CZ2004427A3

CZ2004427A3 - Polypeptidy lidského koagulačního faktoru VII

Info

Publication number: CZ2004427A3
Application number: CZ2004427A
Authority: CZ
Inventors: Perssonáegon; Olsenáoleáhvisted
Original assignee: Novoánordiskáhealthácareáag
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2002-09-26
Publication date: 2004-08-18
Also published as: BR0212818A; WO2003027147A3; EP1432794A2; ES2376694T3; EP1432794B1; MXPA04002833A; CN1602354A; AU2002333211B2; UA82177C2; ATE532858T1; IL160897A0; ZA200402262B; HUP0500060A2; WO2003027147A2; PL368619A1; CA2461003A1; KR20040039444A; JP2005509413A; RU2004112768A; RU2325401C2

Description

Předmětný vynález se vztahuje na polypeptidy lidského koagulačního faktoru Vila s koagulační aktivitou a rovněž na polynukleotidové útvary kódující tyto polypeptidy, vektory a hostitelské buňky obsahující a exprimující polynukleotid, farmaceutické prostředky, použití a léčebné metody.

Dosavadní stav techniky

Srážlivost krve je proces skládající se z komplexu interakcí různých krevních komponent (nebo faktorů), jenž nakonec vede ke vzniku fibrinové sraženiny. Obecně jsou krevní komponenty, jež se podílejí na procesu označovaném jako koagulační „kaskáda“, enymaticky inaktivní proteiny (proenzymy a zymogeny), které jsou konvertovány na proteolytické enzymy působením aktivátoru (jež sám je aktivovaný srážlivostní faktor). Koagulační faKtory, které prošly takovou konverzí, se obecně uvádějí jako „aktivní faktory“ a označují se přidáním písmena „a“ k názvu koagulačního kaktoru (např. faktor Vila).

Iniciace hemostatického procesu je zprostředkována vznikem komplexu mezi tkáňovým faktorem exponovaným v důsledku zranění cévní stěny a faktoru Vila. Tento komplex pak konvertuje faktory IX a X na jejich aktivní formy. Faktor Xa konvertuje omezená množství protrombinu na trombin na buňkách nesoucích tkáňový faktor. Trombin aktivuje krevní destičky a faktory V a Vlil na faktory Va a Vlila, což oba jsou kofaktory v dalším procesu vedoucím k úplnému trombinovému vzplanutí. Tento proces zahrnuje vytváření faktoru Xa pomocí faktoru IXa (v komplexu s faktorem Vlila) a dochází k němu na povrchu aktivovaných destiček. Trombin nakonec konvertuje fibrinogen na fibrin, což vede ke vzniku fibrinové sraženiny. V posledních letech bylo zjištěno, že faktor VII a tkáňový faktor jsou hlavními iniciátory srážení krve.

Faktor VII je stopový plazmový glykoprotein cirkulující v krvi jako jednořetězcový zymogen. Tento zymogen je katalyticky inaktivní Jednořetězcový faktor VII může být konvertován na dvouřetězcový faktor Vila pomocí faktoru Xa, • · faktoru Xlla, faktoru IXa, faktoru Vila nebo trombinu in vitro. Faktor Xa je předpokládaný hlavní fyziologický aktivátor faktoru VII. Jako mnoho dalších plazmových proteinů zapojených do hemostáze závisí faktor VII svou aktivitou na vitamínu K. Tato aktivita je nutná pro gama-karboxylaci mnohočetných zbytků kyseliny glutamové, seskupených poblíž aminokonce proteinu. Tyto gama-karboxylované glutamové kyseliny jsou nutné pro interakci faktoru VII s fosfolipidy, indukovanou kovovými ionty. Ke konverzi zymogenového faktoru VII na aktivovanou dvouřetězcovou molekulu dochází štěpením vnitřní peptidové vazby Argi52-llei53· V přítomnosti tkáňového faktoru, fosfolipidů a vápenatých iontů dvouřetězcový faktor Vila rychle aktivuje faktor X nebo faktor IX limitovanou proteolýzou.

Často je žádoucí stimulovat nebo zlepšovat koagulační kaskádu subjektu. Faktor Vila se používá k potlačování poruch krvácivosti majících řadu příčin, jako je nedostatečnost srážlivostního faktoru (např. hemofilie A a B nebo nedostatečnost koagulačních faktorů XI nebo VII) nebo inhibitorů srážlivostního faktoru. Faktor Vila je také používán k potlačování nadměrného krvácení vyskytujícího se u subjektů s normálně fungující kaskádou krevní srážlivosti (bez nedostatečnosti srážlivostního faktoru nebo inhibitorů kteréhokoli z koagulačních faktorů). Takové krvácení může být způsobeno například defektní funkcí krevních destiček, trombocytopenií nebo von Willebrandovou nemocí. Krvácivost je též důležitý problém v souvislosti s operacemi a dalšími formami tkáňových poškození.

Evropský patent č. 200421 (ZymoGenetics) se vztahuje k nukleotidové sekvenci kódující lidský faktor VII a rekombinantní expresi faktoru VII v savčích buňkách.

Práce Dickinsona a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1996) 93, 14379-14384) se týká varianty faktoru VII, kde Leu305 je nahrazen Ala (FVII(Ala305)).

Práce Iwananga a kol. (Thromb. Haemost. (supplement August 1999), 466, abstract 1474) se týká varianty faktoru Vila, kde jsou zbytky 316 až 320 vypuštěny nebo jsou zbytky 311 až 322 nahrazeny odpovídajícími zbytky z trypsinu.

Jsou požadovány varianty faktoru Vila majícího koagulační aktivitu, varianty s vysokou aktivitou, jež mohou být podávány v relativně nízkých dávkách, a varianty nevyvolávající nežádoucí vedlejší účinky, jako je buď systemická aktivace koagulačního systému anebo krvácení, provázejícího konvenční terapie.

• · • · · • · · « • · · · · ······· ·

Popis vynálezu

Nově bylo zjištěno, že polypeptidové varianty lidského koagulačního faktoru Vila, kde je aminokyselina Leu305 a nejméně jedna aminokyselina nezávisle zvolená ze skupiny sestávající z Lys157, Lys337, Asp334, Ser336, Val158, Glu296 a Met298 ze SEQ ID NO:1 nahrazena odlišnými aminokyselinami, zvyšují koagulační aktivitu ve srovnání s lidským koagulačním faktorem Vila divokého typu.

Termín „odlišná aminokyselina“ používaný v tomto dokumentu znamená jednu aminokyselinu, odlišnou od aminokyseliny nacházející se přirozeně v dané pozici. Toto zahrnuje, ale neomezuje se na aminokyseliny, jež mohou být kódovány polynukleotidem. Výhodně je odlišná aminokyselina v přirozené L-formě a může být kódována polynukleotidem. Typický příklad je L-cystein (Cys).

Termín „aktivita“ používaný v tomto dokumentu znamená schopnost polypeptidu faktoru VII konvertovat svůj substrát faktor X na aktivní faktor Xa. Aktivita polypeptidu faktoru VII může být měřena „proteolytickým testem in vitro“ (viz Příklad 6).

Termín „vrozená aktivita“ též zahrnuje schopnost vytvářet trombin na povrchu aktivovaných krevních destiček za absence tkáňového faktoru.

Leu305 je lokalizován na konci α-helixu nalezeného v tkáňovém faktorukomplexní formě faktoru Vila, o němž se soudí, že je pro aktivitu důležitý. Ve volném faktoru Vila (faktor Vila nevázaný k tkáňovému faktoru) je helix deformován a tak pravděpodobně nestabilní. Polypeptidová varianta podle předmětného vynálezu zaujímá aktivní konformaci, jež musí být normálně vyvolávána tkáňovým faktorem. Zvýšená aktivita polypeptidové varianty ve srovnání s divokým typem faktoru Vila může být důsledkem stabilizace α-helixu, reorientace helixu nebo nějaké další změny v konformaci. Náhrada Leu305 vyvolá reorientaci anebo stabilizaci helixu.

Aminokyseliny zahrnující Lys157, Lys337, Asp334, Ser336, Vah58, Glu296 a Met298 jsou lokalizovány v oblasti, o níž se soudí, že ovlivňuje vložení aminokonce proteázové domény a tím vznik katalyticky aktivní konformace faktoru Vila, který je závislý na solném můstku mezi koncovou aminoskupinou Ile153 a postranním řetězcem Asp343. Nahrazení mohou odstranit elektrostatické odpuzování, přidat vodíkové vazby nebo jinak usnadnit vložení aminokonce.

V důsledku vyšší zděděné aktivity popsaných polypeptidových variant faktoru Vila ve srovnání s přirozeným FVIIa může být pro dosažení funkčně adekvátní koncentrace v místě působení adekvátní nižší dávka, takže bude možné podávat • · • · nižší dávku subjektu s krvácivou příhodou nebo vyžadujícím zlepšení normálního hemostatického systému.

Předmětnými vynálezci bylo zjištěno, že náhradou aminokyseliny Leu305 v kombinaci s jedním nebo více z následujících zbytků - Lys v poloze 157 a Lys v poloze 337 a Val v poloze 158 a Glu v poloze 296 a Met v poloze 298 a Asp v poloze 334 a Ser v poloze 336 - faktor Vila spontánně zaujímá aktivnější konformaci, jež musí být normálně vyvolávána tkáňovým faktorem. Tato polypeptidová varianta faktoru Vila vykazuje vrozenou aktivitu, jež může být terapeuticky využitelná v situacích, kdy je prokoagulační aktivita nezávislá na tkáňovém faktoru (vznik faktoru Xa na povrchu destičky), jako je tomu tehdy, jsou-li kupříkladu podávány vysoké dávky NovoSeven®.

V další formě další náhrada aminokyselin v proteázové doméně dále usnadňuje vznik aktivní konformace molekuly. Má se za to, že ačkoli nejzřetelnější účinky jsou pozorovány tehdy, jsou-li výše zmíněné mutace provedeny v sousedství (sekvenčně nebo prostorově) těchto posledně zmíněných sedmi aminokyselin.

Vynález dále zahrnuje, že náhrada několika aminokyselin v N-koncové Gla doméně (aminokyselin v poloze odpovídající 1 až 37 SEQ ID NO:1) faktoru Vila, může poskytnout protein s podstatně vyšší afinitou k membránovým fosfolipidům, jako jsou membránové fosfolipidy buněk nesoucích tkáňový faktor nebo destiček, čímž jsou generovány polypeptidové varianty faktoru VII se zvýšeným prokoagulačním účinkem.

Takto také může mít výše zmíněná polypeptidová varianta faktoru Vila, navíc k již provedené záměně aminokyseliny v poloze 305 v kombinaci se záměnami v polohách 157, 158, 296, 298, 334, 336 nebo 337 a volitelnými záměnami kdekoli v proteázové doméně, nahrazenu nejméně jednu aminokyselinu v N-koncové Gla-doméně, čímž se získá protein mající zvýšenou aktivitu stejně jako zvýšenou afinitu k membránovým fosfolipidům ve srovnání s přirozeným faktorem VII. S výhodou mohou být aminokyseliny v polohách 10 a 32 (odpovídající SEQ ID NO:1) faktoru VII nahrazeny jinou aminokyselinou. Příklady výhodných aminokyselin vkládaných do výše zmíněných poloh jsou: Aminokyselina Pro v poloze 10 je nahrazena Glu, Arg, His, Gin, Asn nebo Lys; anebo je aminokyselina Lys v poloze 32 nahrazena Glu, Gin nebo Asn.

• · · • · · · · · • · · · · • · · · « · · ····· · · ·····

Další aminokyseliny z Gla-domény, založené na odlišných fosfolipidových afinitách a sekvencích plazmových proteinů závislých na vitaminu K, mohou též připadat v úvahu pro substituci.

Termín „N-koncová GLA-doména znamená aminokyselinovou sekvenci 1 až 37 faktoru VII.

Třípísmenná zkratka „GLA znamená 4-karboxyglutamovou kyselinu (γ-karboxyglutamát).

Termín „proteázová doména znamená aminokyselinovou sekvenci 153 až 406 faktoru VII (těžký řetězec faktoru Vila).

Termín „polypeptid faktoru VII používaný v tomto dokumentu znamená jakýkoli protein zahrnující aminokyselinovou sekvenci 1 až 406 přirozeného lidského faktoru VII (SEQ ID NO:1) nebo jeho varianty. To zahrnuje, ale neomezuje se na lidský faktor VII, lidský faktor Vila a jejich varianty.

Termín „faktor VII, používaný v tomto dokumentu, zamýšlí zahrnovat inaktivní jednořetězcovou molekulu zymogenového faktoru VII, stejně jako aktivovanou dvou řetězcovou molekulu faktoru VII (faktor Vila). To zahrnuje proteiny mající aminokyselinovou sekvenci 1 až 406 přirozeného lidského faktoru VII nebo faktoru Vila. Dále to zahrnuje proteiny s mírně modifikovanou aminokyselinovou sekvencí, například modifikovaný N-konec zahrnující N-terminální aminokyselinové delece nebo adice, pokud si tyto proteiny zachovávají podstatnou aktivitu faktoru Vila. Termín „faktor Vila nebo „FVIIa používaný v tomto dokumentu znamená produkt sestávající z aktivované formy (faktor Vila). „Faktor VII nebo „faktor Vila z výše zmíněné definice též zahrnuje přírodní alelické variace, jež mohou existovat nebo se vyskytovat individuálně. Také stupeň a lokace glykosylace nebo jiné post-translační modifikace se mohou měnit v závislosti na zvolených hostitelských buňkách a povaze prostředí hostitelských buněk.

Termíny „varianta nebo „varianty používané v tomto dokumentu zamýšlejí označovat faktor VII, mající sekvenci SEQ ID NO:1, kde je jedna nebo více aminokyselin mateřského proteinu substituováno jinou aminokyselinou, anebo kde je jedna nebo více aminokyselin vloženo do proteinu, anebo kde je jedna nebo více aminokyselin přidáno k mateřskému proteinu. Taková adice může být provedena buď na N-konci nebo na C-konci rodičovského proteinu anebo na obou koncích. „Varianta nebo „varianty v této definici mají stále aktivitu FVII ve své aktivované formě. V jedné formě je varianta ze 70% identická se sekvencí SEQ ID NO:1. V jiné • · • · β ···· ·· · *·«* formě je varianta z 80% identická se sekvencí SEQ ID NO:1. V další formě je varianta z 90% identická se sekvencí SEQ ID NO:1. V další formě je varianta z 95% identická se sekvencí SEQ ID ΝΟ.Ί.

V prvním aspektu se vynález vztahuje k polypeptidu faktoru VII obsahujícího nejméně dvě substituce vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID ΝΟ.Ί, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou, a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.

Ve druhém aspektu se vynález vztahuje k polypeptidu faktoru VII se dvěma substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou, a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z aminokyseliny vybrané ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.

Ve třetím aspektu se vynález vztahuje k polypeptidu faktoru VII se třemi substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou, a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.

V dalším aspektu se vynález vztahuje k polypeptidu faktoru VII se čtyřmi substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID ΝΟΊ, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou, a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.

V dalším aspektu se vynález vztahuje k polypeptidu faktoru VII s pěti substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou, a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.

V dalším aspektu se vynález vztahuje k polypeptidu faktoru VII se šesti substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou, a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.

• · · · • · • · · · · · ··· • · · · · · · · ··· • · · · · ······· ···· «··· ·· · · · · · · · · ·· · ·· ·

V dalším aspektu se vynález vztahuje k polypeptidu faktoru VII se sedmi substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou, a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.

V dalším aspektu se vynález vztahuje k polypeptidu faktoru VII s osmi substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou, a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.

V dalším aspektu se vynález vztahuje k polynukleotidovému útvaru kódujícímu polypeptid faktoru VII, zahrnující nejméně dvě substituce vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou, a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.

Termín „útvar zamýšlí označovat polynukleotidový segment, jenž může být založen na kompletní nebo částečné přirozeně se vyskytující nukleotidové sekvenci kódující sledovaný polypeptid. Útvar může volitelně obsahovat další polynukleotidové sekvence. Podobně termín „aminokyseliny, jež mohou být kódovány polynukleotidovým útvarem pokrývá aminokyseliny, jež mohou být kódovány polynukleotidovým útvarem definovaným výše, tedy aminokyseliny jako je Ala, Val, Leu, lle, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp a Gin.

V dalším aspektu vynález pokrývá rekombinantní vektor zahrnující polynukleotidový útvar kódující polypeptidový faktor VII.

Termín „vektor, používaný v tomto dokumentu, znamená jakoukoli entitu nukleových kyselin schopnou rozšíření v hostitelské buňce. Tak může vektor být autonomně se replikující vektor, to je vektor, jenž existuje jako extrachromozomální entita, jejíž replikace je nezávislá na chromozomální replikaci, to jest plazmid. Alternativně může vektor být jeden z takových, jež, vloženy do hostitelské buňky, jsou integrovány do genomu hostitelské buňky a replikovány společně s chromozómem/chromozómy, do nichž byly integrovány. Výběr vektoru závisí často na hostitelské buňce, do níž je zaváděn. Vektory zahrnují, ale neomezují se na • · plazmidové vektory, fágové vektory, virusy a kosmidové vektory. Vektory obvykle obsahují replikační zdroj a nejméně jeden volitelný gen, tedy gen, jenž kóduje produkt, jenž se snadno deteguje nebo který je esenciální pro buněčný růst.

V dalším aspektu vynález nárokuje rekombinantní hostitelskou buňku zahrnující polynukleotidový útvar nebo vektor. V jedné formě je rekombinantní hostitelská buňka eukaryotická buňka. V jiné formě je rekombinantní hostitelská buňka savčího původu. V další formě je rekombinantní hostitelská buňka vybrána ze skupiny skládající se z buněk CHO, HEK a BHK.

Termín „hostitelská buňka“ používaná v tomto dokumentu reprezentuje jakoukoli buňku, včetně hybridních buněk, v nichž může být exprimována heterologní DNA. Typická hostitelská buňka zahrnuje, ale není omezena na hmyzí buňky, kvasinkové buňky, savčí buňky včetně lidských, jako jsou BHK, CHO, HEK, a COS buňky. Při provádění předmětného vynálezu jsou kultivované hostitelské buňky s výhodou buňky savčí, ještě výhodněji vytvořená savčí buněčná linie, včetně, bez omezení, buněčných linií CHO (tj. ATCC CCL 61), COS-1 (tj. ATCC CRL 1650), buňky ledvin mláděte křečka (BHK) a HEK293 (tj. ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977). Zvýhodněná buněčná linie BHK je tk' ts13 BHK buněčná linie (Waechtera Baserga, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79; 1106-1110,1982), zde označovaná jako buňky BHK 570. Buněčná linie BHK je dostupná od American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockwille, MD 20852, pod ATCC přístupovým číslem CRL 1632. Další vhodné buněčné linie zahrnuji, bez omezení, Rat Hep I (Rat heptoma; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (Rat heptoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Human lung (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) a buňky DUKX (Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1980). Také použitelné jsou buňky 3T3, buňky Namalwa, myelomy a fúze myelomů s jinými buňkami.

V dalším aspektu vynález nárokuje transgenní zvíře obsahující a exprimující polynukleotidový útvar.

V dalším aspektu vynález nárokuje transgenní rostlinu obsahující a exprimující polynukleotidový útvar.

V dalším aspektu se vynález vztahuje k metodě výroby polypeptidu faktoru VII tohoto vynálezu, metoda zahrnuje kultivaci buňky obsahující polynukleotidový útvar ve vhodném růstovém médiu za podmínek umožňujících expresi polynukleotidového útvaru a získávání výsledného polypeptidu z média kultury.

Tak, jak je použit v tomto dokumentu, znamená termín „vhodné růstové médium“ médium obsahující živiny a další složky nutné pro růst buněk a expresi sekvence nukleových kyselin kódující polypeptid faktoru VII tohoto vynálezu.

V dalším aspektu se vynález vztahuje k metodě výroby polypeptidu faktoru VII, metoda zahrnuje získávání polypeptidu z mléka produkovaného transgenním zvířetem.

V dalším aspektu se vynález vztahuje k metodě výroby polypeptidu faktoru VII, metoda zahrnuje kultivovaci buňky transgenní rostliny zahrnující polynukleotidový útvar, a získávání výsledného polypeptidu z výsledné rostliny.

V dalším aspektu se vynález vztahuje na farmaceutický prostředek obsahující polypeptid faktoru VII zahrnující nejméně dvě substituce vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou, a (ii) nahrazení jakoukoli další aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298; a, volitelně, farmaceuticky přijatelný nosič.

V dalším aspektu se vynález vztahuje k použití polypeptidu faktoru VII pro přípravu léku, přičemž polypeptid zahrnuje nejméně dvě substituce vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO;1, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou, a (ii) nahrazení jakoukoli další aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298. V jedné formě je lék určen pro léčbu poruch krvácivosti nebo krvácivých příhod nebo pro zlepšení normálního hemostatického systému. V jedné formě je to použití pro léčbu hemofilie A nebo B.

V tomto kontextu termín „léčba“ míní zahrnovat jak prevenci předpokládaného krvácení, jako je tomu při operaci, tak regulaci již se nastalého krvácení, jako je tomu při úrazu, s cílem zastavit nebo minimalizovat krvácení. Profylaktické podávání faktoru Vila podle tohoto vynálezu je tedy zahrnuto v termínu „léčba“.

Termín „krvácivé příhody“ míní zahrnovat nekontrolované a nadměrné krvácení. Krvácivé příhody mohou být hlavním problémem v souvislosti s operací i jinými formami poškození tkáně. Nekontrolované a nadměrné krvácení se může vyskytnout jak u subjektů s normálním koagulačním systémem, tak u subjektů s poruchami srážlivosti nebo krvácivosti. Použit v tomto dokumentu, termín „porucha krvácivosti“ reflektuje jakoukoli poruchu, vrozenou, získanou nebo vyvolanou, buněčného nebo molekulárního původu, jež se projevuje krvácením. Příklady jsou ··♦· · · ·· · • · · ··· ··· ··· ···· ···· • · ··· ······· ···· nedostatečnosti srážlivostního faktoru (např. hemofilie A nebo B nebo nedostatečnost koagulačních faktorů XI nebo VII), inhibitory srážlivostního faktoru, defektni funkce destiček, trombocytopenie nebo von Willebrandova nemoc.

Nadměrná krvácivost se také vyskytuje u subjektů s normálně fungující kaskádou krevní srážlivosti (bez nedostatečnosti srážlivostního faktoru a bez inhibitorů jakýchkoli koagulačních faktorů) a může být způsobeno chybnou funkcí krevních destiček, trombocytopenií nebo von Willebrandovou nemocí. V takových případech může být krvácení přirovnáno ke krvácením způsobeným hemofilií, protože hemostatický systém, jako při hemofilii, postrádá nebo má abnormální základní srážecí „sloučeniny“ (jako jsou destičky nebo protein von Willebrandova faktoru), jež způsobují závažná krvácení. U subjektů, jež prodělaly rozsáhlé tkáňové poškození v souvislosti s operací nebo závažným úrazem, může být normální hemostatický mechanismus překonán potřebou okamžité hemostáze, a může se u nich vyvinout krvácivost navzdory normálnímu hemostatickému mechanismu. Dosáhnout uspokojivé hemostázy je také problém tehdy, když se krvácivost objeví v takových orgánech jako je mozek, oblast vnitřního ucha a oči, s omezenou možností chirurgické hemostázy. Stejný problém může vyvstat při procesu odebírání biopsií z různých orgánů (játra, plíce, tumorová tkáň, trávicí trakt), a také při laparoskopické operaci. Pro všechny tyto situace je společné obtížné zajištění hemostázy chirurgickými technikami (šití, svorky aj.), což je obdobné v případě, kdy je krvácení difusní (hemoragická gastritida a profúzní děložní krvácení). Akutní a profúzní krvácení se také může vyskytnout u subjektů s antikoagulační terapií, u nichž byla defektni hemostáze vyvolána danou terapií. U takových subjektů může být vyžadován chirurgický zásah, v případě nutnosti rychlé protiakce na antikoagulační efekt. Radikální retropubická prostatektomie je běžně prováděná procedura u pacientů s lokalizovanou rakovinou prostaty. Operace je často komplikovaná značnou a někdy masivní ztrátou krve. Značná ztráta krve při prostatektomii je hlavně spojena s komplikovanou anatomickou situací s různými hustě prokrvenými místy, jež nejsou snadno přístupná pro chirurgickou hemostázi, a jež mohou vyvolat difúzní krvácení rozsáhlých oblastí. Další situace, jež může způsobovat problémy v případě nedostatečné hemostázy, nastává tehdy, je-li subjektu s normálním hemostatickým mechanismem ordinována antikoagulační terapie s cílem zabránit tromboembolické nemoci. Taková léčba může zahrnovat heparin, jiné formy proteoglykanů, warfarin

.........

nebo jiné formy antagonistů vitaminu K, stejně tak jako aspirin nebo jiné inhibitory agregace krevních destiček.

V jedné formě vynálezu je krvácení spojeno s hemofilií. V další formě je krvácení spojeno s hemofilií se získanými inhibitory. V další formě je krvácení spojeno s trombocytopenií. V další formě je krvácení spojeno s von Willebrandovou nemocí. V další formě je krvácení spojeno s vážným úrazem. V další formě je krvácení spojeno s operací. V další formě je krvácení spojeno s laparoskopickým zákrokem. V další formě je krvácení spojeno s hemoragickou gastritidou. V další formě je krvácení profúzní děložní krvácení. V další formě se krvácení vyskytuje v orgánech s omezenou možností mechanické hemostázy. V další formě se krvácení vyskytuje v mozku, oblasti vnitřního ucha a očích. V další formě je krvácení spojeno s procesem odebírání biopsií. V další formě je krvácení spojeno s antikoagulační terapií.

Termín „subjekt“ používaný v tomto dokumentu zamýšlí znamenat jakéhokoli živočicha, obzvláště savce jako jsou lidé, a může být zaměnitelně používán, je-li to vhodné, s termínem „pacient“.

Termín „zlepšení normálního hemostatického systému“ znamená zlepšení schopnosti vytvářet trombin.

V dalším aspektu se vynález vztahuje k metodě pro léčbu poruch krvácení nebo krvácivých příhod subjektů nebo na zlepšení normálního hemostatického systému, metodě zahrnující podávání potřebnému subjektu terapeuticky nebo profylakticky účinného množství polypeptidu faktoru VII, zahrnujícího nejméně dvě záměny vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID ΝΟ.Ί, kde záměny jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou, a (ii) nahrazení jakoukoli další aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.

V dalším aspektu se vynález vztahuje k polypeptidu faktoru VII tohoto vynálezu pro použití jako lék.

V jedné formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a K157 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a K337 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.

······ ··· ·«· ··· · · · · * · ··· ···· ···· • · · · · ······· ···· ·· ··* *··* · *··* ·

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a D334 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a S336 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a V158 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a E296 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a M298 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde je nejméně jedna aminokyselina ve zbývajících polohách proteázové domény nahrazena jakoukoli jinou aminokyselinou.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde nanejvýš 20 dalších aminokyselin ve zbývajících polohách proteázové domény bylo nahrazeno jinými aminokyselinami.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde nejméně jedna aminokyselina odpovídající aminokyselině v poloze zvolené z 159 až 170 z SEQ ID ΝΟ.Ί byla nahrazena jakoukoli jinou aminokyselinou.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde nejméně jedna aminokyselina odpovídající aminokyselině v poloze zvolené z 290 až 304 z SEQ ID NO:1 byla nahrazena jakoukoli jinou aminokyselinou.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde R304 je nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Tyr, Phe, Leu a Met.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde nejméně jedna aminokyselina odpovídající aminokyselině v poloze zvolené z 306 až 312 z SEQ ID NO:1 byla nahrazena jakoukoli jinou aminokyselinou.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde M306 je nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Asp a Asn.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde D309 je nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Ser a Thr.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde nejméně jedna aminokyselina odpovídající aminokyselině v poloze zvolené z 330 až 339 z SEQ ID NO:1 byla nahrazena jakoukoli jinou aminokyselinou.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde A274 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde A274 je nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Met, Leu, Lys a Arg.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde K157 je nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde K337 je nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde D334 je nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Gly a Glu.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde S336 je nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Gly a Glu.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde V158 je nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde E296 je nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Arg, Lys a Val.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde M298 je nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Lys, Arg, Gin a Asn.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde L305 je nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Val, Tyr a lle.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde L305 je nahrazen Val.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde je aminokyselina nahrazena odlišnou aminokyselinou, a jenž může být kódován polynukleotidovým útvarem.

····*· ·· · ··« • · · ··· · · · • · · · ··· · · r · • · ··· ······· · »♦· ··«· *· * ·· · . . ···· ·· · ·· · 14

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde polypeptid faktoru VII je lidský faktor VII.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Vila popsaného v SEQ ID NO:1 je nejméně přibližně 1,25. V další formě je poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Vila popsaného v SEQ ID NO:1 nejméně přibližně 2,0. V další formě je poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Vila popsaného v SEQ ID NO:1 nejméně přibližně 4,0.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru Vil a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Vila popsaného v SEQ ID NO:1 je nejméně přibližně 1,25 při testování v testu aktivity faktoru Vila. V jedné formě vynálezu je poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Vila popsaného v SEQ ID NO:1 nejméně přibližně 2,0 při testování v testu aktivity faktoru Vila. V další formě vynálezu je poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Vila popsaného v SEQ ID NO:1 nejméně přibližně 4,0 při testování v testu aktivity faktoru Vila. Aktivita faktoru VII může být měřena testy popsanými v příkladech 5 a 6.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Víla popsaného v SEQ ID NO:1 je nejméně přibližně 1,25 při testování v „hydrolytickém testu in vitro“. V jedné formě vynálezu je poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Vila popsaného v SEQ ID NO:1 nejméně přibližně 2,0 při testování v „hydrolytickém testu in vitro“. V další formě vynálezu je poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Vila popsaného v SEQ ID NO:1 nejméně přibližně 4,0 při testování v „hydrolytickém testu in vitro“.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII polypeptid, kde poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Vila popsaného v SEQ ID NO:1 je nejméně přibližně 1,25 při testování v „proteolytickém testu in vitro“. V jedné formě vynálezu je poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Vila popsaného v SEQ ID NO:1 nejméně přibližně 2,0 při testování v „proteolytickém testu in vitro“. V další formě vynálezu je • » ««· · · φ · » · « « · · · · · · · · · « · · « · ·*»···· 4 · · · « · · · «· · · · « • · · · ·· · · · « 15 poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Vila popsaného v SEQ ID NO:1 nejméně přibližně 4,0 při testování v „proteolytickém testu in vitro“. V další formě vynálezu je poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Vila popsaného v SEQ ID NO:1 nejméně přibližně 8,0 při testování v „proteolytickém testu in vitro“.

V další formě vynálezu je polypeptid faktoru VII lidský FVII s nejméně dvěma substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde substituce jsou (i) L305V a (ii) jedna nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z K157X¹, K337A, D334X², S336X³, V158X⁴, E296V A M298Q, kde X¹ je Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp nebo Glu; X² je Gly nebo Glu; X³ je Gly nebo Glu; X⁴ je Thr nebo Asp.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305V/K337A-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158D-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305V/E296V-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305V/M298Q-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158T-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305V/K337AA/158T-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305V/K337A/M298Q-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305V/K337A/E296V-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305V/K337AA/158D-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158D/M298Q-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158D/E296V-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158T/M298Q-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158T/E296V-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305V/E296V/M298Q-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158D/E296V/M298Q

-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158T/E296V/M298Q

-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158T/K337A/M298Q

-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158T/E296V/K337A

-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158D/K337A/M298Q • » · · · * » * · · · · ··«· • · · « · · · • · · · · · *

-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305V/E296V/M298Q/K337A

-FVII

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158D/E296V/K337A

-FVII

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158D/E296V/ M298Q/K337A-FVII.

V další formě vynálezu polypeptid faktoru VII je L305VA/158T/E296V/ M298Q/K337A-FVII.

V dalším aspektu vynález nárokuje polypeptidy lidského koagulačního faktoru Vila, vyznačující se tím, že mají zvýšenou aktivitu nezávislou na tkáňovém faktoru v porovnání s přirozeným lidským koagulačním faktorem Vila. V dalším aspektu není zvýšená aktivita doprovázena změnami v substrátové specifitě. V dalším aspektu vynálezu by vazba polypeptidových variant ke tkáňovému faktoru neměla být oslabena a polypeptidové varianty by měly mít přinejmenším aktivitu divokého typu faktoru Vila, pokud je navázán ke tkáňovému faktoru.

Terminologie pro aminokyselinové záměny používaná v tomto popisu je následující. První písmeno představuje aminokyselinu přirozeně přítomnou v poloze SEQ ID NO:1. Následující číslo představuje pozici v SEQ ID NO:1. Druhé písmeno představuje odlišnou aminokyselinu nahrazující přirozenou aminokyselinu. Příklad je L305V/K337A-FVII, leucin v poloze 305 SEQ ID NO:1.je nahrazen valinem a lysin v poloze 337 SEQ ID NO:1. je nahrazen alaninem, obě mutace jsou ve stejné polypeptidové variantě faktoru VII.

V této souvislosti je používán třípísmenný nebo jednopísmenný kód aminokyselin v jejich konvenčním významu, jak je uvedeno v tabulce 1. Aniž by bylo eplicitně uváděno, jsou zde zmíněné aminokyseliny L-aminokyseliny, levé a pravé konce aminokyselinové sekvence peptidu jsou N- a C-konce, pokud není specifikováno jinak.

• · ·

Tabulka 1: Zkratky aminokyselin:

aminokyselina	třípísmenný kód	jednopísmenný kód
Glycin	Gly	G
Prolin	Pro	P
Alanin	Ala	A
Valin	Val	V
Leucin	Leu	L
Isoleucin	lle	I
Methionin	Met	M
Cystein	Cys	C
Fenylalanin	Phe	F
Tyrosín	Tyr	Y
Tryptofan	Trp	W
Histidin	His	H
Lysin	Lys	K
Arginin	Arg	R
Glutamin	Gin	Q
Asparagin	Asn	N
Glutamová kyselina	Glu	E
Asparagová kyselina	Asp	D
Serin	Ser	S
Threonin	Thr	T

Příprava polypeptidových variant faktoru VII

Vynález se také vztahuje k metodě přípravy polypeptidových variant lidského faktoru VII, jak je zmíněno výše. Polypeptidové varianty lidského faktoru VII popsané v tomto dokumentu mohou být vyráběny pomocí rekombinantních technik nukleových kyselin. Obecně je klonovaný divoký typ sekvence nukleových kyselin faktoru VII modifikován, aby kódoval požadovaný protein. Modifikovaná sekvence je potom vložena do expresního vektoru, který je postupně transformován nebo transfektován do hostitelských buněk. Vyšší eukaryotické buňky, obzvláště kultivované savčí buňky, jsou výhodné jako hostitelské buňky. Kompletní nukleotidové a aminokyselinové sekvence pro lidský faktor VII jsou známé (viz. US 4784950, kde je • · lidského faktoru VII). Sekvence J. Biol. Chem. 263:14868-14872 popsáno klonování a exprese rekombinantního bovinního faktoru VII je popsána v Takeya a kol.

(1988)).

Změn aminokyselinové sekvence může být dosaženo rozmanitými technikami. Modifikace sekvence nukleových kyselin může být místně specifická mutageneze. Techniky místně specifické mutageneze jsou v oboru dobře známy a jsou popsány např. v Zoller a Smith (DNA 3:479-488, 1984) nebo „Splicing by extension overlap“, Horton a kol., Gene 77, 1989, str. 61-68. Takto mohou být za použití sekvencí nukleotidů a aminokyselin faktoru VII zavedeny zvolené změny. Podobně jsou procedury pro přípravu útvarů DNA používající polymerázovou řetězovou reakci za použití specifických primerů dobře známy osobám zběhlým v oboru (PCR Protocols, 1980, Academie Press, San Diego, California, USA).

Útvar nukleových kyselin kódující polypeptidovou variantu faktoru VII předmětného vynálezu může výhodně být genomického nebo cDNA původu, například získaný přípravou genomické nebo cDNA knihovny a prověřením DNA sekvencí kódujících celý polypeptid nebo jeho část hybridizací používající syntetické oligonukleotidové sondy ve shodě se standardními technikami (Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Útvar nukleových kyselin kódující polypeptidové varianty faktoru VII může být též připraven synteticky zavedenými standardními metodami, např. fosfoamiditovou metodou popsanou v práci Beaucage a Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, nebo metodou popsanou v práci Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805. Podle fosfoamiditové metody jsou oligonukleotidy syntetizovány např. na automatickém DNA syntetizéru, čištěny, spojeny, navázány a klonovány ve vhodných vektorech. Sekvence DNA kódující polypeptidové varianty lidského faktoru VII mohou být také připravovány polymerázovou řetězovou reakcí používající specifické primery, jak je například popsáno v US 4683202, Saiki a kol., Science 239 (1988), 487-491, nebo v Sambrook a kol., supra.

Dále mohou být útvary nukleových kyselin směsného syntetického a genomického, směsného syntetického a cDNA nebo směsného genomického a cDNA původu, připravené ligací fragmentů syntetického, genomického nebo cDNA původu (příslušně), kdy fragmenty odpovídající různým částem celého útvaru nukleové kyseliny, ve shodě se standardními technikami.

• · ·

Útvar nukleových kyselin je s výhodou útvar DNA. Sekvence DNA pro použití ve výrobě polypeptidových variant faktoru VII podle předmětného vynálezu typicky kódují pre-pro polypeptid na aminokonci faktoru VII za vzniku vhodného posttranslačního zpracování (např. gama-karboxylace zbytků glutamové kyseliny) a sekrece z hostitelských buněk. Pre-pro polypeptid může být z faktoru VII nebo jiný plazmový protein závislý na vitaminu K, jako je faktor IX, faktor X, protrombin, protein C nebo protein S. Jak ocení osoby zběhlé v oboru, v sekvenci aminokyselin polypeptidové varianty faktoru VII mohou být provedeny dodatečné modifikace, pokud tyto modifikace značně neoslabí schopnost proteinu působit jako koagulant. Polypeptidové varianty faktoru VII mohou být například modifikovány v oblasti aktivace štěpení za účelem inhibice konverze zymogenového faktoru VII na jeho aktivovanou dvouřetězcovou formu, jak je obecně popsáno v US 5288629, zahrnutém zde v referenci.

Sekvence DNA kódující polypeptidové varianty lidského faktoru VII se obvykle vkládají do rekombinantního vektoru, jímž může být jakýkoli vektor, jenž může být vhodně podroben rekombinantním DNA procedurám, a volba vektoru často závisí na hostitelské buňce, do níž má být zaveden. Vektor tedy může být autonomně se replikující vektor, tedy vektor existující v extrachromozomální jednotce, jejíž replikace je nezávislá na chromozomální replikaci, tj. plazmidu. Alternativně vektor může být takový, že se po zavedení do hostitelské buňky integruje do genomu hostitelské buňky a replikuje se společně s chromozomem/chromozomy, do nichž byl integrován.

Vektor je s výhodou expresní vektor, v němž je sekvence DNA kódující polypeptidovou variantu faktoru VII operativně připojena k dalším segmentům požadovaným pro transkripci DNA. Obecně je expresní vektor odvozený z plazmidové nebo virální DNA, anebo může obsahovat prvky obou. Termín „operativně připojena“ znamená, že segmenty jsou uspořádány tak, že fungují ve shodě s jejich zamýšlenými účely, tj. transkripce se iniciuje v promotéru a postupuje sekvencí DNA kódující polypeptid.

Expresní vektory pro použití při expresi polypeptidových variant faktoru Vila zahrnují promotér schopný řídit transkripci klonovaného genu nebo cDNA. Promotér může být jakákoli sekvence DNA, jež vykazuje transkripční aktivitu ve zvolené hostitelské buňce a může být odvozena z genů kódujících proteiny, buďto homologických nebo heterologických vzhledem k hostitelské buňce.

• · · · ·· ·*·· · · · . :: : · : : ··:· · : : ·· ·· ·· ·· · ..

Příklady vhodných promotérů pro řízrení transkripce DNA kódující polypeptidovou variantu lidského faktoru VII v savčích buňkách jsou promotér SV40 (Subramani a kol., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864), promotér MT-1 (metalothioneinový gen) (Palmiter a kol., Science 222 (1983), 809-814), promotér CMV (Boshart a kol., Cell41:521-530, 1985), nebo hlavní pozdní promotér adenoviru 2 (Kaufman a Sharp, Mol Cell. Biol. 2:1304-1319, 1982).

Příklad vhodného promotéru pro použití v hmyzích buňkách je polyhedrinový promotér (US 4745051, Vasuvedan a kol., FEBS Lett. 311, (1992) 7-11), promotér P10 (J.M. Vlak a kol., J. Gen. Virology 69, 1988, str. 765-776), promotér základního proteinu polyhedrózního virusu Autographa californica (EP 397485), promotér přímého časného genu 1 bacilovirusu (US 5155037; US 5162222), nebo promotér 39K zpožděného časného genu bacilovirusu (US 5155037; US 5162222).

Příklady vhodných promotérů pro použití v kvasinkových hostitelských buňkách zahrnují promotéry z kvasinkových glykolytických genů (Hitzeman a kol., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber a Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982). 419-434) nebo z genů alkoholdehydrogenázy (Young a kol., v Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (editoři Hollaender a kol.), Plenům Press, New York, 1982), nebo promotéry TPI1 (US 4599311) nebo ADH2-4c (Russell a kol., Nátuře 304 (1983), 652-654).

Příklady vhodných promotérů pro použití v hostitelských buňkách vláknité houby jsou například promotér ADH3 (McKnight a kol., The EMBO J. 4 (1985), 20932099) nebo promotér tpiA. Příklady dalších použitelných promotérů jsou takové, jež jsou odvozené z genu kódujícího TAKA amylázu A. oryzae, aspartovou proteinázu Rhizomucor miehei, neutrální α-amylázu A. niger, acidostabilní α-amylázu A. niger, glukoamylázu (gluA) A. niger nebo A. awamori, lipázu Rhizomucor miehei, alkalickou proteázu A. oryzae, triózovou fosfátizomerázu A. oryzae nebo acetamidázu A. nidulans. Výhodná je TAKA amyláza a promotéry gluA. Vhodné promotéry jsou zmíněny např. v EP 238023 a EP 383779.

Sekvence DNA kódující polypeptidové varianty lidského faktoru VII mohou také, je-li to nutné, být operabilně připojeny na vhodný terminátor, jako je terminátor lidského růstového hormonu (Palmiter a kol., Science 222 (1983), 809-814) nebo terminátor TPI1 (Alber a Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982). 419-434) nebo terminátor ADH3 (McKnight a kol., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099). Expresní vektory mohou též obsahovat sadu návazných míst RNA, lokalizovaných níže od

promotéru a výše od místa inzerce pro samotnou sekvenci faktoru VII. Zvýhodněná návazná místa RNA mohou být získána z genů adenoviru anebo imunoglobulinu. Dále je v expresním vektoru obsažen polyadenylační signál lokalizovaný níže od místa inzerce. Obzvláště výhodné polyadenylační signály zahrnují časný nebo pozdní polyadenylační signál z SV40 (Kaufman a Sharp, ibid.), polyadenylační signál z oblasti adenoviru 5 Elb, genový terminátor lidského růstového hormonu (DeNoto a kol. Nucl. Acids. Res. 9:3719-3730, 1981) nebo polyadenylační signál z genu lidského faktoru VII nebo z genu bovinního faktoru VII. Expresní vektory mohou také zahrnovat nekódující virální hlavní sekvenci, jako je tripartitiní hlavní sekvence adenovirusu 2, lokalizovaná mezi promotérem a návazných míst RNA; a sekvence enhanceru, jako je enhancer SV40.

Aby byla polypeptidová varianta lidského faktoru VII předmětného vynálezu zavedena do vylučovací dráhy hostitelských buněk, může být vylučovací signální sekvence (také známá jako hlavní sekvence, prepro sekvence nebo pre-sekvence) určena v rekombinantním vektoru. Vylučovací signální sekvence se připojuje k sekvencím DNA kódujícím polypeptidové varianty lidského faktoru VII v přesném čtecím schématu. Vylučovací signální sekvence jsou obvykle umístěny v poloze 5' vzhledem k sekvenci DNA kódující peptid. Vylučovací signální sekvence může být buď normálně asociovaná s proteinem anebo může pocházet z genu kódujícího jiný vylučovaný protein.

Pro sekreci z kvasinkových buněk může vylučovací signální sekvence kódovat jakýkoli signální peptid, který zajišťuje účinné navedení exprimovaných polypeptidových variant lidského faktoru VII na vylučovací dráhu buňky. Signální peptid může být přirozeně se vyskytující signální peptid nebo jeho funkční část, nebo to může být syntetický peptid. O vhodných signálních peptidech bylo zjištěno, že jsou signálním peptidem oc-faktoru (US 4870008), signálním peptidem myší slinné amylázy (O. Hagenbuchle a kol., Nátuře 289, 1981, str. 643-646), signálním peptidem modifikované karboxypeptidázy (L. A. Walls a kol, Cell 48, 1987, str. 887897), signálním peptidem kvasinkového BAR1 (WO 87/02670), nebo signálním peptidem kvasinkové asparagové proteázy 3 (YAP3) (M. Egel-Mitani a kol., YeastQ, 1990, str. 127-137).

Pro účinnou sekreci kvasinek může sekvence kódující vedoucí peptid také být vložena níže od signální sekvence a výše od DNA sekvence kódující polypeptidové varianty lidského faktoru VII. Funkcí hlavního peptidu je umožnit navést exprimovaný • · peptid z endoplasmatického retikula do Golgiho aparátu a dále do sekrečního měchýřku pro sekreci do média kultury (tedy exportace polypeptidové varianty lidského faktoru VII buněčnou stěnou anebo přinejmenším buněčnou membránou do periplazmického prostoru kvasinkové buňky). Hlavní peptid může být hlavní kvasinkový α-faktor (jehož využití je popsáno např. v US 4546082, 4870008, EP 16201, EP 123294, EP 123544 a EP 163529). Alternativně může hlavní peptid být syntetický hlavní peptid, jenž je hlavní peptid nenacházející se v přírodě. Syntetický hlavní peptid může být například vybudován tak, jak je popsáno v WO 89/02463 nebo WO 92/11378.

Pro použití ve vláknitých houbách může být signální peptid obecně odvozen z genu kódujícího amylázu nebo glukoamylázu druhu Aspergillus, z genu kódujícího lipázu nebo proteázu Rhizomucor miehei nebo lipázu Humicola lanuginosa. Signální peptid je výhodně odvozen z genu kódujícího amylázu A. oryzae TAKA, neutrální α-amylázu A. niger, acidostabilní amylázu A. niger, nebo glukoamylázu A. niger. Vhodné signální peptidy jsou popsány například v EP 238023 a EP 215594.

Pro použití v hmyzích buňkách může být signální peptid obecně odvozen z hmyzího genu (WO 90/05783), jako je prekurzor signálního peptidu adipokinetického hormonu motýla Manduca sexta (US 5023328).

Procedury používané pro ligaci sekvencí DNA kódujících polypeptidové varianty lidského faktoru VII, promotérů a volitelně terminátorů anebo vylučovací signální sekvence, a jejich vložení do vhodných vektorů nesoucích informaci nutnou pro replikaci, jsou velmi dobře známé osobám zběhlým v oboru (například Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Metody transfekce savčích buněk a exprese sekvencí DNA vložených do buněk jsou popsány např. v Kaufman a Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern a Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler a kol., Cell 14 (1978), 725; Corsaro a Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603; Graham a Van der Eb, Virology 52 (1973), 456; a Neumann a kol., EMBO J. 1 (1982), 841-845.

Klonované sekvence DNA se vkládají do kultivovaných savčích buněk například pomocí transfekce zprostředkované fosforečnanem vápenatým (Wigler a kol., Cell 14: 725-732, 1978; Corsaro a Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603-616, 1981; Graham a Van der Eb, Virology 52d: 456-467, 1973), nebo elektrokorporace • · · ·

(Neumann a kol., EMBO J: 1:841-845, 1982). Pro identifikaci a výběr buněk exprimujících exogenní DNA se do buněk obecně vkládá gen vykazující volitelný fenotyp (volitelný markér) společně s genem nebo se sledovanou cDNA. Zvýhodněné volitelné markéry zahrnují geny vykazující rezistenci k lékům jako je neomycin, hygromycin a metotrexát. Volitelný markér může být rozšiřitelný volitelný markér. Výhodný rozšiřitelný volitelný markér je sekvence dihydrofolátové reduktázy (DHFR). Volitelné markéry jsou shrnuty Thillym (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, zahrnuto zde v referenci). Osoba zběhlá v oboru snadno zvolí vhodný volitelný markér.

Volitelné markéry mohou být vkládány do buněk na separovaném plazmidu souběžně se sledovaným genem, nebo mohou být vkládány na totožném plazmidu. Jestliže na totožném plazmidu může být volitelný markér nebo sledovaný gen řízen odlišnými promotéry nebo totožným promotérem, pak poslední uspořádání vyvolává dicistronickou zprávu. Útvary tohoto typu jsou v oboru známy (například Levinson a Simonsen, US 4713339). Také může být výhodné přidávat doplňkovou DNA, známou jako „nosičově DNA“ do směsi zavedené do buněk.

Jakmile buňky přijmou DNA, jsou kultivovány ve vhodném růstovém médiu, typicky 1 až 2 dny, a začnou exprimovat sledovaný gen. Tak jak je popsáno v tomto dokumentu, termín „vhodné růstové médium“ znamená médium obsahující živiny a další složky požadované pro buněčný růst a pro expresi sledované polypeptidové varianty lidského faktoru VII. Média obecně zahrnují zdroj uhlíku, dusíku, esenciálních aminokyselin, esenciálních cukrů, vitaminů, solí, fosfolipidů, proteinů a růstových faktorů. Pro produkci gama-karboxylovaných proteinů médium obsahuje vitamín K, výhodně v koncentraci od 0,1 pg/ml do 5 pg/ml. Pro zvolení růstu buněk exprimujících volitelný markér ustáleným způsobem je potom použita léková selekce. U buněk transfektovaných rozšiřitelným volitelným markérem může být koncentrace léčiva zvýšena za účelem selektovat rozšířené množství kopií klonovaných sekvencí, a tak zvýšit úrovně exprese. Klony ustáleně transfektovaných buněk jsou potom prověřeny z hlediska produkce sledované polypeptidové varianty lidského faktoru VII.

Hostitelská buňka, do níž je zavedena DNA sekvence kódující polypeptidovou variantu lidského faktoru VII, může být jakákoli buňka schopná produkovat posttranslacionální polypeptidovou variantu modifikovaného lidského faktoru VII, a zahrnuje kvasinky, houby a vyšší eukaryotické buňky.

• ·

Příklady savčích buněčných linií pro použití v předmětném vynálezu jsou buněčné linie COS-1 (ATCC CRL 1650), ledvin mláděte křečka (BHK) a 293 (ATCC CRL 1573; Graham a kol., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977). Zvýhodněná buněčná linie BHK je tk' ts13 BHK buněčná linie (Waechter a Baserga, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79; 1106-1110,1982, zahrnuto ade v referenci), zde dále označované jako buňky BHK 570. Buněčná linie BHK 570 je deponována v Amrican Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockwille, MD 20852, pod ATCC přístupovým číslem CRL 10314. Buněčná linie tk’ ts13 BHK je také dostupná od ATCC pod přístupovým číslem CRL 1632. Dál může být v předmětném vynálezu použito množství dalších buněčných linií, včetně Rat Hep I (Rat heptoma; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (Rat heptoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Human lung (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61) a buňky DUKX (Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1980).

Příklady vhodných kvasinkových buněk zahrnují Saccharomyces spp. nebo Schizosaccharomyces spp., obzvláště kmeny Saccharomyces cerevisiae nebo Saccharomyces kluyveri. Metody transformace kvasinkových buněk pomocí heterologní DNA a tak výroby heterologních polypeptidů jsou popsány např. v US 4599311, US 4931373, US 4870008, US 5037743 a US 4845075, jež jsou zde všechny zahrnuty v referenci. Transformované buňky jsou zvoleny podle fenotypu určeného volitelným markérem, obvykle lékovou rezistencí nebo schopností růst v nepřítomnosti některých živin, například leucinu. Výhodný vektor použitelný v kvasinkách je vektor POT1 popsaný v US 4931373. Sekvence DNA kódující polypeptidové varianty lidského faktoru VII mohou být uvedeny signální sekvencí a volitelně hlavní sekvencí, jak je popsáno výše. Další příklady vhodných kvasinkových buněk a kmenů Kluyveromyces, jako je K. lactis, Hansenula, např. H. polymorpha, nebo Pichia, např. P. pastoris (Gleeson a kol., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, str. 3459-3465; US 4882279).

Příklady dalších buněk hub jsou buňky vláknitých hub, např. Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. nebo Trichoderma spp., obzvláště kmeny A. oryzae, A. nidulans nebo A. niger. Použití Aspergillus spp. pro expresi proteinů je popsáno například v EP 272277, EP 238023, EP 184438. Transformace F. oxysporum může být například prováděna tak, jak je popsáno v Malardier a kol., 1969, Gene 78; 147156. Transformace Trichoderma spp. může být prováděno například tak, jak je popsáno v EP 244234.

·*·’ : :::. · • :: : * : : ··;· · · · ··:· ···· ·· · · · · • · · · · ·

Je-li jako hostitelská buňka použita vláknitá houba, může být transformována pomocí útvaru DNA podle předmětného vynálezu, vhodně integrací útvaru DNA do hostitelského chromozomu s účelem získat rekombinantní hostitelskou buňku. Integrace je obecně považována za výhodnou, poněvadž sekvence DNA je pravděpodobněji stabilně uchovávána v buňce. Integrace útvaru DNA do hostitelského chromozómu může být provedáděna pomocí konvenčních metod, například homologickou nebo heterologickou rekombinací.

Transformace hmyzích buněk a produkce heterologních polypeptidů v tomto dokumentu může být provedena tak, jak je popsáno v US 4745051; US 4879236; US 5155037; US 5162222; EP 397485, všechny zde popsány v referenci. Vhodná hmyzí buněčná linie použitá jako hostitelská může být buněčná linie Lepidoptera, jako jsou buňky Scodoptera frugiperda nebo buňky Tríchoplusia ni (US 5077214). Vhodné podmínky kultivace mohou být takové, jak je popsáno například v WO 89/01029 nebo v WO 89/01028, nebo v kterékoli z výše zmíněných referencí.

Transformovaná nebo transfektovaná hostitelská buňka popsaná výše je pak kutlivována ve vhodném výživném médiu za podmínek umožňujících expresi polypeptidové varianty lidského faktoru VII, potom je veškerý vzniklý peptid nebo jeho část získávána z kultury. Médium použité ke kultivaci buněk může být jakékoli konvenční médium vhodné pro růst hostitelských buněk, jako jsou minimální nebo komplexní média obsahující vhodné doplňky. Vhodná média jsou dosažitelná od komerčních dodavatelů nebo mohou být připravena podle publikovaných předpisů (např. katalogy American Type Culture Collection). Polypeptidová varianta lidského faktoru VII produkovaná buňkami může potom být regenerována z kulturního média konvenčními procesy včetně procedur zahrnujících separaci hostitelských buněk od média centrifugací nebo filtrací, srážením proteinogenních komponent supernatantu nebo filtrátu pomocí solí, například síranu amonného, čištěním rozmanitými chromatografickými procedurami, jako například ionexovou chromatografií, gelovou filtrací, afinitní chromatografií a podobně, v závislosti na typu uvažovaného polypeptidu.

Technologie transgenních zvířat může být použita pro výrobu polypeptidových variant faktoru VII předmětného vynálezu. Je výhodná pro výrobu proteinů v prsních žlázách hostitelské savčí samice. Produkce v prsní žláze a následná sekrece zájmového proteinu do mléka překonává mnohé obtíže vznikající při izolaci proteinů z jiných zdrojů. Mléko je snadno shromažďováno, získatelné ve velkých množstvích, • · ·

a biochemicky dobře charakterizované. Navíc jsou hlavní mléčné proteiny v mléce přítomny ve vysokých koncentracích (typicky od přibližně 1 do 15 g/l).

Z obchodního hlediska je jasně výhodné použít jako hostitele druhy, jež mají vysoký výtěžek mléka. Zatímco menší zvířata jako myši a krysy mohou být použity (a jsou výhodné ve stadiu principiálních zkoušek), je výhodné používat hospodářské savce včetně, ale nikoli pouze, prasat, koz, ovcí a dobytka. Ovce jsou obzvláště výhodné díky takovým faktorům, jako je předchozí průběh transgenezí v tomto druhu, výtěžek mléka, náklady a snadná dosažitelnost zařízení pro sběr ovčího mléka (viz. např. WO 88/00239 pro porovnání faktorů ovlivňujících výběr hostitelských druhů). Obecně je žádoucí vybírat plemena hostitelských zvířat pěstěných pro produkci mléka, jako je východní fríská ovce, nebo zavádět mléčný dobytek pěstěním transgenních linií čerstvějšího data. V každém případě by měla být užívána zvířata se známým, dobrým zdravotním stavem.

Aby byla dosažena produkce v prsních žlázách, používá se transkripční promotér z genu mléčného proteinu. Geny mléčného proteinu zahrnují geny kódující kaseiny (viz. US 5304489), beta-laktoglobulin, a-laktalbumin a kyselý syrovátkový protein, výhodný je beta-laktoglobulinový (BLG) promotér. V případě genu ovčího beta-laktoglobulinu se obecně používá oblast přinejmenším proximální lemující sekvence 406 bp z 5' genu, i když jsou preferovány větší části z 5' lemující sekvence, až do přibližně 5kbp, jako je -4,25 kpb DNA segment zahrnující 5' lemující promotér a nekódující část genu beta-laktoglobulinu (viz. Whitelaw a kol., Biochem J. 286: 31-39 (1992)). Podobné fragmenty promotéru DNA jiných druhů jsou také vhodné.

Jiné oblasti genu beta-laktoglobulinu mohou být také vkládány do útvarů, jako to mohou být genomové oblasti exprimovaného genu. Obvykle se v oboru akceptuje, že například útvary postrádající introny exprimují špatně ve srovnání s těmi, jež obsahují takové sekvence DNA (viz. Brinster a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 836-840 (1988); Palmiter a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 478-482 (1991); Whitelaw a kol., Transgenic Res. 1: 3-13 (1991); WO 89/01343; a WO 91/02318, všechny zde zahrnuty v referenci). V tomto ohledu se obecně zvýhodňuje, pokud je to možné, použití genomických sekvencí obsahujících všechny nebo některé přirozené introny genu kódujícího sledovaný protein nebo peptid, a tedy je zvýhodněna další inkluze přinejmenším některých intronů například z beta-laktoglobulinového genu. Jedna taková oblast je segment DNA zajišťující • · spojování intronů a polyadenylaci RNA z 3' nekódující oblasti ovčího beta-globulinového genu. Pokud je segment ovčího beta-laktoglobulinu nahrazen přirozenou 3' nekódující sekvencí genu, může tento segment zvyšovat a stabilizovat expresní úrovně sledovaného proteinu nebo polypeptidu. V jiných formách je oblast uzavírající iniciaci ATG sekvence varianty faktoru VII nahrazena odpovídajícími sekvencemi z genu mléčného specifického proteinu. Taková náhrada zajišťuje zdánlivé tkáňově specifické iniciační prostředí zvyšující expresi. Je vhodné nahrazovat pre-pro a 5' nekódující sekvence celé varianty faktoru VII například takovými, jako je například gen BLG, ačkoli mohou být nahrazovány menší oblasti.

Pro účel produkce polypeptidové varianty faktoru VII v transgenních zvířatech se k doplňkovým segmentům DNA, požadovaným pro jeho expresi s cílem vyrábět expresní jednotky, operabilně připojuje segment DNA kódující variantu faktoru VII. Takové doplňkové segmenty zahrnují výše zmíněný promotér stejně tak jako sekvence zajišťující terminaci transkripční a polyadenylační mRNA. Expresní jednotky dále zahrnují segment DNA kódující vylučovací signální sekvenci operabilně připojenou k sekvenci kódující modifikovaný faktor VII. Vylučovací signální sekvence může být přirozená vylučovací signální sekvence faktoru VII, anebo to může být sekvence jiného proteinu, jako je mléčný protein (viz například von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 4683-4690 (1985); a Meade et al., US 4873316, zahrnuté zde v referenci).

Výstavba expresních jednotek pro použití v transgenních zvířatech se obvykle provádí vložením sekvence varianty faktoru VII do plazmidu nebo fágového vektoru obsahujícího doplňkové segmenty DNA, ačkoli expresní jednotka může být vystavěna s pomocí v podstatě jakékoli sekvence ligací. Obzvlášť vhodné je zajišťovat vektor zahrnující segment DNA kódující mléčný protein a nahrazovat kódující sekvenci mléčného proteinu sekvencí varianty faktoru VII; tím vznikne genová fúze zahrnující sekvenci kontroly exprese genu mléčného proteinu. V každém případě klonování expresních jednotek v plazmidech nebo jiných vektorech usnadňuje rozšiřování sekvence varianty faktoru VII. Rozšiřování se vhodně provádí v bakteriálních (např. E. coli) hostitelských buňkách, vektory tudíž typicky zahrnují počátek replikace a volitelný markér fungující v bakteriálních hostitelských buňkách. Expresní jednotka se potom zavádí do oplodněných vajec (včetně embryí v raném stádiu) zvoleného hostitelského druhu. Zavedení heterologní DNA může být dosaženo jednou z více cest, včetně mikroinjekce (např. US patent č. 4873191), retrovirální infekcí (Jaenisch, Science 240: 1468-1474 (1988)) nebo polohově řízenou integrací používající buňky embryonálního kmene (embryonal stem, ES) (přehled Bradley a kol., Bio/Technology 10: 534-539 (1992)). Vajíčka se pak implantují do vejcovodů nebo dělohy pseudopregnantních samic a nechají se vyvíjet po celé období. Potomstvo nesoucí vloženou DNA v zárodečné linii může předat DNA potomkům normálním mendelovským způsobem, což umožňuje vznik transgenních stád. Obecné procedury pro produkci transgenních zvířat jsou v oboru známy (viz. například Hogan a kol., Manipulating the Mouše Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons a kol., Bio/Technology 6: 179183 (1988); Wall a kol., Biol. Reprod. 32: 645-651 (1985); Buhler a kol., Bio/Technology 8: 140-143 (1990); Ebert a kol., Bio/Technology 9: 835-838 (1991); Krimpenfort a kol., Bio/Technology 9: 844-847 (1991); Wall a kol., J. Cell. Biochem. 49: 113-120 (1992); US 4873191; US 4873316; WO/00239, WO 90/05188; WO 92/11757; a GB 87/00458). Techniky zavádění cizích sekvencí DNA do savčích a jejich zárodečných buněk byly původně vyvinuty u myší (viz například Gordon a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 77: 7380-7384 (1980); Gordon a Ruddle, Science 214: 1244-1246 (1981); Palmiter a Brinster, Cell 41: 343-345 (1985); Brinster a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 82: 4438-4442 (1985); a Hogan a kol. (tamtéž)). Tyto techniky byly následně přizpůsobeny pro použití u větších zvířat, včetně druhů dobytka (viz například WO 88/00239, WO 90/05188 a WO 92/11757; a Simons a kol., Bio/Technology 6: 179-183 (1988)). V souhrnu se v dosud nejúčinnější cestě používané pro generaci transgenních myší nebo dobytka injikují stovky sledovaných lineárních molekul DNA do projádra oplodněného vajíčka ve shodě se zavedenými technikami. Může být také použita Injekce DNA do do cytoplazmy zygoty.

Může být také použita produkce v transgenních rostlinách. Exprese může být rozšířena nebo cílena na konkrétní orgán, jako je nádor (viz Hiatt, Nátuře 344: 469479 (1990); Edelbaum a kol., J. Interferon Res. 12: 449-453 (1992); Sijmons a kol., Bio/Technology 8: 217-221 (1990); a EP 0255378).

Polypeptidové varianty faktoru VII předmětného vynálezu se získávají z média buněčné kultury nebo mléka. Polypeptidové varianty faktoru VII podle předmětného vynálezu mohou být čištěny nerůznějšími procedurami známými v oboru včetně, ale nejenom chromatografii (např. ionexovou, afinitní, hydrofobní chromatografii, chromatofokusací a vylučovací chromatografii), elektroforetickými procesy (např. preparativní izoelektickou fokusací (IEF)), na základě odlišné rozpustnosti (např.

···· srážením síranem amonným), nebo extrakcí (viz např. Protein Purification, J.-C. Janson a Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989). S výhodou mohou být čištěny afinitní chromatografií na protilátkové koloně s anti-faktorem VII. Obzvláště výhodné je použití monoklonálních protilátek vázaných na vápník, jak je popsáno v práci Wakabayashi a kol., J. Biol. Chem. 261:11097-11108, (1986) a Thim a kol., Biochemistry 27: 7785-7793, (1988). Dodatečné čištění může být provedeno konvenčním chemickým čištěním, jako je vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Jiné metody čištění, včetně srážení citrátem barnatým, jsou v oboru známy a mohou být použity pro čištění zde popsaných nových polypeptidových variant faktoru VII (viz např. Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, N.Y., 1982).

Pro terapeutické účely je výhodné, aby polypeptidové varianty faktoru VII tohoto vynálezu byly téměř čisté. Ve výhodné formě vynálezu jsou tedy polypeptidové varianty faktoru VII podle předmětného vynálezu čištěny na homogenitu nejméně 90 až 95%, výhodně na nejméně 98%. Čistota může být posouzena např. gelovou elektroforézou a aminokyselinovým sekvenováním aminokonce.

Varianta faktoru VII se štěpí ve své aktivační poloze, aby byla přeměněna na svou dvou řetězcovou formu. Aktivace může být prováděna podle procedur známých v oboru, jako jsou ty popsané v práci Osteruda a kol., Biochemistry 11: 2853-2857 (1972); Thomas, US patent č. 4456591; Hedner a Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 18361841 (1983); nebo Kisiel a Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29-42 (1983). Alternativně, jak je popsáno v práci Bjoerna a kol. (Research Disclosure, 269 září 1986, str. 564-565), může být faktor VII aktivován průtokem přes ionexovou chromatografickou kolonu, jako je Mono Q® (Pharmacia Fine Chemicals) nebo podobnou. Výsledná aktivovaná varianta faktoru VII může potom být připravována a podávána tak, jak je popsáno níže.

• · • · • · • · · · • · · · · • · · · · • · « ·

Testy

Vynález také popisuje vhodné testy pro výběr vhodných variant faktoru Vila podle předmětného vynálezu. Tyto zkoušky se mohou provádět jako jednoduchý předběžný test in vitro.

Příklad 5 v tomto dokumentu popisuje jednoduchý test (nazývaný „Hydrolytický test in vitro“) aktivity variant faktoru Vila předmětného vynálezu. Na základě tohoto testu jsou předmětem zvláštního zájmu takové varianty faktoru Vila, kde poměr mezi aktivitou varianty a aktivitou přirozeného faktoru VII uvedeného na obr. 1 je vyšší než 1,0, např. nejméně 1,25; s výhodou 2,0, stejně jako nejméně 3,0, a ještě výhodněji 4,0, při testování v „Hydrolytickém testu in vitro“.

Aktivita variant může být také měřena s použitím fyziologického substrátu jako je faktor X („Proteolytický test in vitro“) (viz Příklad 6), vhodně při koncentraci 100 až 1000 nM, kdy je vzniklý faktor Xa měřen po přidání vhodného chromogenního substrátu (např. S-2765). Stanovení aktivity může být navíc prováděno při fyziologické teplotě.

Schopnost variant faktoru Vila generovat trombin může být také měřena v testu zahrnujícím všechny relevantní koagulační faktory a inhibitory při fyziologické koncentraci (minus faktor VII imitující podmínky hemofilie A) a aktivované destičky (jak je popsáno na str. 543 v práci Monroe a kol., (1997) Brit J. Haematol. 99, 542547, zahrnuté zde v referenci).

Aplikace a farmaceutické kompozice

Polypeptidové varianty faktoru VII podle předmětného vynálezu mohou být použity pro potlačování poruch krvácivosti, jež mají více příčin, jako je nedostatečnost srážlivostního faktoru (např. hemofilie A a B nebo nedostatečnost koagulačních faktorů XI a VII) nebo inhibitory srážlivostního faktoru, anebo mohou být použity pro potlačování nadměrného krvácení vyskytujícího se u subjektů s normálně fungující kaskádou krevní srážlivosti (bez nedostatečnosti srážlivostního faktoru nebo inhibitorů kteréhokoli z koagulačních faktorů). Takové krvácení může být například způsobeno defektní funkcí krevních destiček, trombocytopenií nebo von Willebrandovou nemocí. Může být také pozorováno u subjektů, u nichž je zvýšená fibrinoiytická aktivita indukována různými podněty.

U subjektů, jež prodělaly prodělaly rozsáhlé tkáňové poškození v souvislosti s operací nebo závažným úrazem, může být normální hemostatický mechanismus • · ·

překonán potřebou okamžité hemostáze, a může se u nich vyvinout krvácivost navzdory normálnímu hemostatickému mechanismu. Dosáhnout uspokojivé hemostázy je také problém tehdy, když se krvácivost objeví v takových orgánech jako je mozek, oblast vnitřního ucha a oči, a může být také problém v případech difuzního krvácení (hemoragická gastritida a profúzní děložní krvácení), kde je obtížné identifikovat zdroj. Stejný problém může vyvstat při procesu odebírání biopsií z různých orgánů (játra, plíce, tumorová tkáň, trávicí trakt), a také při laparoskopické operaci. Pro všechny tyto situace je společné obtížné zajištění hemostázy chirurgickými technikami (šití, svorky aj.). Akutní a profúzní krvácení se také může vyskytnout u subjektů s antikoagulační terapií, u nichž byla defektní hemostáze vyvolána danou terapií. U takových subjektů může být vyžadován chirurgický zásah v případě nutnosti rychlé protiakce na antikoagulační efekt. Další situace, jež může způsobovat problémy v případě nedostatečné hemostázy, nastává tehdy, je-li subjektu s normálním hemostatickým mechanismem ordinována antikoagulační terapie s cílem zabránit tromboembolické nemoci. Taková terapie může zahrnovat heparin, jiné formy proteoglykanů, warfarin nebo jiné formy antagonistů vitaminu K, stejně tak jako aspirin nebo jiné inhibitory agregace krevních destiček.

Systemická aktivace koagulační kaskáddy může vést k rozšířené intravaskulární koagulaci (DIC). Takové komplikace však nebyly pozorovány u subjektů léčených vysokými dávkami rekombinantního faktoru VII díky lokalizovanému hemostatickému procesu takového typu, indukovanému vznikem komplexu mezi faktorem Vila a TF exponovaném v místě poranění cévní stěny. Polypeptidové varianty faktoru VII podle předmětného vynálezu se tedy mohou také použít ve své aktivované formě pro potlačování takových nadměrných krvácení spojených s normálním hemostatickým mechanismem.

Pro léčbu ve spojení s plánovanými zákroky se polypeptidové varianty faktoru VII podle předmětného vynálezu typicky podávají po dobu přibližně 24 hodin před provedením zákroku, a po dobu až 7 dní nebo déle po zákroku. Podání jakožto koagulant může být provedeno mnoha zde popsanými způsoby.

Dávka polypeptidové varianty faktoru VII se pohybuje v mezích od 0,05 mg do 500 mg/den, výhodně od 1 mg do 200 mg/den, a výhodněji od 10 mg do 175 mg/den u 70 kg subjektu jako iniciační a udržovací dávky, v závislosti na váze subjektu a závažnosti podmínek.

• · • · ··· ··· ··· ·· · · ··· · ··· • · · · · ·»····« · * · · 32 ’..**..* *..* : ·..· :

Farmaceutické kompozice jsou primárně zamýšleny pro parenterální dávkování u profylaktické anebo terapeutické léčby. S výhodou jsou farmaceutické kompozice podávány parenterálně, tj intravenózně, subkutanózně anebo intramaskulárně, anebo mohou být podávány kontinuální nebo pulzatilní infuzí. Kompozice pro parenterální dávkování zahrnuje variantu faktoru VII podle předmětného vynálezu v kombinaci, výhodně jako roztok, s farmaceuticky přijatelným nosičem, výhodně vodným nosičem. Mohou být použity nejrůznější vodné nosiče jako je voda, pufrovaná voda, 0,4% solný roztok, 0,3% glycin a podobně. Polypeptidové varianty faktoru VII předmětného vynálezu mohou být také rozplňovány do lipozómových preparátů pro dodání nebo zaměření míst zranění. Lipozómové preparáty jsou obecně popsány například v US 4837028, US 4501728 a US 4975282. Kompozice mohou být sterilizovány konvenčními, dobře známými sterilizačními technikami. Vzniklé vodné roztoky mohou být baleny pro užití anebo filtrovány za aseptických podmínek a lyofilizovány; lyofilizované preparáty se kmbinují se sterilními vodnými roztoky před podáním. Kompozice mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky jak vyžadují přibližné fyziologické podmínky, jako jsou činidla nastavující a pufrující pH, činidla nastavující tonus a podobně, například octan sodný, mléčnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý atd.

Koncentrace variant faktoru VII v těchto léčivech se může široce měnit, tj. od méně než 0,5 váhových %, obvykle je to od 1 nebo nejméně 1 váhového % do 15 nebo 20 váhových %, a volí se primárně podle fluidních objemů, viskozit atd., ve shodě s konkrétním způsobem zvoleného dávkování.

Typická farmaceutická kompozice pro intravenózní infuzi tedy může být uspořádána tak, aby obsahovala 250 ml sterilního Ringerova roztoku a 10 mg varianty faktoru VII. Osobám zběhlým v oboru jsou známy nebo zřejmé aktuální metody přípravy parenterálně dávkovatelných kompozic; metody jsou podrobněji popsány například v Remington Pharmaceutical Sciences, 18^th ed., Marek Publishing Company, Easton, PA (1990).

Kompozice obsahující polypeptidové varianty faktoru VII podle předmětného vynálezu mohou být podávány pro profylaktickou anebo terapeutickou léčbu. V léčebných aplikacích se subjektu již trpícímu výše popsanou nemocí podávají kompozice v množství dostatečném pro léčení, zmírnění nebo částečné zadržení nemoci a jejích komplikací. Adekvátní množství pro dosažení tohoto cíle je ·«···· ··· ··· • · · · · · ··· ·· · · · · · · ··· ·· ··· ······· ···· definováno jako „terapeuticky efektivní množství“. Osoby zběhlé v oboru chápou, že efektivní množství pro tento účel závisí na závážnosti nemoci nebo zranění stejně jako na váze a celkovém stavu subjektu. Avšak obecně se efektivní množství mění od 0,05 mg do 500 mg varianty faktoru VII na den pro 70 kg subjekt, při běžněji používaném dávkování od 1,0 mg do 200 mg varianty faktoru VII na den.

Polypeptidy FVIIa předmětného vynálezu mohou být obecně použity ve vážných stavech nemoci nebo zranění, jako jsou situace ohrožení života nebo potenciálního ohrožení života. V takových případech, se zřetelem na minimalizaci cizorodých látek a obecný nedostatek imunogenicity polypeptidových variant lidského faktoru VII u lidí, se může ošetřujícímu lékaři jevit jako vhodné podávat značný nadbytek těchto kompozic varianty faktoru VII.

U profylaktických aplikací se podávají kompozice obsahující variantu faktoru VII podle předmětného vynálezu subjektu náchylnému nebo jinak ohroženému nemocí nebo zraněním, účelem je zvýšit vlastní koagulační kapacitu subjektu. Takové množství je definováno jako „profylakticky efektivní dávka“. U profylaktických aplikací přesná množství také závisí na zdravotním a váhovém stavu subjektu, ale dávka se obecně mění od 0,05 mg do 500 mg na den pro 70 kg subjekt, obvykleji od 1,0 mg do 200 mg na den pro 70 kg subjekt.

Jednorázové nebo opakované dávkování kompozice může být prováděno při úrovni dávek a modelů vybíraných ošetřujícím lékařem. Ambulantním subjektům vyžadujícím denní udržovací úrovně se mohou podávat polypeptidové varianty faktoru VII kontinuální infuzí například za použití přenosného čerpacího systému.

Lokální podání varianty faktoru VII předmětného vynálezu, jako je například místní aplikace, může být prováděno například pomocí sprejů, perfúzí, dvoubalónkovým katetrem, stentem, vložením do vaskulárních roubů nebo stentů, hydrogelů použitých pro potahování balónkových katetrů, nebo jiných dobře zavedených metod. V každém případě mají farmaceutické kompozice zajišťovat takové množství varianty faktoru VII, jež je dostatečné pro efektivní léčbu subjektu.

Předmětný vynález je dále ilustrován následujícími příklady, jež však nejsou chápány jako omezující rámec ochrany. Charakteristiky popsané v předchozím popisu a v následujících příkladech mohou buď jednotlivě nebo v jakékoli jejich kombinaci být materiálem pro realizaci vynálezu v jeho odlišných formách.

• ·

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 znázorňuje kompletní aminokyselinovou sekvenci přirozeného (divokého typu) lidského koagulačního faktoru VII (SEQ ID NO:1).

Příklady

Terminologie aminokyselinových substitucí používaná v následujících příkladech je následující. První písmeno představuje aminokyselinu přirozeně přítomnou v poloze SEQ ID NO:1. Následující číslo představuje polohu v SEQ ID NO:1. Druhé písmeno představuje odlišnou aminokyselinu nahrazující přirozenou aminokyselinu. Příklad je L305V/K337A-FVII: Leucin v poloze 305 sekvence SEQ ID NO:1 je nahrazen valinem a lysin v poloze 337 sekvence SEQ ID NO:1. je nahrazen alaninem, obě mutace ve variantě faktoru VII.

Příklad 1

DNA kódující L305V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,

L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII.

Útvary DNA kódující L305V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII byly připraveny místně specifickou mutagenezí používající spirálovitý, dvouřetězcový vektor DNA s důležitou inzercí a dvěma syntetickými primery obsahujícími požadovanou mutaci. Byly použity následující primery:

Pro L305V-FVII:

5'-CGT GCC CCG GGT GAT GAC CCA GGA C-3' (SEQ ID NO:2)

5-GTC CTG GGT CAT CAC CCG GGG CAC G-3' (SEQ ID NO:3)

Pro K337A-FVII:

5-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3' (SEQ ID NO:4) 5'-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3' (SEQ ID NO:5) • · • ·

.........

Pro V158D-FVII:

5'-GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3' (SEQ ID N0:6)

5-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3' (SEQ ID N0:7)

Pro E296V/M298Q-FVII:

5-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3' (SEQ ID N0:8)

5'-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3' (SEQ ID N0:9)

Oligonuleotidové primery, všechny komplementární k opačným řetězcům vektoru, byly prodlouženy během teplotního cyklování pomocí Pfu DNA polymerázy. Inkorporací primerů byl generován mutovaný plazmid obsahující střídavě rozložené zářezy. Po teplotním cyklování se na produkt působilo Dpnl specifickým pro methylovanou a hemimethylovanou DNA, aby byl stráven parentální templát DNA a vybrána syntetizovaná DNA obsahující mutaci.

Procedury pro přípravu útvaru DNA používající polymerázové řetězové reakce se specifickými primery jsou dobře známy osobám zběhlým v oboru (PCR Protocols, 1990, Academie Press, San Diego, California, USA).

Příklad 2

Příprava L305V/K337A-FVII.

Buňky BHK byly transfektovány v zásadě tak, jak bylo dříve popsáno (Thim a kol., (1988), Biochemistry 27: 7785-7793; Persson a Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243), aby byla získána exprese varianty L305V/K337A-FVII. Varianta faktoru VII byla čištěna následujícím způsobem:

Upravené médium bylo naplněno na 25 ml kolonu Fast Flow Sefarózy Q (Pharmacia Biotech) po přidání 5 mM EDTA, 0,1% Tritonu X-100 a 10 mM Trisu, nastavení pH na 8,0 a nastavení vodivosti na 10-11 mS/cm přidáním vody.

Eluce proteinu byla provedena přechodem od 10 mM Trisu, 50 mM NaCI, 0,1% Tritonu X-100, pH 8,0 na 10 mM Trisu, 50 mM NaCI, 25 mM CaCI₂, 0,1% Tritonu X-100, pH 8,0. Frakce obsahující L305V/K337A-FVII byly sbírány a • · • · • · · · · · • · · ··· ··· ··· · · · * · · · • · ··· ······· · ·

·..· : ·..· aplikovány na 25 ml kolonu obsahující monoklonální protilátku F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark), vázanou na Sefarózu 4B, aktivovanou CNBr (Pharmacia Biotech).

Kolona byla ekvilibrována 50 mM Hepes, pH 7,5, obsahujícím 10 mM CaCI₂, 100 mM NaCI a 0,02% Triton X-100. Po promytí ekvilibračním pufrem a ekvilibračním pufrem obsahujícím 2 M NaCI byl navázaný materiál eluován ekvilibračním pufrem obsahujícím 10 mM EDTA namísto CaCI₂. Před použitím nebo uskladněním byl přidán nadbytek CaCI₂ oproti EDTA nebo byl L305V/K337A-FVII převeden do pufru obsahujícího Ca²⁺. Výtěžek každého kroku byl sledován měřením ELISA faktoru VII a vyčištěný protein byl analyzován pomocí SDS-PAGE.

Příklad 3

Příprava L305VA/158D/E296V/M298Q-FVII.

Buňky BHK byly transfektovány v zásadě tak, jak bylo dříve popsáno (Thim a kol., (1988), Biochemistry 27: 7785-7793; Persson a Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243), aby byla získána exprese varianty L305VA/158D/E296V/M298Q-FVII. Varianta faktoru VII byla čištěna následujícím způsobem;

Eluce proteinu byla provedena přechodem od 10 mM Trisu, 50 mM NaCI, 0,1% Tritonu X-100, pH 8,0 na 10 mM Trisu, 50 mM NaCI, 25 mM CaCI₂, 0,1% Tritonu X-100, pH 8,0. Frakce obsahující L305VA/158D/E296V/M298Q-FVII byly sbírány a aplikovány na 25 ml kolonu obsahující monoklonální protilátku F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark), vázanou na Sefarózu 4B, aktivovanou CNBr (Pharmacia Biotech).

Kolona byla ekvilibrována 50 mM Hepes, pH 7,5, obsahujícím 10 mM CaCI₂, 100 mM NaCI a 0,02% Triton X-100. Po promytí ekvilibračním pufrem a ekvilibračním pufrem obsahujícím 2 M NaCI byl navázaný materiál eluován ekvilibračním pufrem obsahujícím 10 mM EDTA namísto CaCI₂. Před použitím nebo uskladněním byl přidán nadbytek CaCI₂ oproti EDTA nebo byl L305VA/158D/E296V/M298Q-FVII převeden do pufru obsahujícího Ca²⁺. Výtěžek každého kroku byl sledován měřením ELISA fakrotu VII a vyčištěný protein byl analyzován pomocí SDS-PAGE.

• · • · · · · • · ··· · · ···· ·· · · ·· · ·· ·

Příklad 4

Příprava L305V/V158D/E296V/M298Q/k337A-FVII.

Buňky BHK byly transfektovány v zásadě tak, jak bylo dříve popsáno (Thim a kol., (1988), Biochemistry 27: 7785-7793; Persson a Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243), aby byla získána exprese varianty L305V/V158D/E296V/M298Q/k337A -FVII. Varianta faktoru VII byla čištěna následujícím způsobem:

Eluce proteinu byla provedena přechodem od 10 mM Trisu, 50 mM NaCI, 0,1% Tritonu X-100, pH 8,0 na 10 mM Trisu, 50 mM NaCI, 25 mM CaCI₂, 0,1% Tritonu X-100, pH 8,0. Frakce obsahující L305VA/158D/E296V/M298Q/k337A-FVII byly sbírány a aplikovány na 25 ml kolonu obsahující monoklonální protilátku F1A2 (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark), vázanou na Sefarózu 4B, aktivovanou CNBr (Pharmacia Biotech).

Kolona byla ekvilibrována 50 mM Hepes, pH 7,5, obsahujícím 10 mM CaCI₂, 100 mM NaCI a 0,02% Triton X-100. Po promytí ekvilibračním pufrem a ekvilibračním pufrem obsahujícím 2 M NaCI byl navázaný materiál eluován ekvilibračním pufrem obsahujícím 10 mM EDTA namísto CaCI₂. Před použitím nebo uskladněním byl přidán nadbytek CaCI₂ oproti EDTA nebo byl L305V/V158D/E296V/M298Q/k337A -FVII převeden do pufru obsahujícího Ca²⁺. Výtěžek každého kroku byl sledován měřením ELISA fakrotu VII a vyčištěný protein byl analyzován pomocí SDS-PAGE.

Příklad 5

Hydrolytická zkouška in vitro

Přirozený (divoký typ) faktor Vila a varianta faktoru Vila (oba zde označované jako „faktor Vila“) se stanovují paralelně, aby byly přímo porovnány jejich specifické aktivity. Test se provádí na mikrotitrační destičce (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Chromogenní substrát D-lle-Pro-Arg-p-nitroanilid (S-2288, Chromogenix, Sweden), finální koncentrace 1 mM, se přidává k faktoru Vila (finální koncentrace 100 nM) v 50 mM Hepes, pH 7,4, obsahujícímu 0,1 M NaCI, 5 mM CaCI₂ a 1 mg/ml bovinního sérového albuminu. Absorbance při 405 nm se měří kontinuálně na přístroji • · · ··· « · · ·· · · · · · · ··· ·· ··· ······· ····

SpectraMax™ se sledováním 340 pozic na destičce (Molecular Devices, USA). Absorbance dosažená během 20 minutové inkubace, po odečtení absorbance v jamce blanku neobsahující enzym, se používá pro výpočet poměru mezi aktivitami varianty a divokého typu faktoru Vila:

Poměr = (A₄₀5 nm varianty faktoru VIla)/(A_{405 nm} divokého typu faktoru Vila).

Příklad 6

Ptoteolytická zkouška in vitro

Přirozený (divoký typ) faktor Vila a varianta faktoru Vila (oba zde označované jako „faktor Vila“) se stanovují paralelně, aby byly přímo porovnány jejich specifické aktivity. Test se provádí na mikrotitrační destičce (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Faktor Vila (10 nM) a faktor X (0,8 μΜ) v 100 μΙ 50 mM Hepes, pH 7,4, obsahujícím 0,1 M NaCl, 5 mM CaCI₂ a 1 mg/ml bovinního sérového albuminu se inkubuje po dobu 15 min. Štěpení faktoru X je pak zastaveno přidáním 50 μΙ 50 mM Hepes, pH 7,4, obsahujícím 0,1 M NaCl, 20 mM EDTA a 1 mg/ml bovinního sérového albuminu. Množství vzniklého faktoru Xa se měří přidáním chromogenního substrátu Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilidu (S-2765, Chromogenix, Sweden), finální koncentrace 0,5 mM. Absorbance při 405 nm se měří kontinuálně na přístroji SpectraMax™ se sledováním 340 pozic na destičce (Molecular Devices, USA). Absorbance dosažená během 10 minutové inkubace, po odečtení absorbance v jamce blanku neobsahující FVIIa, se používá pro výpočet poměru mezi aktivitami varianty a divokého typu faktoru Vila:

Poměr = (A₄o5nm varianty faktoru Vlla)/(A405nm divokého typu faktoru Vila).

• · • · • ·

Příklad 7

RELATIVNÍ AKTIVITY VARIANT FVIIA MĚŘENÝCH V TESTECH POPSANÝCH V PŘÍKLADECH 5 A 6.

Varianta	Poměr v příkladu 5	Poměr v příkladu 6
L305V/K337A-FVII	7,2	6,2
L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII	6,7	45
L305V/V158D/E296V/M298Q/k337A-FVI I	11,5	72
wt-FVIIa	1,0	1,0

• · • · • ·

Popis sekvence

SEQ ID NO. 1 (Aminokyselinová sekvence přirozeného lidského koagulačního faktoru VII):

Ala-Asn-Ala-Phe-Leu-GLA-GLA-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Leu-GLA-Arg-GLA-Cys-Lys-GLA-GLA5 10 15 20

Gln-Cys-Ser-Phe-GLA-GLA-Ala-Arg-GLA-lle-Phe-Lys-Asp-Ala-GLA-Arg-Thr-Lys-Leu-Phe25 30 35 40

Trp-lle-Ser-Tyr-Ser-Asp-Gly-Asp-GIn-Cys-Ala-Ser-Ser-Pro-Cys-GIn-Asn-Gly-Gly-Ser-Cys45 50 55 60

Lys-Asp-GIn-Leu-GIn-Ser-Tyr-lle-Cys-Phe-Cys-Leu-Pro-Ala-Phe-Glu-Gly-Arg-Asn-Cys-Glu65 70 75 80

Thr-His-Lys-Asp-Asp-GIn-Leu-lle-Cys-Val-Asn-Glu-Asn-Gly-Gly-Cys-Glu-GIn-Tyr-Cys-Ser85 90 95 100

Asp-His-Thr-Gly-Thr-Lys-Arg-Ser-Cys-Arg-Cys-His-Glu-Gly-Tyr-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Gly105 110 115 120

Val-Ser-Cys-Thr-Pro-Thr-Val-Glu-Tyr-Pro-Cys-Gly-Lys-lle-Pro-lle-Leu-Glu-Lys-Arg-Asn-Ala125 130 135 140 145

Ser-Lys-Pro-GIn-Gly-Arg-lle-Val-Gly-Gly-Lys-Val-Cys-Pro-Lys-Gly-Glu-Cys-Pro-Trp-GIn-Val150 155 160 165

Leu-Leu-Leu-Val-Asn-Gly-Ala-GIn-Leu-Cys-Gly-Gly-Thr-Leu-lle-Asn-Thr-lle-Trp-Val-Val-Ser170 175 180 185 190

Ala-Ala-His-Cys-Phe-Asp-Lys-lle-Lys-Asn-Trp-Arg-Asn-Leu-lle-Ala-Val-Leu-Gly-Glu-His-Asp195 200 205 210

225

230

Leu-Ser-Glu-His-Asp-Gly-Asp-Glu-GIn-Ser-Arg-Arg-Val-Ala-GIn-Val-lle-lle-Pro-Ser-Thr-Tyr215 220 • · • · · • · · · · · • ··· · ♦ · » • ····· · · ·····

Val-Pro-Gly-Thr-Thr-Asn-His-Asp-lle-Ala-Leu-Leu-Arg-Leu-His-GIn-Pro-Val-Val-Leu-Thr-Asp235 240 245 250 255

His-Val-Val-Pro-Leu-Cys-Leu-Pro-Glu-Arg-Thr-Phe-Ser-Glu-Arg-Thr-Leu-Ala-Phe-Val-Arg260 265 270 275

Phe-Ser-Leu-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-GIn-Leu-Leu-Asp-Arg-Gly-Ala-Thr-Ala-Leu-Glu-Leu-Met280 285 290 295

Val-Leu-Asn-Val-Pro-Arg-Leu-Met-Thr-GIn-Asp-Cys-Leu-GIn-GIn-Ser-Arg-Lys-Val-Gly-Asp300 305 310 315

Ser-Pro-Asn-lle-Thr-Glu-Tyr-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Ser-Asp-Gly-Ser-Lys-Asp-Ser-Cys320 325 330 335 340

Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-His-Ala-Thr-His-Tyr-Arg-Gly-Thr-Trp-Tyr-Leu-Thr-Gly-lle-Val345 350 355 360

Ser-Trp-Gly-GIn-Gly-Cys-Ala-Thr-Val-Gly-His-Phe-Gly-Val-Tyr-Thr-Arg-Val-Ser-GIn-Tyr-lle365 370 375 380

Glu-Trp-Leu-GIn-Lys-Leu-Met-Arg-Ser-Glu-Pro-Arg-Pro-Gly-Val-Leu-Leu-Arg-Ala-Pro385 390 395 400

Phe-Pro 405 406 • · · ·

SEQ ID NO. 2 (DNA primer pro přípravu L305V-FVII): 5'-CGT GCC CCG GGT GAT GAC CCA GGA C-3'

SEQ ID NO:3 (DNA primer pro přípravu L305V-FVII): 5'-GTC CTG GGT CAT CAC CCG GGG CAC G-3'

SEQ ID NO:4 (DNA primer pro přípravu K337A-FVII): 5-CGG ATG GCA GCG CGG ACT CCT GCA AGG G-3'

SEQ ID N0:5 (DNA primer pro přípravu K337A-FVII): 5-CCC TTG CAG GAG TCC GCG CTG CCA TCC G-3'

SEQ ID N0:6 (DNA primer pro přípravu V158D-FVII): 5-GTG GGG GGC AAG GAC TGC CCC AAA GGG G-3'

SEQ ID N0:7 (DNA primer pro přípravu V158D-FVII): 5'-CCC CTT TGG GGC AGT CCT TGC CCC CCA C-3'

SEQ ID N0:8 (DNA primer pro přípravu E296V/M298Q-FVII):

5-GCC ACG GCC CTG GTG CTC CAG GTC CTC AAC GTG CCC-3'

SEQ ID N0:9 (DNA primer pro přípravu E296V/M298Q-FVII):

5-GGG CAC GTT GAG GAC CTG GAG CAC CAG GGC CGT GGC-3'

Průmyslová využitelnost

Předmětný vynález může být využit při produkci polypeptidů lidského koagulačního faktoru Vila s koagulační aktivitou, použitelných pro Iniciaci hemostatického procesu. Dále se využívá při produkci polynukleotidových útvarů kódujících tyto polypeptidy, vektorů a hostitelských buněk obsahujících a exprimujících polynukleotid, farmaceutických prostředků, a v léčebných metodách využívajících těchto látek. Je využitelný pro léčbu poruch krvácivosti nebo krvácivých příhod u subjektu nebo pro zlepšení normálního hemostatického systému.

Claims

Patentové nároky

1. Polypeptid faktoru VII, zahrnující nejméně dvě substituce vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO. 1, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.
2. Polypeptid faktoru VII podle nároku 1, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a K157 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.
3. Polypeptid faktoru VII podle nároku 1 nebo 2, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a K337 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.
4. Polypeptid faktoru VII podle ktéréhokoli z nároků 1 až 3, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a D334 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.
5. Polypeptid faktoru VII podle ktéréhokoli z nároků 1 až 4, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a S336 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.
6. Polypeptid faktoru VII podle ktéréhokoli z nároků 1 až 5, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a V158je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.
7. Polypeptid faktoru VII podle ktéréhokoli z nároků 1 až 6, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a E296 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.
8. Polypeptid faktoru VII podle ktéréhokoli z nároků 1 až 7, kde L305 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou a M298 je nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.
9. Polypeptid faktoru VII podle ktéréhokoli z nároků 1 až 8, kde nejméně jedna aminokyselina ve zbývajících polohách proteázové domény je nahrazena jakoukoli jinou aminokyselinou.

• ·
10. Polypeptid faktoru VII podle nároku 9, kde nanejvýš 20 dalších aminokyselin ve zbývajících polohách proteázové domény bylo nahrazeno jinými aminokyselinami.
11. Polypeptid faktoru VII podle ktéréhokoli z nároků 9 až 10, kde nejméně jedna aminokyselina odpovídající aminokyselině v poloze zvolené od 159 do 170 SEQ ID NO:1 byla nahrazena jakoukoli jinou aminokyselinou.
12. Polypeptid faktoru VII podle ktéréhokoli z nároků 9 až 11, kde nejméně jedna aminokyselina odpovídající aminokyselině v poloze zvolené od 290 do 304 SEQ ID NO:1 byla nahrazena jakoukoli jinou aminokyselinou.
13. Polypeptid faktoru VII podle nároku 12, kde R304 byl nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Tyr, Phe, Leu a MEt.
14. Polypeptid faktoru VII podle ktéréhokoli z nároků 9 až 13, kde nejméně jedna aminokyselina odpovídající aminokyselině v poloze zvolené od 306 do 312 SEQ ID NO:1 byla nahrazena jakoukoli jinou aminokyselinou.
15. Polypeptid faktoru VII podle nároku 14, kde M306 byl nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Asp a Asn.
16. Polypeptid faktoru VII podle nároku 14, kde D309 byl nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Ser a Thr.
17. Polypeptid faktoru VII podle ktéréhokoli z nároků 9 až 16, kde nejméně jedna aminokyselina odpovídající aminokyselině v poloze zvolené od 330 do 339 SEQ ID NO:1 byla nahrazena jakoukoli jinou aminokyselinou.
18. Polypeptid faktoru VII podle ktéréhokoli z nároků 9 až 17, kde A274 byl nahrazen jakoukoli jinou aminokyselinou.
19. Polypeptid faktoru VII podle nároku 18, kde A274 byl nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Met, Leu, Lys a Arg.

• ·
20. Polypeptid faktoru VII se dvěma substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde tyto substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z jedné aminokyseliny zvolené ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.
21. Polypeptid faktoru VII se třemi substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde tyto substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou ze dvou aminokyselin zvolených ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.
22. Polypeptid faktoru VII se čtyřmi substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde tyto substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou ze tří aminokyselin zvolených ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.
23. Polypeptid faktoru VII s pěti substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID ΝΟ.Ί, kde tyto substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou ze čtyř aminokyselin zvolených ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.
24. Polypeptid faktoru VII se šesti substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID ΝΟΊ, kde tyto substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z pěti aminokyselin zvolených ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.
25. Polypeptid faktoru VII se sedmi substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde tyto substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou ze šesti aminokyselin zvolených ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.
26. Polypeptid faktoru VII s osmi substitucemi vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID ΝΟ.Ί, kde tyto substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou • · • ·

47 *· *’ .....

aminokyselinou a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z aminokyselin zvolených ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.
27. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoli z nároků 1, 2, 20 až 26, kde K157 byl nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.
28. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoli z nároků 1, 3, 20 až 26, kde K337 byl nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Ala, Gly, Val, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.
29. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoli z nároků 1, 4, 20 až 26, kde D334 byl nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Gly a Glu.
30. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoli z nároků 1, 5, 20 až 26, kde S336 byl nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Gly a Glu.
31. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoli z nároků 1, 6, 20 až 26, kde V158 byl nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Ser, Thr, Asn, Gin, Asp a Glu.
32. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoli z nároků 1, 7, 20 až 26, kde E296 byl nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Arg, Lys a Val.
33. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoli z nároků 1, 8, 20 až 26, kde M298 byl nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Lys, Arg, Gin a Asn.
34. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, 20 až 26, kde L305 byl nahrazen aminokyselinou zvolenou ze skupiny sestávající z Val, Tyr a lle.
35. Polypeptid faktoru VII podle nároku 34. kde L305 byl nahrazen Val.

• · » • · • a • · · » « 4 · • · « · · · a • · · · · *····*«
36. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoli z nároků 1 až 12, 14, 17 až 18, 20 až 26, kde aminokyselina byla nahrazena jakoukoli jinou aminokyselinou, jež může být kódována polynukleotidovými útvary.
37. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoli z nároků 1 až 36, kde polypeptidový faktor VII je lidský faktor VII.
38. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoli z nároků 1 až 36, kde polypeptidový faktor VII je lidský faktor Vila.
39. Polypeptid faktoru VII podle kteréhokoli z nároků 1 až 38, kde poměr mezi aktivitou polypeptidu faktoru VII a aktivitou přirozeného polypeptidu faktoru Vila znázorněném v SEQ ID NO:1 je nejméně 1,25.
40. Polypeptid faktoru VII podle nároku 39, kde tento poměr je nejméně 2,0, výhodně nejméně 4,0.
41. Polypeptid faktoru VII podle nároku 20, jenž je L305V/K337A-FVII.
42. Polypeptid faktoru VII podle nároku 22, jenž je

L305VA/158D/E296V/M298Q-FVII.
43. Polypeptid faktoru VII podle nároku 23, jenž je

L305VA/158D/E296V/M298Q/K337A-FVII.
44. Polynukleotidový útvar kódující polypeptid faktoru VII podle kteréhokoli z nároků 1 až 43.
45. Polynukleotidový útvar podle nároku 44, jenž je vektor.
46. Hostitelská buňka obsahující polynukleotidový útvar podle kteréhokoli z nároků 44 až 45.
47. Hostitelská buňka podle nároku 46, jež je to eukaryotická buňka.

»*· · ·· · 4 * « · · « • · · · · • · « · · · ·*····· · Μ • * ·· ·· · · «
48. Hostitelská buňka podle nároku 47, jež je savčího původu.
49. Hostitelská buňka podle nároku 48, kde je buňka vybrána ze skupiny sestávající z buněk CHO, HEK a BHK.
50. Transgenní zvíře obsahující a exprimující polynukleotidový útvar, definovaný v nároku 44.
51. Transgenní rostlina obsahující a exprimující polynukleotidový útvar, definovaný v nároku 44.
52. Metoda výroby polypeptidu faktoru VII definovaného kterýmkoli z nároků 1 až 43, metoda zahrnující kultivaci buňky tak, jak je definováno v kterémkoli z nároků 46 až 49 ve vhodném růstovém médiu za podmínek umožňujících expresi polynukleotidového útvaru a získávání výsledného polypeptidu z média kultury.
53. Metoda výroby polypeptidu faktoru VII definovaného kterýmkoli z nároků 1 až 43, metoda zahrnující získávání výsledného polypeptidu z mléka produkovaného transgenním zvířetem, jak je definováno v nároku 50.
54. Metoda výroby polypeptidu faktoru VII definovaného kterýmkoli z nároků 1 až 43, metoda zahrnující kultivaci buňky transgenní rostliny, jak je definováno v nároku 51, a získávání polypeptidu faktoru VII z rostliny.
55. Farmaceutická kompozice zahrnující polypeptid faktoru VII, obsahující nejméně dvě substituce vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin zvolených ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298; a volitelně farmaceuticky přijatelný nosič.
56. Farmaceutická kompozice zahrnující polypeptid faktoru VII, definovaná v kterémkoli z nároků 1 až 43, a volitelně farmaceuticky přijatelný nosič.

···· ·· ·· «
57. Použití polypeptidu faktoru VII, obsahujícího nejméně dvě substituce vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:1, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin zvolených ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298; pro přípravu léku.
58. Použití polypeptidu faktoru VII podle nároku 57, kde lék je určen pro léčbu poruch krvácivosti nebo krvácivých příhod nebo pro zlepšení normálního hemostatického systému.
59. Použití polypeptidu faktoru VII tak, jak je definováno v kterémkoli z nároků 1 až 43 pro přípravu léku pro léčbu poruch krvácivosti nebo krvácivých příhod nebo pro zlepšení normálního hemostatického systému.
60. Použití podle kteréhokoli z nároků 57 až 59 pro léčbu hemofilie A nebo B.
61. Metoda pro léčbu poruch krvácivosti nebo krvácivých příhod u subjektu nebo pro zlepšení normálního hemostatického systému, metoda zahrnující podávání potřebnému subjektu terapeuticky nebo profylakticky účinného množství polypeptidu faktoru VII obsahujícího nejméně dvě substituce vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID ΝΟ.Ί, kde substituce jsou (i) nahrazení L305 jakoukoli jinou aminokyselinou a (ii) nahrazení jakoukoli jinou aminokyselinou z jedné nebo více aminokyselin zvolených ze skupiny sestávající z K157, K 337, D334, S336, V158, E296 a M298.
62. Metoda pro léčbu poruch krvácivosti nebo krvácivých příhod u subjektu nebo pro zlepšení normálního hemostatického systému, metoda zahrnující podávání potřebnému subjektu terapeuticky nebo profylakticky účinného množství polypeptidu faktoru VII, jak je definováno v kterémkoli z nároků 1 až 43.
63. Polypeptid faktoru VII definovaný v kterémkoli z nároků 1 až 43 pro použití jako léčivo.