DK162124B - Maerkede nucleinsyresonder og addukter til fremstilling heraf - Google Patents
Maerkede nucleinsyresonder og addukter til fremstilling heraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK162124B DK162124B DK342784A DK342784A DK162124B DK 162124 B DK162124 B DK 162124B DK 342784 A DK342784 A DK 342784A DK 342784 A DK342784 A DK 342784A DK 162124 B DK162124 B DK 162124B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- nucleic acid
- label
- dna
- probe according
- probe
- Prior art date
Links
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 47
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 47
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 47
- 239000000126 substance Substances 0.000 title description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 36
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 31
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 31
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 claims description 18
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 17
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 15
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 15
- -1 furocoumarins Chemical class 0.000 claims description 15
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000006552 photochemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 3
- 239000000999 acridine dye Substances 0.000 claims description 2
- 229940111121 antirheumatic drug quinolines Drugs 0.000 claims description 2
- 150000005053 phenanthridines Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002988 phenazines Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000001484 phenothiazinyl group Chemical class C1(=CC=CC=2SC3=CC=CC=C3NC12)* 0.000 claims description 2
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 claims description 2
- 150000003248 quinolines Chemical class 0.000 claims description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 claims 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 30
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- WBIICVGYYRRURR-UHFFFAOYSA-N 3-(aminomethyl)-2,5,9-trimethylfuro[3,2-g]chromen-7-one Chemical compound O1C(=O)C=C(C)C2=C1C(C)=C1OC(C)=C(CN)C1=C2 WBIICVGYYRRURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical class C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- ALDYXYRBHNYQRB-XEGUGMAKSA-N (2-nitrophenyl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1OC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 ALDYXYRBHNYQRB-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 4
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 3
- XDROKJSWHURZGO-UHFFFAOYSA-N isopsoralen Natural products C1=C2OC=CC2=C2OC(=O)C=CC2=C1 XDROKJSWHURZGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 2
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 description 2
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QXKHYNVANLEOEG-UHFFFAOYSA-N Methoxsalen Chemical compound C1=CC(=O)OC2=C1C=C1C=COC1=C2OC QXKHYNVANLEOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N Quinine Chemical compound C([C@H]([C@H](C1)C=C)C2)C[N@@]1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 description 2
- ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N allyl isothiocyanate Chemical compound C=CCN=C=S ZOJBYZNEUISWFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- CTSPAMFJBXKSOY-UHFFFAOYSA-N ellipticine Chemical compound N1=CC=C2C(C)=C(NC=3C4=CC=CC=3)C4=C(C)C2=C1 CTSPAMFJBXKSOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229960004469 methoxsalen Drugs 0.000 description 2
- SQBBOVROCFXYBN-UHFFFAOYSA-N methoxypsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C(OC)=CC2=CC2=C1OC=C2 SQBBOVROCFXYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- IDBIFFKSXLYUOT-UHFFFAOYSA-N netropsin Chemical compound C1=C(C(=O)NCCC(N)=N)N(C)C=C1NC(=O)C1=CC(NC(=O)CN=C(N)N)=CN1C IDBIFFKSXLYUOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 150000002924 oxiranes Chemical class 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MLMVLVJMKDPYBM-UHFFFAOYSA-N pseudoisopsoralene Natural products C1=C2C=COC2=C2OC(=O)C=CC2=C1 MLMVLVJMKDPYBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 235000011890 sandwich Nutrition 0.000 description 2
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 229960000850 trioxysalen Drugs 0.000 description 2
- KUWPCJHYPSUOFW-SCWFEDMQSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-(2-nitrophenoxy)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)OC1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-SCWFEDMQSA-N 0.000 description 1
- YUDNXDTXQPYKCA-YDHLFZDLSA-N (4-nitrophenyl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 YUDNXDTXQPYKCA-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQIAZOCLNBBZQK-UHFFFAOYSA-N 1-(1,2-Diphosphanylethyl)pyrrolidin-2-one Chemical compound PCC(P)N1CCCC1=O LQIAZOCLNBBZQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LAOOXBLMIJHMFO-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(diethylamino)ethylamino]-4-methylthioxanthen-9-one;hydron;chloride Chemical compound Cl.S1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C(C)=CC=C2NCCN(CC)CC LAOOXBLMIJHMFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOTKRQAVGJMPNV-UHFFFAOYSA-N 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(F)C([N+]([O-])=O)=C1 LOTKRQAVGJMPNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHXWOZNNPSXUKN-UHFFFAOYSA-N 2-azido-9h-fluorene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C3CC2=C1 NHXWOZNNPSXUKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWMBSMJCJWZRNR-UHFFFAOYSA-N 2-pyren-1-yloxirane Chemical compound C1OC1C1=CC=C(C=C2)C3=C4C2=CC=CC4=CC=C13 SWMBSMJCJWZRNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MDQUSQOIBBZWLQ-UHFFFAOYSA-N 3-azidoacridine Chemical compound C1=CC=CC2=NC3=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C3C=C21 MDQUSQOIBBZWLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHDBZCJYSHDCKF-UHFFFAOYSA-N 4,6-dichlorotriazine Chemical group ClC1=CC(Cl)=NN=N1 IHDBZCJYSHDCKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNRKUCSCGGPAQC-UHFFFAOYSA-N 4-(2-aminoacetyl)oxybutyl 2-aminoacetate Chemical compound NCC(=O)OCCCCOC(=O)CN DNRKUCSCGGPAQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YFHYLFGKDYAHBW-UHFFFAOYSA-N 4-azido-7-chloroquinoline Chemical compound [N-]=[N+]=NC1=CC=NC2=CC(Cl)=CC=C21 YFHYLFGKDYAHBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUNGCZLFHHXKBX-UHFFFAOYSA-N 8-methoxypsoralen Natural products C1=CC(=O)OC2=C1C=C1CCOC1=C2OC BUNGCZLFHHXKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFOMVRGJRFLFCJ-UHFFFAOYSA-N 9-azidoacridine Chemical compound C1=CC=C2C(N=[N+]=[N-])=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 BFOMVRGJRFLFCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N Aflatoxin G Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1C1C=COC1O2 XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N Benz[a]pyrene Chemical compound C1=C2C3=CC=CC=C3C=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OJRUSAPKCPIVBY-KQYNXXCUSA-N C1=NC2=C(N=C(N=C2N1[C@H]3[C@@H]([C@@H]([C@H](O3)COP(=O)(CP(=O)(O)O)O)O)O)I)N Chemical compound C1=NC2=C(N=C(N=C2N1[C@H]3[C@@H]([C@@H]([C@H](O3)COP(=O)(CP(=O)(O)O)O)O)O)I)N OJRUSAPKCPIVBY-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000001258 Cinchona calisaya Nutrition 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- SXFPNMRWIWIAGS-UHFFFAOYSA-N Khellin Natural products COC1C2CCOC2C(OC)C3OC(C)CC(=O)C13 SXFPNMRWIWIAGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- WNYOPINACXXCOV-BCAICVSZSA-N N-[(4S,7R,11S,17S,20R,24S)-2,4,12,15,17,25-hexamethyl-11,24-bis[(2R)-3-methylbutan-2-yl]-27-methylsulfanyl-3,6,10,13,16,19,23,26-octaoxo-20-(quinoxaline-2-carbonylamino)-9,22-dioxa-28-thia-2,5,12,15,18,25-hexazabicyclo[12.12.3]nonacosan-7-yl]quinoxaline-2-carboxamide Chemical compound CSC1SCC2N(C)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](COC(=O)[C@H]([C@H](C)C(C)C)N(C)C(=O)C1N(C)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](COC(=O)[C@H]([C@H](C)C(C)C)N(C)C2=O)NC(=O)c1cnc2ccccc2n1)NC(=O)c1cnc2ccccc2n1 WNYOPINACXXCOV-BCAICVSZSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010042309 Netropsin Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- GULVULFEAVZHHC-IITWSDOJSA-N Triostin A Chemical compound O=C([C@@H]1CSSC[C@H](N(C(=O)[C@H](C)NC2=O)C)C(=O)N(C)[C@H](C(OC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1C)NC(=O)C=1N=C3C=CC=CC3=NC=1)=O)C(C)C)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)OC[C@H]2NC(=O)C1=CN=C(C=CC=C2)C2=N1 GULVULFEAVZHHC-IITWSDOJSA-N 0.000 description 1
- VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N UNPD55612 Natural products N1C(O)C2CC(C=CC(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCWZKQSKUXXDDJ-UHFFFAOYSA-N Xanthotoxin Natural products COCc1c2OC(=O)C=Cc2cc3ccoc13 PCWZKQSKUXXDDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- PEJLNXHANOHNSU-UHFFFAOYSA-N acridine-3,6-diamine;10-methylacridin-10-ium-3,6-diamine;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=NC3=CC(N)=CC=C3C=C21.C1=C(N)C=C2[N+](C)=C(C=C(N)C=C3)C3=CC2=C1 PEJLNXHANOHNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 235000016720 allyl isothiocyanate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N anthramycin Chemical compound N1[C@@H](O)[C@@H]2CC(\C=C\C(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- HINUXGZHCXYZMB-DJNFHWKQSA-N beta-Rhodomycin Chemical compound O([C@H]1C[C@]([C@@H](C2=C(O)C=3C(=O)C4=CC=CC(O)=C4C(=O)C=3C(O)=C21)O)(O)CC)[C@H]1C[C@H](N(C)C)[C@H](O)[C@H](C)O1 HINUXGZHCXYZMB-DJNFHWKQSA-N 0.000 description 1
- 229930182873 beta-Rhodomycin Natural products 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- TXFLGZOGNOOEFZ-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl)amine Chemical class ClCCNCCCl TXFLGZOGNOOEFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N chembl1408157 Chemical compound N=1C2=CC=CC=C2C(C(=O)O)=CC=1C1=CC=C(O)C=C1 KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N cinchonine Natural products C1C(C(C2)C=C)CCN2C1C(O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940125758 compound 15 Drugs 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000006193 diazotization reaction Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000001909 effect on DNA Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 150000002220 fluorenes Chemical class 0.000 description 1
- 150000008376 fluorenones Chemical class 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000006713 insertion reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- HSMPDPBYAYSOBC-UHFFFAOYSA-N khellin Chemical compound O1C(C)=CC(=O)C2=C1C(OC)=C1OC=CC1=C2OC HSMPDPBYAYSOBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002801 khellin Drugs 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000005415 magnetization Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- UPBAOYRENQEPJO-UHFFFAOYSA-N n-[5-[[5-[(3-amino-3-iminopropyl)carbamoyl]-1-methylpyrrol-3-yl]carbamoyl]-1-methylpyrrol-3-yl]-4-formamido-1-methylpyrrole-2-carboxamide Chemical compound CN1C=C(NC=O)C=C1C(=O)NC1=CN(C)C(C(=O)NC2=CN(C)C(C(=O)NCCC(N)=N)=C2)=C1 UPBAOYRENQEPJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N p-cresol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1 IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N phenanthrridine Natural products C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=NC2=C1 RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000886 photobiology Effects 0.000 description 1
- 150000003057 platinum Chemical class 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 229960000286 proflavine Drugs 0.000 description 1
- ZXLJWZULPBXHSY-UHFFFAOYSA-N pyrano[2,3-g]chromene-2,7-dione Chemical class O1C(=O)C=CC2=C1C=C1C=CC(=O)OC1=C2 ZXLJWZULPBXHSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000948 quinine Drugs 0.000 description 1
- 229930183794 quinomycin Natural products 0.000 description 1
- 108700038839 quinomycin Proteins 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 108010042747 stallimycin Proteins 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- YMBCJWGVCUEGHA-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium chloride Chemical compound [Cl-].CC[N+](CC)(CC)CC YMBCJWGVCUEGHA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 229940071559 trioxin Drugs 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- JWVYQQGERKEAHW-UHFFFAOYSA-N xanthotoxol Chemical class C1=CC(=O)OC2=C1C=C1C=COC1=C2O JWVYQQGERKEAHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
DK 162124 B
Den foreliggende opfindelse angår en mærket nuclein-syresonde samt en fotokemisk fremgangsmåde og et mellemprodukt til fremstilling deraf. Den her omhandlede, mærkede nucleinsyresonde er udviklet med henblik på påvisning ved 5 hybridiseringsanalyser til bestemmelse af særlige polynucleo-tid-sekvenser.
Den mest effektive og følsomme fremgangsmåde til påvisning af nucleinsyrer, såsom DNA, efter hybridisering kræver radioaktivt mærket DNA. Anvendelsen af autoradiografi 10 og enzymer gør analysen tidsrøvende og kræver et erfarent teknisk personale. For nylig er en ikke-radioaktiv fremgangsmåde til mærkning af DNA blevet beskrevet i EP offentliggørelsesskrift nr. 63.879, ved hvilken der anvendes en nicktranslation for at indsætte biotinyleret U-rest på DNA 15 i stedet for T. Biotinresten afprøves derefter med antibio-tinantistof eller et avidin-holdigt system. Påvisningen er i dette tilfælde hurtigere end autoradiografi, men fremgangsmåden med nicktranslation er en højt udviklet teknik. Desuden fungerer biotinylering ved hjælp af biotinyleret UTP kun 20 for thymin-holdige polynucleotider. Anvendelse af andre nucleotidtriphosphater er meget vanskelig, fordi den kemiske derivatisering af A eller G eller C (indeholdende -NH2) med biotin kræver veluddannende og yderst erfarne organiske kemikere.
25 Det er således opfindelsens formål at tilvejebringe et forenklet system til påvisning af nucleinsyrer ved hjælp af hybridiseringsanalyser, hvilket system let kan produceres og anvendes uden de ulemper, der er anført ovenfor.
Dette og andre formål med og fordele ved fremgangsmå-30 den opnås ifølge opfindelsen ved, at nucleinsyren er fotokemisk bundet til en fotoreaktiv, nucleinsyre-bindende ligand, f.eks. en intercalator(indskudt)-forbindelse, såsom en furokumarin- eller en phenanthridinforbindelse, eller en ikke-intercalatorforbindelse, såsom netropsin, distamycin, 35 Hoechst 33258 og bis-benzimidazol, som på sin side er bundet til et mærkestof, der kan "aflæses" eller afprøves på gængs 2
DK 162124 B
måde, herunder ved fluorescenspåvisning. I overensstemmelse hermed er den her omhandlede, mærkede nucleinsyresonde ejendommelig ved, at den består af (a) en nucleinsyrekomponent, (b) en nucleinsyrebindende ligand, som ved en fotokemisk 5 reaktion er bundet til nucleinsyrekomponenten, og (c) et mærkestof, som er kemisk bundet til (b).
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af den her omhandlede, mærkede nucleinsyresonde er ejendommelig ved, at sonden bringes i berøring med et mellemprodukt 10 bestående af en nucleinsyrebindende ligand og et mærkestof, som er kemisk bundet hertil, og at sonden og mellemproduktet udsættes for fotokemisk bestråling.
Tilsvarende er det her omhandlede mellemprodukt ejendommeligt ved, at det omfatter en nucleinsyrebindende ligand 15 og et mærkestof, som er kemisk bundet dertil.
Denne fotokemiske fremgangsmåde giver mere gunstige reaktionsbetingelser end den sædvanlige kemiske koblingsmetode for biokemisk følsomme stoffer. Ved at anvende de rigtige bølgelængder til stråling kan DNA, RNA og proteiner 20 modificeres uden på negativ måde at påvirke polymerenes oprindelige struktur. Den nucleinsyre-bindende ligand, der herefter eksemplificeres af en intercalator, og mærkestof kobles først og fotoreageres derefter med nucleinsyren. Et almengyldigt skema for kobling af en nucleinsyre, f.eks.
25 dobbeltstrenget DNA, med et mærkestof, såsom en hapten eller et enzym, er følgende: Mærkestof + fotoreaktiv 3 0 intercalator
Mærket foto- dobbeltstrenget DNA
reaktiv in- ^ tercalator 35 v/
mærket DNA
3
DK 162124 B
Når den hybridiserbare del af sonden er i dobbeltstrenget form, denatureres denne del derpå, således at der fås en hybridiserbar, enkeltstrenget del. Alternativt kan, når det mærkede DNA omfatter en hybridiserbar del, der al-5 lerede foreligger i enkeltstrenget form, en sådan denaturering undgås, om ønsket. Alternativt kan dobbeltstrenget DNA mærkes ved hjælp af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, efter at hybridisering er sket ved hjælp af et hybridiseringssy-stem, der kun danner dobbeltstrenget DNA i nærvær af den 10 sekvens, der skal påvises.
Til fremstilling af specifikke og effektive fotokemiske produkter er det ønskeligt, at nucleinsyrekomponenten og den fotoreaktive intercalatorforbindelse først undergår en intercalationsreaktion i mørke, hvorefter fotoadditions-15 produktet dannes ved bestråling med UV-lys.
Til kobling med DNA er aminomethylpsoralen, aminomethylangelicin og aminoalkylethidium- eller -methi-diumazider særlig anvendelige forbindelser. De bindes til dobbeltstrenget DNA, og kun komplekset giver foto-20 addukt. I tilfælde af, at mærket dobbeltstrenget DNA skal denatureres for at give en hybridiserbar, enkeltstrenget region, anvendes sådanne betingelser, at der forhindres samtidig indbyrdes virkning mellem de to DNA-strenge med et enkelt fotoaddukt. Det er nødvendigt, 25 at modifikationsfrekvensen langs en hybridiserbar enkeltstrenget del af sonden ikke er så stor, at den i det væsentlige hindrer hybridisering, og følgelig vil der fortrinsvis kun være ét modifikationssted pr. 25, mere almindeligt 50 og fortrinsvis 100 nucleotidbaser. Angeli-30 cinderivater er bedre end psoralenforbindelser til mo-noadduktdannelse. Hvis en enkeltstrenget sonde bindes covalent til noget ekstra dobbeltstrenget DNA, er anvendelse af phenanthridium- eller psoralenforbindelser ønskelig, eftersom disse forbindelser indbyrdes virker 25 specifikt for dobbeltstrenget DNA i mørke. Kemien ved syntesen af de koblede reagenser til modificering af nu-cleinsyrer med henblik på mærkning, der er beskrevet me- 4
DK 162124 B
O
re detaljeret nedenfor, foregår på lignende måde i alle tilfælde.
Nucleinsyrekomponenten kan være enkelt- eller-dobbeltstrenget DNA eller KNA eller fragmenter deraf, 5 som produceres af restriktionsenzymer eller endog forholdsvis korte oligomere.
Nucleinsyre-bindende ligander ifølge den foreliggende opfindelse, der anvendes til at binde nUclein-surekomponenten med mærkestoffet, kan være en hvilken 10 som helst passende fotoreaktiv form af kendte nuclein-syrebindende ligander. Særlig foretrukne nucleinsyre-bindende ligander er intercalatorforbindelser såsom fu-rokumariner, f.eks. angelicin (isopsoralen) eller psoralen eller derivater deraf, der reagerer fotokemisk med 15 nucleinsyrer, f.eks. 41-aminomethy1-4,5'-dimethylange- licin, 41-aminomethyItrioxsalen / 4,-aminomethyl-4,5',8--trimethyl-psoralen, 3-carboxy-5- eller -8-amino- eller -hydroxypsoralen samt mono- eller bis-azidoaminoalkylme-thidium--'eller -ethidiumforbindelser. Fotoreaktive for 20 mer af en række forskellige andre intercalaterende midler kan også anvendes, således som eksempelvis anført i nedenstående tabel:
Intercalator-klasser og re-25 præsentative forbindelser Litteraturreferencer A. Acridinfarvestoffer Lerman, J. Mol. Biol. 3:18(1961);
Bloomfield m.fl. "Physical Che-proflavin, acridin- mistry of Nucleic Acids", kap. 7,
30 orange, guinacrin, side 429-476, Harper & Rowe, NY
acriflavin (1974), Miller m.fl. Biopolymers 19:2091 (1980).
B. Phenanthridiner Bloomfield m.fl. supra ethidium Miller m.fl. supra 35 coralyn Wilson m.fl. J. Med. Chem. 19: 1261 (1976) 5
O
DK 162124 B
Intercalator-klasser og repræsentative forbindelser Litteraturreferencer 5 ellipticin, ellip- Festy m.fl., FEBS Letters 17: ticinkation og de- 321 (1971) rivater Kohn m.fl., Cancer Res. 36:71 (1976), LePecqm.fi., PNAS (USA) 71:5078, Pelaprat m.fl., J.
10 Med.Chem. 23:1330 (1980).
C. Phenaziner Bloomfield, m.fl. supra 5-methylphenazinkat- ion D. Phenothiaziner 15 chlopromazin samme E. Quinoliner chlorquin samme kinin F. Aflatoxin samme 20 G. Polycycliske carbon- hydrider og deres samme oxiranderivater 3,4-benzpyrenbenzo- Yang m.fl., Biochem. Biophys. pyrendiolepoxid, 1- Res. Comm. 82:929 (1978) 25 pyrenyloxiran benzanthracin-5,6- Amea m.fl., Science 176:47 (1972) oxid H. Actinomyciner Bloomfield m.fl., supra,
actinomycin D
30 I. Anthracyclinoner samme β-rhodomycin A Daunamycin J. Thiazanthenoner samme
miracil D
35 K. Anthramycin samme 6
DK 162124 B
O
Intercalator-klasser og repræsentative forbindelser_ Litteraturreferencer_ 5 L. Mitomycin Ogawa m.fl., Nucl. Acids
Res., Spec. Publ. 3:79(1977), ARhtar m.fl., Can. J. Chem.
Res. 11:211 (1978) M. Platinkomplekser Lippard, Accts. Chem. Res.
10 11:211 (1978) N. Polyintercalatorer ethinomycin Warin m.fl., Nature 252: 653 (1974)
Wake.lin, Biochem. J. 157: 15“ 72Ϊ (1976) quinomycin triostin Lee m.fl., Biochem. J. 173: BBM028A tandem 115(1978), Huang m.fl. Bio chem. 19:5537(1980), Viswa-mitra m.fl., Nature 289:817 20 (1981) diaeridiner LePecq m.fl., PNAS(USA)72: 2915(1975), Carrelakis m.fl. Biochim. Biophys. Acta 418: 277(1976), Wakelin m.fl., 25 Biohcem 17:5057(1978), Wake lin m.fl., FEBS Lett. 104: 261(1979), Capeile m.fl.,
Biochem. 18:3354(1979), Wrightm.fi., Biochem. 19: 30 5825(1980), Bernier m.fl.,
Biochem. J. 199:479(1981),
King rrufl., Biochem. 21: 4982(1982) ethidiumdimer Gaugainm.fi., Biochem. 17: 35 5078(1978), Kuhlmanm.fi.,
Nucl. Acids Res. 5:2629(1978), 7
DK 162124 B
O
Intercalator-klasser og repræsentative forbindelser Litteraturreferencer 5 Marlcovits m.fl., Anal.Bio- chem. 94:259(1979), Dervan m.fl., JACS 100:1968(1978), samme 101:3664(1979).
ellipticendimere og Debarre m.fl., Compt. Rend.
10 analoge Ser. D. 284:81(1977), Pe- laprat m.fl., J. Med. Chem. 23:1336(1980).
heterodimere Cain m.fl., J. Med. Chem.
21:658(1978), Gaugainm.fi.
15 Biochem. 17:5078(1978) trimere Hansen m.fl., JCS Chem. Comm.
162(1983), Atnell m.fl., JACS 105:2913(1983) O. Norphillin A Loun m.fl., JACS, 104:3213 20 (1982) P. Fluorener og fluorenoner Bloomfield m.fl., supra.
fluorenodiaminer Witkowski m.fl., Wiss. Beitr.-
Martin-Luther-Univ. Halle Wittenberg, 11(1981).
25 Q. Furokumariner angelicin Venema m.fl., MGG, Mol. Gen.
Genet. 179:1(1980) 4,51-dimethylangelicin Vedaldim.fi., Chem.-Biol.
Interact. 36:275(1981) 30 psoralen Marciani m.fl., Z.Naturforsch B 27 (2):196 (1972) 8-methoxypsoralen Belognzovm.fi., Mutat. Res.
84:11(1981), Scott m.fl., Photochem. Photobiol. 34:63 35 (1981) o 8
DK 162124 B
Intercalator-klasser og repræsentative forbindelser Litteraturreferencer 5 5-aminomethyl-8-me- Hansen m.fl., Tet. Lett. 22: thoxypsoralen 1847(1981).
4,5,8-trimethylpso- Ben-Hur m.fl., Biochem. Biophys. ralen Acta 351:181(1973) 4'-aminomethyl-4,5,- Issacs m.fl., Biochem. 16:1058 10 8-trimethylpsoralen (1977) xanthotoxin Hradecma m.fl., Acta Virol.
'•(Engl, udg.) 26:305 (1982) .
khellin Beaumont m.fl., Biochim.Biophys.
Acta 608:1829(1980) 15 R. Benzodipyroner Murx m.fl, J. Het. Chem. 12:417 (1975), Horter m.fl., Photochem. Photobiol. 20:407(1974) S. Monstral Fast Blue Juarranz m.fl., Acta Histochem.
70:130(1982) 20 Særlig anvendelige fotoreaktive former af sådanne intercalaterende midler er azidointercalatorerne.
Reaktive nitrener deraf dannes let ved langbølget ultraviolet eller synligt lys, og nitrener af arylazider fore-25 trækker indsætningsreaktioner frem disses omlejringsprodukter (jfr. White m.fl., Methods in Enzymol. 46:644 (1977)). Repræsentative azidointercalatorer er 3-azido-acridin, 9-azidoacridin, ethidiumnonoazid, ethidiumdi-azid, ethidium-dimerazid (Mitchell m.fl., JACS 104:4265 30 (1982)), 4-azido-7-chlorquinolin og 2-azidofluoren. An dre anvendelige fotoomsættelige intercalatorer er foruku-marinerne, der danner (2+2) cycloaddukter med pyrimidin-rester. Alkyleringsmidler kan også anvendes såsom bis-chlorethylaminer og -epoxider eller -azidiriner, f.eks.
35 aflatoxiner, polycycliske carbonhydridepoxider, mitomycin og norphillin A.
O
• 9
DK 162124 B
Mærkestoffet, der bindes til nucleinsyrekompo-nenten ifølge den foreliggende opfindelse, kan være en hvilken som helst kemisk gruppe eller rest, der har en påviselig fysisk eller kemisk egenskab. Mærkestoffet 5 skal have en funktionel kemisk gruppe, der gør det muligt at den kan bindes kemisk til intercalatorforbindelsen.
Sådanne mærkningsmaterialer er stærkt udviklet inden for immunanalyseområdet, og i reglen kan de fleste mærkestoffer, der kan anvendes til sådanne fremgangsmåder, og bru-10 ges i forbindelse med den foreliggende opfindelse. Særlig anvendelige er enzymatisk aktive grupper såsom enzymer (jfr. Clin. Chem. (1976)22:1243), enzymsubstrater (jfr. engelsk patentskrift nr. 1.548.741), coenzymer (jfr. US patentskrifterne nr. 4.230.797 og 4.238.565) 15 og enzyminhibitorer (jfr. US patentskrift nr. 4.134.792), fluoresceringsmidler (jfr. Clin. Chem. (1979)25:353) og chromophorer herunder phycobiliproteiner, lysende midler såsom kemisk lysende midler og biologisk lysende midler (jfr. Clin. Chem. (1979)25:512 og samme 1531), 20 ligander, der bindes specifikt og rester omfattende ra- "3 -3 ς o? lie 14 dioisotoper såsom H, S, P, I og C. Sådanne mærkestoffer påvises på basis af deres egne fysiske egenskaber (f.eks. fluoresceringsmidler, chromophorer og radioisotoper) eller deres reaktive eller bindende egen-25 skaber (f.eks. enzymer, substrater, coenzymer og inhibitorer) . Således kan en co-faktor-mærket nucleinsyre påvises ved tilsætning af det enzym, for hvilket mærkestoffet er en cofaktor og et substrat for enzymet. En med hapteri eller ligand (f.eks. biotin) mærket nuclein-30 syre kan påvises ved tilsætning af et antistof eller antistoffragment til haptenen eller et protein (f.eks. a-vidin), der binder liganden, mærket med et påviseligt molekyle. Et sådant påviseligt molekyle kan være et eller andet molekyle med en målelig fysisk egenskab (f.
35 eks. fluorescens eller absorbans) eller en deltager i en enzymreaktion (f.eks. se listen ovenfor). Således kan 10
DK 162124 B
der anvendes et enzym, der på et substrat virker således, at der dannes et produkt med en målelig fysisk egenskab. Eksempler på sidstnævnte omfatter, men er ikke begrænset til /3-galactos idase, alkalisk phosphatase, papain og peroxi-5 dase. Med henblik på hybridiseringsundersøgelser in situ er slutproduktet ideelt vandopløseligt. Andre mærkestoffer vil være indlysende for fagfolk på området.
Mærkestoffet vil blive bundet til intercal at or forbindelsen ved direkte kemisk binding, såsom covalente bindinger.
10 Fremgangsmåder, ved hvilke mærkestoffet bindes til inter-calatorforbindelser, er kendt teknik, og en hvilken som helst egnet metode kan anvendes til fremstilling af det her omhandlede mellemprodukt.
Ifølge opfindelsen kombineres intercalatorforbindelsen 15 først kemisk med mærkestoffet og derefter med nucleinsyre-komponenten. Eftersom f.eks. biotin har en carboxylgruppe, kan det kombineres med en furokumarin ved hjælp af amideller esterdannelse, uden at der gribes ind i furokumarins fotokemiske reaktivitet eller biotins biologiske aktivitet, 20 f.eks.
vy> s
N-1-L(CH2)Zf *· C - 0 - N
* S-1 or biotin-N-hydroxysuccinimid' eller H +RKH2—► (ii) ” <j ,-.
^->-J—<ch2)a- c - o ^_J)-no2 biotin-p-nitrophenyl ester 11
DK 162124 B
O
<uu YY> . S
^N-, J_I- (CH^- C ' NHR
H
_ eller 5 carbodiimid
Biotin + ROH _^ Biotin CO OR
Eksempelvis
CH2NH2 H
10 I 1 O
W"vS <γ*Ύ _> • (ch2)4Coo y— no2
Amt \=J
0 Biotin nitrophenyl ester 5^γ«γ0
I_I_NH
(ch2)aconhch2
Andre aminomethylangelicin-, psoralen- og 25 phenanthridiumderivater kan omsættes på lignende måde lige som phenanthridiumhalogenider og derivater deraf, såsom aminopropylmethidiumchlorid, dvs.
30 '-( -' Cl /CH3 35 0 = C - NH - CH2 - CH2 - CH2 - NH2 12
O
DK 162124 B
(jfr. Hertzbergm.fi., J. Amer. Chem. Soc. 104:313(1982)).
Alternativt kan et bifunktionelt reagens,såsom dithiobis-succinimidylpropionat eller 1,4-butandiol-digly-ciylether, anvendes direkte til at koble det fotokemisk 5 reaktive molekyle med mærkestoffer, når reaktanterne har alkylaminogrupper, og atter på kendt måde med hensyn til opløsningsmidler, mængdeforhold og reaktionsbetingelser. Visse bifunktionelle reagenser, eventuelt glutar-aldehyd, kan ikke anvendes, fordi, medens de kobler, kan 10 de modificere nucleinsvre og således gribe ind i analysen. Der skal tages rutineforholdsregler for at forhindre sådanne vanskeligheder.
Afstandskædelængden mellem nucleinsyre-bin-dingsliganden og mærkestoffet kan udvides via carbonhy-15 drid eller peptid. Et typisk eksempel indebærer forlængelse af et 8-hydroxy-psoralenderivat med et alkylhalo-genid, ifølge den af J.L. deCour og J.Lhomme i Photochemistry Photobiology, 37, 155-161 (1983) beskrevne fremgangsmåde. Det halogenalkylerede derivat omsættes der-20 på enten med thiol eller aminer til fremstilling af en reaktiv gruppe, som det er beskrevet af W.A. Saffran m. fl-, i Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 4594 (1982).
Hvis mærkestoffet er et enzym f.eks., anbringes produktet til sidst på et passende medium, og kata-25 lyseomfanget bestemmes. Hvis således enzymet er en phosphatase, kan mediet indeholde nitrophenylphosphat, og den dannede mængde nitrophenol overvåges ved at iagttage farven. Hvis enzymet er et β-galactosidase, kan mediet indeholde o-nitrophenyl-D-galacto-pyranosid, der 30 også frigør nitrophenol.
Den mærkede nucleinsyre ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes i alle gængse hybridiserings-analysesystemer og i reglen til et hvilket som helst system, der er muligt baseret på dannelse af et hybridise-35 ringsprodukt eller -aggregat, der omfatter den mærkede
DK 162124B
13 0 nucleinsyre. Især kan den særegne mærkede sonde ifølge den foreliggende opfindelse anvendes i opløsnings- eller fastfase-hybridiseringssystemer, herunder i sidstnævnte tilfælde systemer, der indebærer immobilisering af enten prøve- eller sondenucleinsyrer, og sandwichsystemer.
5
Den mærkede nucleinsyresonde omfatter mindst én enkeltstrenget basesekvens, der i hovedsagen er komplementær med eller homolog med den sekvens, der skal påvises. Imidlertid behøver en sådan basesekvens ikke være et enkelt kontinuerligt polynucleotidsegment, men 10 kan indbefatte to eller flere individuelle segmenter af brudt af ikke-homologe sekvenser. Disse ikke-homologe sekvenser kan være lineære, eller de kan være selv-komplementære og danne hårnåleløkker. Desuden kan sondens homologe region være flankeret i 3'- og 5'-endestillin-15 gerne af ikke-homologe sekvenser, såsom dem, der indbefatter DNA'et eller RNA'et i en vektor, hvori den homologe sekvens er blevet indsat med henblik på formering.
I begge tilfælde vil sonden, når den forekommer som et analytisk reagens, udvise påviselig hvbridisering på et 20 eller flere steder med de pågældende nucleinsyrer i prøven. Lineære eller cirkulære enkeltstrengede polynucleo-tider kan anvendes som sondeelement, idet større eller mindre dele er fordoblet med en komplementær polynucle- otid streng eller strenge, forudsat at det eller de kri-25 tiske homologe segment(er) forefindes i enkeltstrenget form og er til rådighed for hybridisering med prøvens DNA eller RNA. Anvendelige sonder omfatter lineære eller cirkulære sonder, hvor den homologe sondesekvens forekommer i hovedsagelig kun enkeltstrenget form (jfr.
30 især Hu og Messing, Gene 17:271 (1982)).
Den mærkede sonde ifølge opfindelsen kan anvendes ved enhver gængs hybridiseringsteknik. Efterhånden som der foretages forbedringer og der udvikles idémæssigt ny systemer, kan disse let anvendes på den fore-35 liggende mærkede sonde. Gængse hybridiseringssystemer, som er særlig anvendelige, indbefatter sådanne, hvor prø- 14
O
DK 162124 B
vens nucleinsyrer eller den polynucleotide sonde immo-biliseres på et fast underlag (fastfase-hybridisering), og sådanne, hvor polynucleotidarter alle findes i opløsning (opløsningshybridisering).
I fastfase-hvbridiseringssystemer er én af de 5 polynucleotide arter, der deltager i hybridiseringen, fastgjort på en passende måde i sin enkeltstrengede form på et fast underlag. Anvendelige faste underlag er kendt og indbefatter 'sådanne, der binder nucleinsyrer enten covalent eller ikke-covalent. Ikke-covalente un- 10 derlag, som i reglen indebærer hydrophob binding, indbefatter naturligt forekommende og syntetiske polymere Materialer, såsom nitrocellulose, derivatiseret nylon og fluoreret polycarbonhydrider i en række forskellige former såsom filtre eller faste ark. Covalente bindings-15 underlag er også anvendelige og omfatter materialer med kemisk reaktive grupper eller grupper såsom dichlortria-zin, diazobenzyloxymethyl og lignende, der kan aktiveres med hensyn til binding på polynucleotider.
En typisk fas'tfase-hvbridiserings teknik begyn- 20 der med immobilisering af prøvens nucleinsyre på underlaget i enkeItstrenget form. Dette indledende trin forhindrer hovedsagelig genannellering af komplementære strenge fra prøven og kan anvendes som et middel til at koncentrere prøvematerialet på underlaget med henblik på bedre påviselighed. Den polynucleotide sonde bringes derpå i berøring med underlaget, og hybridisering påvises ved måling af mærkestoffet som beskrevet her. Det faste underlag udgør et passende middel til at adskille den mærkede sonde, der er blevet hvbridiseret til se-30 kvensen, fra den, der ikke er blevet hvbridiseret.
En anden interessant fremgangsmåde er sand-wich-hybridiseringsteknikken, hvor det ene af to indbyrdes eksklusive fragmenter i sondens homologe sekvens irn- mobiliseres, og den anden mærkes. Tilstedeværelsen af 35 den pågældende polynucleotide sekvens resulterer i dob-
O
DK 162124 B
15 belt hybridisering til de immobiliserede og mærkede sondesegmenter, jfr. Methods in Enzymology 65:468 (1980) og Gene 21:77-85 (1983) med hensyn til yderligere enkeltheder.
5 Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere beskrevet i forbindelse med eksempler, hvor dele er vægtdele, medmindre andet er angivet.
Eksempel 1 10 50 mg N-hydroxysuccinimido-biotin opløses i 2 ml dimethylsulfoxid (opl. A). 10 mg 4'-aminomethyl- trioxsalen (formel 1) (eller andre aminoalkylforbindel-ser) opløses i 10 ml vandig puffer (opl. B),(f.eks. 10 mmolær natriumtetraborat, pH indstillet med HC1), opløs-15 nings-pH ^8. Opløsning (A) og (B) blandes i et volumenforhold på 10:1, så at den aktiverede hapten forekommer i stort overskud. Reaktionen får lov at forløbe ved 35°C i en time. Omfanget af reaktionen overvåges ved tyndtlagschromatografi på slicagelplader med en fluo-20 rescensindikator i et opløsningsmiddel - 1:1:8 methanol/ eddikesyre/chloroform. Under disse TLC-betingelser bevæger uomsat aminomethyltrioxalan sig med opløsningsmiddelfronten, hvorimod produktet har lavere mobilitet.
Biotin viser ikke nogen fluorescens, men adduktet fluo-25 rescerer på grund af trioxsalen. Vækst af den nye fluorescensplet og den oprindelige fluorescensplets forsvinden viser omfanget af produktdannelse. Eftersom det aktiverede biotin findes i stort overskud, svinder fluorescens svarende til udgangsmaterialet ved TLC, ef-30 ter at reaktionen er afsluttet. Overskud af aktivt biotin omsættes med glycyl-glycin eller lysin. Tilstedeværelse af aminosyre-biotinprodukt griber ikke ind i psoralen-biotin-forbindelsernes fotokemiske reaktion med DNA. Derfor er et rensningstrin efter ovennævnte reak-35 tion ikke væsentligt.
16
O
DK 162124 B
Eksempel 2 100 mg biotin-nitrophenylester opløses i 2-5 ml tørt DMSO, og 10 mg 4'-aminomethyl-trioxsalen opløses i 5 ml tørt DMSO. De to opløsninger blandes i et 5 sådant molforhold, at biotin-nitrophenylester er ca.
10 gange så meget som 4'-aminomethyl-trioxsalen. 100 ml triethylamin tilsættes til blandingen og rystes godt.
Forløbet af reaktionen kontrolleres med TLC, og overskud af ureageret biotin-nitrophenylester omsættes med 10 lysin som i eksempel 1. Reaktionen får lov at forløbe i en time ved 35°C, og derpå tilsættes lysin for at læske reaktionen. Herefter afdampes DMSO under vakuum, og den gummiagtige remanens tages op i methanol og kan renses chromatografisk på en LH 20-kolonne ved hjælp af 15 methanol som elueringsmiddeL. Det sidste trin er ikke væsentligt for den fotokemiske vekselvirkning mellem psoralenaddukt og DNA.
Eksempel 3 --- 20 Biotin kan kobles med aminoalkylhydroxyalkyl- forbindelser ved en carbodiimid-formidlet reaktion. 10 mg biotin opløses i 1 ml dimethylformamid. Til denne opløsning tilsættes 5 mg 41-hydroxymethyl-trioxsalen og derefter 10 mg dicyclohexyl-carbodiimid. Reaktionen 25 får lov at forløbe i 20 timer ved stuetemperatur, dicy-clohexylurinstofbundfaldet fjernes, og produktet udvindes ved at fjerne DMF under vakuum. Den samme reaktion kan udføres i pyridin.
De foregående eksempler vil give lignende 30 resultater, hvis aminoalkyl-trioxsalenet erstattes med andre aminoalkyl-furokumariner, phenanthridium-halogenider og lignende.
35
O
DK 162124 B
17
Eksempel 4
Kobling af et enzym til en fotoaktiv amino-f or b inde 1- se og derefter covalent binding til DNA_
Et typisk eksempel er papain. o,l mg/ml pa-5 painopløsning i 100 mmolær phosphatpuffer (pH 8) tilsættes til 10 mg/ml aminomethyl-trioxsalen. Slutopløs-ningen er 1:1 med hensyn til volumen af enzym og foto-aktivatoropløsning. Derefter tilsættes fast dithiobis-succinimidyl-propionat eller dimethyl-sufcerimidat ind-10 til en slutkoncentration på 20^ug/ml. pH overvåges kontinuerligt og holdes på den oprindelig værdi ved hjælp af 0,001 molær natriumhydroxid. Efter at tværbinderen er tilsat to gange, får reaktionen lov at forløbe i 30 minutter ved stuetemperatur. Den frie foto-15 aktive amin skilles fra de enzymbundne forbindelser ved gelfiltrering på "Sephadex'® G-10. Adduktet udelukkes sammen med konjugaterne af frit protein og protein-protein. De fleste af disse urenheder har kun meget ringe virkning på DNA-binding. Eventuelt enzym, 20 der er blevet modificeret og stadig bibeholder sin aktivitet, kan kobles på lignende måde.
Efter rensningen blandes enzymkonjugatet med DNA i vandig puffer (pH 7,5) og bestråles ved 390 nm i en time. Adduktet fraskilles fra den uomsatte rest på 25 "Sephadex" ® (G -100)-kolonne. Aktiviteten afprøves på følgende måde: DNA-enzyrckonjugat dialyseres mod 10 mmolær EDTA indeholdende puffer (pH 6,2). Til 8 ml af DNA-enzym-oplØsningen tilsættes 10 ml 60 mmolær mercap-toethanol og 1 ml 50 mmol cystein (frisk fremstillet).
on
Dette behandles som enzymopløsning. Substratopløsningen fremstilles på følgende måde: 592 mg benzoyl-L-arginin-ethylester-hydro-chlorid opløses i 30 ml vand (BAEE).
Til denne BAEE-opløsning tilsættes 1,6 ml 35 0,01 molær EDTA, 1,6 ml 0,05 molær cystein frisk frem- 18
O
DK 162124 B
stillet, pH justeres til 6,2, og slutvolumen bringes op på 42 ml.
Fremgangsmåde. Ved hjælp af et pH-meter fremstilles følgende prøvesystem ved 25°C: 5 ml substrat 5 5 ml H20 5 ml 3 molær NaCl 1 ml enzymfortynding.
Den mængde 0,01 molær NaOH i ml, der kræves for at opretholde et pH på 6,2, noteres. Et tidsrum på 5 minutter er i reglen tilfredsstillende.
Eftersom enzym ikke er stabilt ved højere temperatur, hvis konjugaterne anvendes til hybridise-ringsanalyser, skal der anvendes lave temperaturer.
(Der skal benyttes enten oligonuclotider eller en ion-stvrke på under 2 mmolær, så at hybridisering kan ske ved lave temperatur).
Eksempel 5
Der dannes identiske produkter, hvis aminoal- 20 kylfotoaktive forbindelser fotoreageres først med DNA, derpå med proteinerne eller enzymer eller haptener.
1 mg/ml DNA og 0,1 mg/ml aminomethyl-trioxsalen blandes i vandig puffer med pH 7,5 og fotobestråles ved 390 nm i 1 time; produktet fældes med ethanol, genop-25 løses derpå i tværbindingspuffer som i eksempel 4, og resten af proceduren foregår på lignende måde.
Hvis monoadduktdannelse er væsentlig, anvendes monoazidoaminopropyl-methidium- eller aminomethyl-3Q angelicinforbindelser under ellers identiske forbindelser.
Eksempel 6
Et glycoprotein kan ved hjælp af redox-reak- tion kobles til en aliphatisk amin. Et typisk eksempel 35 gives nedenfor med peberrods-peroxidase-(HRPO)-kobling
O
DK 162124 B
19 -il 4'-aminomethyltrioxsalen. Der kan anvendes identiske betingelser med en hvilken som helst aminoalkylfor-bindelse.
Skema; 5
HRPO (HRPO)-CHO
RNH„
Z
(HRPO)CH2-NHR <r—|-^·|·—n- (HRPO) -CH = N-R
n4 10
Forsøg: 10 mg HRPO (Sigma Chemical Co.) opløses i 2
ml frisk fremstillet 0,3 molær natriumbicarbonat (pH
8,1). Til enzymopløsningen tilsættes 200 mikroliter 1%'s 2,4-dinitrofluorobenzen i ethanol til blokering 15 af a- og € -aminogrupper og nogle af enzymet hydroxy-grupper. Blandingen rystes blidt i en time ved stuetemperatur. Derpå tilsættes 2 ml 80 mmolær natriumper-iodat i destilleret vand og blandes i 30 minutter ved stuetemperatur. For at læske det uomsatte periodat tilsættes ethylenglycol til en endelig koncentration på 50 mmolær. Opløsningen dialyseres mod 10 mmolær na-triumcarbonatpuffer (pH 9,5) i et koldt rum {(V 4°C).
Til den dialyserede opløsning tilsættes ca. 1 mg fast aminomethyltrioxsalen, og blandingen ryste blidt i 1 o time ved 25 C. Der tilsættes 10 mg natriumborhydrid- (NaBH^)-faststof, og reaktionen får lov at forløbe i 12 timer ved 4°C. Adduktet dialyseres mod den DNA- bindende puffer og fotoreageres derpå ved blanding i et
vægtforhold på 1:1 (enzym:DNA) som tidligere beskrevet. oU
Adskillelsen af DNA-enzymadduktet fra enzymet sker ved gelfiltrering på en "Sephadex"® G-100-kolonne, hvor adduktet udelukkes.
For at forbedre den fotokemiske effektivitet 35 kan der foretages blokering af reaktive HRPO-steder før oxidation med periodat med allylisothiocyanat, som det 20
O
DK 162124 B
er beskrevet af P.K. Nakane m.fl. i Enzyme Labeled Antibodies for Light and Electron Microscopic Localization of Antigens, J. Histochm Cytochem, 14, 790 (1966).
Medmindre andet er anført udføres alle reaktionerne i mørke, eller der opretholdes betingelser med
O
rødt lys.
Perioxidase-aktiviteten måles på følgende måde:
100-500 mikroliter af prøven blandes med 3 ml 0 14 mmolær para-Cresol i 50 mmolær tirs HCl-puffer (pH
7,5). Hertil tilsættes 1 ml 1% Efter 2 minutters forløb tilsættes 3 ml 5 mmolær natriumcyanid i vand for at læske reaktionen. Opløsningens fluorescens måles ved magnetisering 320 nm, emission 410 nm. H. Perschke 15 og E. Broda, Nature 190, 257 (1961), M. Roth, Methods of Biochemical Analysis, bd. 17, udg. D. Glick, Inter-science Publisher, N.Y., 1969, side 236.
Eksempel 7 2o Analyse for mærkestoffer efter DNA-DNA-hybridiserina.
Et illustrerende eksempel gives her med en DNA-DNA-hybridisering med et enkelt stadium. Den metode, der anvendes, når det drejer sig om hybridisering i to-stadier (USSN 511,063) kan også anvendes. Plas-25 mid pBR322 (New England Billab) omsættes med restrik-tionsendonuclease Pst 1 og Pvu 1. Denne dobbeltomsætning giver ét fragment på 126 basepar langs DNA.indeholdende den del med ampicillinresistensgen og et andet fragment af 4236 basepar langs DNA. Det 126 base-30 par lange fragment isoleres ved at foretage dobbeltomsætningen på 5%'s polyacrylamidgel. En del af dette DNA mærkes enten med biotin eller med enzymer som tidligere beskrevet og anvendes som den mærkede sonde.
Med henblik på hybridisering bindes pBR322 afskåret med 35 Pst 1 eller analyseprøvens DNA covalent med cellulose ved hjælp af en fotokemisk metode (USSN 511.064) ved 21
O
DK 162124 B
hjælp af cyanogenbromid-aktivering eller ved en diazo-tiseringsmetode (H. Biinemann, Nucleic Acids Res., 10, 7181 (1982)).
Cellulosen, der indeholder det denaturerede 5 DNA, suspenderes i 5 ramolær saltopløsning til hybridise-ring med enzymkoblet DNA eller suspenderes i 2,4 mol tetraethylammoniumchlorid, når der anvendes biotinyleret DNA. Derpå foretages hybridiseringen som beskrevet af H. Biinemann i Nucleic Acids Research, 10, 7181 10 (1982) til påvisning af apicillinresistensgenet ved hjælp af mærket fragment på 126 basepar som sonde.
Ved lavt saltindhold foretages hybridisering .ved 30-40°C, i 2,4 molær (højt saltindhold) mellem 40 og 50°C.
Efter hybridisering anvendes FITC-mærket avi-* 15 din til afprøvning for biotin, eller en egentlig enzymanalyse foretages med partiklerne.
20 25 30 35
Claims (9)
1. Mærket nucleinsyresonde, kendetegnet ved, at den består af (a) en nucleinsyrekomponent, (b) en nucleinsyrebindende ligand, som ved en fotokemisk reaktion 5 er bundet til nucleinsyrekomponenten, og (c) et mærkestof, som er kemisk bundet til (b).
2. Sonde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den nucleinsyrebindende ligand er en intercalatorforbin-delse valgt blandt acridinfarvestoffer, phenanthridiner, 10 phenaziner, furokumariner, phenothiaziner og quinoliner.
3. Sonde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at mærkestoffet (c) er en ligand, der kan bindes specifikt.
4. Sonde ifølge krav 3, kendetegnet ved, 15 at ligandmærkestoffet omfatter hapten eller biotin.
5. Sonde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at mærkestoffet (c) er et enzym, et phycobili-protin eller en fluorescerende eller luminiscerende gruppe, fortrinsvis en fluoresceingruppe.
6. Sonde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at nucleinsyrekomponenten hovedsagelig fuldstændig foreligger i enkeltstrenget form.
7. Sonde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at nucleinsyrekomponenten omfat- 25 ter en dobbeltstrenget del.
8. Fremgangsmåde til fremstilling af en mærket nucleinsyresonde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at nucleinsyrekomponenten bringes i berøring med et mellemprodukt bestående af en nucleinsyrebindende ligand og et 30 mærkestof, som er kemisk bundet dertil, og at nucleinsyrekomponenten og mellemproduktet udsættes for fotokemisk bestråling.
9. Mellemprodukt til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 8, kendetegnet ved, at det omfatter 35 en nucleinsyrebindende ligand og et mærkestof, som er kemisk bundet dertil.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51393283A | 1983-07-14 | 1983-07-14 | |
| US51393283 | 1983-07-14 | ||
| US06/611,668 US4737454A (en) | 1983-07-14 | 1984-05-18 | Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays |
| US61166884 | 1984-05-18 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK342784D0 DK342784D0 (da) | 1984-07-12 |
| DK342784A DK342784A (da) | 1985-01-15 |
| DK162124B true DK162124B (da) | 1991-09-16 |
| DK162124C DK162124C (da) | 1992-02-17 |
Family
ID=27058044
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK342784A DK162124C (da) | 1983-07-14 | 1984-07-12 | Maerkede nucleinsyresonder og addukter til fremstilling heraf |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4737454A (da) |
| EP (1) | EP0131830B1 (da) |
| AU (1) | AU567952B2 (da) |
| DE (1) | DE3461651D1 (da) |
| DK (1) | DK162124C (da) |
| ES (1) | ES534156A0 (da) |
| IL (1) | IL72374A (da) |
| NZ (1) | NZ208863A (da) |
Families Citing this family (95)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4713326A (en) * | 1983-07-05 | 1987-12-15 | Molecular Diagnostics, Inc. | Coupling of nucleic acids to solid support by photochemical methods |
| US4959309A (en) * | 1983-07-14 | 1990-09-25 | Molecular Diagnostics, Inc. | Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays |
| US4777129A (en) * | 1983-12-12 | 1988-10-11 | Molecular Diagnostics, Inc. | Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein |
| IL73577A (en) * | 1983-12-12 | 1989-10-31 | Miles Lab | Method and reagent system for detecting dna or rna sequences in a test medium containing single stranded dna or rna using antibodies to intercalation complexes with double stranded nucleic acid |
| EP0170652A4 (en) * | 1984-01-27 | 1988-08-23 | Molecular Biosystems Inc | TEST FOR IMMOBILIZED REPORTER GROUPS. |
| US4748111A (en) * | 1984-03-12 | 1988-05-31 | Molecular Diagnostics, Inc. | Nucleic acid-protein conjugate used in immunoassay |
| US4617261A (en) * | 1984-03-21 | 1986-10-14 | Cetus Corporation | Process for labeling nucleic acids and hybridization probes |
| AU579631B2 (en) * | 1984-04-05 | 1988-12-01 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Probes: synthetic, labelled oligonucleotide strands. |
| IL75142A0 (en) * | 1984-05-15 | 1985-09-29 | Smithkline Beckman Corp | Polynucleotide hybridization probes |
| DE3431536A1 (de) * | 1984-08-28 | 1986-03-13 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Derivatisierte nucleinsaeure-sequenz, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zum nachweis von nucleinsaeuren |
| US5026840A (en) * | 1985-01-10 | 1991-06-25 | Molecular Diagnostics, Inc. | Photochemical nucleic acid-labeling reagent having a polyalklamine spacer |
| ATE40572T1 (de) * | 1985-01-10 | 1989-02-15 | Molecular Diagnostics Inc | Photochemisches verfahren zum markieren von nucleinsaeuren zum nachweis in hybridisationsproben. |
| CA1272443A (en) * | 1985-02-22 | 1990-08-07 | Nanibhushan Dattagupta | Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences |
| WO1987001134A1 (en) * | 1985-08-20 | 1987-02-26 | Apothekernes Laboratorium A.S. | Photoimmune detection of dna and rna |
| US4822731A (en) * | 1986-01-09 | 1989-04-18 | Cetus Corporation | Process for labeling single-stranded nucleic acids and hybridizaiton probes |
| US4855225A (en) * | 1986-02-07 | 1989-08-08 | Applied Biosystems, Inc. | Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides |
| US5348855A (en) * | 1986-03-05 | 1994-09-20 | Miles Inc. | Assay for nucleic acid sequences in an unpurified sample |
| NO870613L (no) * | 1986-03-05 | 1987-09-07 | Molecular Diagnostics Inc | Deteksjon av mikroorganismer i en prve inneholdende nukleinsyre. |
| US4968602A (en) * | 1986-03-05 | 1990-11-06 | Molecular Diagnostics, Inc. | Solution-phase single hybridization assay for detecting polynucleotide sequences |
| NO870614L (no) * | 1986-03-06 | 1987-09-07 | Molecular Diagnostics Inc | Rask dna-pvisning av mikrober. |
| GB2190189B (en) * | 1986-03-21 | 1990-06-13 | Block Myron Jacques | Assay for polynucleotides |
| US5242797A (en) * | 1986-03-21 | 1993-09-07 | Myron J. Block | Nucleic acid assay method |
| EP0245206A1 (en) * | 1986-05-05 | 1987-11-11 | IntraCel Corporation | Analytical method for detecting and measuring specifically sequenced nucleic acid |
| US5714380A (en) | 1986-10-23 | 1998-02-03 | Amoco Corporation | Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification |
| BE1000572A4 (fr) * | 1987-05-20 | 1989-02-07 | Block Myron J | Cellule rta, appareil et procede pour titrer un polynucleotide dans un liquide. |
| US4978608A (en) * | 1987-09-04 | 1990-12-18 | Molecular Devices Corporation | DNA detection system |
| US4963658A (en) * | 1987-09-04 | 1990-10-16 | Molecular Devices Corporation | DNA detection method |
| US5283174A (en) * | 1987-09-21 | 1994-02-01 | Gen-Probe, Incorporated | Homogenous protection assay |
| US5639604A (en) * | 1987-09-21 | 1997-06-17 | Gen-Probe Incorporated | Homogeneous protection assay |
| DE3854029T2 (de) * | 1987-09-21 | 1995-10-26 | Gen Probe Inc | Homogener Abschirmungstest. |
| US6004745A (en) * | 1987-09-21 | 1999-12-21 | Gen-Probe Incorporated | Hybridization protection assay |
| DE3732145A1 (de) * | 1987-09-24 | 1989-04-06 | Merck Patent Gmbh | Verfahren und reagenz zur durchfuehrung von hybridisierungsreaktionen |
| US5185439A (en) * | 1987-10-05 | 1993-02-09 | Gen-Probe Incorporated | Acridinium ester labelling and purification of nucleotide probes |
| US5656731A (en) * | 1987-10-15 | 1997-08-12 | Chiron Corporation | Nucleic acid-amplified immunoassay probes |
| DK641487A (da) * | 1987-12-07 | 1989-06-08 | Gluetech Aps | Fremgangsmaade til modificering af polymeroverflader |
| DE3804243A1 (de) * | 1988-02-11 | 1989-08-24 | Max Planck Gesellschaft | Teils einzel- und teils doppelstraengige nukleinsaeuresonde und verfahren zu ihrer herstellung |
| FR2627590A1 (fr) * | 1988-02-24 | 1989-08-25 | Ire Celltarg Sa | Sonde d'acides nucleiques comportant un nucleotide terminal modifie chimiquement en 5(prime) (oh) en vue de son marquage non radioactif et procedes de preparation |
| US6326136B1 (en) | 1988-04-01 | 2001-12-04 | Digene Corporation | Macromolecular conjugate made using unsaturated aldehydes |
| EP0401313B1 (en) * | 1988-04-01 | 1995-05-10 | Digene Diagnostics Incorporated | Macromolecular conjugate |
| US5109124A (en) * | 1988-06-01 | 1992-04-28 | Biogen, Inc. | Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine |
| FR2634211B1 (fr) * | 1988-07-13 | 1992-06-26 | Lebacq Philippe | Procede de marquage d'une sonde nucleique et trousse de reactifs pour la mise en oeuvre de ce procede |
| FR2644163B2 (fr) * | 1988-07-13 | 1994-09-30 | Bioprobe Systems Sa | Procede de marquage d'une sonde nucleique et trousse de reactifs pour la mise en oeuvre de ce procede |
| US6203977B1 (en) * | 1988-11-15 | 2001-03-20 | Yale University | Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization |
| WO1990010718A1 (en) * | 1989-03-10 | 1990-09-20 | Millipore Corporation | Sequencing nucleic acids using chemiluminescent detection |
| US5547839A (en) * | 1989-06-07 | 1996-08-20 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection |
| GB8927503D0 (en) * | 1989-12-04 | 1990-02-07 | Kronem Systems Inc | Enzyme-amplified lanthanide chelate luminescence |
| US5763162A (en) * | 1990-03-14 | 1998-06-09 | The Regents Of University Of California | Multichromophore fluorescent DNA intercalation complexes |
| CA2078006C (en) * | 1990-03-14 | 2002-02-05 | Alexander Namiot Glazer | Multichromophore fluorescent probes |
| US5783687A (en) * | 1990-03-14 | 1998-07-21 | The Regents Of The University Of California | Dyes designed for high sensitivity detection of double-stranded DNA |
| US5401847A (en) * | 1990-03-14 | 1995-03-28 | Regents Of The University Of California | DNA complexes with dyes designed for energy transfer as fluorescent markers |
| CA2037349C (en) * | 1990-03-26 | 2008-06-17 | James G. Wetmur | Branch migration of nucleotides |
| EP0834575B1 (en) * | 1990-12-06 | 2001-11-28 | Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) | Identification of nucleic acids in samples |
| US5869605A (en) * | 1992-10-30 | 1999-02-09 | Rhone-Poulencchimie | Protected compound comprising a protective group removably attached to a compound to be protected |
| US6359113B1 (en) | 1990-12-31 | 2002-03-19 | Rhodia Chimie | Protective group, compound protected by said group and device for grafting the protective group on the compound to protect it |
| US5830644A (en) * | 1992-05-13 | 1998-11-03 | Geron Corporation | Method for screening for agents which increase telomerase activity in a cell |
| US5686306A (en) * | 1992-05-13 | 1997-11-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and reagents for lengthening telomeres |
| US5989807A (en) | 1992-05-13 | 1999-11-23 | Geron Corporation & Board Of Regents | Detecting cancerous conditions by assaying for telomerase activity |
| US5489508A (en) * | 1992-05-13 | 1996-02-06 | University Of Texas System Board Of Regents | Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity |
| US5648215A (en) * | 1992-05-13 | 1997-07-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Telomerase diagnostic methods |
| US5645986A (en) * | 1992-05-13 | 1997-07-08 | Board Of Reagents, The University Of Texas System | Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity |
| US6007989A (en) | 1992-05-13 | 1999-12-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods of screening for compounds that derepress or increase telomerase activity |
| US5837453A (en) * | 1992-05-13 | 1998-11-17 | Geron Corporation | Telomerase activity assays |
| WO1994000474A1 (en) * | 1992-06-25 | 1994-01-06 | Life Technologies, Inc. | Method for the rapid and ultra-sensitive detection and quantification of nucleic acid |
| JP3247001B2 (ja) * | 1992-12-21 | 2002-01-15 | キヤノン株式会社 | ピリリウム化合物を用いた２本鎖核酸の検出方法、ピリリウム化合物を含有するプローブ及びそれを用いた標的核酸の検出方法、新規ピリリウム化合物 |
| EP0693065B1 (en) * | 1993-04-13 | 2001-12-05 | Naxcor | Non-nucleosidic coumarin derivatives as polynucleotide-crosslinking agents |
| US5658751A (en) * | 1993-04-13 | 1997-08-19 | Molecular Probes, Inc. | Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability |
| US5767259A (en) | 1994-12-27 | 1998-06-16 | Naxcor | Oligonucleotides containing base-free linking groups with photoactivatable side chains |
| US6495676B1 (en) * | 1993-04-13 | 2002-12-17 | Naxcor | Nucleic acid sequence detection employing probes comprising non-nucleosidic coumarin derivatives as polynucleotide-crosslinking agents |
| US6277570B1 (en) | 1993-04-13 | 2001-08-21 | Naxcor | Nucleic acid sequence detection employing probes comprising non-nucleosidic coumarin derivatives as polynucleotide-crosslinking agents |
| US5804380A (en) * | 1993-11-12 | 1998-09-08 | Geron Corporation | Telomerase activity assays |
| US5863726A (en) * | 1993-11-12 | 1999-01-26 | Geron Corporation | Telomerase activity assays |
| US6482606B1 (en) | 1994-01-27 | 2002-11-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Human DNA mismatch repair polynucleotides |
| US6380369B1 (en) * | 1994-01-27 | 2002-04-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Human DNA mismatch repair proteins |
| CA2182206A1 (en) * | 1994-01-27 | 1995-08-03 | William A. Haseltine | Human dna mismatch repair proteins |
| US5776679A (en) * | 1994-07-07 | 1998-07-07 | Geron Corporation | Assays for the DNA component of human telomerase |
| US5583016A (en) | 1994-07-07 | 1996-12-10 | Geron Corporation | Mammalian telomerase |
| US5958680A (en) | 1994-07-07 | 1999-09-28 | Geron Corporation | Mammalian telomerase |
| JP3189000B2 (ja) * | 1994-12-01 | 2001-07-16 | 東ソー株式会社 | 特定核酸配列の検出方法 |
| US5922534A (en) | 1995-03-28 | 1999-07-13 | Hewlett-Packard Company | Dry biochemical assay plate and method for making the same |
| US5741677A (en) * | 1995-06-07 | 1998-04-21 | Geron Corporation | Methods for measuring telomere length |
| US5700921A (en) * | 1995-11-27 | 1997-12-23 | Vector Laboratories | Labeling nucleic acids |
| EP0851228A4 (en) * | 1996-06-10 | 2000-07-26 | Lab Molecular Biophotonics | HIGH SENSITIVITY FLUORESCENCE IMMUNOASSAY |
| WO1999022020A2 (en) * | 1997-10-23 | 1999-05-06 | Guillet James E | Labelling of polymers and sequencing of nucleic acids |
| ES2210846T3 (es) * | 1997-11-20 | 2004-07-01 | Cerus Corporation | Nuevos psoralenos para inactivar agentes patogenos. |
| US6187566B1 (en) | 1999-03-09 | 2001-02-13 | Applied Gene Technologies, Inc. | Method of labeling a nucleic acid amplicon with simultaneous contamination prevention |
| US6379930B1 (en) | 1999-07-30 | 2002-04-30 | Applied Gene Technologies, Inc. | Stabilization of nucleic acid amplification cocktails |
| US6242188B1 (en) | 1999-07-30 | 2001-06-05 | Applied Gene Technologies, Inc. | Sample processing to release nucleic acids for direct detection |
| US20030215864A1 (en) * | 2002-04-23 | 2003-11-20 | U.S. Genomics, Inc. | Compositions and methods related to two-arm nucleic acid probes |
| EP1543155A4 (en) * | 2002-07-17 | 2006-08-16 | Us Genomics Inc | METHOD AND COMPOSITIONS FOR THE ANALYSIS OF POLYMERS USING CHIMERIC TAGS |
| US20040265870A1 (en) * | 2003-04-09 | 2004-12-30 | Invitrogen Corporation | Methods of synthesizing and labeling nucleic acid molecules |
| US7776529B2 (en) | 2003-12-05 | 2010-08-17 | Life Technologies Corporation | Methine-substituted cyanine dye compounds |
| JP5306811B2 (ja) * | 2005-05-11 | 2013-10-02 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | ２本鎖ｄｎａへの高い選択性を有する蛍光化学物質及びそれらの使用 |
| US7572990B2 (en) * | 2007-03-30 | 2009-08-11 | Intermec Ip Corp. | Keypad overlay membrane |
| US8093063B2 (en) * | 2007-11-29 | 2012-01-10 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Assay for detecting genetic abnormalities in genomic nucleic acids |
| CN110702834B (zh) * | 2019-09-27 | 2021-08-10 | 石家庄平安医院有限公司 | 一种补肾托毒颗粒的无干扰快速薄层鉴别方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4218539A (en) * | 1978-03-24 | 1980-08-19 | Weltman Joel K | Enzyme conjugates and method of preparation and use |
| FR2422956A1 (fr) * | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede |
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| US4713326A (en) * | 1983-07-05 | 1987-12-15 | Molecular Diagnostics, Inc. | Coupling of nucleic acids to solid support by photochemical methods |
| US4617261A (en) * | 1984-03-21 | 1986-10-14 | Cetus Corporation | Process for labeling nucleic acids and hybridization probes |
| US4582789A (en) * | 1984-03-21 | 1986-04-15 | Cetus Corporation | Process for labeling nucleic acids using psoralen derivatives |
| AU580042B2 (en) * | 1984-03-22 | 1988-12-22 | Bresatec Limited | Non-radioactive biological probes |
-
1984
- 1984-05-18 US US06/611,668 patent/US4737454A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-07-02 EP EP84107624A patent/EP0131830B1/en not_active Expired
- 1984-07-02 DE DE8484107624T patent/DE3461651D1/de not_active Expired
- 1984-07-10 ES ES534156A patent/ES534156A0/es active Granted
- 1984-07-11 IL IL72374A patent/IL72374A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-07-11 AU AU30483/84A patent/AU567952B2/en not_active Expired
- 1984-07-11 NZ NZ208863A patent/NZ208863A/xx unknown
- 1984-07-12 DK DK342784A patent/DK162124C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK342784A (da) | 1985-01-15 |
| EP0131830B1 (en) | 1986-12-10 |
| NZ208863A (en) | 1988-06-30 |
| DK342784D0 (da) | 1984-07-12 |
| DK162124C (da) | 1992-02-17 |
| DE3461651D1 (en) | 1987-01-22 |
| US4737454A (en) | 1988-04-12 |
| IL72374A0 (en) | 1984-11-30 |
| ES8600771A1 (es) | 1985-10-16 |
| IL72374A (en) | 1989-03-31 |
| ES534156A0 (es) | 1985-10-16 |
| AU3048384A (en) | 1985-01-17 |
| EP0131830A1 (en) | 1985-01-23 |
| AU567952B2 (en) | 1987-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK162124B (da) | Maerkede nucleinsyresonder og addukter til fremstilling heraf | |
| US4959309A (en) | Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays | |
| EP0187332B1 (en) | Photochemical method of labelling nucleic acids for detection in hybridization assays | |
| US4968602A (en) | Solution-phase single hybridization assay for detecting polynucleotide sequences | |
| US4777129A (en) | Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein | |
| US4898951A (en) | Compounds used as intermediates in the preparations of non-radioactive biological probes | |
| US4743535A (en) | Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid | |
| US4822731A (en) | Process for labeling single-stranded nucleic acids and hybridizaiton probes | |
| EP0747706B1 (en) | Adduct protection assay | |
| EP0165313B1 (en) | Nucleic acid hybridization assay | |
| US5026840A (en) | Photochemical nucleic acid-labeling reagent having a polyalklamine spacer | |
| US4724202A (en) | Use of non-hybridizable nucleic acids for the detection of nucleic acid hybridization | |
| CN109661232A (zh) | 核苷酸衍生物及其使用方法 | |
| EP0601606B1 (en) | Method for detecting bioindividuals by use of nonnatural type nucleic acid probe, and probe for use in it | |
| EP3380841B1 (en) | Autonomous sensing molecules (asm) | |
| EP0237833B1 (en) | Solution-phase hybridization assay for detecting polynucleotide sequences | |
| US4307189A (en) | Method for the quantitative determination of terminal deoxynucleotidyl transferase in biological samples | |
| CA2169535A1 (en) | Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex | |
| WO2002082078A2 (en) | Activated enzyme-linked detection systems for detecting and quantifying nucleid acids, antigens antibodies and other analytes | |
| US4840892A (en) | Polynucleotide hybridization probes | |
| CA1222705A (en) | Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays | |
| KR20040035878A (ko) | 상동적으로 결합되거나 신규 복합체에 존재하는 핵산 또는핵산 동족체의 서열을 함유하는 아프타머 | |
| US20180016582A1 (en) | Dna aptamer binding to non-small cell lung cancer cells (h1975) | |
| EP0172153A1 (en) | Polynucleotide hybridization probes | |
| EP0155854B1 (en) | Non-radioactive biological probes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |