DK163068B - Cellulasepraeparat, detergentadditiv og detergentkomposition indeholdende cellulasepraeparatet samt fremgangsmaade til behandling af bomuldsholdige tekstiler med cellulasepraeparatet - Google Patents

Description

i

DK 163068 B

Den foreliggende opfindelse angår et cellulase-præparat, som er nyttigt til reduktion af ruheden i bomulds-holdige tekstiler og til nedsættelse af hastigheden, hvormed sådanne tekstiler bliver ru. Opfindelsen angår endvidere et 5 detergentadditiv, som omfatter cellulasepræparatet, en detergentkomposition indeholdende cellulasepræparatet, så vel som en fremgangsmåde til behandling af bomuldsholdige tekstiler med cellulasepræparatet.

Det er velkendt, at gentagen vask af bomuldsholdige 10 tekstiler almindeligvis forårsager en udtalt, ubehagelig ruhed i stoffet, og der er tidligere i den kendte teknik foreslået adskillige metoder til løsning af dette problem.

For eksempel beskriver GB 1.368.599 (Unilever Ltd.) anvendelsen af cellulytiske enzymer til reduktion af ruheden 15 i bomuldsholdige tekstiler. Desuden beskriver US patentskrift nr. 4.435.307 (Novo Industri A/S) anvendelsen af et celluly-tisk enzym hidrørende fra Humicola insolens så vel som en fraktion deraf med betegnelsen ΑΟχΙ, som ruhedsreducerende detergentadditiv. Andre anvendelsesområder for beskrevne 20 cellulytiske enzymer er farveklaring og fjernelse af snavs i stof (se f.eks. EP 220 016).

Skønt anvendelsen af cellulytiske enzymer til ru-hedsreduktion i bomuldsholdige tekstiler blev foreslået og påvist for næsten 20 år siden, er mekanismerne i denne proces 25 endnu ikke forklaret eller kendt i detaljer. Dette skyldes blandt andet mangfoldigheden af enzymer og de involverede enzym-katalyserede reaktioner. Faktisk er de naturligt frembragte cellulaser, f.eks. af mikrobielle arter, komplekse blandinger af cellulytiske enzymer. Som en følge deraf er den 30 af cellulaser katalyserede forandring af naturligt forekommende materialer som bomuld uhyre vanskelig at analysere detaljeret.

Grundet disse omstændigheder er den praktiske udnyttelse af enzymatisk ruhedsreduktion og -forebyggelse, hvor 35 ønskværdig den end måtte være, ikke blevet almindeligt udbredt eller af større praktisk betydning: det er vanskeligt at optimere produktionen af sammensatte enzymsystemer og dermed iværksætte industriel rentabel produktion af cellu-

DK 163068B

2 lytiske enzymer, og deres anvendelse i praksis er blevet vanskeliggjort af nødvendigheden af, at der skal anvendes temmelig store mængder af de cellulytiske enzymer for at opnå den ønskede reduktion og forebyggelse af ruhed i bomulds-5 tekstiler: for eksempel er hverken tilsætning af store mængder af enzymer til detergentkomposition forenelig med andre bestanddeles optimale funktion, eller tilsætning af meget store enzymmængder til detergentkompositionen i forbrugernes interesse.

10 Det har nu overraskende vist sig, at enzymatisk blødgøring af celluloseholdige tekstiler, især bomuldsholdige tekstiler, såvel som fjernelse af snavs og farveklaring kan tilvejebringes af en cellulasefraktion med øget endoglu-canaseaktivitet.

15 Den foreliggende opfindelse angår derfor et cellu- lasepræparat, som er ejendommeligt ved, at det omfatter mindst 50% (vægt% af det totale cellulaseindhold) af en i det væsentlige homogen endoglucanasekomponent med følgende egenskaber: 20 (a) en CMC-endoaseaktivitet [defineret som endoglucana- seaktiviteten af endoglucanasekomponenten udtrykt ved evnen til at nedsætte viskositeten i en carboxymethylcellulose (CMC) opløsning, som bestemt ved fremstilling af en substratopløsning på 35 g/1 CMC i 0,1 M tris puffer ved pH 9,0, 25 opløsning af en prøve af cellulasepræparatet i den samme puffer, blanding af 10 ml af substratopløsningen og 0,5 ml af enzymopløsningen og overføring af blandingen til et viskosi-meter thermostatteret ved 40°c, hvor 1 enhed CMC-endoaseaktivitet er defineret som den mængde enzym, der nedsætter visko-30 siteten af CMC opløsningen til halvdelen efter 30 minutter] på mindst 5 CMC-endoaseenheder pr. mg totalt protein, (b) en CAVU aktivitet [defineret som affiniteten af endoglucanasekomponenten for cellulose, som bestemt ved tilsætning af ca. 50 CMC-endoaseenheder i 10 ml tris puffer, pH 9,0, til 35 2,5 g Avicel®, omrøring af suspensionen i 30 minutter ved

DK 163068 B

3 stuetemperatur, centrifugering i 10 minutter ved 3000 rpm og måling af CMC-endoaseaktiviteten i supernatanten, hvor % CAVU aktivitet beregnes som forskellen mellem total CMC-endoaseak-tivitet af henholdsvis den originale opløsning og super-5 natanten divideret med den totale CMC-endoaseaktivitet og ganget med 100] på mindst 50% under basiske betingelser, og (c) et pH-optimum ved pH ca. 7,5-10, og at cellulasepræparatet i det væsentlige ikke udviser nogen cellobiohydrolaseaktivitet (hvor cellobiohydrolaseaktivitet 10 er defineret som aktiviteten over for cellobiose p-nitrophenyl, bestemt som beskrevet nedenfor).

Det bemærkes, at endoglucanasekomponenten i cellulasepræparatet ifølge den foreliggende opfindelse er aktiv (udtrykt i CMC-endoase og CAVU aktivitet) under basiske 15 betingelser, idet den som anført ovenfor har et pH optimum ved en pH på ca. 7,5-10. I modsætning til adskillige kendte cellulaser, som er aktive ved surt pH og relativt inaktive ved basiske pH-værdier, gør denne egenskab hos cellulasepræparatet ifølge den foreliggende opfindelse 20 præparatet særlig anvendeligt til vaskeformål, især som en bestanddel i en detergentkomposition, eftersom tøjvask typisk finder sted under basiske betingelser på grund af de fleste vaskedetergenters basiske egenskaber. Alkalophile cellulaser er kendt, f.eks. fra EP 271 004; men cellulasepræparater 25 indeholdende en endoglucanasekomponent, som udviser høj affinitet over for cellulose under basiske betingelser, er hidtil ukendte.

Den iagttagelse, at en bestemt endoglucanasekomponent i cellulase er ansvarlig for blødgøringen af 30 bomuldsholdige tekstiler, er af stor praktisk betydning; den tillader en rentabel produktion af tekstilblødgørende cellu-lytiske enzymer, f.eks. ved anvendelse af rekombinant DNA-teknikker til fremstilling af den aktive komponent, den gør den effektive anvendelse af disse enzymer praktisk mulig, og 35 den tillader en identifikation af cellulytiske enzymer med en

DK 163068 B

4 høj affinitet over for cellulose til anvendelse som blødgørere af tekstil.

Foretrukne cellulasepræparater ifølge opfindelsen er sådanne, i hvilke endoglucanasekomponenten udviser en CMC-5 endoase-aktivitet på mere end ca. 10, især mere end ca. 15 CMC-endoase-enheder pr. mg. totalt protein. Endoglucanasekomponenten udviser især en CMC-endoase-aktivitet på ca. 50 eller flere CMC-endoase-enheder pr. mg totalt protein. Andre foretrukne cellulasepræparater er sådanne, i hvilke endoglu-10 canasekomponenterne udviser en CAVU aktivitet på mere end ca.

65%, især mere end ca. 75%. Særligt foretrukne cellulasepræparater er sådanne, i hvilke endoglucanasekomponenten udviser en høj CMC-endoase-aktivitet sammenfaldende med en høj CAVU aktivitet.

15 I overensstemmelse med principperne for den fore liggende opfindelse er det en fordel, at cellulasepræparatet er så rent som muligt, d.v.s. at indholdet af endoglucanasekomponenten er så højt som muligt, således at en mindre præparatmængde er nødvendig til blødgøring af bomuldsholdige 20 tekstiler, end hvad der er tilfældet med kendte cellulaser. Særligt foretrukne cellulasepræparater ifølge opfindelsen er sådanne, som omfatter ca. 90% (vægt% af det totale cellulase-indhold) eller mere af den egnede endoglucanasekomponent.

Cellulasepræparater ifølge opfindelsen kan fås fra 25 planter og mikroorganismer, hvor endoglucanaser kan være til stede i små mængder sammen med et udvalg af andre cellu-lytiske enzymer. Eksempler på bakterier og svampe, hvorfra eventuelt interessante cellulytiske enzymer kan isoleres, er angivet i GB 2094826, p. 3, 1.35, til p. 6, 1. 7. For at opnå 30 cellulasepræparater ifølge opfindelsen må ubehandlede cellulaser underkastes omfattende oprensningsprocedurer ifølge kendte principper. Til industriel fremstilling af cellulasepræparater ifølge opfindelsen foretrækkes det at anvende rekombinante DNA-teknikker eller andre teknikker, som inde-35 bærer justering af fermenteringer, mutation af de anvendte mikroorganismer for at sikre overproduktion af de ønskede enzymatiske aktiviteter eller udvikling af fremgangsmåder til oprensning af endoglucanasekomponenten i stor målestok.

DK 163068 B

5 Sådanne metoder og teknikker er kendte og kan nemt udføres af fagfolk. I de følgende eksempler gives nogle specifikke eksempler på oprensningsteknikker, som kan anvendes til at tilvejebringe enzymer, der skal anvendes ved fremgangsmåden 5 ifølge opfindelsen. Det fremgår af eksemplerne, at ionbytningskromatografi, størrelsesudelukkelseskromatografi og fraktioneret udfældning er teknikker, som kan anvendes med stor fordel.

Endoglucanasekomponenten i cellulasepræparatet 10 ifølge opfindelsen kan være en, som er fremstillet af en svamp. Man har fundet, at cellulasepræparater med en høj CMC-endoase og CAVU aktivitet nemt kan isoleres fra arten Humico-la såsom Humicola insolens, især stamme DSM 1800, deponeret 1 oktober 1981 hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, 15 Mascheroder Weg IB, D-3300 Braunschweig, FRG, i overensstemmelse med Budapesttraktaten om international anerkendelse af deponering af mikroorganismer i forbindelse med behandling af patentsager (Budapesttraktaten).

Som følge deraf angår den foreliggende opfindelse 20 endvidere et cellulasepræparat indeholdende en cellulase, der kan fremstilles ved dyrkning af en stamme af H. insolens, hvilken cellulase omfatter mere end ca. 40%, fortrinsvis over 90% (på basis af totalt protein, bestemt ud fra OD ved 280 nm) af en endoglucanasekomponent med følgende egenskaber: 25 a) omtrentlig molekylvægt på ca. 65 kD (bestemt ved SDS-PAGE) b) isoelektrisk punkt på ca. 8,5-9,5 c) endoglucanaseaktivitet på over ca. 50 CMC-endoase-enheder/mg totalt protein 30 d) immunologisk reaktion med polyspecifikt antistof mod en cellulase hidrørende fra Humicola insolens DSM 1800

En anden foretrukket mikroorganisme, hvorfra enzymer, som kan anvendes ifølge opfindelsen, kan isoleres, 35 er stammer af Fusarium, hvor Fusarium oxysporum er foretrukket, især DSM stamme 2672, deponeret 6 juni 1983 hos

DK 163068 B

6

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen i overensstemmelse med Budapesttraktatens bestemmelser.

En yderligere foretrukket mikroorganisme, fra hvilken de nævnte enzymer kan isoleres, er en stamme af 5 Myceliopthora, hvor Myceliopthora thermophile er særligt foretrukket.

Også foretrukket som kilder til enzymer, der kan anvendes ifølge opfindelsen, er arter af Erwinia, arter af Microbispora, arter af Neocallimastix, arter af Piromonas 10 eller arter af Robillarda.

Endoglucanasekomponenten kan også være fremstillet af en bakterie, f.eks. en art af Streptomyces eller Clostridium.

Endoglucanasekomponenten kan endvidere fremstilles 15 ifølge en fremgangsmåde, som omfatter dyrkning af en værtscelle transformeret med en rekombinant DNA vektor, som bærer en DNA sekvens, der koder for endoglucanasekomponenten så vel som DNA sekvenser, der koder for funktioner, der tillader udtrykkelse af DNA sekvensen, der koder for endoglucanase-20 komponenten, i et dyrkningsmedium under betingelser, der tillader udtrykkelse af endoglucanasekomponenten, og isolering af endoglucanasekomponenten fra kulturen.

Et DNA fragment, der koder for endoglucanasekomponenten, kan f.eks. isoleres ved at etablere et cDNA 25 eller genombibliotek af en cellulaseproducerende mikroorganisme, såsom en af de nævnte organismer, og screene for positive kloner ved hjælp af kendte metoder, såsom hybridi-sering til oligonucleotidprober syntetiseret på basis af hele eller dele af aminosyresekvensen fra endoglucanasen eller 30 selektion for kloner, der udtrykker den relevante enzymaktivitet (d.v.s. CMC-endoase og CAVU aktivitet som defineret ovenfor), eller selektion for kloner, der producerer et protein, som kan reagere med et antistof mod en nativ cellu-lase (endoglucanase) komponent.

35 Når DNA sekvensen er selekteret, kan den indsættes i en egnet replicerbar ekspressionsvektor omfattende egnede promoter-, operator- og terminatorsekvenser, der lader endoglucanasen blive udtrykt i en bestemt værtsorganisme, så vel

DK 163068 B

7 som et replikationsorigin, som tillader vektoren at replikere i den pågældende værtsorganisme.

Den resulterende ekspressionssvektor kan derpå transformeres i en egnet værtscelle, såsom en svampecelle, 5 hvor et foretrukket eksemplel er en art af Aspergillus, mest foretrukket Aspergillus oryzae eller Aspergillus niger. Svampeceller kan transformeres ved en proces, der omfatter protoplastdannelse og transformation af protopiasterne efterfulgt af regenerering af cellevæggen på i og for sig kendt 10 måde. Anvendelsen af Aspergillus som værtsorganisme er beskrevet i EP 238,023 (Novo Industri A/S), hvortil der henvises.

Som et alternativ kan værtsorganismerne være en bakterie, især stammer af Streptomyces og Bacillus og E.

15 coli. Transformation af bakterieceller kan udføres ifølge konventionelle metoder, f.eks. som beskrevet i T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring

Harbor, 1982.

Screeningen af passende DNA sekvenser og konstruk-20 tionen af vektorer kan også udføres efter standardfremgangsmåder, cf. T. Maniatis et al., op.cit.

Mediet, der anvendes til dyrkning af de transformerede værtsceller, kan være et hvilket som helst konventionelt medium egnet til dyrkning af de pågældende værtsceller.

25 Den udtrykte endoglucanase kan bekvemt secerneres i dyrkningsmediet og isoleres derfra ved hjælp af velkendte procedurer, herunder separering af cellerne fra mediet ved centrifugering eller filtrering, udfældning af proteinholdige dele af mediet ved hjælp af et salt såsom ammoniumsulfat, 30 efterfulgt af kromatografiske procedurer såsom ionbytterkro-matografi, affinitetskromatografi eller lignende.

Ved at anvende rekombinante DNA teknikker som ovenfor beskrevet, proteinoprensningsteknikker, fermenteringsteknikker og mutations- eller andre teknikker, som er vel-35 kendte, er det muligt at få endoglucanaser af høj renhed.

Cellulasepræparatet ifølge opfindelsen kan bekvemt tilsættes til bomuldsholdige tekstiler sammen med andre detergentmaterialer ved iblødsætning, vask eller skylning.

DK 163068 B

8

Derfor angår den foreliggende opfindelse i et andet aspekt et detergentadditiv, der indeholder cellulasepræparatet ifølge opfindelsen i form af et støvfrit granulat, stabiliseret væske eller beskyttet enzym. Støvfri granulater kan frem-5 stilles, f.eks. ifølge US 4.106.991 og 4.661.452 (begge Novo Industri A/S) og kan eventuelt være overtrukket ifølge kendte fremgangsmåder. Flydende enzympræparater kan f.eks. stabiliseres ved tilsætning af en polyol såsom propylenglycol, en sukkerart eller sukkeralkohol, mælkesyre eller borsyre ifølge 10 kendte metoder. Andre enzymstabilisatorer er kendt. Beskyttede enzymer kan være fremstillet ifølge den i EP 238.216 beskrevne fremgangsmåde.

Detergentadditivet kan passende udvise en CMO endoaseaktivitet (som defineret ovenfor) på 500-10.000 CMC-15 endoaseenheder pr. gram additiv. Det er klart, at detergentadditivet yderligere kan omfatte et eller flere enzymer, såsom protease, lipase og/eller amylase, der konventionelt inkorporeres i detergentadditiver.

Ifølge et yderligere aspekt angår opfindelsen en 20 detergentkomposition, der indeholder et cellulasepræparat ifølge opfindelsen.

Detergentkompositioner ifølge opfindelsen omfatter endvidere overfladeaktive stoffer, som kan være af den anio-niske, non-ioniske, kationiske, amfotere eller zwitterioniske 25 type så vel som blandinger af disse overfladeaktive klasser. Typiske eksempler på anioniske overfladeaktive stoffer er lineære alkyl benzensulfonater (LAS), alfaolefinsulfonater (AOS), alcoholethoxysulfater (AES) og alkalimetalsalte af naturlige fedtsyrer.

30 Detergentkompositioner ifølge opfindelsen kan inde holde andre kendte detergentbestanddele, f.eks. buildere, blegemidler, blegeaktivatorer, antikorrosionsmidler, se-kvestreringsmidler, antismudsaf lej ringsmidler, parfumer, enzymstabilisatorer etc.

35 Detergentkompositionen ifølge opfindelsen kan for muleres på en hvilken som helst egnet måde, f.eks. som et pulver eller flydende middel. Enzymet kan stabiliseres i et flydende detergent ved medtagning af enzymstabilisatorer som

DK 163068 B

9 beskrevet ovenfor. Almindeligvis vil pH i en opløsning af detergentkompositionen ifølge opfindelsen være 7-12 og i nogle tilfælde 7,0 - 10,5. Andre detergentenzymer såsom proteaser, lipaser og/eller amylaser kan inkorporeres i 5 detergentkompositionerne ifølge opfindelsen, enten separat eller i et kombineret additiv som beskrevet ovenfor.

De blødgørings-, smudsfjernelses- og farveklarings-effekter, der kan opnås ved hjælp af cellulasepræparatet ifølge opfindelsen, kræver almindeligvis en koncentration af 10 cellulasepræparatet i vaskeopløsningen svarende til en endo-glucanaseaktivitet på 5 - 200 CMC-endoaseenheder pr. liter. Detergentkompositionen ifølge opfindelsen anvendes typisk i koncentrationer på 0,5 - 20 g/1 i vaskeopløsningen. Som følge deraf er cellulasekoncentrationen i detergentkomposi-15 tionen ifølge opfindelsen ca. 0,3 - 400 CMC-endoaseenheder pr. gram. Almindeligvis er det mest hensigtsmæssigt at tilsætte detergentadditivet i mængder på 0,1 - 5% w/w eller fortrinsvis i mængder på 0,2 - 2% af detergentkompositionen.

I yderligere et aspekt angår den foreliggende op-20 findelse en fremgangsmåde til nedbringelse af hastigheden, hvormed bomuldsholdige tekstiler bliver ru eller til reduktion af ruheden i bomuldsholdige tekstiler, idet fremgangsmåden omfatter behandling af bomuldsholdige tekstiler med et cellulasepræparat ifølge opfindelsen. Fremgangsmåden ifølge 25 opfindelsen kan udøves ved behandling af bomuldsholdige tekstiler under vask. imidlertid, kan behandlingen af tekstilerne om ønsket også udføres under iblødsætning eller skylning eller simpelthen ved tilsætning af cellulasepræparatet til vandet, som tekstilerne er eller vil blive 30 anbragt i.

Den foreliggende opfindelse er beskrevet mere detaljeret i de følgende eksempler.

DK 163068 B

10

Eksempel l

Anvendelse af cellulaser fra Humicola insolens til oprensnings- og vaskeforsøg

Fraktionering af H. insolens cellulase 5 Cellulase fremstilles ved dyrkning af Humicola insolens DSM 1800 ifølge US 4.435.307, eksempel 6. Rå cellulase fjernes fra dyrkningsmediet ved filtrering på diatoméjord, ultrafiltrering og frysetørring af retentatet, jfr. eksemplerne 1 og 6 fra US 4.435.307.

10 Den rå cellulase oprenses på DEAE-Sephadex og se pareres ved anionbytningskromatografi på DEAE-Sepharose ved pH 10. Den ikke-absorberede fraktion (betegnet Fl) har en blødgørende virkning (pr mg protein), som er ca. dobbelt så stor som hos rå cellulase eller hos ACXI fraktionen ifølge US 15 4.435.307).

Efter koncentration fraktioneres Fl ved en to-trins udfældning (NH4)2S04: det udfældede materiale kasseres ved 25% mætning, hvorefter det udfældede materiale opsamles ved 55% mætning og betegnes F1P1. Det har ca. tre gange så høj blød-20 gøringseffekt som rå cellulase.

F1P1 separeres derpå ved størrelseskromatografi (Sephacryl). Proteinet eluerer i fortrinsvis tre toppe, Cl, C2, og C3. Cl eluerer med en tydelig MW på ca. 80.000. C2 med en MW på ca. 65.000 og C3 med en MW på ca. 40.000. Hoved-25 aktiviteten i Cl er aktivitet over for PNP-Cellobiose. Hovedaktiviteten i C2 er endoglucanaseaktiviteten. C3-fraktionen indeholder hovedsageligt exoglucanaseaktivitet. Således er det kun F1P1C2 af de tre fraktioner, der ligger inden for opfindelsens område. Det har ca. 5 gange så stor blødgørings-30 effekt som rå cellulase.

F1P1C2 indeholder ca 50% af et enkelt protein, betegnet Endoglucanase I. Det kan yderligere oprenses ved hjælp af præparativ størrelseskromatografi, d.v.s. på en TSK søjle.

35 I det følgende sammenlignes rå cellulase og de forskellige fraktioner med hensyn til blødgøringseffekt (i

DK 163068 B

11 vaskeforsøg udført som beskrevet i det følgende), endoglu-canaseaktivitet (CMC-endoase, som defineret ovenfor) og indeholdet af endoglucanase I (i % totalt protein, bestemt ifølge en senere angivet fremgangsmåde). Hver af disse ud-5 trykkes i forhold til den totale proteinmængde, bestemt ved OD ved 280 nm. Tallene angiver typiske resultater. Det menes, at nogle af de målte aktiviteter påvirkes negativt af pro-teaseurenheder.

Blødgøringseffekt 10 Cellulase CMC- % Endo I i forhold til præparat endoase protein proteinmængde

Kendt teknik: rå cellulase lx ACXI 4,5 under 10 lx 15 (US 4.435.307)

Fraktioner:

F1 6 15 2X

F1P1 12 25 3x F1P1C2 19 50 5x 20 (opfindelsen)

Som vist fører fraktionering af rå cellulase til Fl, F1P1 og til sidst F1P1C2 til en progressivt stigende blød-gøringseffekt (pr proteinmængde). Fjernelsen af snavs stiger tilsvarende. De forbedrede præparater ifølge opfindelsen kan 25 skelnes fra kendte præparater ved den øgede endoglucanase-aktivitet (CMC-endoase/mg totalt protein) og ved det forøgede indhold af Endoglucanase I. Den rå cellulase udviste en CAVU aktivitet på 78%. Fraktionernes CAVU aktiviteter lå i området 75-92%. 1

Enzymkemisk karakterisering af "Endoglucanase I11 SDS-PAGE og isoelektrisk fokusering (IEF) med markørproteiner er velegnede fremgangsmåder til bestemmelse af henholdsvis molekylvægt (MW) og isolektrisk punkt (pi).

DK 163068 B

12

Ifølge disse metoder har Endoglucanase I en MW på ca. 65 kD og et pi på ca. 8,5-9,5. Den ovenfor beskrevne F1P1C2 fraktion indeholder ca. 50% af denne cellulase, og den indeholder en mindre mængde protein med en MW på ca. 50 kD og et pi på 5 ca. 5,8. På grund af den høje grad af glycosylering kan MW i S DS gelen og pi variere på grund af forskellen i fermenteringsbetingelser og puffertype under oprensning.

Enzymaktiviteten blev målt som CMC-endoase- og CAVU-aktivitet som defineret ovenfor. I hvert tilfælde anvendtes 10 F1P1C2 præparatet til bedømmelse af egenskaberne hos ren Endoglucanase I.

a) endoglucanaseaktivitet af ca. 50 CMC-endoase/mg totalt protein.

b) i det væsentlige ingen cellobiohydrolaseaktivitet 15 (under 0,5 PNP-Cel/mg).

Endoglucanase I er glycosyleret, hvilket fremgår af binding til Con-A.

Immunkemisk karakterisering

Antiserum mod proteiner kan for eksempel rejses ved 20 immunisering af kaniner ifølge fremgangsmåden beskrevet af N. Axelsen et al. i: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, kap. 23. Oprensede immunoglobuliner kan fås ud fra antiserum, f.eks. ved saltudfældning (NH4)2S04, efterfulgt af dialyse og 25 ionbytningskromatografi, d.v.s. på DEAE-Sephadex.

Immunkemisk karakterisering af proteiner kan udføres enten ved hjælp af Outcherlony dobbelt-diffusionsanalyse (O. Ouchterlony i: Handbook of Experimental Immunology (D.M.

Weir, ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp. 655-30 706), ved hjælp af krydset immunelektroforese (N. Axelsen et al., supra, kap. 3 og 4) eller ved hjælp af raket-immunelektroforese (N. Axelsen et al., kap. 2).

DK 163068B

13

De fraktionerede cellulasepræparater ifølge opfindelsen (FI, F1P1, F1P1C2) viser immunologisk reaktion med serum rejst imod den rå cellulase fra DSM 1800, så vel som serum rejst mod F1P1C2.

5 Cellobiohvdrolaseaktivitet (PNP-Cel^

Cellobiohydrolaseaktivitet kan måles med PNP-Cello-biose, p-Nitrophenyl-beta-D-cellobiosid (Sigma N-5759). Aktiviteten bestemmes som /xmol frigjort nitrophenyl pr. minut ved 37°C ved pH 7,0.

10 Bestemmelse af Endoalucanase I ved størrelseskromatoqrafi

Analytisk HPLC udføres på en 220 ml søjle af TSK SW 3000 med strømningshastigheden 5 ml/min af 0,1 M natriumacetatpuffer, pH 6,1. Cl eluerer ved 35 minutter, C2 ved 37 minutter (som okseserumalbumin) og C3 ved 40 minutter. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Oprensning af cellulase 2

Der anvendtes en total mængde på 228.000 CMC-endoase 3

rå cellulase fremstillet som beskrevet i eksempel 6 i US

4 4.435.307. Det blev fortyndet i 20 1 puffer ved pH 10,5 med 5 ethanolamin og behandlet med 25 g DEAE-Sephadex ved 4eC i 4 6 timer. Det ikke-bundne protein blev koncentreret og fryse 7

tørret. Dette svarer til ACXI fraktionen beskrevet i US

8 patent 4.435.307.

9

Efter koncentration på en Millipore Pelicon celle 10 med en molekylvægtsgrænse på 10.000, fik man 4000 ACXI inde- 11 holdende 215.000 endoase. Dette underkastedes anionbytnings- 12 kromatografi ved pH 10,5.

13 Søjlekromatografi udførtes på DEAE-Sepharose CL i en 14

10 x 25 cm søjle ækvilibreret med puffer 20 nM ethanolamin pH

15 10,5, gennemstrømningshastighed 500 ml i timen.

16

Det ikke-bundne materiale i et totalt volumen på 10.000 ml blev indstillet til pH 7,0 og koncentreret på en

DK 163068B

14

Millipore Pelicon en celle med en molekylvægtsgrænse på 10.000.

Resultatet var en fraktion på 1300 ml, betegnet Fl. Denne blev først mættet med 20% w/v ammoniumsulfat, og præci-pitatet blev kasseret, efterfulgt af 35% w/v ammoniumsulfat.

5 Det ny præcipitat blev opsamlet ved centrifugering og opløst i vand til et totalt volumen på 130 ml, betegnet F1P1.

To gange 40 ml af dette blev tilsat en Sephacryl S-200 størrelseskromatografi: puffer 100 mM ammoniumacetat, pH

6,5, strømningshastighed 200 ml i timen, størrelse af søjlen 10 5 x 85 cm. Proteinet eluerede fortrinsvis i tre toppe: Cl, C2, C3.

Resultat Volumen Protein Endoase PNPCEL

mg pr. ml pr. ml pr. ml ACX1 4000 12 54 1.3 15 Cl 410 2,8 22 8,8 C2 265 5,3 100 0,5

Blødaørinaseffekt i vaskeforsøa

Forsøgsbetingelser:

Vaskemaskine: Terg-O-tometer

20 Temperatur: 40°C

Tid: 15 minutter

Omdrejning: 100 rpm

Detergent: 5 g/1 "Grøn Biotex" fra Bluemøller A/S,

Danmark 25 pH: Indstillet til pH 9,0 Hårdhedsgrad

i vand: Vandværksvand, ca. l8°dH

Prøvemateriale: Bomuldsfrotté, 19 cm x 19 cm A/S Georg Jensen Damaskvæveriet 30 forbehandlet som beskrevet i det følgende

Stof/væskeforhold: 2 stoflapper/ 1 liter pr beholder, 38/1

Cellulase: Se nedenfor

DK 163068 B

15

Cellulasedosering: I området 2,5 til 125 mg protein/1

Skylning: Stoflapperne blev skyllet i en hushold- ningsmaskine (Miele W 761). Skylningen blev efterfulgt af centrifugering ved 5 900 rpm i 38 sekunder Tørring: Lufttørring

Antal vaske: 1

Forbehandling af prøvemateriale 100 stof lapper eller ca. 1,9 kg blev forvasket i en 10 husholdningsvaskemaskine (Miele W 761). Vaskeprogrammet "Kulørt vask 60°C, kort", d.v.s. en enkeltcyklus europæisk vask. Stof lapperne blev centrifugeret ved 1200 rpm i slutningen af hver vaskecyklus, men ikke tørret mellem vaskene. Efter 20 vaske blev stoflapperne lufttørret.

15 Forskellige cellulasepræparater anvendtes, og de behandlede stoflappers blødhed blev sammenlignet for at finde den forholdsmæssige dosering af de forskellige præparater, som var nødvendig for at give den samme blødgøringseffekt.

Resultater 20 Cellulase Blødgøringseffekt i sammenligning med proteinmængde Rå cellulase (taget som basis) ACXI ca. 1 x basis 25 F1 ca. 2 x basis F1P1 ca. 3 x basis F1P1C2 ca. 5 x basis

Det ses, at de tre fraktionerede præparater (Fl, F1P1, F1P1C2) viste forbedret blødgøringseffekt.

DK 163068 B

16

Eksempel 2

Oprensning oct vaskeforsøq ved anvendelse af cellulaser fra Fusarium oxvsporum

Fusarium oxysporum stamme J 79 (deponeringsnummer 5 DSM 2672) blev dyrket ved 30°C på et agarsubstrat indeholdende følgende næringsmidler: Gærekstrakt Difco 4 g K2HP04 1 g

MgS04 · 7H20 0,5 g 10 Glucose 15 g

Destilleret vand 1000 ml

Agar 15 g

Kulturen blev inkuberet i 6 dage i en Fernbach kolbe, hvorefter de resulterende sporer blev transformeret 15 til en 500 1 rustfri stålfermenteringsbeholder indeholdende 300 liter præfermenteringssubstrat af følgende sammensætning:

Majsstøbevand 23,3 g pr liter

Glucose 24,0 g pr liter

CaC03 5,0 g pr liter 20 Pluronsyre 0,1 ml pr liter (pH i mediet blev indstillet til 5,5 med H3P04 inden sterilisering ved 121° C i 60 minutter). Den resulterende kultur blev beluftet, idet der anvendtes 300 liter luft pr. minut ved et tryk på 0,5 atm.

25 Efter dyrkning i 23 timer ved 30°C anvendtes 150 liter af den tætte kultur til at pode en fermenteringsproduktionstank indeholdende 1500 liter af et medium sterili seret ved pH 6,5 ved 121°C i 60 minutter og indeholdende følgende ingredienser: 1

Majsstøbevand 20 g pr liter

Cellulosepulver, Diacell 40 g pr liter KH2P04 10 g pr liter

DK 163068B

17

CaC03 5 g pr liter NH4N03 10 g pr liter

MgS04 · 7H20 1 g pr liter

Pluronsyre 0,1 ml pr liter 5 Fermentateringsblandingen blev beluftet med 750-1500 liter luft i minuttet ved et tryk på 0,5 atm og omrystet ved en hastighed på 200 rpm. Temperaturen var 30°C, og pH blev holdt på 6,0 ved tilsætning af 4,9% phosphorsyre i de første 40 timer af fermenterings tiden og efter 70 timer holdt over 10 5,0 ved tilsætning af fortyndet kalciumcarbonat. Efter 108 timer standsedes fermenteringen, kulturen blev nedkølet til 59C, dyrkningsmediet blev fjernet fra filtret, og til slut blev filtratet frysetørret efter koncentration ved ultrafiltrering.

15 10 gram frysetørret cellulasepulver (som havde en total CMC-endoaseaktivitet på 18.118 enheder) blev underkastet kromatografi på 350 ml DEAE-Sepharose type CL-6B, indkøbt hos Pharmacia Company med 600 ml lineær gradient af 1 M NaCl i 50 mM Tris puffer ved pH 7. Fraktioner (20 ml) fra 20 kromatografien blev samlet sammen, koncentreret på en Amicon ultrafiltreringsmembranreaktor med en membran af typen GR 81 PP med en molekylvægtsgrænse på 10 kDalton indkøbt fra De Danske Sukkerfabrikker og til slut analyseret som vist i tabellen nedenfor: 25 Pulje ml E.280 Total rig BxJoase Total Endoase/ protein pr ml endoase rrg protein 1 58,8 52,2 3070 329 19.369 6,3 2 18,8 15,2 286 14 254 0,9 3 24,2 6,0 145 22 527 3,7 3 0 4 33 40 1320 11 363 0,3

Pulje l, som ikke bandt til anionbytningssøjlen, udviste en CAVU akti-vitet på 87%. I SDS PAGE viste den et større bånd med en molekylvægt på 80 kDalton. Ved afprøvning i vaskeforsøg (som beskrevet i eksempel 1) med et simpelt* 35 detergent på pH 8 og en CMC-endoase aktivitet fra 60 enheder

DK 163068 B

18 pr liter vaskevæske udviste proteinet i dette bånd en fremragende blødgøringseffekt.

Eksempel 3

Oprensning oa vaskeforsøq med cellulaser fra Mvceliophthora 5 thermophile

Stammen CBS 11765 (Myceliopthora thermophile) blev dyrket ved 37° C på et agarsubstrat med følgende sammensætning : Gærekstrakt Difco 4 g 10 K2HP04 1 g

MgS04 * 7H20 0.5 g

Glucose 15 g

Destilleret vand 1000 ml

Agar 15 g 15 Kulturen blev inkuberet i seks dage i en Fernbach kolbe. Derpå blev sporerne overført til en 500 1 rustfri stål fermenteringsbeholder indeholdende 280 liter af et medium bestående af følgende:

Sojabønnemel 28,9 g pr liter 20 K,HP04 2,1 g pr liter

CaC03 5,0 g pr liter

Pluronsyre 0,4 ml pr liter

Glucose 4,3 g pr liter

Citronsyre 6,7 g pr liter 1 2 3 4 5 6 (Glucosen og citronsyren i mediet blev steriliseret 2 separat ved 123°C i 60 minutter. pH i mediet blev indstillet 3 til 5,5 med H3P04 inden sterilisering ved 123°c i 90 minut 4 ter) . Steril luft blev ledt gennem kulturen ved et tryk på 5 0,5 atm og med en hastighed på 200 liter pr min.

6

Efter dyrkning i 48 timer ved 37° C anvendtes 120 liter af den tætte kultur til podning af en enzymproduktionstank indeholdende 1500 liter af et substrat med følgende sammensætning:

DK 163068 B

19

Sojabønnemel 30 g pr liter

Cellulosepulver, Solkafloc 20 g pr liter KH2P04 2 g pr liter

CaC03 4,5 g pr liter 5 Pluronsyre 0,17 ml pr liter (mediets pH blev indstillet til 6,5 med Na0H/H3P04 inden sterilisering ved 123“C i 90 minutter)

Kulturen blev beluftet med en hastighed på 1500 liter i minuttet under et tryk på 0,5 atm og omrystet med en 10 hastighed på 250 rpm. Fermenteringen blev fortsat i 64 timer ved 37*C, hvorefter kulturen blev nedkølet til 5*C og filtreret. Filtratet blev frysetørret efter koncentration ved ultrafiltrering.

5 g cellulasepulver (som havde en CMC-endoase-15 aktivitet på 6176 enheder pr gram) blev fraktioneret med søjlemateriale af typen Sephacryl S 200 og en 0,1 M natriumacetatpuffer ved pH 6,1. Fraktioner på 15 ml blev opsamlet, analyseret med SDS elektroforese og fordelt ifølge gelernes proteinmønster som følger: 20 pulje 1 475 ml, SDS gel: 100, 90 kDalton pulje 2 500 ml, SDS gel: 70, 50, 45 kDalton pulje 3 400 ml, SDS gel: 70, 60, 50, 45 kDalton pulje 4 410 ml, SDS gel: 45, 30 kDalton pulje 5 310 ml, SDS gel: 65, 50, 18 kDalton 25 pulje 6 850 ml, SDS gel: 65, 50, 40, 18 kDalton

Puljerne blev derpå koncentreret på en Amicon membranreaktor med en ultrafiltreringsmembran af typen GR 81 PP indkøbt hos De Danske Sukkerfabrikker, molekylvægtsgrænse 10 kDalton, og de blev derpå analyseret som følger:

DK 163068 B

20

Pulje ml E.280 Total ryg Ehdoase Total Endoase/ protein ' pr ml endoase mg protein 1 13,0 17,6 229 74 956 4,2 2 18,3 23,1 423 372 6803 16,1 5 3 11,8 16,2 191 139 1645 8,6 4 20,0 18,3 366 196 3929 10,7 5 11,6 22,6 262 286 3318 11,6 6 21,0 20,0 420 252 5292 12,6 Følgende CAVU aktiviteter blev målt:

10 Pulje 2 23% CAVU

Pulje 3 22% CAVU

Pulje 4 13% CAVU

Pulje 5 75% CAVU

Pulje 6 88% CAVU 1 2 3 4 5 6

Ved afprøvning i vaskeforsøg (som beskrevet i 2 eksempel 1) med et enkelt detergent med pH 8 og en CMC-endo- 3 aseaktivitet på 180 enheder pr liter vaskevæske havde kun 4 puljerne 5 og 6 en udmærket blødgøringseffekt. Derimod havde 5 pulje 2, som har en CMC-endoaseaktivitet på 16 enheder/mg, 6 ikke nogen blødgøringseffekt ved afprøvning.

Claims (20)

1. Cellulasepræparat, kendetegnet vedf at det omfatter mindst 50% (vægt% af det totale cellulase-indhold) af en i det væsentlige homogen endoglucanasekompo-5 nent med følgende egenskaber: (a) en CMC-endoaseaktivitet [defineret som endoglucana-seaktiviteten af endoglucanasekomponenten udtrykt ved evnen til at nedsætte viskositeten i en carboxymethylcellulose (CMC) opløsning, som bestemt ved fremstilling af en substrat- 10 opløsning på 35 g/1 CMC i 0,1 M tris puffer ved pH 9,0, opløsning af en prøve af cellulasepræparatet i den samme puffer, blanding af 10 ml af substratopløsningen og 0,5 ml af enzymopløsningen og overføring af blandingen til et viskosi-meter thermostatteret ved 40’C, hvor 1 enhed CMC-endoaseakti-15 vitet er defineret som den mængde enzym, der nedsætter viskositeten af CMC opløsningen til halvdelen efter 30 minutter] på mindst 5 CMC-endoaseenheder pr. mg totalt protein, (b) en CAVU aktivitet [defineret som affiniteten af endoglucanasekomponenten for cellulose, som bestemt ved tilsætning 20 af ca. 50 CMC-endoaseenheder i 10 ml tris puffer, pH 9,0, til 2,5 g Avicel®, omrøring af suspensionen i 30 minutter ved stuetemperatur, centrifugering i 10 minutter ved 3000 rpm og måling af CMC-endoaseaktiviteten i supernatanten, hvor % CAVU aktivitet beregnes som forskellen mellem total CMC-endoaseak-25 tivitet af henholdsvis den originale opløsning og supernatanten divideret med den totale CMC-endoaseaktivitet og ganget med 100] på mindst 50% under basiske betingelser, og (c) et pH-optimum ved pH ca. 7,5-10, og at cellulasepræparatet i det væsentlige ikke udviser nogen 30 cellobiohydrolaseaktivitet. DK 163068 B

2. Cellulasepræparat ifølge krav l, kendetegnet ved, at det omfatter mindst 90% (vægt% af det totale cellulaseindhold) af endoglucanasekomponenten.

3. Cellulasepræparat ifølge krav 1, kendete g- 5. e t ved, at endoglucanasekomponenten udviser en CMC- endoaseaktivitet på over ca. 10, fortrinsvis over ca. 15, CMC-endoaseenheder pr. mg totalt protein.

4. Cellulasepræparat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at endoglucanasekomponenten udviser en CMC- 10 endoaseaktivitet på ca. 50 eller flere CMC-endoaseenheder pr. mg totalt protein.

5. Cellulasepræparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at endoglucanasekomponenten udviser en CAVU-aktivitet på over ca. 65%, fortrinsvis over ca. 75%.

6. Cellulasepræparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at endoglucanasekomponenten er fremstillet af en svamp.

7. Cellulasepræparat ifølge krav 6, kendetegnet ved, at svampen er en art af Humicola, især Humicola 20 insolens.

8. Cellulasepræparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, at endoglucanasekomponenten udviser følgende egenskaber: a) omtrentlig molekylvægt på ca. 65 kD (SDS-PAGE) 25 b) isoelektrisk punkt på ca. 8,5-9,5 c) endoglucanaseaktivitet på over ca. 50 CMC-endoase-enheder/mg totalt protein d) immunologisk reaktion med et polyspecifikt antistof rejst mod cellulase hidrørende fra Humicola insolens

30 DSM 1800. DK 163068 B

9. Cellulasepræparat ifølge krav 6, kendetegnet ved, at endoglucanasekomponenten er fremstillet fra en Fusarium sp., især Fusarium oxysporum, en Myceliopthora sp., især Myceliopthora thermophile, en Erwinia sp., en

5 Microbispora sp., en Neocallimastix sp., en Piromonas sp. eller en Robillarda sp.

10. Cellulasepræparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at endoglucanasekomponenten er fremstillet af en bakterie.

11. Cellulasepræparat ifølge krav 10, kendeteg net" ved, at bakterien er en art af Streptomyces eller Clostridium.

12. Detergentadditiv omfattende et cellulasepræparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11, kendete g- 15. e t ved, at det er i form af et støvfrit granulat, stabiliseret væske eller beskyttede enzymer.

13. Detergentadditiv ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det udviser en CMC-endoaseaktivitet på 500- 10.000 CMC-endoaseenheder pr. g additiv.

14. Detergentadditiv ifølge krav 12, kendeteg net ved, at det yderligere omfatter et andet enzym såsom en protease, lipase og/eller amylase.

15. Detergentkomposition, kendetegnet ved, at den omfatter et cellulasepræparat ifølge et hvilket som 25 helst af kravene l-ll.

16. Detergentkomposition ifølge krav 15, kende tegnet ved, at den udviser en CMC-endoaseaktivitet på ca. 0,3-400 CMC-endoaseenheder pr. g detergent. 1 Detergentkomposition ifølge krav 15, kende- DK 163068 B tegnet ved, at den yderligere omfatter et andet enzym såsom protease, lipase og/eller amylase.

18. Fremgangsmåde til nedsættelse af hastigheden, hvormed bomuldsholdige tekstiler bliver ru, eller til reduk- 5 tion af ruheden i bomuldsholdige tekstiler, kendetegnet ved, at den omfatter behandling af bomuldsholdige tekstiler med et cellulasepræparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet 10 ved, at behandlingen af tekstilerne med cellulasepræparatet udføres under iblødsætning, vask eller skylning af tekstilerne.