DK161097B - Modificeret faktor vii/viia, dna-sekvens, som koder herfor, ekspressionsvektor indeholdende en saadan dna-sekvens, celle, der er transformeret med en saadan vektor og fremgangsmaade til fremstilling af modificeret faktor vii/viia - Google Patents
Modificeret faktor vii/viia, dna-sekvens, som koder herfor, ekspressionsvektor indeholdende en saadan dna-sekvens, celle, der er transformeret med en saadan vektor og fremgangsmaade til fremstilling af modificeret faktor vii/viia Download PDFInfo
- Publication number
- DK161097B DK161097B DK653989A DK653989A DK161097B DK 161097 B DK161097 B DK 161097B DK 653989 A DK653989 A DK 653989A DK 653989 A DK653989 A DK 653989A DK 161097 B DK161097 B DK 161097B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- factor vii
- viia
- arg
- replaced
- factor
- Prior art date
Links
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 title claims abstract description 64
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 title claims abstract description 64
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 title claims abstract description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 25
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 17
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 17
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 15
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 15
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 23
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 abstract description 9
- 229940099816 human factor vii Drugs 0.000 abstract description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 31
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 7
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 7
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 7
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 7
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 4
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 4
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940006612 barium citrate Drugs 0.000 description 4
- PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H barium(2+);2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Ba+2].[Ba+2].[Ba+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O PAVWOHWZXOQYDB-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 3
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 2
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 2
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMBIICKZNSTXJA-UHFFFAOYSA-N 2-(carboxyamino)pentanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCC(C(O)=O)NC(O)=O YMBIICKZNSTXJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100025566 Chymotrypsin-like protease CTRL-1 Human genes 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 1
- 206010053172 Fatal outcomes Diseases 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100040004 Gamma-glutamylcyclotransferase Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- GVGLGOZIDCSQPN-PVHGPHFFSA-N Heroin Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)OC(C)=O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4OC(C)=O GVGLGOZIDCSQPN-PVHGPHFFSA-N 0.000 description 1
- 101000856199 Homo sapiens Chymotrypsin-like protease CTRL-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000886680 Homo sapiens Gamma-glutamylcyclotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000013544 Platelet disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241001522306 Serinus serinus Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L barium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ba+2] WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000006624 extrinsic pathway Effects 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000008742 procoagulation Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007363 regulatory process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
DK 161097 B
Den foreliggende opfindelse angår modificeret faktor VII/VIIa, DNA-sekvenser, der koder for sådanne modificerede faktorer og en fremgangsmåde til fremstilling deraf.
Faktor Vila er en serinprotease, som medvirker i 5 blodkoagulering ved aktivering af faktor X og/eller faktor IX. Faktor Vila produceres af sin precursor, faktor Vil, som syntetiseres i leveren og udskilles i blodet, hvor det cirkulerer som et enkeltkædet glycoprotein (Mw = 50.000). Faktor VII kan in vitro omdannes til den dobbeltkædede form 10 faktor Vila ved hjælp af faktor Xa, faktor Xlla, faktor IXa eller thrombin. I nærvær af vævsfaktor og kalciumioner menes faktor Vila in vivo at omdanne faktor X til faktor Xa ved begrænset proteolyse. Det sidstnævnte enzym omdanner på sin side prothrombin til thrombin i nærvær af faktor Va, kalcium-15 ioner og phospholipid. Faktor Vila vil også omdanne faktor IX til faktor IXa i nærvær af vævsfaktor og kalcium.
Faktor VII kan oprenses fra plasma og aktiveres til faktor Vila ved hjælp af de af Broze og Majerus, J.Biol.Chem.
255 (4): 1242 - 1247, 1980 og af Hedner og Kisiel, J.Clin.
20 Invest 71: 1836 - 1841, 1983 beskrevne metoder.
Faktor Vila kan også fremstilles ved rekombinant DNA-teknologi ved dyrkning i et egnet medium af mammale celler, der er transficeret med en DNA-sekvens, der koder for faktor VII, ved isolering af det fremstillede protein og aktivering af 25 proteinet til faktor Vila (se europæisk patentansøgning nr. 86302855.1).
cDNA, der koder for human faktor VII, er blevet karakteriseret (Hagen et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 83: 2412 - 2416, 1986). Den fra cDNA afledte aminosyresekvens angiver, 30 at faktor VII syntetiseres med en præpro-leader sekvens på 60 eller 38 aminosyrer. Den modne faktor VII, som cirkulerer i plasma består af 406 aminosyrerester. Aminosyresekvensanalyse af det aktiverede protein og den fra cDNA afledte aminosyresekvens antyder, at faktor VII omdannes til faktor 35 Vila ved spaltning af en enkelt peptidbinding mellem arginin (152) og isoleucin (153). Dette resulterer i dannelsen af et 2
DK 161097 B
dobbeltkædet molekyle bestående af en let kæde (152 aminosyrerester) og en tung kæde (254 aminosyrerester), som bindes sammen af en disulfidbinding. Den lette kæde indeholder et y-carboxyglutaminsyre(Gla)område og to potentielle 5 epidemiske vækstfaktorområder, medens den tunge kæde indeholder serinproteasedelen af molekylet.
Faktor Vila kan anvendes i behandlingen af patienter, som har udviklet inhibitorer mod faktor VIII (Hedner, U. og Kisiel, W., J.Clin.Invest., 71: 1836 - 1841, 1983) og i 10 behandlingen af patienter, der lider af blødningssygdomme, såsom blodpladelidelser, herunder thrombocytopæni, von Willebrand's syndrom og andre, som typisk forekommer i forbindelse med kraftige vævsskader (europæisk patentansøgning nr. 86309197.1).
15 Ifølge opfindernes iagttagelser er faktor Vila et protein, der er følsomt for proteolytisk spaltning, hvilket giver anledning til et antal nedbrydningsprodukter uden størkningsaktivitet. Den proteolytiske spaltning kan forekomme på forskellige trin i udvindingsproceduren og også under 20 opbevaring. Nedbrydningsprodukter er blevet iagttaget både for faktor Vila stammende fra plasma så vel som for faktor Vila fremstillet ved rekombinant DNA-teknologi. Nedbrydningen kan forekomme inden faktor VII er blevet aktiveret til faktor Vila, d.v.s. under fremstilling og isolering af faktor VII, under 25 selve aktiveringstrinnet eller under isolering, oprensning og/eller opbevaring af det aktiverede produkt.
Eftersom nedbrydningsprodukterne er inaktive molekyler, vil deres forekomst i faktor Vila præparatet medføre en lavere specifik aktivitet af slutpræparatet. Endvidere kan 30 mængden og arten af nedbrydningsprodukter variere fra produktion til produktion, hvilket giver anledning til præparater med et variabelt indhold af biologisk aktivt faktor Vila.
Faktor Vila præparater indeholdende inaktive 35 nedbrydningsprodukter vil som nævnt have en mindre specifik aktivitet sammenlignet med præparater, i hvilke det hele eller en væsentlig del af proteinmaterialet er aktivt. Derfor er højere og hyppigere doser nødvendige for at opnå og 3
DK 161097 B
vedligeholde en terapeutisk eller profylaktisk effekt i sammenligning med et præparat med højere specifik aktivitet.
Variable mængder af inaktive nedbrydningsprodukter og som følge heraf variabelt indhold af biologisk aktivt faktor 5 Vila vil yderligere gøre beregningen af passende doser arbejdskrævende og vanskelig, om ikke under visse omstændigheder umulig.
Endelig kan et indhold af ikke-fysiologiske nedbrydningsprodukter i slutpræparatet udløse patientens immun-10 system. Ny indgift kan derpå føre til allergiske reaktioner, som i alvorlige tilfælde kan få dødelig udgang. Patienten kan også udvikle høje antistoftitre mod faktor Vila, hvilket vil gøre påfølgende behandling vanskelig eller ineffektiv. Som følge heraf vil et faktor Vila præparat med mindre tendens til 15 proteolytisk nedbrydning in vitro være mere tilfredsstillende og potentielt mere nyttigt i faktor Vila terapi.
Sandsynligvis fjernes faktor Vila ligesom andre cirkulerende proteiner fra blodstrømmen ved hjælp af enzymatisk nedbrydning. På det initiale trin af denne regu-20 lerende proces spaltes det biologisk aktive enzym ved en eller nogle få følsomme peptidbindinger til fremstilling af et inaktivt nedbrudt molekyle. Det er meget sandsynligt, at de peptidbindinger, som er mest følsomme over for enzymatisk hydrolyse in vivo er identiske med de labile peptidbindinger, 25 som hyppigst iagttages hydrolyseret under fremstilling, oprensning og/eller opbevaring af faktor Vila (George J. Broze,
Jr., Scot Hichman og Joseph P. Miletich, J.Clin. Invest. 76 (1985) 937 - 946).
Faktor VII indeholder 17 lysinrester (positionerne 30 18, 32, 38, 62, 85, 109, 137, 143, 148, 157, 161, 197, 199, 316, 337, 341, 389) og 24 argininrester (positionerne 9, 15, 28, 36, 79, 110, 113, 144, 152, 202, 223, 224, 247, 266, 271, 277, 290, 304, 315, 353, 379, 392, 396, 402), som i princippet alle er følsomme over for proteolytisk spaltning, men i 35 almindelighed er nogle af disse rester ikke "aktive" som spaltningssteder.
Skønt den nøjagtige halveringstid for cirkulerende faktor Vila er ukendt, viser foreløbige resultater, at faktor 4
DK 161097 B
Vila prokoaguleringsaktivitet hurtigt fjernes fra blodstrømmen ved intravenøs indgift (Ulla Hedner og Walter Kisiel, J.Clin.Invest. 71 (1983) 1836 - 1841).
Behandlingen og patienternes liv vil blive negativt 5 påvirket af den observerede korte in vivo halveringstid af nativt faktor Vila. Relativt høje doser og hyppig indgift vil være nødvendig for at opnå og opretholde den ønskede terapeutiske eller profylaktiske virkning. Som en følge heraf vil en adækvat dosisregulering være vanskelig at opnå, og behovet for 10 hyppig intravenøs indgift vil medføre begrænsninger i patientens livsførelse.
Som følge heraf er der inden for den kendte teknik et behov for faktor Vila præparater, som er stabile under fremstilling, oprensning og opbevaring selv ved høje kon-15 centrationer, og som yderligere har en længere halveringstid og langsommere udskillelse fra blodet end den naturlige eller rekombinante faktor Vila. Den foreliggende opfindelse imødekommer dette behov ved at tilvejebringe visse modificerede faktor VII/VIIa.
20 I sit bredeste aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en modificeret faktor VII/VIIa, der er stabiliseret over for proteolytisk spaltning i visse positioner i molekylet. Mere specifikt tilvejebringer den foreliggende opfindelse modificeret faktor VII/VIIa, i hvilket en eller flere 25 proteolytisk følsomme peptidbinding(er) i naturligt faktor VII/VIIa er blevet erstattet af en proteolytisk mere stabil peptidbinding.
Ifølge den foreliggende opfindelse opnås dette ved modifikationer i visse positioner i det naturlige humane faktor 30 VII/VIIa molekyle. Sådanne modifikationer kan omfatte fjernelse af visse aminosyrerester eller erstatning af en eller flere aminosyrerester med en anden aminosyrerest. For eksempel kan en trypsinlignende proteolytisk spaltning hæmmes ved stabilisering af peptidbindingen ved den C-terminale ende af visse Arg 35 og/eller Lys rester og/eller ved erstatning af visse Arg og/eller Lys rester med andre aminosyrerester og/eller ved fjernelse af visse Arg og/eller Lys rester.
5
DK 161097 B
Eksempler på trypsin-lignende spaltningssteder i det humane faktor VII molekyle, hvor spaltninger er blevet iagttaget omfatter (i) lysin(38)-leucin(39), 5 (ii) lysin(32)-aspartat(33), (iii) lysin(143)-arginin(144), (iv) arginin(290)-glycin(291), (v) arginin(315)-lysin(316), (vi) lysin(316)-valin(3l7) , 10 (vii) lysin(341)-glycin(342), (viii) arginin(392)-serin(393), (ix) arginin(396)-prolin(397) og (x) arginin(402)-alanin(403).
Mindre chymotrypsinlignende spaltninger er også blevet 15 iagttaget efter (xi) isoleucin(42) og (xii) tyrosin(44).
Blandt disse spaltningssteder har det vist sig, at (i), (ii), (iv) og (v) er mest følsomme over for proteolytisk 20 nedbrydning, medens de resterende er af mindre kvantitativ betydning.
Når man betragter stabiliseringen af faktor VII/VIIa, er det et vigtigt aspekt, at det resulterende modificerede faktor VII bibeholder sin aktivitet. Dette opnås ifølge 25 den foreliggende opfindelse ved at sammenligne sekvensen for naturligt faktor VII/VIIa i området, der skal modificeres, med tilsvarende sekvenser i beslægtede proteiner, såsom faktor IX, faktor X, faktor II og protein C. Homologe sekvenser omkring de vigtige spaltningssteder er vist nedenfor: 30 6
DK 161097 B
32 38
I I
Faktor II EEAFEALESSTATDVFWAKY
Faktor VII EEAREIFKDAERTKLFWISY
5 Faktor X EEAREVFEDS DKTNEFWNKY
Faktor IX EEAREVFENTERTTEFWKQY
Faktor C EEAKEIFQNVDDTLAFWSKH
290
10 Faktor II RVTGWGNLKETWTANVGKGQPSV-L
Faktor VII LVSGWGQL-------LDRGATALEL
Faktor X IVSGFGRT-------HEKGRQSTRL
Faktor IX YVSGWGRV-------FHKGRSALVL
Protein C LVTGWGYH-------SSREKEAKRN
15 315 341
I I
Faktor II C-KDSTRI----RITDNMFCAGYKPDEGKRGDACEGDSGGPF
Faktor VII CLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYS—DGSK-DSCKGDSGGPH
Faktor X C-----KLSSSFIITQNMFCAGYD—TKQE-DACQGDSGGPH
20 Faktor IX CLR-STKFT----IYNNMFCAGFH—EGGR- DS CQGDSGGPH
Protein C CSEVMSNM-----VSENMLCAGIL—DGRQ-DACEGDSGGPM
Det er derfor den foreliggende opfindelses formål at tilvejebringe modificeret faktor VII/VIIa, hvori en, flere eller alle lysin-, arginin-, isoleucin- og tyrosinresterne: 25 (i) lysin(38) (ii) lysin(32) (iii) lysin(143) (iv) arginin(290) (v) arginin(315) 30 (vi) lysin(316) (vii) lysin(341) (viii) arginin(392) (ix) arginin(396) (x) arginin(402) 35 (xi) isoleucin(42) og (xii) tyrosin(44) er blevet stabiliseret ved substitution eller deletion.
7
DK 161097 B
I en foretrukket udførelsesform for den foreliggende opfindelse er en, flere eller alle aminosyrerester i positionerne (32), (38), (290) og (315) blevet stabiliseret ved substitution eller deletion.
5 Ifølge den foreliggende opfindelse kan Lys i position 32 (ii) og/eller 38 (i) erstattes med en anden aminosyrerest.
Lys(38) kan fortrinsvis erstattes af Thr, Asp, Leu, Gly, Ala, Ser, Asn eller His og Lys(32) kan fortrinsvis erstattes af Gin, Glu, His, Gly, Thr, Ala eller Ser.
10 Også Arg i position 290 (iv) kan erstattes med en anden aminosyrerest, for eksempel Gly, Ala, Ser, Thr eller Lys, fortrinsvis Ser, Ala eller Gly.
Arg(315) (v) kan fortrinsvis erstattes med Gly, Thr, Ala, Ser eller Gin.
15 Endvidere kan Lys(341) (vii) erstattes med Glu, Gin,
Gly, Thr, Ala eller Ser, fortrinsvis Glu eller Gin.
Ud over substitution af de ovenfor nævnte Arg henholdsvis Lys rester med andre aminosyrerester kan fjernelse af Arg eller Lys aminosyreresterne også overvejes for at 20 forhindre proteolytisk spaltning. Endvidere kan en eller flere af aminosyreresterne på enten den N- eller C-terminale side af sådanne Arg eller Lys erstattes af en anden aminosyrerest, der har en stabiliserende virkning på den proteolytisk følsomme peptidbinding. Et eksempel på sådanne modifikationer er 25 substitution af aminosyreresten forbundet med den C-terminale ende af en Lys eller Arg rest med Pro.
For at undgå proteolytisk spaltning ved position 42 (xi) og 44 (xii), kan Ile(42) og/eller Tyr(44) erstattes med Asn, Ser, Ala eller Gin.
30 Den foreliggende opfindelse tænkes at dække en hvilken som helst kombination af de ovenfor nævnte substitutioner og deletioner.
Andre aspekter af opfindelsen vil blive forklaret i den følgende detaljerede beskrivelse med tegning.
35 Figur 1 viser aminosyresekvensen angivet med enkeltbogstavsforkortelser og den foreløbige struktur for faktor VII, 8
DK 161097 B
Figur 2 viser konstruktionen af plasmid pFW10-3/6,
Figur 3 viser konstruktionen af plasmid pFW60-3/6 og
Figur 4 viser konstruktionen af plasmid pFWx-3/6.
Definitioner 5 Inden opfindelsen skal beskrives, kan det være en hjælp for forståelsen deraf, at visse udtryk, som anvendes i det følgende, defineres.
Komplementær DNA eller cDNA; Et DNA molekyle eller sekvens, som er blevet syntetiseret enzymatiskt fra se-10 kvenserne i en mRNA templat eller en klon af et sådant molekyle.
DNA-konstruktion: Et DNA molekyle eller en klon af et sådant molekyle, enten enkelt- eller dobbeltstrenget, som kan isoleres i partiel form fra et naturligt forekommende gen, 15 eller som er blevet modificeret til at indeholde DNA-segmenter, som er kombineret og forbundet på en måde, som ellers ikke ville forekomme i naturen.
Plasmid eller vektor: DNA konstruktion indeholdende genetisk information, som kan sørge for dens replikation, når 20 den indsættes i en værtscelle. Et plasmid indeholder almindeligvis mindst en gensekvens, der skal udtrykkes i værtscellen, så vel som sekvenser, der koder for funktioner, som letter en sådan genekspression, herunder promotorer og transkriptionsinitieringssteder. Det kan være et lineært eller 25 lukket cirkulært molekyle. Som det anvendes her, skal udtrykket ekspressionsvektor betegne et plasmid eller en vektor indeholdende en transkriptionspromoter og -terminator, der er funktionelt forbundet med en DNA sekvens, der koder for et protein eller en polypeptid af interesse. Ekspressionsvektorer 30 kan endvidere indeholde andre elementer herunder selektionsmarkører, transkriptionsforstærkende sekvenser, polyadenyleringssignaler etc., som delvist bliver bestemt af den særlige værtscelle, der er valgt.
9
DK 161097 B
Biologisk aktivitet: En funktion eller et sæt af funktioner, der udføres af et molekyle i en biologisk sammenhæng (d.v.s. i en organisme eller et in vitro faksimile). Proteiners biologiske aktiviteter kan opdeles i katalytiske og 5 effektoraktiviteter. Størkningsfaktorers katalytiske aktiviteter involverer ofte aktivering af andre faktorer ved specifik spaltning af precursorer. Ef fektoraktiviteter omfatter specifik binding af det biologisk aktive molekyle til kalcium eller andre små molekyler, til makromolekyler eller til celler.
10 Effektoraktivitet forøger hyppigt eller er væsentlig for katalytisk aktivitet under fysiologiske betingelser.
Katalytiske og effektoraktiviteter kan i nogle tilfælde være tilknyttet det samme domæne i et protein.
For faktor Vila er biologisk aktivitet kendetegnet 15 ved at være bindeled til blodkoagulering ad den extrinsikke bane. Faktor Vila aktiverer faktor X til faktor Xa, som igen omdanner prothrombin til thrombin og derved igangsætter dannelsen af en fibrinprop.
Det modificerede faktor Vila ifølge den foreliggende 20 opfindelse har en biologisk aktivitet, som i det væsentlige er den samme som hos nativt faktor Vila.
Udtrykket "faktor VII/VIIa", som det anvendes i denne ansøgning betegner et produkt, der består af enten den uaktiverede form (faktor VII) eller den aktiverede form (faktor 25 Vila) eller blandinger deraf. "Modificeret faktor VII/VIIa" skal betegne et biologisk aktivt molekyle afledt fra faktor VII/VIIa ved substitution eller deletion af en eller flere aminosyrerester.
Eftersom modifikationerne ifølge den foreliggende 30 opfindelse udføres på genekspressionsniveau, vil der i det aktiverede produkt (faktor Vila) også kunne findes modifikationer indført i faktor VII molekylet.
"Faktor VII/VIIa" indenfor den nævnte definition omfatter proteiner, som har aminosyresekvensen for nativt human 35 faktor VII/VIIa. Det omfatter også proteiner med en let modificeret aminosyresekvens for eksempel en modificeret N-terminal ende herunder N-terminale aminosyredeletioner eller
DK 161097B
10 additioner, så længe som disse proteiner i det væsentlige bibeholder faktor Vila aktivitet.
"Faktor VII" omfatter inden for den nævnte definition også naturlige alleliske varianter, som måtte findes og 5 forekomme fra individ til individ. Også grad og placering af glycosylering eller andre posttranslationsmodifikationer kan variere afhængigt af de valgte værtsceller og egenskaberne hos værtscelleomgivelserne.
Det her anvendte nummereringssystem for amino-10 syresekvensen af faktor VII/VIIa fremgår af figur 1, hvor den N-terminale alanin har nummer 1 og den C-terminale prolin har nummer 406.
Trebogstavs- og enkeltbogstavsforkortelserne, der er anvendt for aminosyrerne, er dem, der normalt anvendes inden 15 for dette område, d.v.s.:
Aminosyre Trebogstavs- Etbogstavs-
forkortelse forkortelse Alanin Ala A
Cystein Cys C
20 Asparatat Asp D
Glutamat Glu E
Phenylalanin Phe F
Glycin Gly G
Histidin His H
25 Isoleucin Ile I
Lysin Lys K
Leucin Leu L
Methionin Met M
Asparagin Asn N
30 Prolin Pro P
Glutamin Gin Q
Arginin Arg R
Serin Ser S
Threonin Thr T
35 Valin Val V
Tryptophan Trp W
11
DK 161097 B
Tyrosin Tyr Y
7-carboxyglutaminsyre Gla 7
Aminosyreændringerne indføres fortrinsvis ved oligonucleotidrettet stedsspecifik mutagenese i faktor VII 5 cDNA. Efter screening af E. coli celler isoleres det muterede faktor VII gen og reklones i en egnet ekspressionsvektor. Ekspressionsvektoren transficeres derpå til en passende værtscelle, som ved dyrkning i et egnet dyrkningsmedium udtrykker og secernerer det modificerede faktor VII, som efter 10 udvinding fra dyrkningsmediet omdannes til den tilsvarende modificerede faktor Vila ved hjælp af kendt teknik.
Forskellige værtsceller kan anvendes herunder mammale celler, gær og andre svampe og bakterier. Imidlertid foretrækkes mammale celler. En særligt foretrukket mammal 15 cellelinie er BHK cellelinien tk‘tsl3 (Waechter og Basserga, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 79: 1106-1110, 1982). Fremgangsmåder til ekspression af klonede gener i hver af disse værtstyper er kendt teknik, se f.eks. EP offentliggjort patentansøgning nr. 200.421 (ekspression af faktor VII og IX i mammale celler), 20 EP publiceret patentansøgning nr. 191.606 (ekspression af protein C i bakterielle celler) og EP publiceret patentansøgning nr. 167.420 (ekspression af faktor IX i gær).
Til udtrykkelse af modificeret faktor VII ifølge opfindelsen i dyrkede mammale celler indføres ekspressions-25 vektorer indeholdende klonede modificerede faktor VII sekvenser i cellerne ved passende transfektionsteknik, såsom kalciumphosphatmedieret transfektion (Graham og Van der Eb, Virology 52: 456-467, 1973; som modificeret af Wigler et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77: 3567-3570, 1980). Elektro- 30 poreringstransfektionsteknik kan også anvendes (Neuman et al., EMBO.J. 1: 841-845, 1982). Et DNA-kalciumphosphatprecipitat dannes, og dette precipitat tilsættes cellerne. En del af cellerne optager DNA og beholder det i cellen i adskillige dage. En lille del af cellerne integrerer DNA i værtscellens 35 genom. Disse integranter identificeres ved cotransfektion med et gen, som giver en selekterbar fenotype (en selekterbar markør). En foretrukket selekterbar markør er 12
DK 161097 B
musedihydrofolatreduktasegenet (DHFR), som giver cellulær modstandskraft over for lægemidlet methotrexat (MTX). Efter at værtscellerne har optaget DNA, anvendes lægemiddelselektion for at udvælge en cellepopulation, som udtrykker den selekterbare 5 markør på stabil måde.
Modificeret faktor VII fremstillet af de trans-ficerede celler kan fjernes fra cellekulturmediet ved adsorption til bariumcitrat. Brugt medium blandes med natriumcitrat og bariumchlorid og bundfaldet opsamles. Det udfældede 10 materiale kan derpå analyseres for tilstedeværelsen af den passende størkningsfaktor. Yderligere oprensning kan foretages ved immunoadsorption. Det foretrækkes, at immunoad-sorptionssøjlen omfatter et høj specifikt monoklonalt antistof. Alternativt kan oprensning af det bariumcitratudfældede 15 materiale udføres ved hjælp af mere konventionelle biokemiske metoder eller ved high-performance liquid chromatography (HPLC).
Omdannelse af enkeltkædet modificeret faktor VII til aktivt dobbeltkædet modificeret faktor Vila kan opnås ved 20 anvendelse af faktor Xlla, som beskrevet af Hedner and Kisiel (J.Clin.Invest. 71: 1836-1841, 1983), eller med andre prote-aser med trypsinlignende specificitet (Kisiel og Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29-42, 1983). Alternativt kan modificeret faktor VII aktiveres ved at føre det gennem en ion-25 bytterchromatografisøjle, såsom mono Q® (Pharmacia Fine Chemicals) eller lignende (Bjoern et al., Research Disclosures, 269, September 1986, pp. 564-565).
EKSEMPLER
Materialer og metoder 30 Restriktionsenzymer var fra Bethesda Research
Laboratories (BRL), New England Biolabs, og Stratagene og blev anvendt i overensstemmelse med producentens anvisninger, medmindre andet er angivet. Oligonucleotider blev syntetiseret på en automatisk DNA-syntesemaskine under anvendelse af 13
DK 161097 B
phosphoramiditkemi på et reguleret poreglasunderlag (S.L. Beaucage og M.H. Caruthers (1981) Tetrahedron Letters 22, 1859 - 1869). E. coli celler blev transformeret som beskrevet af Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold 5 Spring Harbour Laboratory, 1982).
En repræsentativ modificeret faktor VII blev fremstillet ved ændring af aminosyre nr. 32 fra Lys —> Gin og aminosyre nr. 38 fra Lys —> Thr ved oligonucleotidrettet mutagenese.
10 Oligonucleotiderne med disse ændringer har se kvenserne : I) Bglll Lys(32) cDNA: ... ... GAG ... ... AAG ... ... ...
i i 15 oligonucleotid: 5' GCC CGG GAA ATC TTC CAG GAC GCG GAG 3' t t nucleotidposition 228 235
Glu Gin som er en 27-mer med ændringer ved nucleotidposition 228, som 20 ødelægger et Bglll site uden at ændre aminosyren, og ved position 235, som ændrer aminosyren Lys(32) til Gin.
II) Lys(38) cDNA ......AAG............
25 oligonucleotid: 5' AGG ACG ACG CTG TTC TGG ATT 3' t nucleotidposition 254
Thr som er en 21-mer med ændringer ved nucleotidposition 254, der 30 ændrer aminosyren Lys(38) til Thr.
En yderligere repræsentativ modificeret faktor VII blev fremstillet ved ændring af aminosyre nr. 290 fra Arg —> Ser og aminosyre nr. 315 fra Arg —> Ser ved oligonucleotidrettet mutagenese.
35 Oligonucleotider med disse ændringer har sekvenserne: DK 161097 El· 14 (XII) Arg CDNA .........CGT..............
4- .
oligonucleotid: 5' GCTG CTG GAC AGT GGC GCC ACG GCC CT
5 t nucleotidposition 1009
Ser som er en 27-mer med ændringer ved nucleotidposition 1009, der ændrer aminosyren Arg (290) til Ser.
10 (IV) Arg CDNA ..........CGG.............
i 4-
oligonucleotid: 5' GCAG CAG TCA AGT AAG GTG GGA GAC T
ΐ t 15 nucleotidposition 1084 1086
Ser som er en 26-mer med ændringer ved nucleotidposition 1084 og 1086, der ændrer aminosyre Arg(315) til Ser.
Eksempel 1 20 Fremstilling af en modificeret faktor Vila, hvori
Lys(32) er erstattet med Gin (faktor Vila(Gin(32))).
Rekloning af faktor VII cDNA
Faktor VII cDNA med en 38 aminosyrer lang leader * (Berkner, K.L. et al., Cold Spring Harbour Symposium on 25 Quantitative Biology, vol. LI, 531-541, 1986) blev klonet i EcoRI site i pGEM3 vektor (Promega Biotec) og opformeret i E. coli MC 1061 (dam+) eller MC 1000 (dam‘) bakteriestamme.
Kort sagt blev plasmid FVII (565 + 2463)/pDX skåret med EcoRI og faktor VII cDNA blev ligeret til EcoRI skåret 30 pGEM3. Konstruktionen af plasmid FVII(565 + 2463)/pDX er beskrevet i EP patentansøgning nr. 86302855.1. Plasmidet er også deponeret ved American Type Culture Collection (ATTC nr. 40205).
DNA præparater i lille og stor målestok blev 35 fremstillet som beskrevet i for eksempel Maniat is et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour 15
DK 161097 B
1982. Et af disse plasmidpræparater betegnes pFW 10-3/6. Konstruktionen af pFW 10-3/6 er vist i fig. 2.
Tilsætning af 5' phosphatgrupper til oligonucleotider
Tilsætning af enten mærkede eller umærkede phos-5 phatgrupper til oligonucleotider blev udført som beskrevet (Maniatis et al., som ovenfor).
Oligonucleotidrettet stedsspecifik mutagenese under anvendelse af dobbeltstrenget plasmid DNA
Den stedsrettede mutagenesereaktion blev udført ved 10 at modificere metoden af Morinaga et al. 1984 (BIO/TECHNOLOGY vol. 2, p. 636). Plasmid pFW10-3/6 indeholdende FVII cDNA blev nedbrudt med Bgll, et unikt sted i plasmidet. Denne spaltning frembragte fragment a) vist i fig. 3 og fig. 4 og ødelægger ampicillinresistensen. Fragment a) blev oprenset ved 15 elektroeluering fra agarosegel og behandlet med kalvetarms alkalisk phosphatase (CIAP) som beskrevet i Maniatis et al.f som ovenfor.
En anden prøve af pFW 10-3/6 blev nedbrudt med BssHII og SacII dannende fragment b) i fig. 3 med et vindue på 575 bp 20 i FVII cDNA. Fragment b) blev oprenset ved elektroeluering fra agarosegel efter elektroforese.
Fragmenterne a) og b) blev yderligere oprenset ved adskillige phenolekstraktioner, phenol/chloroform (1:1, v/v) og chloroform/isoamylalkohol (24:1, v/v) ekstraktioner, 25 udfældet med 0,3 M Na-acetat og 70% (v/v) ethanol og opløst i TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7,6).
Derpå blev 0,1 - 0,15 pmol af både fragment a) og b) blandet med 25 pmol af det phosphorylerede syntetiske oligonucleotid I) i et Eppendorf-rør.
30 Derpå blev 10 μΐ 5Xpolymerase-ligase puffer (0,5 M
NaCl, 33 mM Tris HCl pH 7,5, 40 mM MgCl2, 5 mM 2-ME) tilsat.
Fra slutblandingen blev 15 μΐ prøver udtaget og opbevaret på is til senere anvendelse som markør i gelelek-troforese. Restblandingen blev inkuberet i et kogende vandbad 35 i 4 minutter for at denaturere DNA fragmenterne. Efter inkubering blev blandingen gradvist nedkølet. Ved genbasepar-
DK 161097 B
16 ring dannedes heteroduplekser og under anvendelse af agarose-gelelektroforese påvistes dannelsen af en ny cirkulær DNA med den korrekte mutation ved sammenligning med den før omtalte uopvarmede prøve.
5 Derpå tilsattes 10 μΐ af de fire deoxyribonucleo- sidtriphosphater (2,5 mM hver), 3 μΐ 20 mM ATP, 1 /il Klenow-fragment af DNA polymerase I (5 U//xl) og 1 μΐ T4 DNA ligase (10 ϋ/μΐ) blev tilsat blandingen (20 μΐ) af heteroduplekser (slutvolumen 40 μΐ). Den resulterende blanding blev inkuberet 10 ved 12°C natten over.
Transformation af E. coli MC 1061 og MC 1000 med inkubationsblandingen resulterede i ampicillinresistente transformanter. Transforraanter, der bærer det muterede FVII
gen blev selekteret ved kolonihybridisering (Maniatis et al.) 32 15 med 5'- P-mærket 27-mer og 21-mer syntetiske oligonucleotid-er.
Efter retransformation blev plasmid DNA oprenset fra udvalgte kolonier, analyseret og sekvensbestemt (efter Maxam-Gilbert metoden og dideoxymetoden) for at verificere den af det 20 syntetiske oligonucleotid forårsagede mutation.
Konstruktionen af plasmid pFW 60-3/6, der indeholder et muteret faktor VII gen, hvori Lys(32) er blevet erstattet med Gin er vist i fig. 3.
pFW 60-3/6 blev nedbrudt med EcoRI og EcoRI-EcoRI 25 faktor VII fragmentet blev ligeret i EcoRI skåret pDX plasmid for at opnå plasmid pFW 78-3/6 indeholdende faktor VII-(Gln(32)) genet i samme orientering som i plasmid FVII(565 + 2463)/pDX. Plasmid pFW 78-3/6 blev derpå transficeret i BHKtk' tsl3 celler, idet den ovenfor generelle fremgangsmåde fulgtes.
30 Den af cellerne fremstillede modificerede faktor VII
udfældes derpå med barium citrat; oprenses ved immuno-adsorption; og aktiveres til modificeret faktor Vila ved at føre den gennem en ionbytterkromatograferingssøjle som beskrevet af Bj oern et al., supra.
35 Aktivitetstest
Ligesom aktiveret naturlig faktor Vila forkortede den aktiverede modificerede faktor Vila koaguleringsperioden i et 17
DK 161097 B
enkelttrinsstørkningsassay. Den aktiverede modificerede faktor Vila blev inkuberet ved en koncentration på ca. 0,9 mg/ml i en 10 mM Tris-HCl puffer ved pH 8,5 omfattende 390 mM NaCl og 5 mM EDTA. Nedbrydningen blev fulgt ved SDS-PAGE af reducerede 5 prøver, og da en væsentlig nedbrydning havde fundet sted, blev en portion udtaget og sat til en HPLC søjle. Den præparative kromatografi tjente hovedsageligt til at fjerne Tris fra prøven til aminosyresekvensbestemmelse, da intakt og nedbrudt modificeret faktor Vila koeluerede fra søjlen. N-terminal 10 aminosyresekvensbestemmelse afslørede, at der ikke var foregået hydrolyse af peptidbindingen mellem glutaminresten nr. 32 og asparaginsyreresten nr. 33. Derimod iagttoges kraftig nedbrydning ved lysinrest nr. 32, når aktiveret nativ faktor Vila blev udsat for den samme behandling og analyse i en 15 parallel undersøgelse.
Eksempel 2
Fremstilling af en modificeret faktor Vila hvori Lys(38) er erstattet med Thr (faktor VIIa(Thr 38))
Ved at følge fremgangsmåden fra eksempel 1 blot med 20 undtagelse af, at det syntetiske oligonucleotid II) anvendtes i stedet for I), fremkom et udtrykkelsesplasmid indeholdende det muterede faktor VII gen.
Dette plasmid transficeres derpå til BHKtk‘tsl3 celler og faktor VII(Thr38) udvindes fra cellesupernatanten og 25 aktiveres til faktor VIIa(Thr38) som beskrevet.
Eksempel 3
Fremstilling af en modificeret faktor Vila hvori Lys(32) og Lys(38) er erstattet med henholdsvis Gin og Thr (faktor Vila (Gln32, Thr38)) 30 Ved at følge fremgangsmåden fra eksempel 1 med undtagelse af, at 12,5 pmol af både oligonucleotid I) og II) 18
DK 161097 B
anvendes i den stedsrettede mutagenesereaktion, opnåede man et udtrykkelsesplasmid indeholdende det muterede faktor VII gen.
Dette plasmid transficeres derpå til BHKtk'tsl3 celler, og faktor VII (Gln32, Thr38) udvindes fra cellesupernatanten og 5 aktiveres til faktor Vila (Gln32, Thr38) som beskrevet.
Eksempel 4
Fremstilling af en modificeret faktor Vila hvori Arg(290) er erstattet med Ser (faktor Vlla(Ser(290))
Konstruktionen af plasmid pFW A-3/6 indeholdende et 10 muteret faktor VII gen hvori Arg(290) er erstattet med Ser er vist i fig. 4.
Plasmid pFW 10-3/6 anvendtes til fremstilling af fragment a) fra eksempel 1, og en anden prøve af pFW 10-3/6 blev nedbrudt med SacII og Drain dannende fragment b) i fig.
15 4 med et vindue på 1366 i FVII cDNA.
Fragmenterne b) og a) blev derpå behandlet som beskrevet i eksempel 1 med undtagelse af anvendelsen af oligonucleotid III) i stedet for I).
pFW A-3/6 blev nedbrudt med EcoRI og EcoRI-EcoRI 20 faktor VII fragmentet blev ligeret i EcoRI skåret pDx plasmid til opnåelse af plasmid pFW X-3/6 indeholdende faktor VII(Ser290) genet med samme orientering som i plasmid FVII(565 + 2463)/pDX. Plasmid pFW X-3/6 blev derpå transficeet i BHKtk' tsl3 celler, idet den ovenfor beskrevne generelle procedure 25 fulgtes.
Den modificerede faktor VII fremstillet af cellerne udfældes derpå med bariumcitrat, oprenses ved immunoadsorption og aktiveres til modificeret faktor Vila ved at føre det gennem en ionbytterkromatografisøjle som beskrevet af Bjørn et al., 30 supra.
Eksempel 5
Fremstilling af en modificeret faktor Vila hvori Arg(315) er erstattet med Ser (faktor VIIa(Ser315))
DK 161097 B
”•9
Ved at følge fremgangsmåden i eksempel 4 med undtagelse af, at det syntetiske oligonucleotid IV) anvendtes i stedet for III) fremkom et ekspressionsplasmid indeholdende det muterede faktor VII gen.
5 Dette plasmid transficeres derpå til BHKtk'tsl3 celler og faktor VII(Ser315) udvindes fra cellesupernatanten og aktiveres til faktor VIIa(Ser315) som beskrevet.
Eksempel 6
Bestemmelse af tre aktive proteolytiske spaltnings- 10 steder
For at identificere nogle aktive spaltningssteder blev et kraftigt nedbrudt rekorabinant faktor VII præparat underkastet N-terminal sekvensanalyse ved automatisk Edman nedbrydning, idet der anvendtes et Applied Biosystems model 15 470 A gasfasesekvensbestemmelsesapparat. Resultaterne er vist i tabel I.
DK 161097 B
20 Φ -Ρ •P . .
>i lo n co η m φ Ό lo ^ ^ σι co o φ r·*
Λ « co n Η H co · h o lo cover·* · CM
φ — <# η Η ·ΐ n n f! vf Η π η n o (5 ^
Ρ Η Η H
O P
g Φ • ^ 52 (0 w * fi • * * d« * — Φ
Cd W H >i ft P OClIkS Ρ .p Φ Φ Cd >
I >i (d Η Φ Φ ^ OlHXlH >οΦΛ>ιΗ X
Μ η! > 0 i< CO E-ι g ft O C Φ
Ed CM tø ft \ Η Φ — fi >
φ -H
p Φ
•P
>1 VO CM CO VO CM «tf O VO CTl LO CM r* M1 o O
ja o co co co ve lo "3* co co cm cm vo o r~ -P
Φ — 0* CM H CM H CM H CM CM H CM CO CM
JDH Φ O Φ g • Λ cd ^
• d< P
cd ^idPtdø PP-PHa fid O S' Φ I Η Η X) Η Φ Η Φ Φ cd φ Μ td Ρ Ρ g te ο < e-ι < ρ ø ρ s > pi c >ft << g
Ed O
ft * Φ
P
O
φ <H
P
-P · · g >i vo co co o vo ιο φ o io r·* o φ «tf co «tf φ Λ ιο co cm co co co · σι h «tf o* · o σι φ
Φ — Γ^ΗΗΟ*σ> co G vo co νο VO G VO CO
Ρ Η Η Η * Ο Ρ g φ • ft -Ρ cd ω • de d« — —de φ cd φη ^>10 η ω ο ω >< ρ w ο a c Ρ I Η ΓΟ Η Η Ϊ>1 f0 ί>-ι Ρ toH Η £>ι Ρ Ρ Η φ Μ H>ØØP >OftPØ 0 Ο ft Ed 0 Ρ
Ed CM CM Kd ft \ \ w
rd Η O
^ P
•H
Φ g •p td -p >t CO f"* H CO CO h M1 CM O CO ·Μ"ΰΟΐΗΙΟ Φ
Λ OlOlvflOH OUJlrlOl· t> · C" CO VO φ G
Φ — tO «tf CO «tf CM CO CO «tf CM CM C CO CP W
pH c c Ο «
g g P -P
. pi Φ g td — φ ρ Φ
• dc — Η Φ -P
<d 3Φ&ΦΡ ρ p ft >o ft etnedPP td η ω I ΦΛΡΗΦ >ι Φ tø H tø Η >ιΗ Φ Φ -P >t Φ ffi P ft Ed H CO EdCOriJØKi: ØUCcoco 0 tø Λ
Ed CM -Ρ Ο ft \ υ φ H fi >i
— φ Η X
• Q 0 Η Ρ c Η tø Η Ρ Η cm co «tf ιο vo r·* co σι ο Η cm co «tf ιο φ Η Η Η Η Η Η Η -—· · Λ X — ·* φ
Cd >1 de de ·
Ed α *- c ΙΟ ο ΙΟ ο
Π CM
Claims (8)
- 5 PATENTKRAV
- 1. Modificeret faktor VII/VIIa, kendetegnet ved, at en, flere eller alle lysin-, arginin-, isoleucin- og tyros inresterne (i) Lys(38) 10 (ii) Lys(32) (iii) Lys(143) (iv) Arg(290) (v) Arg(315) (vi) Lys(316) 15 (vii) Lys(341) (viii) Arg(392) (ix) Arg(396) (x) Arg(402) (xi) Ile(42) 20 (xii) Tyr(44) er erstattet og/eller fjernet, idet fortrinsvis en, flere eller alle aminosyreresterne (i), (ii), (iv) og (v) er erstattet eller fjernet.
- 2. Modificeret faktor VII/VIIa ifølge krav 1, k e n -25detegnet ved, at Lys (38) er erstattet med Thr, Asp, Leu, Gly, Ala, Ser, Asn eller His, fortrinsvis Ser, Ala, Gly eller Thr; og/eller at Lys(32) er erstattet med Gin, Glu, His, Gly, Thr, Ala eller Ser, fortrinsvis Gin; og/eller at Arg(290) er erstattet med Gly, Ala, Ser, Thr eller Lys; og/eller at 30 Arg(315) er erstattet med Gly, Thr, Ser, Ala eller Gin; DK 161097 B og/eller at Lys(341) er erstattet med Glu, Gin, Thr, Ser, Ala eller Gly, fortrinsvis Glu eller Gin; og/eller at Ile(42) er erstattet med Asn, Ser, Ala eller Gin; og/eller at Tyr(44) er erstattet med Asn, Ser, Ala eller Gin.
- 53. Modificeret faktor VII/VIIa ifølge krav l eller 2, kendetegnet ved, at Lys(38) er erstattet med Thr, og Lys(32) er erstattet med Gin.
- 4. DNA-sekvenser, kendetegnet ved, at de koder for en modificeret faktor VII/VIIa ifølge et hvilket som 10 helst af kravene l til 3.
- 5. Ekspressionsvektorer, kendetegnet ved, at de indeholder en DNA-sekvens ifølge krav 4.
- 6. Celler, kendetegnet ved, at de er transformeret til at fremstille modificeret faktor VII/VIIa 15 ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3.
- 7. Fremgangsmåde til fremstilling af modificeret faktor VII/VIIa, kendetegnet ved, at et gen, der koder for ekspressionen af faktor VII, muteres i en, flere eller alle de kodoner, der er ansvarlige for udtrykkeisen af lysin-, arginin- 20. isoleucin- og tyrosinresterne (i) Lys(38) (ii) Lys(32) (iii) Lys(143) (iv) Arg(290) 25 (v) Arg(315) (vi) Lys(316) (vii) Lys(341) (viii) Arg(392) (ix) Arg(396) 30 (x) Arg(402) (xi) Ile(42) (xii) Tyr(44) DK 161097 B i nativt faktor Vil, dannende et muteret gen, der er i stand til at udtrykke en modificeret faktor VII, i hvilken en, flere eller alle nævnte aminosyrerester er substitueret eller fjernet, det muterede gen indsættes i en egnet vært, der er i 5 stand til at udtrykke det muterede gen, værten dyrkes i et hensigtsmæssigt dyrkningsmedium, hvorved det modificerede faktor VII/VIIa udtrykkes, som derpå isoleres og eventuelt aktiveres til dannelse af et modificeret faktor Vila produkt.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK653989A DK161097C (da) | 1987-06-25 | 1989-12-21 | Modificeret faktor vii/viia, dna-sekvens, som koder herfor, ekspressionsvektor indeholdende en saadan dna-sekvens, celle, der er transformeret med en saadan vektor og fremgangsmaade til fremstilling af modificeret faktor vii/viia |
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK323587 | 1987-06-25 | ||
| DK323587A DK323587D0 (da) | 1987-06-25 | 1987-06-25 | Protein |
| DK8800103 | 1988-06-24 | ||
| PCT/DK1988/000103 WO1988010295A1 (en) | 1987-06-25 | 1988-06-24 | MODIFIED FACTOR VII/VIIa |
| DK653989A DK161097C (da) | 1987-06-25 | 1989-12-21 | Modificeret faktor vii/viia, dna-sekvens, som koder herfor, ekspressionsvektor indeholdende en saadan dna-sekvens, celle, der er transformeret med en saadan vektor og fremgangsmaade til fremstilling af modificeret faktor vii/viia |
| DK653989 | 1989-12-21 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK653989D0 DK653989D0 (da) | 1989-12-21 |
| DK653989A DK653989A (da) | 1989-12-21 |
| DK161097B true DK161097B (da) | 1991-05-27 |
| DK161097C DK161097C (da) | 1991-11-11 |
Family
ID=8120606
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK323587A DK323587D0 (da) | 1986-11-03 | 1987-06-25 | Protein |
| DK653989A DK161097C (da) | 1987-06-25 | 1989-12-21 | Modificeret faktor vii/viia, dna-sekvens, som koder herfor, ekspressionsvektor indeholdende en saadan dna-sekvens, celle, der er transformeret med en saadan vektor og fremgangsmaade til fremstilling af modificeret faktor vii/viia |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK323587A DK323587D0 (da) | 1986-11-03 | 1987-06-25 | Protein |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0370036B1 (da) |
| JP (1) | JPH03500963A (da) |
| AT (1) | ATE76900T1 (da) |
| CA (1) | CA1339815C (da) |
| DE (1) | DE3871798T2 (da) |
| DK (2) | DK323587D0 (da) |
| WO (1) | WO1988010295A1 (da) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5580560A (en) * | 1989-11-13 | 1996-12-03 | Novo Nordisk A/S | Modified factor VII/VIIa |
| ATE163048T1 (de) * | 1989-12-29 | 1998-02-15 | Zymogenetics Inc | Hybrides protein c |
| US5358932A (en) * | 1989-12-29 | 1994-10-25 | Zymogenetics, Inc. | Hybrid protein C |
| JP3330932B2 (ja) * | 1990-01-29 | 2002-10-07 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | 抗凝固剤タンパク質 |
| US7247708B2 (en) | 1997-10-23 | 2007-07-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US6693075B1 (en) | 1997-10-23 | 2004-02-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US6747003B1 (en) | 1997-10-23 | 2004-06-08 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| DE60138364D1 (de) | 2000-02-11 | 2009-05-28 | Bayer Healthcare Llc | Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate |
| US7812132B2 (en) | 2000-04-28 | 2010-10-12 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US7220837B1 (en) | 2000-04-28 | 2007-05-22 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US6905683B2 (en) | 2000-05-03 | 2005-06-14 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Human coagulation factor VII variants |
| US20030211094A1 (en) | 2001-06-26 | 2003-11-13 | Nelsestuen Gary L. | High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides |
| AU8755001A (en) * | 2000-09-13 | 2002-03-26 | Novo Nordisk As | Human coagulation factor vii variants |
| MXPA03001984A (es) * | 2000-09-13 | 2003-08-29 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Variantes de factor vii de coagulacion humano. |
| AU2002218029A1 (en) | 2000-11-09 | 2002-05-21 | The Scripps Research Institute | Modified factor viia |
| MXPA03008590A (es) * | 2001-03-22 | 2003-12-08 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Derivados del factor vii de coagulacion. |
| BR0212818A (pt) * | 2001-09-27 | 2004-10-05 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Polipeptìdeo de fator vii, construção de polionucletìdeo, célula hospedeira, animal transgênico, planta transgênica, método para produzir o polipeptìdeo de fator vii composição farmacêutica, uso de um polipeptìdeo de fator vii, e, método para o tratamento de distúrbios do sangramento em um sujeito ou para o aprimoramento do sistema hemostático normal |
| US7052868B2 (en) | 2001-09-27 | 2006-05-30 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Human coagulation factor VII polypeptides |
| JP2005512524A (ja) * | 2001-11-02 | 2005-05-12 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | ヒト凝固第ｖｉｉ因子ポリペプチド |
| US6960657B2 (en) | 2001-11-02 | 2005-11-01 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Human coagulation factor VII polypeptides |
| SI1499719T1 (sl) | 2002-04-30 | 2011-03-31 | Bayer Healthcare Llc | Polipeptidne variante faktorja VII ali VIIa |
| US6911323B2 (en) | 2002-09-25 | 2005-06-28 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Human coagulation factor VII polypeptides |
| AU2003266931B2 (en) | 2002-09-30 | 2010-01-21 | Bayer Healthcare Llc | FVII or FVIIa variants having increased clotting activity |
| DK1608745T3 (da) | 2003-03-20 | 2009-06-15 | Bayer Healthcare Llc | FVII eller FVIIa-Varianter |
| US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
| NZ573412A (en) | 2003-06-19 | 2010-09-30 | Maxygen Holdings Ltd | Factor VII or VIIa Gla domain variants |
| ES2381110T3 (es) * | 2003-09-09 | 2012-05-23 | Novo Nordisk Health Care Ag | Polipéptidos de factor VII de coagulación |
| US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
| ATE469216T1 (de) | 2004-08-17 | 2010-06-15 | Csl Behring Gmbh | Modifizierte vitamin-k-abhängige polypeptide |
| EP1891231A4 (en) | 2005-05-25 | 2011-06-22 | Novo Nordisk As | GLYCOPEGYLATED FACTOR IX |
| BRPI0810172A2 (pt) | 2007-04-13 | 2014-10-14 | Catalyst Biosciences Inc | Polipeptídeos de fator vii modificado e seus usos |
| WO2008154639A2 (en) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Neose Technologies, Inc. | Improved process for the production of nucleotide sugars |
| FR2917414B1 (fr) * | 2007-06-15 | 2012-07-13 | Lab Francais Du Fractionnement | Facteur vii/viia humain modifie et composition pharmaceutique contenant celui-ci |
| TWI465247B (zh) | 2008-04-11 | 2014-12-21 | Catalyst Biosciences Inc | 經修飾的因子ｖｉｉ多肽和其用途 |
| KR102170375B1 (ko) | 2009-06-09 | 2020-10-27 | 프로롱 파마슈티컬스, 엘엘씨 | 헤모글로빈 조성물 |
| WO2021030787A1 (en) | 2019-08-15 | 2021-02-18 | Catalyst Biosciences, Inc. | Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration and on-demand treatment |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2461040A1 (fr) * | 1979-07-09 | 1981-01-30 | Inst Textile De France | Procede et dispositif pour l'obtention d'un fil presentant sur sa longueur des zones de torsion alternativement de sens inverse |
| US4753879A (en) * | 1984-08-27 | 1988-06-28 | Biogen N.V. | Modified tissue plasminogen activators |
| EP0201153A3 (en) * | 1985-02-09 | 1987-10-07 | Beecham Group Plc | Modified enzyme and process for its preparation |
| GR860984B (en) * | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
| DK43387A (da) * | 1986-01-29 | 1987-07-30 | Beecham Group Plc | Fibrinolytisk enzym |
-
1987
- 1987-06-25 DK DK323587A patent/DK323587D0/da not_active Application Discontinuation
-
1988
- 1988-06-24 WO PCT/DK1988/000103 patent/WO1988010295A1/en not_active Ceased
- 1988-06-24 JP JP63505496A patent/JPH03500963A/ja active Pending
- 1988-06-24 DE DE8888905735T patent/DE3871798T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-06-24 EP EP88905735A patent/EP0370036B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-06-24 AT AT88905735T patent/ATE76900T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-06-27 CA CA000570535A patent/CA1339815C/en not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-12-21 DK DK653989A patent/DK161097C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03500963A (ja) | 1991-03-07 |
| CA1339815C (en) | 1998-04-14 |
| DK161097C (da) | 1991-11-11 |
| DK653989D0 (da) | 1989-12-21 |
| ATE76900T1 (de) | 1992-06-15 |
| DK323587D0 (da) | 1987-06-25 |
| EP0370036A1 (en) | 1990-05-30 |
| DE3871798T2 (de) | 1993-05-13 |
| EP0370036B1 (en) | 1992-06-03 |
| DE3871798D1 (de) | 1992-07-09 |
| DK653989A (da) | 1989-12-21 |
| WO1988010295A1 (en) | 1988-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK161097B (da) | Modificeret faktor vii/viia, dna-sekvens, som koder herfor, ekspressionsvektor indeholdende en saadan dna-sekvens, celle, der er transformeret med en saadan vektor og fremgangsmaade til fremstilling af modificeret faktor vii/viia | |
| US5580560A (en) | Modified factor VII/VIIa | |
| JP4317976B2 (ja) | 修飾されたプロテアーゼ切断部位を有するｘ因子類似体 | |
| ES2346072T3 (es) | Polipeptidos modificados dependientes de la vitamina k. | |
| AU2010290077C1 (en) | Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same | |
| KR101273229B1 (ko) | 변형된 활성화 특성을 갖는 응고 인자 ｘ 폴리펩타이드 | |
| KR20080107385A (ko) | 변형된 활성화 특성을 갖는 응고 인자 ｘ 폴리펩타이드 | |
| HUT61592A (en) | Process for producing deoxyribonucleic acid molecules and vectors for expressing zymogen forms of human c protein | |
| CA2071630C (en) | Hybrid protein c | |
| KR101574042B1 (ko) | 지혈을 조절하기 위한 조성물 및 방법 | |
| JP3043403B2 (ja) | ヒトプラスミノーゲン変異体を発現させる方法及びその原料 | |
| AU6280700A (en) | Factor x analog with an improved ability to be activated | |
| US8017750B2 (en) | Haemocoagulase | |
| HUP0102444A2 (hu) | Protein-C származékok | |
| FI114102B (fi) | Menetelmä trombiinin vaikutuksesta pilkkoutuvan plasminogeenianalogin valmistamiseksi | |
| HK1165443A (en) | Compositions and methods for modulating hemostasis | |
| HK1165444B (en) | Compositions and methods for modulating hemostasis | |
| HK1165446A (en) | Compositions and methods for modulating hemostasis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PSP | Patent surrendered |