10"!j 72,1% 1 3,6 X 10 q 4,4 X 10 b 44,3% 1.8 x 10 q 4,4 x 10_b 35,4% 0,9 x 10 q 4,4 x 10"° 30,4% 0,45 x 10 q 4,4 x Hf? 32,8% 0,275 x 10 y 4,4 x 10_b 30,4% E- 7,2 x 10“q 4,4 x 10-® 1,6% 3,6 x 10 q 4,4 x 10“b 1,4% 1.8 x 10 q 4,4 x 10~b 1,2% 0,9 x 10 q 4,4 x 10'b 1,5% 0,45 x 10 Q 4,4 x 10~b 1,1% 0,275 x 10”y 4,4 x 10“b 1,2% 16

DK 161015B

a der er vist den oprindelige koncentration for fibrinogen og fragment E.

procentmængden af total radioaktivitet som forbliver i den sammentrykte, vaskede klump, gennemsnit af 3 prøver.

Tabel 5, O ——

Binding af fragmenter E^ og E^ til en foruddannet størknet klump,__ u 125-1 fragment E Koncentration Koncentration % Inkorporeret É3 (M) fibrinogen3 (M) Εχ 7,2 x 10"9 4,4 x 10"6 14,1% 3.6 X 10"9 '4,4 x l(f6 9,8% 1.8 x 10"9 4,4 X 10"6 8,4% 0,9 x 10”9 4,4 x 10"6 8,3% 0,45 x 10-9 4,4 x 10-6 7,6% 0,275 x 10~9 4,4 x 1θ“β 7,0% E3 7,2 x 10"9 4,4 x 10"6 0,13% 3.6 X 10"9 4,4 x 10"6 0,11% 1.8 X 10“9 4,4 x 10"6 0,19% 0,9 x 10"9 4,4 x 10"6 0,21% 0,45 X 10"9 4,4 x 10"6 0,21% . 0,275 X 10-9 4,4 x 1θ"6 0,13% a der er vist de oprindelige koncentrationer for fibrinogen og fragment E.

procentmængden af total radioaktivitet som bliver tilbage i den sammentrykte, vaskede klump, gennemsnit 10 af 3 prøver.

DK 161015 B

17

Inkorporering af radiojoderet fragment i blodpropper in vivo._ '

For at afprøve mulighederne af systemisk injiceret radio-mærket fragment E1 til lokalisering af blodprop i mennesker 5 med thrombose blev der anvendt en in vivo model af thrombose hos dyr. Fordi en blodprop er strukturelt heterogen (i modsætning til størknede blodklumper), og fordi blodcirkulationen og naturlige kataboliske mekanismer kan påvirke optagelsen af røbestoffer in vivo, var disse forsøg 10 vigtige til at forudsige velegnetheden af radiomærket frag-, ment E^, som et radiofarmaceutikum til klinisk lokalisering af blodprop.

Svin blev udvalgt som forsøgsdyrmodel, da de vides at ligne mennesker helt med hensyn til cardiovaskulære sygdomme, 15 som beskrevet i Pond et al, "The Pig as a Model i Biomedical Research" i The Biology of the Pig, Comstock Pub. Assoc, side 31-35, 1978. Blodpropper blev induceret i halsvenerne på unge svin,der vejede 11,2 til 23 kg, méd en lokalt påført elektrisk strøm. Metoden vides at producere blodprop-20 per som er morfologisk lig med naturligt forekommende blodpropper. Efter induktion fik blodpropperne lov at ælde i op til 5 dage, før injektion af radiojoderet fragment E^ i svinet. Dette muliggjorde undersøgelse af optagelsen af røbestof i blodpropper af forskellige aldre, liggende fra 25 friske blodpropper, hvori fibrinaflejring er aktiv, til ældede blodpropper, hvori fibrinaflejring sandsynligvis er 125 meget langsom. I de fleste tilfælde blev I-mærket fi-brinogen injiceret samtidigt med XI- eller I-mærket fragment E^, for direkte at sammenligne blodpropoptagelsen 2q af de to røbestoffer. Radiojoderet fibrinogen er et røbestof, der for tiden anvendes til klinisk påvisning af dyb venethrombose under dannelse, og dets adfærd ved optagelse i blodpropper er blevet undersøgt godt. 24 timer efter injek- 18

DK 161015B

tion af radiosporstofferne blev blodpropperne fjernet kirurgisk, og der blev taget blodprøver. Prøverne blev vejet og talt.

Resultaterne af disse forsøg er vist i tabel 6, for alle 5 aldre af de undersøgte blodpropper. Et højt forhold mellem mål og baggrund er ønskeligt for at muliggøre ydre billededannelse af en blodprop med et gammascintillationskamera. Fordi hovedkilden til baggrundsstråling ved billeddannelse af blodpropper sandsynligvis vil skyldes radioaktivitet 10 fra blodmassen, er graden af lokalisering i forsøgsblodpropperne udtrykt som et forhold mellem blodprop og blod, der er defineret som:

Blodpropradioaktivitet pr. gram Blodradioaktivitet pr. gram

Et blodprop:Blod forhold på 4 antages at være tilstrækkeligt 15 til billeddannelse af en blodprop i venerne i benene, og et forhold på 6 til 8 kan være nødvendigt for billeddannelse af blodpropper i brystet. Resultaterne i tabel 6 viser at radiojoderet fibrinogen kun bliver betydeligt lokaliseret i meget friske blodpropper (mindre end 20 timer gamle), 20 Radiojoderet fragment E^^ lokaliseres imidlertid i et betydeligt omfang i blodpropper af alle de afprøvede aldre (0-5 dage). Fordi fragment E^ menes at binde til overfladen af en blodprop, kan den her sete variation i optagelsen skyldes forskelle i tilgængelicrt blodpropoverfladeareal 25 fra dyr til dyr.

Tabel 6.

Blodpropoptagelse i svin af radiojoderet human fragment E^.

Claims

1. Blanding til anvendelse ved ekstern påvisning og lokali- 30 sering af en blodprop, kendetegnet ved, at den omfatter radiomærket peptid valgt af gruppen bestående af fragment Ej isoleret af tværbundet fibrin, fragment E2 isoleret af tværbundet fibrin, og peptider, som har en aminosyresekvens, 35 DK 161015 B der ligger mellem sekvenserne i fragmenterne Ej og E2, og en farmaceutisk anvendelig bærer, der er egnet til intravenøs injektion. 5

........2. Blanding ifølge krav 1, kendetegnet ved, at peptidet er mærket med en radioaktiv isotop af jod, technetium eller indium.

3. Blanding ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 10 peptidet er mærket med Ulln, 99mTC, 125I, 131I eller 123I.

4. Blanding ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bæreren er en ugiftig isotonisk vandig opløsning af et salt eller en ikke-ionisk forbindelse. 15

5. Blanding ifølge krav 4, kendetegnet ved, at bæreren er en ugiftig isotonisk vandig opløsning af NaCl eller glucose.

6. Blanding ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter et andet lægemiddel,

7. Blanding ifølge krav 6, kendetegnet ved, at lægemidlet er et antikoaguleringsmiddel. 25

8. Blanding ifølge krav 7, kendetegnet ved, at an-tikoaguleringsmidlet er heparin.

9. Blanding ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 30 fragment har en aminosyresekvens identisk med den af human fibrinogen aminosyrer α 17-78, α 17-78, β 15-122, β 15-122, γ 1-62, γ 1-62 og fragment Ε2 har en ami nosyresekvens identisk med den af human fibrinogen aminosyrer a-17-78, a 17-78, β 15-121, β 54-121, γ 1-62 og γ 1-62. 35