JPH08507295A - 診断造影用のテクネチウム‐９９ｍ標識ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、試薬、放射性同位体標識試薬、ならびにかかる試薬および放射性同位体標識試薬の製法に関する。詳細には、本発明は、イン・ビボにおける感染、炎症、血栓症、アテローム性動脈硬化症および新生物増殖の部位に特異的に結合するテクネチウム-９９ｍ（Ｔｃ-９９ｍ）標識ペプチド、かかるペプチドを製造するためのキット、ならびにかかるペプチドを使用して哺乳動物体内部位を造影する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 診断造影用のテクネチウム-９９ｍ標識ペプチド 本出願は、１９９１年２月８日に出願した米国特許出願番号第０７/６５３， ０１２号の一部継続出願である。 発明の背景 １．発明の分野 本発明は、放射線診断用の試薬およびペプチド、これらの放射線診断試薬を用 いる方法、ならびにかかる標識放射線診断剤を製造する方法に関する。詳細には 、本発明は、テクネチウム-９９ｍ（Ｔｃ-９９ｍ）標識試薬、かかる試薬を製造 する方法およびキット、ならびにかかる試薬を用いて哺乳動物体内部位を造影す るための方法に関する。 ２．先行技術の説明 病巣感染または局所感染の部位の位置および/または程度を検出できるという ことに対する臨床的要望がある。実質数のケースにおいて、（身体検診、ｘ-線 、ＣＴおよび超音波検査のごとき）診断の慣用的な方法は、かかる部位（例えば 、膿瘍）を同定するのに失敗した。生検に頼ることができるが、少なくとも、判 明した部位の膿瘍の原因となる病原菌を同定するのにそれらが診断的に適当とな るまでは、かかる侵入的方法は避けることが好ましい。問題の迅速な位置決めお よび同定は臨床的に有効な治療介在であるために、かかる「目に見えない」感染 の部位を同定することは重要である。 核医学の分野において、病原部位に特異的に蓄積する放射能-標識トレーサー 化合物（すなわち、ラジオトレーサーまたは放射線医薬）を投与した体内分布を 造影することによって、ある種の病理学的状態を局在することができ、あるいは かかる状態の程度を検出することができる。⁶⁷Ｇａ、^99mＴｃ（Ｔｃ-９９ｍ）、¹¹¹ Ｉｎ、¹²³Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹⁶⁹Ｙｂおよび¹⁸⁶Ｒｅを含む種々の放射性核種が放射 線造影に有用であることが知られている。 しかしながら、膿瘍は数多くの可能性のある病原菌のいずれか１により引き起 こされ得、そのため特定の病原菌に特異的なラジオトレーサーは範囲が限定され るであろう。一方、感染はほとんど変わることなく、組織損傷に対する身体の一 般的な反応である炎症を伴う。従って、炎症部位に特異的なラジオトレーサーは 、いずれの病原菌によって引き起こされる感染部位を位置決めするのにも有用で あり、他の炎症部位を局在するのにも有用であることが期待されるであろう。 炎症に関連する主な現象の１つは、通常は単球および好中球である白血球（白 血球細胞）の該炎症部位における局在である。白血球に特異的なラジオトレーサ ーは、局所感染の部位における白血球を検出するのに有用であろう。感染部位を 造影する最近認可された核医学方法は、インジウム-１１１標識白血球（¹¹¹Ｉｎ -ＷＢＣ）（例えば、ピータース（Peters）、１９９２年、ジャーナル・オブ・ ヌクレイック・メディシン（J.Nucl.Med.）、第３３巻：６５-６７頁参照）また はガリウム-６７（⁶⁷-Ｇａ）クエン酸塩（例えば、エブライト（Ebright）ら、 １９８２年、アーカイブス・オブ・インターナル・メディシン（Arch.Int.Med. ）、第１４２巻：２４６-２５４頁参照）を用いる。¹¹¹Ｉｎ-標識ＷＢＣを用い る主な短所は、そのラジオトレーサーの調製には多くの技術工程：自己血液の無 菌取り出し、血液からの白血球の無菌単離、（傷付いたＷＢＣは再注射時に網内 系によって取り込まれるため）白血球細胞を傷付けない条件を用いた該白血球の 無菌的標識、および（ここに標識した）白血球の患者への無菌的返還（再注射） を要することである。さらに、最適の造影を得るには、注射と造影の間に１２な いし４８時間の遅延が必要となり得る。Ｔｃ-９９ｍ標識白血球がこの遅延期間 を短縮するために用いられて来たが（例えば、ボルネ（Vorne）ら、１９８９年 、ジャーナル・オブ・ヌクレイック・メディシン（J.Nucl.Med.）、第３０巻： １３３２-１３３６頁）、身体外の標識が依然として必要である。好ましいラジ オトレーサーは、自己血液成分の取り出しおよび操作を要しないものであろう。 別法として、⁶⁷Ｇａ-クエン酸塩を注射によって投与することもできる。しか しながら、この化合物は感染または炎症の部位に特異的でない。さらに、ラジオ トレーサーの注射と造影との間に７２時間までもの遅延がしばしば必要とされる 。 加えて、⁶⁷Ｇａのγ-（ガンマ）線放射エネルギーは、慣用的なガンマカメラに 十分には適さない。 （単球、好中球、顆粒細胞および他の細胞型を含む）ヒト白血球に対して生起 した放射性同位体を用いて標識したモノクローナルおよびポリクローナル抗体が 開発されている。Ｔｃ-９９ｍ標識抗顆粒球モノクローナル抗体（例えば、リン ド（Lind）ら、１９９０年、ジャーナル・オブ・ヌクレイック・メディシン（J. Nucl.Med.）、第３１巻：４１７-４７３頁）および¹¹¹Ｉｎ-標識非特異的ヒト免 疫グロブリン（例えば、ラムラグリア（LaMuraglia）ら、１９８９年、ジャーナ ル・オブ・バスキュラー・サージェリィ（J.Vasc.Surg.）、第１０巻：２０-２ ８頁）が、感染に対し二次的な炎症検出のために試験されている。¹¹¹Ｉｎ-標識 ＩｇＧは、注射および最適造影の間には２４-４８時間を要するという点で¹¹¹Ｉ ｎ-標識ＷＢＣの短所を共有している。加えて、全ての放射線同位体標識抗体は 、それらが調節作用によって生物学的製剤として通常分類されるために、作製す るのが困難であり、長引く認可手続きに直面する。 日常的に用いる放射線標識医薬としては、小さな容易に合成される分子が好ま しい。患者に直接注射でき、かつ白血球が蓄積する部位を位置決めすることによ り感染および炎症の部位を造影するであろう小さな合成分子に対して、明らかな 要望がある。かかる適用に有用な１種の小さく容易に合成される分子はペプチド である。 放射性ペプチドの特異的結合は目的の領域、例えば、炎症部位にわたって放射 性シグナルを濃縮するために、放射能標識ペプチドを用いる造影法の感度は、当 該分野で知られている他の技術よりも遥かに高い。加えて、小さなペプチドの高 収率化学合成を達成するための方法は当該分野でよく知られている。 白血球に結合することが知られている１つのクラスのペプチドは、ペプチド濃 度勾配を高濃度側に向けて白血球を移動させる走化性ペプチドである（ウィルキ ンソン（Wi1kinson）、１９８８年、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Meth. Enzymol.）、第１６２巻：１２７-１３２頁参照）。これらの化合物は、高アフ ィニティーで白血球表面上の受容体に結合する。これらのペプチドは、補体因子 （complement factor）、細菌、ツフツシン、エラスチン、フィブリノペプチド Ｂ、フィブリノーゲンＢ、血小板第４因子等多数の起源に由来する。これらの走 化性化合物に由来し、かつ放射性同位体標識した小さな合成ペプチドは、イン・ ビボにおける炎症部位を造影するためのラジオトレーサーとして非常に有用であ ろう。 放射性同位体標識ペプチドは先行技術に報告されている。 ゾグビ（Zoghbi）ら、１９８１年、ジャーナル・オブ・ヌクレイック・メディ シン（J.Nucl.Med.）、第２２巻：３２頁（抄録）は、細菌由来で、¹¹¹Ｉｎ-標 識トランスフェリンに結合したホルミルペプチド走化性因子（ｆＭＬＦ）を開示 している。 ジャン（Jiang）ら、１９８２年、ヌクレアールメディツィン（Nuklearmedizi n）、第２１巻：１１０-１１３頁は、¹²⁵Ｉで放射性同位体標識した走化性ホル ミル化ペプチド（ｆＭＬＦ）を開示している。 フィッシュマン（Fishman）ら、１９９１年、ジャーナル・オブ・ヌクレイッ ク・メディシン（J.Nucl.Med.）、第３２巻：４８２-４９１頁は走化性ホルミル ペプチド（ｆＭＬＦ）-¹¹¹Ｉｎ-標識ＤＴＰＡ複合体に関する。 ＥＰＣ９０１０８７３４.６は、走化性ホルミルペプチド（ｆＭＬＦ）-¹¹¹Ｉ ｎ-標識ＤＴＰＡ複合体に関する。 米国特許第４，９８６，９７９号は、放射性同位体標識白血球に対する、放射 性同位体標識した走化性ホルミルペプチド（ｆＭＬＦ）の光アフィニティー標識 を介した体外での使用に関する。 ＰＣＴＷＯ９０/１０４６３号は、放射性同位体標識白血球に対する、放射性 同位体標識した走化性ホルミルペプチド（ｆＭＬＦ）の光アフィニティー標識を 介した体外での使用に関する。 前記分野で知られている標識ホルミル-メチオニル-ロイシル-フェニルアラニ ル（ｆＭＬＦ）ペプチドの使用は、このペプチドが好中球からスーパーオキシド を放出させ（ニーデル（Niedel）およびクアトレカサス（Cuatrecasas）、１９ ８０年、カル・トップ・セル・レグ（Curr.Top.Cell.Reg.）、第１７巻：１３７ -１７０頁における「白血球およびマクロファージのホルミルペプチド走化性受 容体（Formyl Peptide Chemotactic Receptors of Leukocytes and Macrophages）」）、およ び十分な投与量が白血球減少症を引き起こし得る（ジャン（Jiang）ら、１９８ ２年、ヌクレアールメディツィン（Nuklearmed.）、第２１巻：１１０−１１３ 頁）という重大な欠点に苦しめられている。 血小板第４因子は、７０個のアミノ酸よりなり、イン・ビボにおける炎症およ び感染の部位に関与することが知られている好中球および単球の細胞型に結合す ることが従来技術で知られている天然の走化性ペプチドである。 ソルベッケ（Thorbecke）およびツッカー（Zucker）、１９８９年、欧州特許 出願第８８１１１９６２.２号は、免疫調節量の血小板第４因子またはそれ由来 のペプチドを投与することからなる免疫反応を調節するための組成物および方法 を開示している。 デュエル（Deuel）ら、１９７７年、プロシーディングズ・オブ・ナショナル ・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci .ＵＳＡ）、第７４巻：２２５６-２２５８頁は、ヒト血小板第４因子のアミノ酸 配列を開示している。 デュエル（Deuel）ら、１９８１年、プロシーディングズ・オブ・ナショナル ・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci .ＵＳＡ）、第７８巻：４５８４-４５８７頁は、血小板第４因子が、イン・ビト ロにおいて好中球および単球に対して走化性を示すことを開示している。 オスターマン（Osterman）ら、１９８２年、バイオケミカル・アンド・バイオ フィジカル・リサーチ・コミューニケーションズ（Biochem.Biophys.Res.Comm. ）、第１０７巻：１３０-１３５頁は、血小板第４因子のカルボキシル末端トリ デカペプチドが走化性特性を有することを開示している。 ホルト（Holt）およびニービアロフスキー（Niewiarowski）、１９８５年、セ ミナーズ・イン・ヘマトロジー（Sem.Hematol.）、第２２巻：１５１-１６３頁 は、血小板第４因子を含む血小板α-顆粒蛋白質の生化学のレビューを記載して いる。 ゴールドマン（Goldman）ら、１９８５年、イミュノロジー（Immunol.）、 第５４巻：１６３-１７１頁は、血小板第４因子およびそのカルボキシ末端デカ ペプチドによってｆＭＬＦ媒介の取り込みが、ヒト好中球において阻害されるこ とを明らかにしている。 ベバウィー（Bebawy）ら、１９８６年、ジャーナル・オブ・ロイコサイト・バ イオロジー（J.Leukocyte Biol.）、第３９巻：４２３-４３４頁は、イン・ビト ロにおける好中球の血小板第４因子-媒介の走化性反応を記載している。 ロスカルゾ（Loscalzo）ら、１９８５年、アーカイブス・オブ・バイオケミス トリー・アンド・バイオフィジィックス（Arch.Biochem.Biophys.）、第２４０ 巻：４４６-４５５頁は、血小板第４因子とヘパリンのごときグリコサミノグリ カンとの間の生化学的相互作用を記載している。 マイオン（Maione）ら、１９８９年、サイエンス（Science）、第２４７巻： ７７-７９頁は、組換えヒト血小板第４因子およびそのペプチド断片によって血 管新生が阻害されることを開示している。 ポリペプチドを放射性同位体標識するキレート剤の使用、およびペプチドおよ びポリペプチドをＴｃ-９９ｍで標識する方法は、先行技術で知られており、（ 出典明示して本明細書の一部とみなす）同時係属米国特許出願 第０７/６５３，０１２号、第０７/８０７，０６２号、第０７/８５１，０７４ 号、第０７/８７１，２８２号、第０７/８８６，７５２号、第０７/８９３，９ ８１号、第０７/９０２，９３５号、第０７/９５５，４６６号および第０８/０ ４４，８２５号に開示されている。 発明の概要 本発明は、放射能-標識ペプチドであるシンチグラフィー造影剤を提供する。 本発明の試薬は、イン・ビボにおいて部位、特に感染部位および炎症部位、なら びに血栓症、アテローム性動脈硬化症および腫瘍の部位に特異的に結合するペプ チドよりなり、これは、放射性同位体錯体化基に共有結合しており、ここに該錯 体化基は放射性同位体に結合する。 本発明は、イン・ビボにおいてかかる複数の部位に結合する試薬、かかる試薬 のテクネチウム-９９ｍとの放射性同位体標識錯体、かかる錯体の製法、哺乳動 物体内の感染、炎症、血栓症、アテローム性動脈硬化症および新生物増殖の部位 を造影するためのかかる放射性同位体標識錯体の使用方法、ならびに本発明の試 薬の製法を提供する。 本発明の第一の態様において、哺乳動物体内の部位を造影できる放射性同位体 標識ペプチドが提供され、かかるペプチドは、哺乳動物体内の感染、炎症、血栓 症、アテローム性動脈硬化症および新生物増殖の部位に結合する血小板第４因子 またはそのペプチド断片よりなり、式： Ｉ． Ｃｐ（ａａ）Ｃｐ ［式中、Ｃｐは保護されたシステイン残基であり、（ａａ）はアミノ酸を表わす ］の放射性同位体標識結合基に共有結合した特異的結合ペプチドよりなり、ここ に該放射性同位体結合基は該特異的結合ペプチドに共有結合している。好ましい 具体例において、該アミノ酸はグリシンである。もう１の好ましい具体例におい て、該放射性同位体標識-結合基は、１またはそれを超えるアミノ酸を介して該 特異的ペプチドに結合されている。 第二の態様において、本発明は、以下の構造： II． Ａ-ＣＺ（Ｂ）-［Ｃ（Ｒ¹Ｒ²）］_n-Ｘ ［式中、ＡはＨ、ＨＯＯＣ、Ｈ₂ＮＯＣ、（ペプチド）-ＮＨＯＣ、（ペプチド） -ＯＯＣまたはＲ⁴であり；ＺはＨまたはＲ⁴であり；ＢはＨ、ＳＨまたは-ＮＨＲ³ 、-Ｎ（Ｒ³）-（ペプチド）またはＲ⁴であり；ＸはＳＨまたは-ＮＨＲ³、-Ｎ（ Ｒ³）-（ペプチド）またはＲ⁴であり；Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は、独立して、 Ｈまたは直鎖もしくは分岐鎖のまたは環状の低級アルキルてあり；ｎは０、１ま たは２であり；（１）Ｂが-ＮＨＲ³または-Ｎ（Ｒ³）-（ペプチド）である場合 、ＸはＳＨであってｎは１または２であり；（２）Ｘが-ＮＨＲ³または-Ｎ（Ｒ³ ）-（ペプチド）である場合、ＢはＳＨであってｎは１または２であり；（３） ＢがＨまたはＲ⁴である場合、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ₂ＮＯＣ、（ペプチド）-ＮＨＯ Ｃ、（ペプチド）-ＯＯＣであり、ＸはＳＨであってｎは０または１であり；（ ４）ＡがＨまたはＲ⁴で、Ｂが ＳＨで、Ｘが-ＮＨＲ³または-Ｎ（Ｒ³）-（ペプチド）であり、かつＸがＳＨで ある場合、Ｂは-ＮＨＲ³または-Ｎ（Ｒ³）-（ペプチド）であり；（５）ＸがＨ またはＲ⁴である場合、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ₂ＮＯＣ、（ペプチド）-ＮＨＯＣ、（ ペプチド）-ＯＯＣであってＢはＳＨであり；（６）Ｚがメチルである場合、Ｘ はメチルで、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ₂ＮＯＣ、（ペプチド）-ＮＨＯＣ、（ペプチド） -ＯＯＣであって、ＢはＳＨであり、かつｎは０であり，（７）ＺがＳＨであっ てＸがＳＨである場合、ｎは０ではなく：ここにチオール基は還元型である］ を有する放射性同位体標識-結合基に共有結合されている炎症-造影ペプチドを提 供する。 もう１つの具体例において、本発明は式： ［本発明の目的のためには、この構造を有する放射性同位体標識-結合基を、ピ コリン酸（Pic）をベースとした基という］； または、 ［本発明の目的のためには、この構造を有する放射性同位体標識-結合基を、ピ コリルアミン（Pica）をベースとした基という］； ［両式中、ＸはＨまたは保護用基であり；（amino acid）はいずれかのアミノ酸 を表す］で示される放射性同位体標識結合基に共有結合した、血小板第４因子ま たはそのペプチド断片からなる特異的結合ペプチドよりなる、哺乳動物体内の部 位を造影するための放射性同位体標識シンチグラフィー造影剤を提供し、ここに 、放射性同位体標識-結合基は該ペプチドに共有結合しており、該放射性同位体 標 識-結合基と放射性同位体標識との錯体は電気的に中性である。好ましい具体例 において、該アミノ酸はグリシンであって、Ｘはアセトアミドメチル保護基であ る。さらに好ましい具体例において、該ペプチドはアミノ酸、最も好ましくはグ リシンを介して該放射性同位体標識-結合基に共有結合しており、該放射性同位 体標識はテクネチウム-９９ｍである。 さらにもう１つの本発明の具体例において、特異的結合ペプチド、および当該 ペプチドに共有結合しているビスアミノビスチオール放射性同位体標識-結合基 よりなる、哺乳動物体内の部位を造影するための放射性同位体標識試薬が提供さ れる。本発明のこの具体例における該ビスアミノビスチオール放射性同位体標識 -結合基は： ［式中、各Ｒ⁵は、独立して、Ｈ、ＣＨ₃またはＣ₂Ｈ₅でもよく；各（pgp）^sは、 独立して、チオール保護基またはＨでもよく；ｍ、ｎおよびｐは、独立して、２ または３であり；Ａは直鎖または環状の低級アルキル、アリール、複素環、それ らの組合せまたはそれらの置換誘導体であって；Ｘはペプチドである］； ［式中、各Ｒ⁵は、独立して、Ｈ、１ないし６個の炭素原子を有する低級アルキ ル、 フェニル、または低級アルキルもしくは低級アルコキシで置換されたフェニルで あり；ｍ、ｎおよびｐは、独立して、１または２であり；Ａは直鎖または環状の 低級アルキル、アリール、複素環、それらの組合せまたはそれらの置換誘導体で あり；ＶはＨまたはＣＯ-ペプチドであり；Ｒ⁶はＨまたはペプチドであり；但し 、ＶがＨである場合、Ｒ⁶はペプチドであり、Ｒ⁶がＨである場合、Ｖはペプチド である］ よりなる群から選択される式を有する［本発明の目的では、これらの構造を有す る放射性同位体標識-結合基を「ＢＡＴ」基という］。好ましい具体例において 、該ペプチドはアミノ酸、最も好ましくはグリシンを介して該放射性同位体標識 -結合基に共有結合しており、該放射性同位体標識はテクネチウム-９９ｍである 。 また、本発明は、Ｔｃ-９９ｍと本発明のペプチドとの錯体、Ｔｃ-９９ｍで放 射性同位体標識した本発明のペプチドを調製するためのキット、Ｔｃ-９９ｍで 本発明のペプチドを放射性同位体標識する方法、ならびにガンマ-シンチグラフ ィーによって、哺乳動物体内の感染、炎症、血栓症、アテローム性動脈硬化症お よび新生物増殖の部位を造影するために本発明の放射性同位体標識ペプチドを使 用する方法からなる。 本発明は、本発明のペプチド試薬とＴｃ-９９ｍとの錯体であるシンチグラフ ィー造影剤、ならびに本発明の該ペプチド試薬をＴｃ-９９ｍで放射性同位体標 識する方法を提供する。本発明により提供される放射性同位体標識錯体は、還元 剤の存在下にて、本発明のペプチド試薬をＴｃ-９９ｍと反応させることにより 形成される。好ましい還元剤には、限定するものではないが、亜二チオン酸イオ ン、第一スズイオンおよび第一鉄イオンが含まれる。また、本発明の錯体は、本 明細書に提供するごとき予め還元したＴｃ-９９ｍ錯体のリガンド交換によって 本発明のペプチド試薬をＴｃ-９９ｍで標識することによって形成される。 また、本発明は、Ｔｃ-９９ｍで放射性同位体標識した本発明のペプチド試薬 であるシンチグラフィー造影剤を調製するためのキットを提供する。Ｔｃ-９９ ｍで本発明のペプチド試薬を標識するためのキットは、所定量の本発明のペプチ ド試薬と、該試薬をＴｃ−９９ｍで標識するのに十分な量の還元剤とを含む密閉 バ イアルからなる。 本発明は、イン・ビトロにおける化学合成によって本発明のペプチド試薬を調 製する方法を提供する。好ましい具体例において、特異的結合ペプチドは固相ペ プチド合成によって合成される。 本発明は、イン・ビボにおけるガンマシンチグラフィー造影を得ることによっ て哺乳動物体内の炎症部位および感染部位を造影するための、Ｔｃ-９９ｍ標識 ペプチド試薬であるシンチグラフィー造影剤を使用する方法を提供する。これら の方法は、診断有効量の本発明のＴｃ-９９ｍ標識ペプチド試薬を投与し、哺乳 動物体内の炎症部位に局在したＴｃ-９９ｍ標識によって放射されるガンマ放射 を検出することからなる。 感染部位および炎症部位に局在することに加えて、白血球は血栓部位にも局在 することが知られている（例えば、クワーン（Kwaan）ら、１９８９年、「臨床 血栓症（Clinical Thrombosis）」における「血栓症の病原論（Pathogenesis of Thrombosis）」、クワーン（Kwaan）およびサママ（Samama）編、シイアールシ イ・プレス（ＣＲＣ Press）；ボカ・ラートン，ラ（Boca Raton，La）、３５ 頁参照）。従って、感染部位および炎症部位を造影するのに有用なラジオトレー サーを提供することに加えて、本発明のＰＦ４由来ラジオトレーサーは深部静脈 血栓症部位および肺塞栓症部位を造影するのに有用なラジオトレーサーも提供す る。 さらに、ＰＦ４はヘパリンおよび他のグリコサミノグリカンにも結合すること が知られている（ラスカルゾ（Lascalzo）ら、１９８５年、同書参照）。アテロ ーム性動脈硬化症において、過度の細胞増殖、特に平滑筋細胞増殖は、過剰な細 胞外マトリックス由来物質（その主な成分はグリコサミノグリカン）に導く。従 って、また、本発明の放射性同位体標識ＰＦ４-由来ペプチドは、アテローム性 動脈硬化症部位の造影に有用なラジオトレーサーも提供する。 また、ＰＦ４およびＰＦ４断片は腫瘍関連の血管新生を阻害できることも示さ れている（シャープ（Sharpe）ら、１９９０年、ジャーナル・オブ・ナショナル ・キャンサー・インベスティゲーション（J.Natl.Cancer Inst.）、第８２巻： ８４８-８５３頁およびマイオン（Maione）ら、１９９０年、同書参照）。かく し て、本発明の放射性同位体標識ＰＦ４-由来ペプチドは腫瘍部位を造影するのに も有用である。 本発明の特異的結合ペプチドは、多価結合部位にも共有結合できる。本発明の 多価結合部位は、特異的結合ペプチドまたはＴｃ-９９ｍ結合基に共有結合でき る少なくとも２個のリンカー官能基よりなる。好ましいリンカー官能基は、第一 級または第二級アミン、ヒドロキシル基、カルボン酸基、または、２-ハロアセ チル基およびマレイミド基のごときチオール反応性基である。好ましい具体例に おいて、多価結合部位は、ビス-スクシンイミジルメチルエーテル（ＢＳＭＥ） 、４-（２，２-ジメチルアセチル）安息香酸（ＤＭＡＢ）、トリス（スクシンイ ミジルエチル）アミン（ＴＳＥＡ）、トリス-アセトアミドエチルアミンおよび １，１０-ビスアセトアミド-４，７-ジオキサデカンよりなる。 本発明の特に好ましい具体例は、ある種の好ましい具体例および請求の範囲の 以下のさらに詳細な説明から明らかになるであろう。 発明の詳細な説明 本発明は、哺乳動物体内の感染、炎症、血栓症、アテローム性動脈硬化症およ び新生物増殖の部位に特異的に結合する、該哺乳動物体内の標的部位を造影する ためのＴｃ-９９ｍ標識ペプチドを提供し、該特異的結合ペプチドは放射性同位 体結合基に共有結合されており、ここに該放射性同位体標識結合部位は放射性同 位体に結合する。 本発明のペプチドは、哺乳動物体内の感染、炎症、血栓症、アテローム性動脈 硬化症および新生物増殖の部位に特異的に結合する。これらの試薬は白血球、好 ましくは単球および好中球、最も好ましくは好中球にも結合し得る。本発明の目 的のために、「白血球に結合する」なる語は、本発明の特異的結合ペプチドおよ びペプチド試薬が哺乳動物体内の感染部位または炎症部位に十分蓄積して、本明 細書で開示した本発明の試薬から調製した放射性同位体標識の感染部位または炎 症部位におけるガンマシンチグラフィーによる検出が可能となることを意味する ことを意図する。また、「白血球に結合する」なる語の意味には、白血球がかか る血栓症部位に局在できるという事実により、本発明の特異的結合ペプチドおよ びペプチド試薬が血栓症部位に蓄積できるということも含まれている。 本発明の試薬は、アテローム性動脈硬化症部位に存在するヘパリンおよび他の グリコサミノグリカンにも結合できる。本発明の目的のために、「ヘパリンおよ び他のグルコサミノグリカンに結合する」なる語は、グリコサミノグリカンを含 む細胞外マトリックス物質がアテローム性動脈硬化症部位に蓄積され得るという 事実により、本発明の特異的結合ペプチドがかかるアテローム性動脈硬化症部位 に蓄積することができることの意味を意図している。 本発明のＰＦ４-由来ペプチド試薬は腫瘍関連の血管新生を阻害でき、本発明 の特異的結合ペプチドは、ペプチドがかかる腫瘍部位に蓄積し得るという事実に より、イン・ビボにおいて腫瘍部位に蓄積できる。 本発明の好ましいペプチドには、血小板第４因子およびそれ由来のペプチドが 含まれる。本発明の目的のために、「それ由来のペプチド」なる語は、血小板第 ４因子アミノ酸配列の全体または一部に相同なアミノ酸配列を有するペプチドを 包含することを意図する。また、この語で定義することを意図するのは、天然血 小板第４因子蛋白質の蛋白質加水分解によるか、あるいは血小板第４因子アミノ 酸配列の一部分の化学合成により生成するかを問わず、血小板第４因子のペプチ ド断片である。本発明の実施に有用なペプチド断片には、哺乳動物体内における 感染部位および炎症部位に特異的に結合することができる断片が含まれる。かか るペプチドの例は、実施例において後記する。 Ｃｐ（ａａ）Ｃｐ-含有ペプチドにおいて、Ｃｐとは、Ｓ-保護基が同一または 異なっていて、限定するものではないが： -ＣＨ₂-アリール、（アリールはフェニル、またはアルキルもしくはアルキル オキシ置換フェニル）； -ＣＨ-（アリール）₂、（アリールはフェニル、またはアルキルもしくはアル キルオキシ置換フェニル）； -Ｃ-（アリール）₃、（アリールはフェニル、またはアルキルもしくはアルキ ルオキシ置換フェニル）； -ＣＨ₂-（４-メトキシフェニル）； -ＣＨ-（４−ピリジル）（フェニル）₂； -Ｃ（ＣＨ₃）₃； -９-フェニルフルオレニル； -ＣＨ₂ＮＨＯＲ、（Ｒは非置換または置換アルキルもしくはアリール）； -ＣＨ₂-ＮＨＣＯＯＲ、（Ｒは非置換または置換アルキルもしくはアリール） ； -ＣＯＮＨＲ、（Ｒは非置換または置換アルキルもしくはアリール）； -ＣＨ₂-Ｓ-ＣＨ₂-フェニル であってもよい保護システインである。 本発明のビスアミノ、ビスチオール基のごとき、「（pgp）^s」で表されるシス テイン-硫黄保護基よりなる放射性同位体標識結合基は、保護基の前記リストに よっても記載されている。 好ましい保護基は、式-ＣＨ_2-ＮＨＣＯＲ（式中、Ｒは１ないし８個の炭素原 子を有する低級アルキル、フェニル、または低級アルキル、ヒドロキシル、低級 アルコキシ、カルボキシもしくは低級アルコキシカルボニルで置換されたフェニ ル）を有する保護基である。 この放射性同位体の核および放射能特性がそれを理想的なシンチグラフィー造 影剤とするため、Ｔｃ-９９ｍでの標識は本発明の利点である。この放射性同位 体は１４０ｋｅＶの単一フォトンエネルギーおよび約６時間の放射性半減期を有 し、⁹⁹Ｍｏ-^99mＴｃ発生器から容易に入手できる。先行技術で知られている他の 放射性核種は、遥かに長期の有効半減期を有する（例えば、６７.４時間の半減 期を有する¹¹¹Ｉｎ）か、毒性（例えば、¹²⁵Ｉ）である。 本発明のペプチドは、イン・ビトロにおいて化学的に合成できる。本発明のペ プチドは、ペプチド合成器上で一般的に有利に調製できる。本発明のペプチドは 合成できるが、そこでは、放射性同位体標識結合基は、当業者によく知られてい る技術を用いて、イン・ビトロ化学合成の間にペプチドに共有結合される。共有 結合の特異的部位をそこで決定できるために、合成に際して放射性同位体標識結 合基に共有結合されたかかるペプチドは有利である。 本発明の放射性同位体標識結合基は、ペプチド合成の間に、標的の特異的ペプ チドに導入できる。ピコリン酸（Ｐic-）よりなる具体例［例えば、Ｐic-Ｇly- Ｃys（保護基）-］に関しては、合成の最後の残基（すなわち、アミノ末端）と して放射性同位体標識-結合基を合成できる。加えて、ピコリン酸-含有放射性同 位体標識-結合基をリジンのε-アミノ基に共有結合させて、例えば、ペプチド鎖 のいずれの位置にも導入できるαＮ（Ｆmoc）-Ｌys-εＮ［Ｐic-Ｇly-Ｃys（保 護基）］を得ることもできる。この配列は標的結合ペプチドに容易な導入法を提 供するために、特に有利である。 同様にして、ペプチド鎖のカルボキシル末端に配列［-Ｃys（保護基）-Ｇly- ］を含ませることによって、ペプチド合成の間にピコリルアミン（Ｐica）-含有 放射性同位体標識-結合基［-Ｃys（保護基）-Ｇly-Ｐica］も調製できる。樹脂 からペプチドを切断した後に、該ペプチドのカルボキシル末端を活性化し、ピコ リルアミンにカップリングさせる。この合成経路には、反応性の側鎖官能基がマ スク（保護）されたまま残っていて、ピコリルアミンの結合の間に反応しないこ とを要する。 Ｐic-Ｇly-Ｃys-キレーターを含む小さな合成ペプチドの例は、本明細書で後 記する実施例に挙げられている。本発明は、実質的にいずれかの血小板第４因子 -由来ペプチドにこれらのキレーターを導入し、Ｔｃ-９９ｍ放射性同位体標識ペ プチドを得ることを提供する。 また、本発明は、Ｔｃ-９９ｍで標識することができるビスアミノ ビスチオ ール（ＢＡＴ）キレーターを導入する、特異的に結合する小さな合成ペプチドを 提供する。 本発明のペプチド試薬で放射性テクネチウムの錯体の形成においては、還元剤 （好ましい具体例において、該還元剤は塩化第一スズである）の存在下において 、テクネチウム錯体、好ましくはＴｃ−９９ｍ過テクネチウム酸の塩を本発明の ペプチド試薬と反応させる。錯体およびかかる錯体を調製するための手段は、標 識すべき所定量の本発明のペプチド試薬と、該試薬をＴｃ-９９ｍで標識するの に十分な量の還元剤とを含む密閉バイアルよりなるキット形態で簡便に提供され る。別法として、該錯体は、本発明のペプチド試薬を、テクネチウムおよびトラ ンスファー・リガンドとして知られているもう１つの化合物の予め形成したラー ビル 錯体と反応させることにより形成できる。この工程はリガンド交換として知られ ており、当業者によく知られている。該ラービル錯体は、例えば、タルトレート 、シトレート、グルコネートおよびマンニトールのごときトランスファー・リガ ンドを用いて形成できる。本発明で有用なＴｃ-９９ｍ過テクネチウム酸塩の中 には、ナトリウム塩のごときアルカリ金属塩、またはアンモニウム塩もしくは低 級アルキルアンモニウム塩が含まれる。本発明のペプチド試薬のＴｃ-９９ｍ過 テクネチウム酸塩との反応は、室温にて水性媒質にて行うことができる。水性媒 質中でアニオン性錯体が形成された場合、放射性同位体標識錯体は、ナトリウム カチオン、アンモニウムカチオン、モノ、ジ-もしくはトリ-低級アルキルアミン カチオン、またはいずれの医薬上許容されるカチオンのごとき適当なカチオンと の塩の形態である。 本発明の好ましい具体例において、テクネチウム標識ペプチドを調製するため のキットが提供される。本発明のペプチド試薬は、当業者によく知られ、本明細 書で後記する方法および手段を用いて化学的に合成できる。ペプチドは放射性同 位体標識結合基に共有結合しており、ここに該放射性同位体標識結合基は放射性 同位体に結合する。Ｔｃ-９９ｍで試薬を標識するのに十分な量の塩化第一スズ または固相還元剤のごとき還元剤を含有するバイアルに適量のペプチド試薬を導 入する。（例えば、タルトレート、シトレート、グルコネートまたはマンニトー ルのごとき）前記した適量のトランスファー・リガンドも含ませることができる 。本発明によるテクネチウム-標識ペプチドは、適量のＴｃ-９９ｍまたはＴｃ- ９９ｍ錯体をバイアルに添加し、本明細書で後記する実施例２に記載する条件下 で反応させることによって調製できる。 本発明により提供される放射能標識ペプチド試薬は、適量の放射能を有するも のとして提供される。Ｔｃ-９９ｍ放射性錯体の形成において、１ｍl当たり約０ .０１ミリキュリー（ｍＣｉ）ないし１００ｍＣｉの濃度の放射能を含有する溶 液中で放射性錯体を形成させるのが一般に好ましい。 本発明によって提供されるテクネチウム-標識ペプチド試薬は、膿瘍および「 肉眼で見えない」感染部位を含めた炎症部位を視覚化するのに用いることがで きる。本発明により提供されるＴｃ-９９ｍ標識ペプチドは、炎症性腸疾病およ び関節炎のごとき疾患を含む組織性虚血により引き起こされる炎症部位を視覚化 するのにも用いることができる。本発明のペプチドは、アテローム性動脈硬化症 および血栓症の部位を視覚化するのにも用いることができ、加えて、小さ過ぎて 他では検出できない一次または転移性の腫瘍の特定の部位である、イン・ビボに おける腫瘍部位を位置決定するのにも有用である。 本発明によれば、テクネチウム-標識ペプチド、または医薬上許容できる対イ オンとの錯体もしくは塩のいずれかとしての錯体を単一ユニット注射用量で投与 する。滅菌生理食塩水溶液または血漿のごとき当業者に知られているいずれかの 普通の担体を、本発明により、種々の器官、腫瘍等を診断的に造影するための注 射溶液を調製するのに、放射性同位体標識した後に、用いることができる。一般 的に、投与すべきユニット投与量は約０.０１ｍＣｉないし約１００ｍＣｉ、好 ましくは１ｍＣｉないし２０ｍＣｉの放射能を有する。ユニット投与量で注射す べき溶液は、約０.０１ｍlないし約１０ｍlである。静脈投与した後に、イン・ ビボにおける器官または腫瘍の造影は、およそ数分で起こり得る。しかしながら 、望むなら、患者に注射した１時間後またはさらに長時間後に造影を起こすこと もできる。ほとんどの例において、十分な量の投与した用量が約０.１時間内に 造影すべき領域に蓄積し、シンチフォトを採ることができるであろう。診断目的 のシンチグラフィー造影のいずれの常法も、本発明で用いることができる。 本発明により提供されるテクネチウム-標識ペプチドおよび錯体は、水性生理 食塩水媒質のごとき静脈注射用のいずれかの慣用的な媒質、または血漿媒質に入 れて静脈内投与できる。かかる媒質は、例えば、浸透圧を調整するための医薬上 許容できる塩、緩衝液、保存料等のごとき慣用的な医薬添加物質を含有していて もよい。好ましい媒質には生理食塩水および血漿がある。 これらの化合物を製造し標識するための方法を、以下の実施例においてさらに 十分に説明する。これらの実施例は、前記の方法のある種の態様および有利な結 果を説明するものである。これらの実施例は、説明するものであって限定するも のではない。 実施例１ 固相ペプチド合成 固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、ジシクロヘキシルカルボジイミド／ヒドロ キシベンゾオリアゾールまたは２-（１Ｈ−ベンゾトリアゾール-１-イル）-１， １，３，３-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／ヒドロキシ ベンゾトリアゾール（ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ）に結合させた９-フルオレニルメチ ルオキシカルボニル（Fmoc）アミノ-末端保護を用い、かつｐ-ヒドロキシメチル フェノキシメチル-ポリスチレン（ＨＭＰ）樹脂をカルボキシル-末端酸またはリ ンク（Rink）アミド樹脂をカルボキシル-末端アミドに用い、アプライド・バイ オシステムズ・モデル４３１Ａ・ペプチド・シンセサイザー（Applied Biosyste ms Model４３１Ａ Peptide Synthesizer）を用いて０.２５ミリモル（mmol）ス ケールで行った。適当には、樹脂結合ペプチドをＮ-メチルピロリジノン（ＮＭ Ｐ）中の無水酢酸で処理することによって、適当なＮ-α-アセチル基を導入した 。樹脂-結合生成物は、１００:５:５:２.５:２の比で室温にて１.５-３時間調製 したトリフルオロ酢酸、水、チオアニソール、エタンジチオールおよびトリメチ ルシランよりなる溶液を用いてルーチン的に切断した。未精製ペプチドは、ウォ ーターズ・デルタ・パックＣ１８カラム（Waters Delta Pak C18 column）、お よびアセトニトリルで修飾した水中の０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用 いる勾配溶出を用いる分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって 精製した。溶出された画分からアセトニトリル蒸発させ、次いでそれを凍結乾燥 した。各生成物の同定は、高速原子衝突質量分析（ＦＡＢＭＳ）により確認した 。 実施例２ Ｔｃ-９９ｍで放射性同位体標識する一般的方法 実施例１で調製したペプチド（０.１ｍｇ）を表Ｉの脚注に記載した溶媒０.１ ｍＬに溶解した。Ｔｃ−９９ｍグルセプテートは、グルコスカン（Glucoscan） バイアル（イー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール，インコーポレイティッド（ E．I.DuPont de Nemours,Inc.））を、２００ｍＣｉまで含有する１.０ｍＬのＴ ｃ-９９ｍ過テクネチウム酸ナトリウムで復元し、室温にて１５分間静置す ることにより調製した。次いで、２５μＬのＴｃ−９９ｍグリセプテートを該ペ プチド試薬に添加し、１００℃または室温にて３０分間反応を進行させ、次いで 、０.２μｍフィルターを通して濾過した。 Ｔｃ-９９ｍ標識ペプチド試薬の純度は、ビダック（Vydak）２１８ＴＰ５４分 析用カラム（ＲＰ-１８、５ミクロン、２２０×４.６ｍｍ）またはウォーターズ ・Ｄ・デルタパック分析用カラム（Ｃ１８、５ミクロン、３９ｍｍ×５０ｍｍ） および表Ｉの脚注に記載した溶出液を用いてＨＰＬＣによって測定した。放射性 成分は、積分レコーダーに連結したin-Iineラジオメトリック検出器によって検 出した。これらの条件下では、Ｔｃ-９９ｍグリセプテートおよびＴｃ-９９ｍ過 テクネチウム酸ナトリウムは１および４分の間に溶出されるが、Ｔｃ-９９ｍ標 識ペプチドは遥かに長時間後に溶出される。 以下の表は、本明細書に記載した方法を用いて実施例１に従って調製した一連 のＴｃ-９９ｍ標識ペプチドを掲載している。 ＊適当なペプチドと共に以下の標識条件を用いた： １．ペプチドを水に溶解し、１００℃にて標識する。 ２．ペプチドを水に溶解し、室温にて標識する。 ３．ペプチドをエタノール：水の１：１混合液に溶解し、１００℃にて標識す る。 ４．ペプチドをエタノール：水の１：１混合液に溶解し、室温にて標識する。 ＨＰＬＣ方法： 一般： 溶媒Ａ＝０.１％ＣＦ₃ＣＯＯＨ/Ｈ₂Ｏ 溶媒Ｂ₉₀＝０.１％ＣＦ₃ＣＯＯＨ/９０％ＣＨ₃ＣＮ/Ｈ₂Ｏ 溶媒流速＝１ｍl/分 ビダック（Vydak）カラム ＝ガードカラムを付けたビダック218ＴP54 RP-18 、5μ、220mm×4.6mm、分析用カラム ウォーターズ（Waters）カラム＝ウォーターズ・デルタパックC18、５μ、 39mm×150mm 方法： ビダックまたはウォーターズ・カラム １０-２０分で １００％Ａから１００％Ｂ₉₀ 実施例３ Ｔｃ-９９ｍ標識ペプチドのシンチグラフィー造影および生体内分布 前記にて提供したＴｃ-９９ｍ標識ペプチド試薬の有効性を証明するために、 イー・コリ（E.coli）の病原性株でニュージーランド（New Zea1and）白ウサギ の左腓に筋肉内接種した。２４時間後に、該動物をケタミンおよびキシラジンの 筋肉内注射によって沈静させ、次いでＴｃ-９９ｍ標識ペプチド（＜１５０μｇ 、２-１０ｍＣｉ）で静脈内注射した。該動物をガンマカメラ（LEAPコリメータ ー/Ｔｃ−９９ｍでフォトピーク化）の視野の中に仰向けに置き、注射後の最初 の１時間にわたり、次いで注射後の次の３時間にわたっては約１時間間隔で造影 した。必要に応じて、動物を造影採取および再麻酔の間で覚醒させた。 最後の造影が完了したら、致死量のフェノバルビタールを静脈内注射すること により各動物を死亡させ、解剖して血液試料ならびに感染組織および対照の筋肉 組織を得た。組織試料を計量し、標準量の注射投与量でもってガンマカウンター を用いてカウントし、該組織に残留した％注射用量（組織１ｇ当たり）を算出し た。感染筋肉組織-対-非感染筋肉組織、および感染筋肉組織-対-血液の１グラム 当たりの注射用量の％比を各ペプチドにつき算出した。これらの結果を以下の表 に示す。式： アセチル/ＫＫＫＫＫＣ_AcmＧＣ_AcmＧＧＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ を有する本発明のＴｃ-９９ｍ標識試薬で注射したウサギの全身および脚の造影 のシンチフォトを図１に示す。 表に見られる感染/対照筋肉の比は、正常の組織と比較して、感染部位におけ る本発明の放射性同位体標識ペプチドの特異的かつ優先的な局在性を明らかに証 明している。図１に示す造影も、非-感染の反対の脚と比較して、実験的に感染 させた部位関係の脚における放射能の遥かに高いレベルの局在性を明らかに示し ている。 実施例４ Ｔｃ−９９ｍ標識化合物血栓シンチグラフィー造影剤を用いた イヌ科モデルにおける深部静脈血栓症のイン・ビボ造影 雑種イヌ（２５−３５１ｂ、一晩絶食）をケタミンおよびアセプロザミンの組 合せを筋肉内注射して沈静させ、次いでペンタバルビタールナトリウムを静脈内 注射して麻酔する。１８-ゲージの血管カテーテル（angiocath）を右大腿静脈の 遠位半分に挿入し、８ｍｍのダクロン（Daron）^Rを巻き付けたステンレススチー ル塞栓コイル（クック・コポレイション（Cook Corporation）、インディアナ州 、ブルーミントン（Bloomington，IN））を各動物のおよそ中位の大腿部の大腿 静脈に設置する。カテーテルを取り出し、傷を縫合し、コイルの位置をＸ線によ って記録する。次いで、該動物を一晩覚醒させる。 コイル設置１日後に、各動物を再麻酔し、各前脚に静脈内生理食塩水点滴を設 置し、膀胱カテーテルを挿入して尿を採取する。該動物を、低エネルギーの全目 的コリメーターを備え、かつＴｃ−９９ｍにフォトピーク化したガンマカメラ下 に仰向けに設置する。イメージを核医学コンピューターシステムに獲得する。 Ｔｃ-９９ｍ標識試薬［１８５-３７０ｍＢｑ（５-１０ｍＣｉ）のＴｃ-９９ｍ および０.２-０.４ｍｇの試薬］を１の前脚の静脈内ラインにその挿入時点で注 射する。第二ラインは血液採取用に残して置く。脚にわたる前方イメージを、お よそ注射１、２、３および４時間後に、５００,０００カウントまたは２０分間 （いすれか短時間の方）、約１０-２０分間獲得する。最後のイメージを採取し た後に、各動物をペノバルビタールで深く麻酔する。ヘパリン処理シリンジを用 いた心臓穿刺で２種の血液試料を採取し、続いて心臓内注射または静脈内ボーラ ス注射によって安楽死量の飽和塩化カリウム溶液を投与する。次いで、血栓を含 む大腿静脈および腿部筋肉の試料を注意深く切除する。次いで、血栓を脈管を含 ませずに切除し、予め計量した試験管に入れる。次いで、該血栓試料を計量し、 Ｔｃ-９９ｍチャンネルにてガンマウェルカウンターでカウントする。注射した 用量の公知画分も同様にカウントする。 安楽死させる直前に得た新鮮血栓重量、血栓および血液中の％注射用量 （％ＩＤ）/ｇ）ならびに血栓/血液および血栓/筋肉比を算出する。血栓/バック グラウンド比は、コンピューター保存イメージからの血栓および近隣の筋肉にわ たり引き出した目的部位（ＲＯＩ）で測定したカウント/ピクセルの分析によっ て算出した。これらの結果を用いて放射能の血栓-特異的な局在性、およびイン ・ビボにおける血栓形成部位を位置決定するシンチグラフィー造影の有効性を証 明する。 実施例５ 高コレステロール症ウサギモデルを用いた 粥状斑の位置決定およびイン・ビボ造影 ２-３ｋｇの体重を有する雌雄のニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギ を２群に分ける。対照群を小屋に入れ、市販のウサギ用餌（プリナ（Purina）） を摂食させる。ＨＣ群には、標準化され、コレステロールに富む食餌（１％ｗ/ ｗ濃度のコレステロールに混合したウサギ用餌）を７週齢から２８週齢に至るま で摂食させる。全ての動物は自由に飲水させる。 約２５０-４００μｇの前記ペプチドを、１４０-１６０ｍＣｉのＴｃ-９９ｍ で標識し、０.２ｍＬ投与用量中に７-８ｍＣｉ（１２.５-２０.０μｇ/ウサギ； ６-７μｇ/ｋｇ）のユニット用量で調製する。速度の遅いボーラス点滴により、 成体ラットの側耳静脈にＴｃ-９９ｍ標識ペプチドを静脈内注射する（約０.１ｍ Ｌ/１分）。ピン-ホール・コリメーター（５ｍｍ窓）、およびＴｃ-９９ｍに設 定したエネルギー・ウインドウを備え、かつ５０,０００カウントを蓄積するか 、または所望の時間スキャンするようにプログラムしたガンマカメラを用いる。 造影の直前に動物をケタミンおよびキシラジンの混合物（５：１、１ｍＬ/ｋｇ 筋肉内投与）で麻酔する。 心臓の真上４０°-４５°でガンマカメライメージを採取し（左前方斜め［Ｌ ＡＯ］図）、大動脈アーチを描写し、下降する大動脈を検分する。イメージは、 注射１時間および２時間後に、場合によっては３時間および５時間後に獲得する 。必要に応じて、各イメージ採取の前に補助的な麻酔剤を注射する。 （２時間のスキャンの後である）２.５時間において、静脈内投与量のペント バ ルビタールナトリウムで動物を屠殺する。死体解剖において、大動脈を取り出し 、分岐脈管を大動脈弁から中腹部までを切り出す。平行ホール（parallel hole ）コリメーターを用いて大動脈を体外にてに造影する。次いで、その大動脈を縦 軸方向に切開し、スダンIVで染色すると、それによって粥状斑が深紅レンガ色に なる。無脂質で注射していない大動脈内皮はその正常な状態のままであり、これ らの条件下にては白色ないし桃色の外観に輝いている。 染色によって観察された粥状斑を動脈に位置付けることに対応する、イン・ビ ボまたは体外イメージで認められた動脈の粥状斑領域における取込み-対-非粥状 斑動脈における取込みを用いて、アテローム性動脈硬化症のイメージを提供する 本発明の放射性同位体標識ペプチドの有用性が証明される。 前記開示は本発明のある種の特定の具体例を強調するものであって、それに相 等する全ての修飾または別法も添付した請求の範囲に記載する本発明の趣旨およ び範囲の中であることは理解されるべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．放射線同位体標識結合基に共有結合した、血小板第４因子またはそのペプチ ド断片からなる特異的結合ペプチドよりなる、哺乳動物体内部位を造影するため の放射線同位体標識ペプチドの調製用試薬。 ２． Ｉ． Ｃｐ（ａａ）Ｃｐ ［式中、Ｃｐは保護システインであって、（ａａ）はα-またはβ-アミノ酸］： II． Ａ-ＣＺ（Ｂ）-［Ｃ（Ｒ¹Ｒ²）］_n-Ｘ ［式中、 ＡはＨ、ＨＯＯＣ、Ｈ₂ＮＯＣ、（ペプチド）-ＮＨＯＣ、（ペプチド）-ＯＯ ＣまたはＲ⁴； ＢはＨ、ＳＨ、-ＮＨＲ³、-Ｎ（Ｒ³）-（ペプチド）またはＲ⁴； ＸはＨ、ＳＨ、-ＮＨＲ³、-Ｎ（Ｒ³）-（ペプチド）またはＲ⁴； ＺはＨまたはＲ⁴； Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は、独立して、Ｈまたは低級の直鎖もしくは分岐鎖ま たは環状のアルキル； ｎは０、１または２であって； Ｂが-ＮＨＲ³または-Ｎ（Ｒ³）-（ペプチド）である場合、ＸはＳＨであって ｎは１または２； Ｘが-ＮＨＲ³または-Ｎ（Ｒ³）-（ペプチド）である場合、ＢはＳＨであって ｎは１または２； ＢがＨまたはＲ⁴である場合、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ₂ＮＯＣ、（ペプチド）-ＮＨ ＯＣ、（ペプチド）-ＯＯＣ、ＸはＳＨであってｎは０または１； ＡがＨまたはＲ⁴であってＢがＳＨである場合、Ｘは-ＮＨＲ₃または-Ｎ（Ｒ³ ）-（ペプチド）； ＸがＳＨである場合、Ｂは-ＮＨＲ³または-Ｎ（Ｒ³）-（ペプチド）； ＸがＨまたはＲ⁴である場合、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ₂ＮＯＣ、（ペプチド）-ＮＨ ＯＣ、（ペプチド）-ＯＯＣであってＢはＳＨ； Ｚがメチルである場合、Ｘはメチル、ＡはＨＯＯＣ、Ｈ₂ＮＯＣ、（ペプチド ）-ＮＨＯＣ、（ペプチド）-ＯＯＣ、ＢはＳＨであってｎは０； ＢがＳＨであってＸがＳＨである場合、ｎは０ではない； ここに、チオール基は還元型である］；および ［式中、Ｘ＝Ｈまたは保護用基； （amino acid）＝いずれかのアミノ酸］ ［式中、各Ｒ⁵は、独立して、Ｈ、ＣＨまたはＣ₂Ｈ₅； 各（pgp）^sは、独立して、チオール保護基またはＨ； ｍ、ｎおよびｐは、独立して、２または３； Ａ＝線状または環状の低級アルキル、アリール、複素環、それらの組合せまた は置換誘導体］； ［式中、 各Ｒ⁵は、独立して、Ｈ、１ないし６個の炭素原子を有する低級アルキル、フ ェニル、または低級アルキルもしくは低級アルコキシで置換されたフェニル； ｍ、ｎおよびｐは、独立して、１または２； Ａ＝線状または環状の低級アルキル、アリール、複素環、それらの組合せまた は置換誘導体； Ｖ＝Ｈまたは-ＣＯ-ペプチド； Ｒ⁶＝Ｈまたはペプチド； ここに、Ｖ＝Ｈである場合、Ｒ⁶＝ペプチドで、Ｒ⁶＝Ｈの場合、Ｖ＝-ＣＯ-ペ プチドを意味する］ よりなる群から選択される式で示される放射性同位体標識-結合基に共有結合し た、血小板第４因子またはそのペプチド断片からなる特異的結合ペプチドよりな り、ここに、該放射性同位体標識-結合基は放射性同位体とで錯体を形成し、か つ該錯体は電気的に中性である哺乳動物体内部位を造影するための放射性同位体 標識ペプチドの調製用試薬。 ３．該特異的結合ペプチドと放射性同位体標識結合基が１個ないし約２０個のア ミノ酸を通して共有結合している請求項２記載の試薬。 ４．式Ｉで示される放射性同位体標識-結合基の保護されたシステインが式 -ＣＨ₂-ＮＨ-ＣＯ-Ｒ ［式中、 Ｒは１ないし６個の炭素原子を有する低級アルキル、２-，３-，４-ピリジル 、フェニル、または低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシも し くは低級アルコキシカルボニルで置換されたフェニル］ の保護用基を有する請求項２記載の試薬。 ５．式Ｃｐ（ａａ）Ｃｐの放射性同位体標識-結合基が式： を有する請求項２記載の試薬。 ６．放射性同位体標識結合基が放射性同位体標識に結合している請求項２記載の 試薬。 ７．放射性同位体標識がテクネチウム-９９ｍ、ガリウム-６８またはインジウム -１１１である請求項６記載の試薬。 ８．特異的結合ペプチドが、アミノ酸配列 PLYKKIIKKLLES、 PLY.Orn.Orn.II.Orn.Orn.LLES、QAPLYKKIIKKLLESおよびKKIIKKLLESを有するペプ チドよりなる群から選択される請求項２記載の試薬。 ９．該試薬が、さらに、複数の特異的結合ペプチドに共有結合し、かつ複数の放 射性同位体標識-結合基にも共有結合して多重結合多価シンチグラフィー造影剤 を構成する多価連結基よりなり、ここに該多重結合多価シンチグラフィー造影剤 の分子量が約２０，０００ダルトンより小さい請求項１記載の試薬。 １０．多価連結基がビス-スクシンイミジルメチルエーテル、４-（２，２-ジメ チルアセチル）安息香酸、ジエチレントリアミン五酢酸、トリス（スクシンイミ ジルエチル）アミン、トリス-アセトアミドエチルアミンおよび１，１０-ビスア セトアミド-４，７-ジオキサ-デカン、またはその誘導体である請求項９記載の 多重多価シンチグラフィー造影剤。 １１．還元剤の存在下にて請求項２記載の試薬をテクネチウム-９９ｍと反応さ せることにより形成された錯体。 １２．該還元剤が亜二チオン酸イオン、第一スズイオンまたは第一鉄イオンより なる群から選択される請求項１１記載の錯体。 １３．予め還元したテクネチウム-９９ｍ錯体のリガンド交換によって、請求項 ２記載の試薬をテクネチウム-９９ｍで標識することにより形成された錯体。 １４．所定量の請求項２記載の試薬、および該試薬をテクネチウム-９９ｍで標 識するのに十分な量の還元剤を含有する密閉バイアルよりなる放射性医薬調製物 の調製用キット。 １５．テクネチウム-９９ｍで標識した診断有効量の請求項２記載の試薬を投与 し、哺乳動物体内部位に局在したＴｃ-９９ｍを検出することよりなり、該部位 が、哺乳動物体内の炎症部位、血栓部位、アテローム性動脈硬化症部位および新 生物増殖部位よりなる群から選択される哺乳動物体内部位を造影する方法。 １６．試薬をイン・ビトロで化学的に合成する請求項２記載の試薬を調製する方 法。 １７．特異的結合ペプチドが固相ペプチド合成法により合成される請求項１６記 載の試薬を調製する方法。 １８．イン・ビトロ化学合成の間に放射性同位体標識結合基が特異的結合ペプチ ドに共有結合する請求項２記載の試薬。 １９．固相ペプチド合成の間に放射性同位体結合基が特異的結合ペプチドに共有 結合する請求項１８記載の試薬。 ２０．還元剤の存在下にて該ペプチドをＴｃ-９９ｍと反応させることよりなる 請求項２記載のペプチドを標識する方法。 ２１．還元剤が亜二チオン酸イオン、第一スズイオンまたは第一鉄イオンから選 択される請求項２０記載の方法。 ２２．式： Ｃ_AcmＧＣ_AcmＧＧＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ を有する組成物。 ２３．式： ＡｃＫＫＫＫＫＣ_AcmＧＣ_AcmＧＧＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ を有する組成物。 ２４．式： Ｃ_MobＧＣ_AcmＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ を有する組成物。 ２５．式： ［ＤＴＰＡ］Ｃ_AcmＧＣ_AcmＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ を有する組成物。 ２６．式： Ｐ_icＧＣ_AcmＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ を有する組成物。 ２７．式： ［ＢＡＴ］ＧＧＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ を有する組成物。 ２８．式： を有する組成物。 ２９．式： を有する組成物。 ３０．式： ［ＢＡＴ］.ＫＫＬＬＫＫＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ を有する組成物。 ３１．式： ＡｃＫＫＣ_AcmＧＣ_AcmＧＧＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ を有する組成物。 ３２．式： ＡｃＫＫＣ_AcmＧＣ_AcmＱＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ を有する組成物。 ３３．式： ＡｃＣ_AcmＧＣ_AcmＱＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ を有する組成物。